Summary
Her beskriver vi en S. pneumoniae serotype 1 stamme 519/43, der kan genmodificeres ved at bruge dens evne til naturligt at erhverve DNA og et selvmordsplasmid. Som bevis for princippet blev der lavet en isogen mutant i pneumolysin (lag) genet.
Abstract
Streptococcus pneumoniae serotype 1 er fortsat et enormt problem i lav- og mellemindkomstlande, især i Afrika syd for Sahara. På trods af dens betydning er undersøgelser i denne serotype blevet hindret af manglen på genetiske værktøjer til at ændre den. I dette studie beskriver vi en metode til genetisk modifikation af et klinisk serotype 1-isolat (stamme 519/43). Interessant nok blev dette opnået ved at udnytte Pneumokokkers evne til naturligt at erhverve DNA. I modsætning til de fleste pneumokokker var brugen af lineært DNA imidlertid ikke vellykket; For at mutere denne vigtige stamme måtte der anvendes et selvmordsplasmid. Denne metode har givet mulighed for en dybere forståelse af denne undvigende serotype, både hvad angår dens biologi og patogenicitet. For at validere metoden blev det store kendte pneumokoktoksin, pneumolysin, muteret, fordi det har en velkendt og let at følge fænotype. Vi viste, at mutanten som forventet mistede sin evne til at lyse røde blodlegemer. Ved at være i stand til at mutere et vigtigt gen i den interessante serotype var vi i stand til at observere forskellige fænotyper for tab af funktionsmutanter ved intraperitoneale og intranasale infektioner end dem, der blev observeret for andre serotyper. Sammenfattende viser denne undersøgelse, at stamme 519/43 (serotype 1) kan være genetisk modificeret.
Introduction
Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae, pneumokokker) er en af hovedårsagerne til sygelighed og dødelighed globalt. Indtil for nylig er der opdaget tæt på 100 serotyper af S. pneumoniae 1,2,3,4,5,6,7. Årligt, invasiv pneumokoksygdom (IPD) hævder omkring 700.000 dødsfald, af børn yngre end 5 år8. S. pneumoniae er hovedårsagen til bakteriel lungebetændelse, otitis media, meningitis og septikæmi på verdensplan9.
I det afrikanske meningitisbælte er serotype 1 ansvarlig for meningitisudbrud, hvor sekvenstype (ST) ST217, en ekstremt virulent sekvenstype, er dominerende 10,11,12,13,14,15. Dens betydning i meningitis patologi er blevet sammenlignet med Neisseria meningitidis i det afrikanske meningitis bælte16. Serotype 1 er ofte hovedårsagen til IPS; Det findes dog meget sjældent i vogn. Faktisk er denne serotype i Gambia ansvarlig for 20% af al invasiv sygdom, men den blev kun fundet hos 0,5% af raske bærere14,17,18,19. Genetisk udveksling og rekombination i kompetente pneumokokker forekommer generelt i transport snarere end i invasiv sygdom20. Desuden har serotype 1 vist sig at have en af de korteste transportrater, der er beskrevet blandt pneumokokker (kun 9 dage). Derfor er det blevet foreslået, at denne serotype kan have en meget lavere rekombinationshastighed end andre21.
Dybtgående undersøgelser er nødvendige for at forstå årsagen til serotype 1-stammernes lave transporthastighed og dens betydning for invasiv sygdom i Afrika syd for Sahara.
Her rapporterer vi en protokol, der tillader genomdækkende mutagenese af en bestemt serotype 1-stamme, 519/43. Denne stamme kan let erhverve og rekombinere nyt DNA i sit genom. Denne metode er endnu ikke sammentømret, men den er meget effektiv, når den udføres i 519/43 baggrund (andre mål er muteret, manuskripter under udarbejdelse). Ved blot at bruge 519/43-stammen og udnytte dens naturlige kompetence samt erstatte den måde, hvorpå det eksogene DNA tilvejebringes, var vi i stand til at mutere pneumolysingenet (lag) i denne serotype 1-stamme. Denne metode repræsenterer en forbedring i forhold til den, der præsenteres af Harvey et al.22 , da den udføres i et trin uden behov for at føre DNA'et gennem en anden serotype. Ikke desto mindre, og på grund af variabilitet mellem stammer, er ingen metode blevet standardiseret til alle stammer. Evnen til at mutere specifikke gener og observere dens virkninger vil muliggøre en dyb forståelse af serotype 1 S. pneumoniae stammer, og det vil give svar på disse stammers rolle i meningitis i Afrika syd for Sahara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Frembringelse af muterende amplikon ved SOE-PCR23 og amplifikation af spectinomycinkassetten
- Start med at udføre PCR til amplifikation af homologiarmene (henholdsvis lag 5' (488 bp) og ply3' (715 bp)) i de flankerende områder af laggenet fra stamme 519/43. Brug primere plyFw1_NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG), ply5'R1_BamHI (CGAAATATAGACCAAAGGACGC GGATCC AGAACCAAACTTGACCTTGA), ply3'F1_BamHI (TCAAGGTCAAGTTTTTTTCTGGATCC GCGTCCTTTTTTTTTTTTC) og plyRv2_NotI (TTTGCGGCCGCCATTTTCTCTCTCTCTCTCTCTACC).
- Brug følgende PCR-betingelser for lag5': denaturering ved 94 °C i 60 s, trin 2: denaturering ved 94 °C i 30 s, trin 3: udglødning ved 58 °C i 30 s, trin 4: forlængelse ved 72 °C i 30 s, trin 5: Gå tilbage til trin 2, og gentag i 35 cyklusser, trin 6: endelig forlængelse ved 72 °C i 30 s.
- Brug de samme PCR-betingelser for ply3' med undtagelse af forlængelsestiden på trin 4 og trin 6, hvor den skal være 60 s.
- Analyser PCR-produkterne ved gelelektroforese og punktafgifter amplikon fra gelen.
- Rens PCR-amplikonerne i henhold til protokollen beskrevet i producentens instruktioner (materialetabel).
- Brug ækvimolære mængder af begge homologiarme som skabeloner i SOE-PCR. Sammensmelt de to amplicons ved hjælp af primere plyFw1_ NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG) og plyRv2_NotI (TTTGCGGCCGCCATTTTCTCTACCTTATCCTCTACC).
- Brug følgende SOE-PCR-betingelser (trin 1: denaturering ved 94 °C i 2 minutter, trin 2: denaturering ved 94 °C i 30 s, trin 3: udglødning ved 58 °C i 30 s, trin 4: forlængelse ved 68 °C i 60 s, trin 5: Gå tilbage til trin 2 og gentag i 25 cyklusser, trin 6: endelig forlængelse ved 68 °C i 90 s).
- SOE-PCR-produktet analyseres ved gelelektroforese. Punktafgifter det fra gelen ved hjælp af et gelekstraktionssæt, og følg instruktionerne.
- Spectinomycinkassetten forstærkes fra plasmidet pR412 ved hjælp af følgende PCR-betingelser: trin 1: denaturering ved 94 °C i 60 s, trin 2: denaturering ved 94 °C i 30 s, trin 3: udglødning ved 55 °C i 30 s, trin 4: forlængelse ved 68 °C i 60 s, trin 5: gå tilbage til trin 2 og gentag i 25 cyklusser, Trin 6: Endelig forlængelse ved 68 °C i 60 s.
- Brug primere BamHI_SP2F2 (GGATCC, CTA, GAA, CTA, GTG, GAT, CCC, CC) og BamHI_SP2R2 (GGATCC, AAT, TCT, GCAT, GATT, TTT, AC, ATG, ATC). Plasmid pR412 blev erhvervet fra Dr. Marc PrudHomme (CNRS-Universite, Paul Sabatier, Toulouse, Frankrig).
- Analyser PCR-amplicons ved gelelektroforese. Punktafgifter og rensning af den resulterende PCR-amplikon som beskrevet ovenfor.
2. Generering af plasmid pSD1 og kemisk transformation af E. coli Dh5α
- Udfør en ligering efter producentens vejledning til pGEMT-easy system I (materialetabel). I et mikrocentrifugerør tilsættes 5 μL 2x ligeringsbuffer, 1 μL pGEMTeasy, 2 μL af det ply_SOE produkt, 1 μL T4 DNA-ligase og vand til et 20 μL totalvolumen. Der inkuberes natten over ved 4 °C. Dette genererer plasmid pSD1.
- Transformér kemisk kompetent E. coli Dh5α med pSD1. Start med at inkubere 50 μL kemisk kompetent E. coli Dh5α med 3 μL pSD1 ligeringsreaktion i 15 minutter på is. Fortsæt derefter ved at udsætte cellerne for termisk chok (42 °C, 30 s). Placer cellerne på is i 2 min.
- Fjern cellerne fra isen og tilsæt 350 μL SOC-medier. Kulturen inkuberes i 2 timer ved 37 °C, 120 omdr./min.
- Pladen transformationen på Luria Bertani Agar (LBA) suppleret med 0,4 mM IPTG, 0,24 mg/ml X-Gal til blå/hvid selektion og 100 μg/ml ampicillin for at sikre, at alle kolonier, der vokser i pladen, har plasmidet rygrad. Hvide kolonier indeholder pSD1.
- Vælg tre hvide kolonier og sæt nattevækst op i 10 ml LB, suppleret med 100 μg/ml ampicillin. Kulturerne inkuberes natten over ved 37 °C under omrystning.
- Den næste dag centrifugeres kulturerne ved 3.082 x g og bruges pellet til plasmidekstraktion.
3. Plasmid-DNA-ekstraktion, restriktionsfordøjelse af pSD1 og spectinomycingen og samling af pSD2
- Uddrag plasmid-DNA'et ved at følge instruktionerne, der følger med det kommercielle kit (materialetabel).
- Opsæt en BamHI-restriktionsfordøjelse for både pSD1-plasmid og spectinomycinkassetten, der tidligere er amplificeret og renset. Brug følgende betingelser og mængder beskrevet i tabel 1.
- Restriktionsfordøjelsesreaktionerne og kontrollerne inkuberes ved 37 °C i 3 timer.
- Analyser begrænsningsfordøjelsen ved elektroforese, punktafgifter båndet og rens efter instruktionerne, der følger med det kommercielle kit (materialetabel).
- Derefter fremstilles en ligeringsreaktion efter producentens instruktioner (materialetabel) ved hjælp af BamHI-fordøjet pSD1 og spectinomycin (fra trin 3.2). I et mikrocentrifugeglas tilsættes følgende reaktionskomponenter: 5 μL 2x ligeringsbuffer, 2 μL pSD1, 2 μL spectinomycinkassette, 1 μL T4 DNA-ligase og inkuberes natten over ved 4 °C. Dette genererer plasmid pSD2.
- Plasmidet pSD2 omdannes til kemisk kompetent E. coli Dh5α som beskrevet i trin 2.2.
- Vælg de transformanter, der bærer plasmidet pSD2, baseret på deres evne til at vokse i LBA suppleret med 100 μg/ml spectinomycin og ampicillin.
- Udfør en plasmid-DNA-ekstraktion (pSD2) som beskrevet ovenfor og følg producentens anvisninger (μL).
4. Transformation af S. pneumoniae stamme 519/43
- Forbered en natkultur af S. pneumoniae 519/43 i BHI og lad den vokse statisk ved 37 ° C, 5% CO2.
- Den følgende dag fortyndes kulturerne 1:50 og 1:100 i 10 ml frisk BHI-bouillon. Inkuber kulturerne statisk ved 37 °C, indtil OD595nm er mellem 0,05 og 0,1 (optimal erhvervelse af DNA tættere på 0,1 OD).
- Når en OD på 0,1 er nået, tages 860 μL og overføres til et mikrocentrifugerør. I samme mikrocentrifugerør tilsættes: 100 μL 100 mM NaOH, 10 μL 20% (w/v) BSA, 10 μL 100 mM CaCl 2,2 μL 50 ng/ml CSP124 og 500 ng pSD2.
- Reaktionen inkuberes statisk ved 37 °C i 3 timer.
- Plade 330 μL på 5% blodagarplader (BA) suppleret med 100 μg/ml spectinomycin, hver time i løbet af de 3 inkubationstimer.
- Inkubationspladerne inkuberes natten over ved 37 °C, 5% CO2. Patch spectinomycinresistente kolonier på en anden BA-plade suppleret med 100 μg/ml spectinomycin samt på BA-plader suppleret med 100 μg/ml ampicillin. Begge sæt plader inkuberes natten over under ovennævnte betingelser. Ampicillinpladerne skal teste for tilstedeværelsen af plasmidrygraden.
- Spectinomycinkassetten bekræftes ved PCR ved hjælp af primere plyFw1_ NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG) og SPEC_REV (TAATTCCTCTAAGTCATAATTTCCG). Bekræft mutationen ved PCR ved hjælp af primere plySCN1 (CCAATGGAAATCGCTAGGCAAGAGATAA) og plySCN2 (ATTACTTAGTCCAACCACGGCTGAT), som fastgøres uden for det muterede område.
- Bekræft integrationen i den korrekte placering af genomet ved sekventering ved hjælp af primere plySCN1 (CCAATGGAAATCTAGGCAAGAGATAA), plySCN2 (ATTACTTAGTCCAACCACGGCTGAT) samt primere med deres bindingssted i spectinomycinkassetten sqr1 (CCTGATCCAAACATGTAAGTACC) sqf2 (CGTAGTTATCTTGGAGAGAATA) spec_sqf1 (GGTACTTACATGTTTGGATCAGG ) og spec_sqr2 TATTCTCTCCAAGATAACTACG.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen beskrevet her starter med at bruge PCR til at forstærke venstre og højre homologiarme, samtidig med at 191 bp slettes fra det midterste område af laggenet . Under udførelsen af PCR introduceres et BamHI-sted ved 3' i venstre homologiarm og i 5' ende af højre homologiarm (figur 1A). Dette efterfølges af PCR-SOE, hvor venstre og højre homologiarme smeltes sammen til en amplicon (figur 1B). Denne SOE-PCR-amplikon klones derefter til pGEMTeasy ved hjælp af TA-kloning til at generere plasmid pSD1 (figur 1C). Vellykket transformation vil give hvide kolonier, der er resistente over for ampicillin. Eventuelle blå kolonier vil være transformerende stoffer, der indeholder et tomt pGEMTeasy-plasmid. pSD1 vil derefter blive fordøjet på BamHI stedet, der blev introduceret på tidspunktet for SOE-PCR (figur 1D) og ligeret til en spectinomycin kassette (også BamHI fordøjet for kompatible ender). Det nye plasmid kaldes pSD2 (figur 1E). Korrekt samling af pSD2 bekræftes ved restriktionsfordøjelse (figur 2A). pSD2, der fungerer som et selvmordsplasmid, da det ikke indeholder en grampositiv kompatibel replikationsoprindelse, blev brugt til at transformere 519/43WT (tidligere forberedt på at være kompetent). Positive transformanter er kolonier, der vokser på 100 μg/ml spectinomycin efter en inkubation natten over. Alle kolonier lappes på friskfriske blodagarbundplader suppleret med 100 μg/ml spectinomycin samt blodagarbase suppleret med 100 μg/ml ampicillin. Eventuelle kolonier, der vokser på den anden overnatningsplade suppleret med spectinomycin, er mulige positive. Eventuelle kolonier, der vokser på ampicillinplader, vil betegne integration af det fulde plasmid eller rekombination af ampicillinkassetten andetsteds i genomet. Indtil videre og ved hjælp af stamme 519/43 er der ikke vokset kolonier på pladerne suppleret med ampicillin. Alle kolonier, der er positive ved PCR, skal bekræftes ved sekventering (figur 2C) for at vurdere og bekræfte placeringen af indsættelsen. Til dette formål skal primere have deres bindingssted uden for homologiområdet (figur 2C). Det valgte mål har en meget markant fænotype (hæmolyse af røde blodlegemer (RBC)), og derfor kan mutationen også bekræftes fænotypisk (figur 2B). Mutanten mistede sin evne til at lyse RBC'er.
| Komponenter | Reaktion (μL) | Kontrol (μL) | Reaktion (μL) | Kontrol (μL) |
| Buffer | 2 | 2 | 2 | 2 |
| pSD1 | 4 | 4 | - | |
| Spectinomycin kassette | - | - | 6 | 6 |
| BamHI-HF | 1 | - | 1 | - |
| Vand | 13 | 14 | 11 | 12 |
| Samlet volumen | 20 | 20 | 20 | 20 |
Tabel 1: Restriktionsfordøjelsesreaktionskomponenter for pSD1 og spectinomycinkassette.
Figur 1: Oversigt over mutagenesestrategien. A) Forstærkning af homologiarme (Ply3' og Ply5' (bane 2 til 5); og splejsning ved overlappende forlængelse PCR (bane 6 og 7). L- hyperladder I (Bioline), bane 1- negativ kontrol for reaktionen, bane 2 og 3- lag5' (488 bp) og ply3' (715 bp) homologiarme forstærket fra D39 gDNA, bane 4 og 5- lag5' (488 bp) og ply3' (715 bp) homologiarme forstærket fra 519/43 gDNA. Højre vognbane 6- D39 SOE PCR-produkt, bane 7- 519/43 SOE PCR-produkt (1235 bp). B) skematisk gengivelse af den endelige SOE-PCR-konstruktion (ply_SOE) Angivet med pile er de primere, der bruges til at opnå homologiområdet mellem begge homologiarme samt den valgte begrænsningsfordøjelse. C) Plasmid pSD1, der viser kloning af ply_SOE; D) Begrænsning fordøjelse af pSD1 og spectinomycin kassette. E) Endelig konstruktion pSD2, der derefter bruges som et selvmordsplasmid til at omdanne S. pneumoniae. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: A) Bekræftelse af tilstedeværelsen af spectinomycinkassetten i pSD2. L- hyperladder 1kb (Bioline); 1- pSD1 fordøjet med BamHI; 2-pSD2 fordøjet med BamHI; L hyperladder 1 kb (Bioline); 3- Spectinomycin kassette amplificeret fra pR412, 4- Spectinomycin kassette fordøjet med BamHI; B) Fænotypisk bekræftelse af pneumolysinmutationen ved bestemmelse af hæmolytisk aktivitet for D39, 519/43WT og mutant 519/43Δply. Dette blev sammenlignet med hæmolyse af røde blodlegemer med 0,5% saponin. Saponinafledt hæmolyse betragtes som 100%, og raterne for 519/43Wt og 519/43Δply blev beregnet ud fra det. Hvert datapunkt er gennemsnittet af 5 tekniske og 3 biologiske replikater. C) Sekventering af data kortlagt til det mutante genomområde, hvor pneumolysin blev afbrudt. Primere er angivet som pile og ved navn. PLYSCN1 og PLYSCN2 binder uden for homologiarmene. Sekventering opnået fra primere PLYSCN1 og 2 viste, at der var uafbrudt sekvens fra de nærliggende regioner uden for homologiområdet indtil spectinomycinkassetten, hvilket demonstrerede indsættelsen i genomet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Streptococcus pneumoniae, navnlig serotype 1, er fortsat en global trussel, der forårsager invasiv pneumokoksygdom og meningitis. På trods af introduktionen af forskellige vacciner, der skal beskytte mod serotype 1, i Afrika, er denne serotype stadig i stand til at forårsage udbrud, der fører til høj sygelighed og dødelighed13. Evnen til genetisk manipulation af denne serotype er af afgørende betydning på grund af dens kliniske relevans. Metoden beskrevet i denne undersøgelse tillader genetisk manipulation af en repræsentativ stamme inden for denne serotype. En invasiv stamme 519/43 (ST5316), et klinisk isolat fra en meningitispatient i Danmark25.
Den metode, der præsenteres her, var vellykket hovedsagelig på grund af den valgte stamme, da den kan erhverve eksogent DNA, men også på grund af ændringer foretaget i de traditionelle protokoller, der anvendes til S. pneumoniae-transformation , er en typisk succesrate for vores transformationsprotokol på ca. 70%.
Med denne metode er det afgørende at anvende et selvmordsplasmid i stedet for det sædvanlige lineære DNA. Konventionelt ville lineært DNA26,27,28 have været brugt; Imidlertid var alle forsøg på at anvende det eksogene DNA i denne form mislykkede. Desuden lykkedes forsøg på at udnytte S. pneumoniae 519/43's naturlige kompetence ved lavere absorbans ikke. Fejlfinding viste, at den naturlige kompetence for stamme 519/43 var højere, når OD595 var 0,1, hvilket er forskelligt fra de data, der blev observeret for andre serotyper af S. pneumoniae, hvor højeste naturlige kompetence blev observeret ved meget lav OD24.
For at validere metoden blev en pneumolysinmutant konstrueret, fordi den udviser en let at følge fænotype; For at bevise, at metoden kan anvendes på ethvert gen inden for denne stamme, er andre gener imidlertid blevet målrettet med succes (manuskripter under udarbejdelse). En sådan metode, der bruger en selvmordsvektor, der ikke har nogen grampositiv kompatibel oprindelse, kunne også bruges til kromosomkomplementaritet, overekspression af gener af interesse samt introduktion af reportersystemer, alt sammen ved at bruge nabogenerne som homologiregioner.
Udvidelsen af genetiske værktøjer til S. pneumoniae serotype 1, stamme 519/43 er vigtig, fordi vi nu kan genetisk manipulere repræsentative stammer direkte. Stamme 519/43 er af interesse, da den er genetisk bøjelig, er patogen, da den blev isoleret fra en meningitispatient, og dens manipulation vil give spor til bedre at forstå udviklingen og etableringen af meningitis. Tidligere blev forståelsen af visse determinanter inden for arten gjort ved at indsætte det pågældende gen i en af de meget velkarakteriserede stammer af S. pneumoniae, såsom D39 (serotype 2). Paton et al. anvendte en sådan fremgangsmåde på grund af vanskeligheder med mutagenesen af serotype 129. Resultaterne rapporteret af dem på D39, der bærer en mindre hæmolytisk allel af serotype 1-lag sammenlignet med 519/43 ∆lag , adskiller sig fra dem, der præsenteres af os30 , hvilket fremhæver vigtigheden af at kunne mutere et gen inden for den oprindelige stammebaggrund. Senere var den samme gruppe i stand til at mutere en ikke-afstamning A serotype 1 stamme22. Interessant nok er deres protokol helt forskellig fra vores, da det er en to-trins tilgang, der kræver, at mutationen først udføres i serotype 2-stammer, og dette bruges derefter som en skabelon, der skal transformeres i deres serotype 1-stamme.
I øjeblikket er der en begrænsning i den præsenterede metode. Indtil videre fungerer denne metode kun for den repræsentative 519/43-stamme. Den samme nøjagtige protokol blev forsøgt i andre stammer, nemlig kliniske isolater fra ST3081 og ST303, og det lykkedes ikke. Desuden blev elektroporation som en metode til levering af eksogent DNA til cellen også forsøgt på alle tre sekvenstyper, med positive resultater observeret kun for 519/43. Udvidelse og standardisering af metoden til alle serotype 1-stammer er af afgørende betydning, da der er enorm variation i hele gruppen. Der er i øjeblikket undersøgelser i gang for at udvide anvendeligheden af metoden til alle stammer inden for serotype 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Meningitis Trust og MRC for at yde finansiering til dette arbejde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AccuPrime Pfx DNA polymerase | Invitrogen | 12344024 | Used for amplification of the fragments |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A9518 | Used for bacterial selection on stage 1(pSD1) |
| Blood Agar Base | Oxoid | CM0055 | Used to plate S. pneumoniae transformants |
| Bovine Serum Albumine | sigma | 55470 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Brain Heart Infusion | Oxoid | CM1135 | used to grow S. pneumoniae cells |
| Calcium Chloride Cacl2 | Sigma | 449709 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Competence stimulating peptide 1 | AnaSpec | AS-63779 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Luria Broth Agar | Gibco | 22700025 | used for plating and selection of pSD1 and pSD2 |
| Luria Broth Base (Miller's formulation) | Gibco | 12795027 | used for plating and selection of pSD1 and pSD2 |
| Monarch Gel Extraction Kit | NEB | T1020S | Used to extract the bands from the DNA gel |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | NEB | T1010S | Used to extract plasmid from the cells |
| pGEM T-easy | Promega | A1360 | used as suicide plasmid |
| S.O.C. | Invitrogen | 15544034 | used for recovery of cells after transformation |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma | S0899 | used for S.pneumoniae Transformation |
| Spectinomycin Hydrochloride | SigmaAldrich | PHR1426 | Used for bacterial selection |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Invitrogen | 18265017 | used for the creation of pSD1 and pSD2 |
References
- Bentley, S. D., et al. Genetic Analysis of the Capsular Biosynthetic Locus from All 90 Pneumococcal Serotypes. PLoS Genetics. 2 (3), 31 (2006).
- Calix, J. J., Nahm, M. H. A new pneumococcal serotype, 11E, has a variably inactivated wcjE gene. The Journal of Infectious Diseases. 202 (1), 29-38 (2010).
- Park, I. H., Pritchard, D. G., Cartee, R., Brandao, A., Brandileone, M. C. C., Nahm, M. H. Discovery of a New Capsular Serotype (6C) within Serogroup 6 of Streptococcus pneumoniae. Journal of Clinical Microbiology. 45 (4), 1225-1233 (2007).
- Jin, P., et al. First Report of Putative Streptococcus pneumoniae Serotype 6D among Nasopharyngeal Isolates from Fijian Children. The Journal of Infectious Diseases. 200 (9), 1375-1380 (2009).
- Oliver, M. B., vander Linden, M. P. G., Küntzel, S. A., Saad, J. S., Nahm, M. H. Discovery of Streptococcus pneumoniae Serotype 6 Variants with Glycosyltransferases Synthesizing Two Differing Repeating Units. Journal of Biological Chemistry. 288 (36), 25976-25985 (2013).
- Calix, J. J., et al. Serological Characterization of Two Capsule Subtypes among Streptococcus pneumoniae Serotype 20 Strains. Journal of Biological Chemistry. 287 (33), 27885-27894 (2012).
- Park, I. H., et al. and Serological Characterization of a New Pneumococcal Serotype, 6H, and Generation of a Pneumococcal Strain Producing Three Different Capsular Repeat Units. Clinical and Vaccine Immunology. 22 (3), 313-318 (2015).
- O'Brien, K. L., et al. Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates. The Lancet. 374 (9693), 893-902 (2009).
- Henriques-Normark, B., Tuomanen, E. I. The Pneumococcus: Epidemiology, Microbiology, and Pathogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 3 (7), 010215 (2013).
- Leimkugel, J., et al. An Outbreak of Serotype 1 Streptococcus pneumoniae Meningitis in Northern Ghana with Features That Are Characteristic of Neisseria meningitidis Meningitis Epidemics. The Journal of Infectious Diseases. 192 (2), 192-199 (2005).
- Yaro, S., et al. Epidemiological and Molecular Characteristics of a Highly Lethal Pneumococcal Meningitis Epidemic in Burkina Faso. Clinical Infectious Diseases. 43 (6), 693-700 (2006).
- Antonio, M., et al. Molecular epidemiology of pneumococci obtained from Gambian children aged 2-29 months with invasive pneumococcal disease during a trial of a 9-valent pneumococcal conjugate vaccine. BMC Infectious Diseases. 8 (1), 81 (2008).
- Kwambana-Adams, B. A., et al. An outbreak of pneumococcal meningitis among older children (≥5 years) and adults after the implementation of an infant vaccination programme with the 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in Ghana. BMC Infectious Diseases. 16 (1), 575 (2016).
- Antonio, M., et al. Seasonality and outbreak of a predominant Streptococcus pneumoniae serotype 1 clone from The Gambia: Expansion of ST217 hypervirulent clonal complex in West Africa. BMC Microbiology. 8 (1), 198 (2008).
- Staples, M., et al. Molecular characterization of an Australian serotype 1 Streptococcus pneumoniae outbreak. Epidemiology and Infection. 143 (2), 325-333 (2015).
- Gessner, B. D., Mueller, J. E., Yaro, S. African meningitis belt pneumococcal disease epidemiology indicates a need for an effective serotype 1 containing vaccine, including for older children and adults. BMC Infectious Diseases. 10 (1), 22 (2010).
- Hill, P. C., et al. Nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae in Gambian infants: a longitudinal study. Clinical Infectious Diseases. 46 (6), 807-814 (2008).
- Ebruke, C., et al. Temporal changes in nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae serotype 1 genotypes in healthy Gambians before and after the 7-valent pneumococcal conjugate vaccine. PeerJ. 3, 90 (2015).
- Adegbola, R. A., et al. Serotype and antimicrobial susceptibility patterns of isolates of Streptococcus pneumoniae causing invasive disease in The Gambia 1996-2003. Tropical Medicine and International Health. 11 (7), 1128-1135 (2006).
- Marks, L. R., Reddinger, R. M., Hakansson, A. P. High Levels of Genetic Recombination during Nasopharyngeal Carriage and Biofilm Formation in Streptococcus pneumoniae. mBio. 3 (5), (2012).
- Ritchie, N. D., Mitchell, T. J., Evans, T. J. What is different about serotype 1 pneumococci. Future Microbiology. 7 (1), 33-46 (2012).
- Harvey, R. M., et al. The variable region of pneumococcal pathogenicity island 1 is responsible for unusually high virulence of a serotype 1 isolate. Infection and Immunity. 84 (3), 822-832 (2016).
- Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. BioTechniques. 8 (5), 528-535 (1990).
- Alioing, G., Granadel, C., Morrison, D. A., Claverys, J. P. Competence pheromone, oligopeptide permease, and induction of competence in Streptococcus pneumoniae. Molecular Microbiology. 21 (3), 471-478 (1996).
- Lund, E. Enumeration and description of the strains belonging to the State Serum Institute, Copenhagen Denmark. , (1951).
- Barany, F., Tomasz, A. Genetic transformation of Streptococcus pneumoniae by heterologous plasmid deoxyribonucleic acid. Journal of Bacteriology. 144 (2), 698-709 (1980).
- Terra, V. S., Homer, K. A., Rao, S. G., Andrew, P. W., Yesilkaya, H. Characterization of novel β-galactosidase activity that contributes to glycoprotein degradation and virulence in Streptococcus pneumoniae. Infection and Immunity. 78 (1), (2010).
- Terra, V. S., Zhi, X., Kahya, H. F., Andrew, P. W., Yesilkaya, H. Pneumococcal 6-phospho-β-glucosidase (BglA3) is involved in virulence and nutrient metabolism. Infection and Immunity. 84 (1), (2015).
- Harvey, R. M., Ogunniyi, A. D., Chen, A. Y., Paton, J. C. Pneumolysin with Low Hemolytic Activity Confers an Early Growth Advantage to Streptococcus pneumoniae in the Blood. Infection and Immunity. 79 (10), 4122 (2011).
- Terra, V. S., Plumptre, C. D., Wall, E. C., Brown, J. S., Wren, B. W. Construction of a pneumolysin deficient mutant in Streptococcus pneumoniae serotype 1 strain 519/43 and phenotypic characterisation. Microbial Pathogenesis. 141, 103999 (2020).
