Summary
Hier beschrijven we een S. pneumoniae serotype 1 stam 519/43 die genetisch kan worden gemodificeerd door gebruik te maken van zijn vermogen om op natuurlijke wijze DNA en een zelfmoordplasmide te verkrijgen. Als proof of principle werd een isogene mutant in het pneumolysine (ply) gen gemaakt.
Abstract
Streptococcus pneumoniae serotype 1 blijft een groot probleem in lage- en middeninkomenslanden, met name in Afrika ten zuiden van de Sahara. Ondanks het belang ervan zijn studies in dit serotype belemmerd door het gebrek aan genetische hulpmiddelen om het te wijzigen. In deze studie beschrijven we een methode om een serotype 1 klinisch isolaat (stam 519/43) genetisch te modificeren. Interessant is dat dit werd bereikt door gebruik te maken van het vermogen van de Pneumokokken om op natuurlijke wijze DNA te verkrijgen. In tegenstelling tot de meeste pneumokokken was het gebruik van lineair DNA echter niet succesvol; Om deze belangrijke stam te muteren, moest een zelfmoordplasmide worden gebruikt. Deze methodologie heeft de middelen verschaft voor een dieper begrip van dit ongrijpbare serotype, zowel in termen van biologie als pathogeniciteit. Om de methode te valideren, werd het belangrijkste bekende pneumokokkentoxine, pneumolysine, gemuteerd omdat het een bekend en gemakkelijk te volgen fenotype heeft. We toonden aan dat de mutant, zoals verwacht, zijn vermogen verloor om rode bloedcellen te lyseren. Door een belangrijk gen in het serotype van belang te kunnen muteren, waren we in staat om verschillende fenotypes te observeren voor functieverlies mutanten bij intraperitoneale en intranasale infecties van die waargenomen voor andere serotypen. Samenvattend bewijst deze studie dat stam 519/43 (serotype 1) genetisch gemodificeerd kan worden.
Introduction
Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae, de pneumokok) is wereldwijd een van de belangrijkste oorzaken van morbiditeit en mortaliteit. Tot voor kort zijn bijna 100 serotypen van S. pneumoniae ontdekt 1,2,3,4,5,6,7. Jaarlijks claimt invasieve pneumokokkenziekte (IPD) ongeveer 700.000 sterfgevallen, van kinderen jonger dan 5 jaar8. S. pneumoniae is wereldwijd de belangrijkste oorzaak van bacteriële longontsteking, otitis media, meningitis en septikemie9.
In de Afrikaanse meningitisgordel is serotype 1 verantwoordelijk voor uitbraken van meningitis, waarbij sequentietype (ST) ST217, een extreem virulent sequentietype, dominant is 10,11,12,13,14,15. Het belang ervan in de meningitispathologie is vergeleken met dat van Neisseria meningitidis in de Afrikaanse meningitisgordel16. Serotype 1 is vaak de belangrijkste oorzaak van IPD; het wordt echter zeer zelden aangetroffen in het rijtuig. In Gambia is dit serotype verantwoordelijk voor 20% van alle invasieve ziekten, maar het werd slechts gevonden bij 0,5% van de gezonde dragers14,17,18,19. Genetische uitwisseling en recombinatie bij competente pneumokokken vindt over het algemeen plaats in het vervoer in plaats van bij invasieve ziekte20. Bovendien is aangetoond dat serotype 1 een van de kortste vervoerssnelheden heeft die worden beschreven onder pneumokokken (slechts 9 dagen). Daarom is voorgesteld dat dit serotype een veel lager recombinatiepercentage zou kunnen hebben dan andere21.
Diepgaande studies zijn nodig om de reden achter de lage transportsnelheid van serotype 1-stammen en het belang ervan bij invasieve ziekten in Afrika ten zuiden van de Sahara te begrijpen.
Hier rapporteren we een protocol dat genoombrede mutagenese van een bepaalde serotype 1-stam mogelijk maakt, 519/43. Deze stam kan gemakkelijk nieuw DNA verwerven en recombineren in zijn genoom. Deze methode is nog niet inter-strain, maar het is zeer efficiënt wanneer het wordt gedaan in 519/43 achtergrond (andere doelen zijn gemuteerd, manuscripten in voorbereiding). Door simpelweg de 519/43-stam te gebruiken en de natuurlijke competentie ervan te benutten, evenals de manier waarop het exogene DNA wordt verstrekt, te vervangen, waren we in staat om het pneumolysine-gen (ply) in deze serotype 1-stam te muteren. Deze methode vertegenwoordigt een verbetering ten opzichte van die gepresenteerd door Harvey et al.22 , omdat het in één stap wordt gedaan zonder de noodzaak om het DNA door een ander serotype te laten gaan. Niettemin, en als gevolg van inter-strain variabiliteit, is er geen methode gestandaardiseerd voor alle stammen. Het vermogen om specifieke genen te muteren en de effecten ervan te observeren, zal een diepgaand begrip van serotype 1 S. pneumoniae-stammen mogelijk maken en het zal antwoorden bieden op de rol van deze stammen in meningitis in Afrika ten zuiden van de Sahara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generatie van het muterende amplicon door SOE-PCR23 en versterking van de spectinomycinecassette
- Begin met het uitvoeren van PCR voor de amplificatie van de homologiearmen (respectievelijk ply 5' (488 bp) en ply3' (715 bp) van de flankerende gebieden van het ply-gen van stam 519/43. Gebruik primers plyFw1_NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG), ply5'R1_BamHI (CGAAATATAGACCAAAGGACGC GGATCC AGAACCAAACTTGACCTTGA), ply3'F1_BamHI (TCAAGGTCAAGTTTGGTTCTGGATCC GCGTCCTTTTGGTCTATATTTCG) en plyRv2_NotI (TTTGCGGCCGCCATTTTTTCTACCTCTCTCTACCTCTACC).
- Gebruik de volgende PCR-voorwaarden voor ply5': denatureren bij 94 °C gedurende 60 s, stap 2: denatureren bij 94 °C gedurende 30 s, stap 3: gloeien bij 58 °C gedurende 30 s, stap 4: verlengen bij 72 °C gedurende 30 s, stap 5: teruggaan naar stap 2 en herhalen gedurende 35 cycli, stap 6: laatste verlenging bij 72 °C gedurende 30 s.
- Gebruik dezelfde PCR-voorwaarden voor ply3' met uitzondering van de verlengingstijd bij stap 4 en stap 6, waar deze 60 s zou moeten zijn.
- Analyseer de PCR-producten door gel-elektroforese en verwijder het amplicon uit de gel.
- Zuiver de PCR-amplicons volgens het protocol dat wordt beschreven in de instructies van de fabrikant (materiaaltabel).
- Gebruik equimolaire hoeveelheden van beide homologiearmen als sjablonen in de SOE-PCR. Fuseer de twee amplicons met primers plyFw1_ NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG) en plyRv2_NotI (TTTGCGGCCGCCATTTTTTACCTTATCTCTACCTTATCTACC).
- Gebruik de volgende SOE-PCR-condities (stap 1: denatureren bij 94 °C gedurende 2 min, stap 2: denatureren bij 94 °C gedurende 30 s, stap 3: gloeien bij 58 °C gedurende 30 s, stap 4: verlengen bij 68 °C gedurende 60 s, stap 5: teruggaan naar stap 2 en herhalen gedurende 25 cycli, stap 6: laatste verlenging bij 68 °C gedurende 90 s).
- Analyseer het SOE-PCR-product door gel-elektroforese. Verwijder het uit de gel met behulp van een gelextractiekit en volg de instructies.
- Amplificeer de spectinomycinecassette van plasmide pR412 met behulp van de volgende PCR-voorwaarden: stap 1: denatureren bij 94 °C gedurende 60 s, stap 2: denatureren bij 94 °C gedurende 30 s, stap 3: gloeien bij 55 °C gedurende 30 s, stap 4: verlenging bij 68 °C gedurende 60 s, stap 5: ga terug naar stap 2 en herhaal gedurende 25 cycli, stap 6: laatste verlenging bij 68 °C gedurende 60 s.
- Gebruik primers BamHI_SP2F2 (GGATCC CTA GAA CTA GTG GAT CCC CC) en BamHI_SP2R2 (GGATCC AAT TCT GCA GAT TTT AC ATG ATC). Plasmide pR412 werd overgenomen van Dr. Marc PrudHomme (CNRS-Universite Paul Sabatier, Toulouse, Frankrijk).
- Analyseer de PCR-amplicons door gel-elektroforese. Accijns en zuiver het resulterende PCR-amplicon zoals hierboven beschreven.
2. Generatie van plasmide pSD1 en chemische transformatie van E. coli Dh5α
- Voer een ligatie uit volgens de instructies van de fabrikant van pGEMT-easy system I (materiaaltabel). Voeg in een microcentrifugebuis 5 μL 2x ligatiebuffer, 1 μL pGEMTeasy, 2 μL van het ply_SOE product, 1 μL T4 DNA-ligase en water toe aan een totaal volume van 20 μL. Incubeer een nacht bij 4 °C. Dit genereert plasmide pSD1.
- Transformeer chemisch competente E. coli Dh5α met pSD1. Begin met het incuberen van 50 μL chemisch competente E. coli Dh5α met 3 μL pSD1-ligatiereactie gedurende 15 minuten op ijs. Ga vervolgens verder door de cellen bloot te stellen aan thermische schokken (42 °C, 30 s). Plaats de cellen gedurende 2 minuten op ijs.
- Verwijder de cellen uit het ijs en voeg 350 μL S.O.C. media toe. Incubeer de cultuur gedurende 2 uur bij 37 °C, 120 tpm.
- Plaat de transformatie op Luria Bertani Agar (LBA) aangevuld met 0,4 mM IPTG, 0,24 mg/ml X-Gal voor blauw/witte selectie en 100 μg/ml ampicilline om ervoor te zorgen dat alle kolonies die in de plaat groeien de plasmide-ruggengraat hebben. Witte kolonies bevatten pSD1.
- Kies drie witte kolonies en zet 's nachts groei op in 10 ml LB, aangevuld met 100 μg / ml ampicilline. Incubeer de culturen een nacht bij 37 °C met schudden.
- Centrifugeer de volgende dag de culturen op 3.082 x g en gebruik de pellet voor plasmide-extractie.
3. Plasmide DNA-extractie, restrictievertering van pSD1 en spectinomycine gen en assemblage van pSD2
- Extraheer het plasmide-DNA volgens de instructies die bij de commerciële kit zijn geleverd (Materiaaltabel).
- Stel een BamHI-restrictievertering in voor zowel pSD1-plasmide als de spectinomycinecassette die eerder is versterkt en gezuiverd. Gebruik de volgende voorwaarden en hoeveelheden zoals beschreven in tabel 1.
- Incubeer de restrictieverteringsreacties en controles bij 37 °C gedurende 3 uur.
- Analyseer de restrictievertering door elektroforese, snijd de band weg en zuiver volgens de instructies die bij de commerciële kit (materiaaltabel) zijn geleverd.
- Bereid vervolgens een ligatiereactie voor volgens de instructies van de fabrikant (materiaaltabel) met behulp van de BamHI-verteerde pSD1 en spectinomycine (uit stap 3.2). Voeg in een microcentrifugebuis de volgende reactiecomponenten toe: 5 μL 2x ligatiebuffer, 2 μL pSD1, 2 μL spectinomycinecassette, 1 μL T4 DNA-ligase en incubeer 's nachts bij 4 °C. Dit genereert plasmide pSD2.
- Transformeer plasmide pSD2 in chemisch competente E. coli Dh5α zoals beschreven in stap 2.2.
- Selecteer de transformanten die plasmide pSD2 dragen op basis van hun vermogen om te groeien in LBA aangevuld met 100 μg / ml spectinomycine en ampicilline.
- Voer een plasmide DNA-extractie (pSD2) uit zoals hierboven beschreven en volg de instructies van de fabrikant (μL).
4. Transformatie van S. pneumoniae stam 519/43
- Bereid een nachtkweek van S. pneumoniae 519/43 in BHI en laat deze statisch groeien bij 37 °C, 5% CO2.
- Verdun de volgende dag de culturen 1:50 en 1:100 in 10 ml verse BHI-bouillon. Incubeer de culturen statisch bij 37 °C totdat de OD595nm tussen 0,05 en 0,1 ligt (optimale verwerving van DNA dichter bij 0,1 OD).
- Zodra een OD van 0,1 is bereikt, neemt u 860 μL en brengt u deze over in een microcentrifugebuis. Voeg in dezelfde microcentrifugebuis toe: 100 μL 100 mM NaOH, 10 μL 20% (w/v) BSA, 10 μL 100 mM CaCl 2,2 μL 50 ng/ml CSP124 en 500 ng pSD2.
- Incubeer de reactie statisch bij 37 °C gedurende 3 uur.
- Plaat 330 μL op 5% bloedagarplaten (BA) aangevuld met 100 μg/ml spectinomycine, elk uur gedurende de 3 incubatie-uren.
- Incubeer platen 's nachts bij 37 °C, 5% CO2. Patch spectinomycine resistente kolonies op een andere BA-plaat aangevuld met 100 μg / ml spectinomycine en op BA-platen aangevuld met 100 μg / ml ampicilline. Incubeer beide sets platen 's nachts onder de hierboven vermelde omstandigheden. De ampicillineplaten moeten worden getest op de aanwezigheid van de plasmide-ruggengraat.
- Bevestig de aanwezigheid van de spectinomycinecassette door PCR met behulp van primers plyFw1_ NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG) en SPEC_REV (TAATTCCTCTAAGTCATAATTTCCG). Bevestig de mutatie door PCR met behulp van primers plySCN1 (CCAATGGAAATCGCTAGGCAAGAGATAA) en plySCN2 (ATTACTTAGTCCAACCACGGCTGAT) die zich buiten het gemuteerde gebied hechten.
- Bevestig de integratie in de juiste locatie van het genoom door sequencing met behulp van primers plySCN1 (CCAATGGAAATCGCTAGGCAAGAGATAA), plySCN2 (ATTACTTAGTCCAACCACGGCTGAT), evenals primers met hun bindingsplaats in de spectinomycinecassette sqr1 (CCTGATCCAAACATGTAAGTACC) sqf2 (CGTAGTTATCTTGGAGAGAATA) spec_sqf1 (GGTACTTACATGTTTTTGGATCAGG ) en spec_sqr2 TATTCTCTCCAAGATAACTACG.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het hier beschreven protocol begint met het gebruik van PCR om de linker en rechter homologiearmen te versterken, terwijl tegelijkertijd 191 bp uit het middelste gebied van het ply-gen wordt verwijderd. Tijdens het uitvoeren van de PCR wordt een BamHI-site geïntroduceerd aan de 3' van de linker homologiearm en aan het 5' uiteinde van de rechter homologiearm (figuur 1A). Dit wordt gevolgd door PCR-SOE waarbij linker en rechter homologiearmen zijn samengesmolten tot één amplicon (figuur 1B). Dit SOE-PCR-amplicon wordt vervolgens gekloond tot pGEMTeasy met behulp van TA-klonen om plasmide pSD1 te genereren (figuur 1C). Succesvolle transformatie zal witte kolonies opleveren die resistent zijn tegen ampicilline. Alle blauwe kolonies zijn transformanten die een leeg pGEMTeasy plasmide bevatten. pSD1 zal vervolgens worden verteerd op de BamHI-locatie die werd geïntroduceerd ten tijde van de SOE-PCR (figuur 1D) en geligeerd aan een spectinomycinecassette (ook BamHI verteerd voor compatibele uiteinden). Het nieuwe plasmide wordt pSD2 genoemd (figuur 1E). De juiste samenstelling van pSD2 wordt bevestigd door restrictievertering (figuur 2A). pSD2, dat werkt als een zelfmoordplasmide omdat het geen Gram-positieve compatibele oorsprong van replicatie bevat, werd gebruikt om 519/43WT te transformeren (eerder voorbereid om competent te zijn). Positieve transformanten zijn kolonies die groeien op 100 μg / ml spectinomycine na een nachtelijke incubatie. Alle kolonies worden gepatcht op nieuw verse bloedagarbasisplaten aangevuld met 100 μg / ml spectinomycine en bloedagarbasis aangevuld met 100 μg / ml ampicilline. Alle kolonies die groeien op de tweede nachtplaten aangevuld met spectinomycine zijn mogelijke positieven. Alle kolonies die op ampicillineplaten groeien, duiden op integratie van het volledige plasmide of recombinatie van de ampicillinecassette elders in het genoom. Tot nu toe zijn er met stam 519/43 geen kolonies gegroeid op de platen aangevuld met ampicilline. Alle kolonies die positief zijn door PCR moeten worden bevestigd door sequencing (figuur 2C) om de locatie van de insertie te beoordelen en te bevestigen. Hiertoe moeten primers hun bindingsplaats buiten het homologiegebied hebben (figuur 2C). Het gekozen doelwit heeft een zeer uitgesproken fenotype (hemolyse van rode bloedcellen (RBC)) en daarom kan de mutatie ook fenotypisch worden bevestigd (figuur 2B). De mutant verloor zijn vermogen om RBC's te lyseren.
| Onderdelen | Reactie (μL) | Controle (μL) | Reactie (μL) | Controle (μL) |
| Buffer | 2 | 2 | 2 | 2 |
| pSD1 | 4 | 4 | - | |
| Spectinomycine cassette | - | - | 6 | 6 |
| BamHI-HF | 1 | - | 1 | - |
| Water | 13 | 14 | 11 | 12 |
| Totaal volume | 20 | 20 | 20 | 20 |
Tabel 1: Restrictie digestie reactie componenten voor pSD1 en spectinomycine cassette.
Figuur 1: Overzicht van de mutagenesestrategie. A) Versterking van homologiearmen (Ply3' en Ply5' (banen 2 tot en met 5); en splicing door overlappende uitbreidings-PCR (rijstroken 6 en 7). L- hyperladder I (Bioline), baan 1- negatieve controle voor de reactie, baan 2 en 3- ply5' (488 bp) en ply3' (715 bp) homologiearmen versterkt uit D39 gDNA, banen 4 en 5- ply5' (488 bp) en ply3' (715 bp) homologiearmen versterkt uit 519/43 gDNA. Rechter rijstrook 6- D39 SOE PCR product, baan 7- 519/43 SOE PCR product (1235 bp). B) Schematische weergave van de uiteindelijke verkregen SOE-PCR-constructie (ply_SOE); Aangegeven met pijlen zijn de primers die worden gebruikt om het homologiegebied tussen beide homologiearmen te verkrijgen, evenals de gekozen restrictievertering. C) Plasmide pSD1, met afbeelding van het klonen van ply_SOE; D) Restrictievertering van pSD1 en spectinomycine cassette. E) Uiteindelijke constructie pSD2 die vervolgens wordt gebruikt als een zelfmoordplasmide om S. pneumoniae te transformeren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: A) Bevestiging van de aanwezigheid van de spectinomycinecassette in pSD2. L- hyperladder 1kb (Bioline); 1- pSD1 verteerd met BamHI; 2-pSD2 verteerd met BamHI; L hyperladder 1 kb (Bioline); 3- Spectinomycine cassette versterkt uit pR412, 4- Spectinomycine cassette verteerd met BamHI; B) Fenotypische bevestiging van de pneumolysine mutatie door bepaling van hemolytische activiteit voor D39, 519/43WT en mutant 519/43Δply. Dit werd vergeleken met hemolyse van rode bloedcellen met 0,5% saponine. Saponine-afgeleide hemolyse wordt beschouwd als 100% en de tarieven voor 519/43Wt en 519/43Δply werden ertegen berekend. Elk datapunt is het gemiddelde van 5 technische en 3 biologische replicaties. C) Sequencinggegevens toegewezen aan het mutante genoomgebied waar pneumolysine werd onderbroken. Primers worden aangeduid als pijlen en bij naam. PLYSCN1 en PLYSCN2 binden buiten de homologiearmen. Sequencing verkregen uit primers PLYSCN1 en 2 toonde aan dat er een ononderbroken sequentie was van de naburige regio's buiten het homologiegebied tot aan de spectinomycinecassette, wat de insertie in het genoom aantoonde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Streptococcus pneumoniae, in het bijzonder serotype 1, blijft een wereldwijde bedreiging die invasieve pneumokokkenziekte en meningitis veroorzaakt. Ondanks de introductie van verschillende vaccins die beschermend zouden moeten zijn tegen serotype 1, is dit serotype in Afrika nog steeds in staat om uitbraken te veroorzaken die leiden tot hoge morbiditeit en mortaliteit13. Het vermogen om dit serotype genetisch te manipuleren is van cruciaal belang vanwege de klinische relevantie ervan. De in deze studie beschreven methode maakt genetische manipulatie van een representatieve stam binnen dit serotype mogelijk. Een invasieve stam 519/43 (ST5316), een klinisch isolaat van een meningitispatiënt in Denemarken25.
De hier gepresenteerde methodologie was vooral succesvol vanwege de gekozen stam omdat deze exogene DNA kan verwerven, maar ook vanwege wijzigingen in de traditionele protocollen die worden gebruikt voor S. pneumoniae-transformatie , een typisch succespercentage voor ons transformatieprotocol is ongeveer 70%.
Met deze methodologie is het van het grootste belang om een zelfmoordplasmide te gebruiken in plaats van het gebruikelijke lineaire DNA. Conventioneel zou lineair DNA26,27,28 zijn gebruikt; alle pogingen om het exogene DNA in deze vorm te gebruiken waren echter niet succesvol. Bovendien waren pogingen om de natuurlijke competentie van S. pneumoniae 519/43 bij lagere absorptie te benutten niet succesvol. Probleemoplossing toonde aan dat de natuurlijke competentie voor stam 519/43 hoger was wanneer OD595 0,1 was, wat verschilt van de gegevens die werden waargenomen voor andere serotypen van S. pneumoniae, waar de hoogste natuurlijke competentie werd waargenomen bij zeer lage OD24.
Om de methode te valideren, werd een pneumolysinemutant geconstrueerd omdat deze een gemakkelijk te volgen fenotype vertoont; Om echter te bewijzen dat de methode kan worden toegepast op elk gen binnen deze stam, zijn andere genen met succes gericht (manuscripten in voorbereiding). Een dergelijke methode, met behulp van een zelfmoordvector die geen Gram-positieve compatibele oorsprong heeft, zou ook kunnen worden gebruikt voor chromosomale complementatie, overexpressie van genen van belang, evenals introductie van reportersystemen, allemaal door de naburige genen als homologiegebieden te gebruiken.
De uitbreiding van genetische hulpmiddelen naar S. pneumoniae serotype 1, stam 519/43 is belangrijk omdat we nu representatieve stammen direct genetisch kunnen manipuleren. Stam 519/43 is van belang omdat het genetisch buigzaam is, pathogeen is omdat het werd geïsoleerd van een meningitispatiënt, en de manipulatie ervan zal aanwijzingen geven om de ontwikkeling en oprichting van meningitis beter te begrijpen. Voorheen werd het begrijpen van bepaalde determinanten binnen de soort gedaan door het gen in kwestie in te brengen in een van de zeer goed gekarakteriseerde stammen van S. pneumoniae, zoals D39 (serotype 2). Een dergelijke benadering werd gebruikt door Paton et al., vanwege problemen met de mutagenese op serotype 129. De door hen gerapporteerde resultaten op D39 met een minder hemolytisch allel van serotype 1 ply in vergelijking met 519/43 ∆ply verschillen van die door ons30 gepresenteerd, wat het belang benadrukt van het kunnen muteren van een gen binnen de oorspronkelijke stamachtergrond. Later was dezelfde groep in staat om een niet-afstamming A serotype 1 stam22 te muteren. Interessant is dat hun protocol heel anders is dan het onze, omdat het een tweestapsbenadering is waarbij de mutatie eerst moet worden uitgevoerd in serotype 2-stammen en dit vervolgens wordt gebruikt als een sjabloon om te worden getransformeerd in hun serotype 1-stam.
Momenteel is er één beperking in de gepresenteerde methode. Voorlopig werkt deze methode alleen voor de representatieve stam 519/43. Hetzelfde exacte protocol werd geprobeerd in andere stammen, namelijk klinische isolaten van ST3081 en ST303 en het was niet succesvol. Bovendien werd elektroporatie als een methode voor de afgifte van exogene DNA aan de cel ook geprobeerd op alle drie de sequentietypen, met positieve resultaten die alleen voor 519/43 werden waargenomen. Het uitbreiden en standaardiseren van de methodologie naar alle serotype 1 stammen is van het grootste belang, omdat er een enorme variabiliteit is in de hele groep. Momenteel worden studies uitgevoerd om de toepasbaarheid van de methode uit te breiden naar alle stammen binnen serotype 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We willen de Meningitis Trust en de MRC bedanken voor het verstrekken van financiering voor dit werk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AccuPrime Pfx DNA polymerase | Invitrogen | 12344024 | Used for amplification of the fragments |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A9518 | Used for bacterial selection on stage 1(pSD1) |
| Blood Agar Base | Oxoid | CM0055 | Used to plate S. pneumoniae transformants |
| Bovine Serum Albumine | sigma | 55470 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Brain Heart Infusion | Oxoid | CM1135 | used to grow S. pneumoniae cells |
| Calcium Chloride Cacl2 | Sigma | 449709 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Competence stimulating peptide 1 | AnaSpec | AS-63779 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Luria Broth Agar | Gibco | 22700025 | used for plating and selection of pSD1 and pSD2 |
| Luria Broth Base (Miller's formulation) | Gibco | 12795027 | used for plating and selection of pSD1 and pSD2 |
| Monarch Gel Extraction Kit | NEB | T1020S | Used to extract the bands from the DNA gel |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | NEB | T1010S | Used to extract plasmid from the cells |
| pGEM T-easy | Promega | A1360 | used as suicide plasmid |
| S.O.C. | Invitrogen | 15544034 | used for recovery of cells after transformation |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma | S0899 | used for S.pneumoniae Transformation |
| Spectinomycin Hydrochloride | SigmaAldrich | PHR1426 | Used for bacterial selection |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Invitrogen | 18265017 | used for the creation of pSD1 and pSD2 |
References
- Bentley, S. D., et al. Genetic Analysis of the Capsular Biosynthetic Locus from All 90 Pneumococcal Serotypes. PLoS Genetics. 2 (3), 31 (2006).
- Calix, J. J., Nahm, M. H. A new pneumococcal serotype, 11E, has a variably inactivated wcjE gene. The Journal of Infectious Diseases. 202 (1), 29-38 (2010).
- Park, I. H., Pritchard, D. G., Cartee, R., Brandao, A., Brandileone, M. C. C., Nahm, M. H. Discovery of a New Capsular Serotype (6C) within Serogroup 6 of Streptococcus pneumoniae. Journal of Clinical Microbiology. 45 (4), 1225-1233 (2007).
- Jin, P., et al. First Report of Putative Streptococcus pneumoniae Serotype 6D among Nasopharyngeal Isolates from Fijian Children. The Journal of Infectious Diseases. 200 (9), 1375-1380 (2009).
- Oliver, M. B., vander Linden, M. P. G., Küntzel, S. A., Saad, J. S., Nahm, M. H. Discovery of Streptococcus pneumoniae Serotype 6 Variants with Glycosyltransferases Synthesizing Two Differing Repeating Units. Journal of Biological Chemistry. 288 (36), 25976-25985 (2013).
- Calix, J. J., et al. Serological Characterization of Two Capsule Subtypes among Streptococcus pneumoniae Serotype 20 Strains. Journal of Biological Chemistry. 287 (33), 27885-27894 (2012).
- Park, I. H., et al. and Serological Characterization of a New Pneumococcal Serotype, 6H, and Generation of a Pneumococcal Strain Producing Three Different Capsular Repeat Units. Clinical and Vaccine Immunology. 22 (3), 313-318 (2015).
- O'Brien, K. L., et al. Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates. The Lancet. 374 (9693), 893-902 (2009).
- Henriques-Normark, B., Tuomanen, E. I. The Pneumococcus: Epidemiology, Microbiology, and Pathogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 3 (7), 010215 (2013).
- Leimkugel, J., et al. An Outbreak of Serotype 1 Streptococcus pneumoniae Meningitis in Northern Ghana with Features That Are Characteristic of Neisseria meningitidis Meningitis Epidemics. The Journal of Infectious Diseases. 192 (2), 192-199 (2005).
- Yaro, S., et al. Epidemiological and Molecular Characteristics of a Highly Lethal Pneumococcal Meningitis Epidemic in Burkina Faso. Clinical Infectious Diseases. 43 (6), 693-700 (2006).
- Antonio, M., et al. Molecular epidemiology of pneumococci obtained from Gambian children aged 2-29 months with invasive pneumococcal disease during a trial of a 9-valent pneumococcal conjugate vaccine. BMC Infectious Diseases. 8 (1), 81 (2008).
- Kwambana-Adams, B. A., et al. An outbreak of pneumococcal meningitis among older children (≥5 years) and adults after the implementation of an infant vaccination programme with the 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in Ghana. BMC Infectious Diseases. 16 (1), 575 (2016).
- Antonio, M., et al. Seasonality and outbreak of a predominant Streptococcus pneumoniae serotype 1 clone from The Gambia: Expansion of ST217 hypervirulent clonal complex in West Africa. BMC Microbiology. 8 (1), 198 (2008).
- Staples, M., et al. Molecular characterization of an Australian serotype 1 Streptococcus pneumoniae outbreak. Epidemiology and Infection. 143 (2), 325-333 (2015).
- Gessner, B. D., Mueller, J. E., Yaro, S. African meningitis belt pneumococcal disease epidemiology indicates a need for an effective serotype 1 containing vaccine, including for older children and adults. BMC Infectious Diseases. 10 (1), 22 (2010).
- Hill, P. C., et al. Nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae in Gambian infants: a longitudinal study. Clinical Infectious Diseases. 46 (6), 807-814 (2008).
- Ebruke, C., et al. Temporal changes in nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae serotype 1 genotypes in healthy Gambians before and after the 7-valent pneumococcal conjugate vaccine. PeerJ. 3, 90 (2015).
- Adegbola, R. A., et al. Serotype and antimicrobial susceptibility patterns of isolates of Streptococcus pneumoniae causing invasive disease in The Gambia 1996-2003. Tropical Medicine and International Health. 11 (7), 1128-1135 (2006).
- Marks, L. R., Reddinger, R. M., Hakansson, A. P. High Levels of Genetic Recombination during Nasopharyngeal Carriage and Biofilm Formation in Streptococcus pneumoniae. mBio. 3 (5), (2012).
- Ritchie, N. D., Mitchell, T. J., Evans, T. J. What is different about serotype 1 pneumococci. Future Microbiology. 7 (1), 33-46 (2012).
- Harvey, R. M., et al. The variable region of pneumococcal pathogenicity island 1 is responsible for unusually high virulence of a serotype 1 isolate. Infection and Immunity. 84 (3), 822-832 (2016).
- Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. BioTechniques. 8 (5), 528-535 (1990).
- Alioing, G., Granadel, C., Morrison, D. A., Claverys, J. P. Competence pheromone, oligopeptide permease, and induction of competence in Streptococcus pneumoniae. Molecular Microbiology. 21 (3), 471-478 (1996).
- Lund, E. Enumeration and description of the strains belonging to the State Serum Institute, Copenhagen Denmark. , (1951).
- Barany, F., Tomasz, A. Genetic transformation of Streptococcus pneumoniae by heterologous plasmid deoxyribonucleic acid. Journal of Bacteriology. 144 (2), 698-709 (1980).
- Terra, V. S., Homer, K. A., Rao, S. G., Andrew, P. W., Yesilkaya, H. Characterization of novel β-galactosidase activity that contributes to glycoprotein degradation and virulence in Streptococcus pneumoniae. Infection and Immunity. 78 (1), (2010).
- Terra, V. S., Zhi, X., Kahya, H. F., Andrew, P. W., Yesilkaya, H. Pneumococcal 6-phospho-β-glucosidase (BglA3) is involved in virulence and nutrient metabolism. Infection and Immunity. 84 (1), (2015).
- Harvey, R. M., Ogunniyi, A. D., Chen, A. Y., Paton, J. C. Pneumolysin with Low Hemolytic Activity Confers an Early Growth Advantage to Streptococcus pneumoniae in the Blood. Infection and Immunity. 79 (10), 4122 (2011).
- Terra, V. S., Plumptre, C. D., Wall, E. C., Brown, J. S., Wren, B. W. Construction of a pneumolysin deficient mutant in Streptococcus pneumoniae serotype 1 strain 519/43 and phenotypic characterisation. Microbial Pathogenesis. 141, 103999 (2020).
