Summary
Ici, nous décrivons une souche 519/43 de sérotype 1 de S. pneumoniae qui peut être génétiquement modifiée en utilisant sa capacité à acquérir naturellement de l’ADN et un plasmide suicide. Comme preuve de principe, un mutant isogénique dans le gène de la pneumolysine (pli) a été fabriqué.
Abstract
Streptococcus pneumoniae sérotype 1 reste un énorme problème dans les pays à revenu faible ou intermédiaire, en particulier en Afrique subsaharienne. Malgré son importance, les études sur ce sérotype ont été entravées par le manque d’outils génétiques pour le modifier. Dans cette étude, nous décrivons une méthode pour modifier génétiquement un isolat clinique de sérotype 1 (souche 519/43). Fait intéressant, cela a été réalisé en exploitant la capacité du pneumocoque à acquérir naturellement de l’ADN. Cependant, contrairement à la plupart des pneumocoques, l’utilisation de l’ADN linéaire n’a pas été couronnée de succès; Pour muter cette souche importante, un plasmide suicide a dû être utilisé. Cette méthodologie a permis de mieux comprendre ce sérotype insaisissable, tant sur le plan biologique que pathogénique. Pour valider la méthode, la principale toxine pneumococcique connue, la pneumolysine, a été mutée car elle a un phénotype bien connu et facile à suivre. Nous avons montré que le mutant, comme prévu, a perdu sa capacité à lyser les globules rouges. En étant capable de muter un gène important dans le sérotype d’intérêt, nous avons pu observer différents phénotypes de mutants de perte de fonction sur les infections intrapéritonéales et intranasales de ceux observés pour d’autres sérotypes. En résumé, cette étude prouve que la souche 519/43 (sérotype 1) peut être génétiquement modifiée.
Introduction
Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae, le pneumocoque) est l’une des principales causes de morbidité et de mortalité dans le monde. Jusqu’à récemment, près de 100 sérotypes de S. pneumoniae ont été découverts 1,2,3,4,5,6,7. Chaque année, les pneumococcies invasives (IIP) font environ 700 000 morts chez les enfants de moins de 5 ans8. S. pneumoniae est la principale cause de pneumonie bactérienne, d’otite moyenne, de méningite et de septicémie dans le monde9.
Dans la ceinture africaine de la méningite, le sérotype 1 est responsable des flambées de méningite, où le type de séquence (ST) ST217, un type de séquence extrêmement virulent, est dominant 10,11,12,13,14,15. Son importance dans la pathologie de la méningite a été comparée à celle de Neisseria meningitidis dans la ceinture africaine de la méningite16. Le sérotype 1 est souvent la principale cause des IIP; Cependant, on le trouve très rarement en voiture. En fait, en Gambie, ce sérotype est responsable de 20% de toutes les maladies invasives, mais il n’a été trouvé que chez 0,5% des porteurs sains14,17,18,19. L’échange génétique et la recombinaison chez les pneumocoques compétents se produisent généralement en portage plutôt qu’en cas de maladie invasive20. De plus, il a été démontré que le sérotype 1 a l’un des taux de portage les plus courts décrits parmi les pneumocoques (seulement 9 jours). Par conséquent, il a été proposé que ce sérotype pourrait avoir un taux de recombinaison beaucoup plus faible que les autres21.
Des études approfondies sont nécessaires pour comprendre la raison du faible taux de portage des souches de sérotype 1 et son importance dans les maladies invasives en Afrique subsaharienne.
Nous rapportons ici un protocole qui permet la mutagénèse pangénomique d’une souche particulière de sérotype 1, 519/43. Cette souche peut facilement acquérir et recombiner un nouvel ADN dans son génome. Cette méthode n’est pas encore inter-déformation, mais elle est très efficace lorsqu’elle est réalisée en fond 519/43 (d’autres cibles ont été mutées, des manuscrits en préparation). En utilisant simplement la souche 519/43, en exploitant sa compétence naturelle, ainsi qu’en substituant la façon dont l’ADN exogène est fourni, nous avons pu muter le gène de la pneumolysine (pli) dans cette souche de sérotype 1. Cette méthode représente une amélioration par rapport à celle présentée par Harvey et coll.22 , car elle se fait en une seule étape sans qu’il soit nécessaire de faire passer l’ADN par un sérotype différent. Néanmoins, et en raison de la variabilité inter-déformation, aucune méthode n’a été normalisée pour toutes les souches. La capacité de muter des gènes spécifiques et d’observer ses effets permettra une compréhension approfondie des souches de S. pneumoniae de sérotype 1 et fournira des réponses sur le rôle de ces souches dans la méningite en Afrique subsaharienne.
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Protocol
1. Génération de l’amplicon mutant par SOE-PCR23 et amplification de la cassette de spectinomycine
- Commencer par effectuer la PCR pour l’amplification des bras d’homologie (pli 5' (488 pb) et pli3' (715 pb) respectivement) des régions flanquantes du gène pli de la souche 519/43. Utilisez les amorces plyFw1_NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG), ply5'R1_BamHI (CGAAATATAGACCAAAGGACGC GGATCC AGAACCAAACTTGACCTTGA), ply3'F1_BamHI (TCAAGGTCAAGTTTGGTTCTGGATCC GCGTCCTTTGGTCTATATTTCG) et plyRv2_NotI (TTTGCGGCCGCCATTTTCTACCTTATCCTCTACC).
- Utiliser les conditions PCR suivantes pour le pli 5': dénaturation à 94 °C pendant 60 s, étape 2: dénaturation à 94 °C pendant 30 s, étape 3: recuit à 58 °C pendant 30 s, étape 4: extension à 72 °C pendant 30 s, étape 5: revenir à l’étape 2 et répéter pendant 35 cycles, étape 6: extension finale à 72 °C pendant 30 s.
- Utiliser les mêmes conditions de PCR pour ply3' à l’exception du temps de prolongation aux étapes 4 et 6 où il devrait être de 60 s.
- Analyser les produits PCR par électrophorèse sur gel et exciser l’amplicon du gel.
- Purifier les amplicons PCR en suivant le protocole décrit dans les instructions du fabricant (Tableau des matériaux).
- Utilisez des quantités équimolaires des deux bras d’homologie comme modèles dans le SOE-PCR. Fusionner les deux amplicons à l’aide d’amorces plyFw1_ NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG) et plyRv2_NotI (TTTGCGGCCGCCATTTTCTACCTTATCCTCTCTACC).
- Utiliser les conditions SOE-PCR suivantes (étape 1: dénaturation à 94 °C pendant 2 min, étape 2: dénaturation à 94 °C pendant 30 s, étape 3: recuit à 58 °C pendant 30 s, étape 4: extension à 68 °C pendant 60 s, étape 5: revenir à l’étape 2 et répéter pendant 25 cycles, étape 6: extension finale à 68 °C pendant 90 s).
- Analyser le produit SOE-PCR par électrophorèse sur gel. Retirez-le du gel à l’aide d’un kit d’extraction de gel et suivez les instructions fournies.
- Amplifier la cassette de spectinomycine à partir du plasmide pR412 en utilisant les conditions de PCR suivantes : étape 1 : dénaturation à 94 °C pendant 60 s, étape 2 : dénaturation à 94 °C pendant 30 s, étape 3 : recuit à 55 °C pendant 30 s, étape 4 : extension à 68 °C pendant 60 s, étape 5 : retour à l’étape 2 et répétition pendant 25 cycles, étape 6: extension finale à 68 °C pendant 60 s.
- Utilisez les amorces BamHI_SP2F2 (GGATCC CTA GAA CTA GTG GAT CCC CC) et BamHI_SP2R2 (GGATCC AAT TCT GCA GAT TTT AC ATG ATC). Le plasmide pR412 a été acquis auprès du Dr Marc PrudHomme (CNRS-Université Paul Sabatier Toulouse France).
- Analyser les amplicons PCR par électrophorèse sur gel. Extrayez et purifiez l’amplicon PCR résultant comme décrit ci-dessus.
2. Génération du plasmide pSD1 et transformation chimique d’E. coli Dh5α
- Effectuer une ligature en suivant les instructions du fabricant du système pGEMT-easy I (Table des matériaux). Dans un tube microcentrifugé, ajouter 5 μL de tampon de ligature 2x, 1 μL de pGEMTeasy, 2 μL du produit ply_SOE, 1 μL d’ADN ligase T4 et de l’eau pour un volume total de 20 μL. Incuber pendant une nuit à 4 °C. Cela génère un plasmide pSD1.
- Transformer E. coli Dh5α chimiquement compétent avec pSD1. Commencez par incuber 50 μL d’E. coli Dh5α chimiquement compétent avec 3 μL de réaction de ligature pSD1 pendant 15 minutes sur de la glace. Continuez ensuite en exposant les cellules à un choc thermique (42 °C, 30 s). Placez les cellules sur de la glace pendant 2 min.
- Retirer les cellules de la glace et ajouter 350 μL de milieu S.O.C. Incuber la culture pendant 2 h à 37 °C, 120 tr/min.
- Plaquer la transformation sur gélose Luria Bertani (LBA) complétée par 0,4 mM IPTG, 0,24 mg/mL X-Gal pour la sélection bleu/blanc et 100 μg/mL d’ampicilline pour s’assurer que toutes les colonies qui poussent dans la plaque ont le squelette plasmidique. Les colonies blanches contiennent du pSD1.
- Choisir trois colonies blanches et mettre en place des excroissances pendant la nuit dans 10 mL de LB, complétées par 100 μg/mL d’ampicilline. Incuber les cultures pendant la nuit à 37 °C en agitant les cultures.
- Le lendemain, centrifuger les cultures à 3 082 x g et utiliser la pastille pour l’extraction plasmidique.
3. Extraction de l’ADN plasmidique, digestion de restriction du gène pSD1 et spectinomycine et assemblage de pSD2
- Extraire l’ADN plasmidique en suivant les instructions fournies avec la trousse commerciale (Tableau des matériaux).
- Mettre en place une digestion de restriction BamHI pour le plasmide pSD1 et la cassette de spectinomycine précédemment amplifiée et purifiée. Utilisez les conditions et les quantités suivantes décrites dans le tableau 1.
- Incuber les réactions de digestion de restriction et les contrôles à 37 °C pendant 3 h.
- Analyser la restriction digérée par électrophorèse, exciser la bande et purifier en suivant les instructions fournies avec le kit commercial (Tableau des matériaux).
- Ensuite, préparez une réaction de ligature en suivant les instructions du fabricant (tableau des matériaux) en utilisant le pSD1 et la spectinomycine digérés par BamHI (à partir de l’étape 3.2). Dans un tube microcentrifugé, ajouter les composants de réaction suivants : 5 μL de tampon de ligature 2x, 2 μL de pSD1, 2 μL de cassette de spectinomycine, 1 μL d’ADN ligase T4 et incuber pendant une nuit à 4 °C. Cela génère un plasmide pSD2.
- Transformer le plasmide pSD2 en E. coli Dh5α chimiquement compétent comme décrit à l’étape 2.2.
- Sélectionner les transformants porteurs du plasmide pSD2 en fonction de leur capacité à se développer dans le LBA supplémenté en 100 μg/mL de spectinomycine et d’ampicilline.
- Effectuer une extraction d’ADN plasmidique (pSD2) comme décrit ci-dessus et en suivant les instructions du fabricant (μL).
4. Transformation de la souche 519/43 de S. pneumoniae
- Préparer une culture nocturne de S. pneumoniae 519/43 dans BHI et laisser pousser statiquement à 37 °C, 5% CO2.
- Le lendemain, diluer les cultures 1:50 et 1:100 dans 10 ml de bouillon BHI frais. Incuber les cultures statiquement à 37 °C jusqu’à ce que la DO595 nm soit comprise entre 0,05 et 0,1 (acquisition optimale de l’ADN plus proche de 0,1 OD).
- Une fois qu’une DO de 0,1 est atteinte, prendre 860 μL et transférer dans un tube de microcentrifugeuse. Dans ce même tube microcentrifugé, ajouter : 100 μL de NaOH 100 mM, 10 μL de BSA à 20 % (p/v), 10 μL de CaCl2 100 mM, 2 μL de CSP124 à 50 ng/mL et 500 ng de pSD2.
- Incuber statiquement la réaction à 37 °C pendant 3 h.
- Plaquer 330 μL sur des plaques de gélose au sang (BA) à 5 % complétées par 100 μg/mL de spectinomycine, toutes les heures pendant les 3 heures d’incubation.
- Incuber les plaques pendant une nuit à 37 °C, 5% CO2. Appliquer des colonies résistantes à la spectinomycine sur une autre plaque de BA additionnée de spectinomycine à 100 μg/mL ainsi que sur des plaques de BA additionnées de 100 μg/mL d’ampicilline. Incuber les deux jeux d’assiettes pendant la nuit dans les conditions énoncées ci-dessus. Les plaques d’ampicilline doivent tester la présence du squelette plasmidique.
- Confirmer la présence de la cassette de spectinomycine par PCR à l’aide d’amorces plyFw1_ NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG) et SPEC_REV (TAATTCCTCTAAGTCATAATTTCCG). Confirmer la mutation par PCR à l’aide des amorces plySCN1 (CCAATGGAAATCGCTAGGCAAGAGATAA) et plySCN2 (ATTACTTAGTCCAACCACGGCTGAT) qui se fixent à l’extérieur de la région mutée.
- Confirmer l’intégration à l’emplacement correct du génome par séquençage à l’aide des amorces plySCN1 (CCAATGGAAATCGCTAGGCAAGAGATAA), plySCN2 (ATTACTTAGTCCAACCACGGCTGAT), ainsi que des amorces avec leur site de liaison dans la cassette de spectinomycine sqr1 (CCTGATCCAAACATGTAAGTAGTACC) sqf2 (CGTAGTTATCTTGGAGAGAATA) spec_sqf1 (GGTACTTACATGTTTGGATCAGG ) et spec_sqr2 TATTCTCTCCAAGATAACTACG.
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Representative Results
Le protocole décrit ici commence par l’utilisation de la PCR pour amplifier les bras d’homologie gauche et droit, tout en supprimant simultanément 191 pb de la région médiane du gène du pli . Lors de l’exécution de la PCR, un site BamHI est introduit au 3' du bras d’homologie gauche et à l’extrémité 5' du bras d’homologie droit (Figure 1A). Ceci est suivi par PCR-SOE où les bras d’homologie gauche et droite sont fusionnés en un amplicon (Figure 1B). Cet amplicon SOE-PCR est ensuite cloné dans pGEMTeasy en utilisant le clonage TA pour générer le plasmide pSD1 (Figure 1C). Une transformation réussie donnera des colonies blanches résistantes à l’ampicilline. Toutes les colonies bleues seront des transformants contenant un plasmide pGEMTeasy vide. pSD1 sera ensuite digéré au site BamHI qui a été introduit au moment de la SOE-PCR (Figure 1D) et ligaturé sur une cassette de spectinomycine (également digérée BamHI à des fins compatibles). Le nouveau plasmide est appelé pSD2 (Figure 1E). L’assemblage correct de pSD2 est confirmé par digestion de restriction (Figure 2A). pSD2, qui fonctionne comme un plasmide suicide puisqu’il ne contient pas d’origine de réplication compatible à Gram positif, a été utilisé pour transformer 519/43WT (précédemment préparé pour être compétent). Les transformants positifs sont des colonies qui se développent avec 100 μg/mL de spectinomycine après une incubation d’une nuit. Toutes les colonies sont rapiécées sur des plaques de base de gélose au sang fraîche supplémentées avec 100 μg/mL de spectinomycine ainsi que sur une base de gélose au sang additionnée de 100 μg/mL d’ampicilline. Toutes les colonies qui se développent sur les deuxièmes plaques de nuit supplémentées en spectinomycine sont des points positifs possibles. Toutes les colonies qui se développent sur des plaques d’ampicilline indiqueront l’intégration du plasmide complet ou la recombinaison de la cassette d’ampicilline ailleurs dans le génome. Jusqu’à présent et en utilisant la souche 519/43, aucune colonie ne s’est développée sur les plaques supplémentées en ampicilline. Toutes les colonies positives par PCR doivent être confirmées par séquençage (Figure 2C) pour évaluer et confirmer l’emplacement de l’insertion. À cette fin, les amorces doivent avoir leur site de liaison en dehors de la région d’homologie (Figure 2C). La cible choisie a un phénotype très marqué (hémolyse des globules rouges (GR)), et donc la mutation peut également être confirmée phénotypiquement (Figure 2B). Le mutant a perdu sa capacité à lyser les globules rouges.
| Composants | Réaction (μL) | Contrôle (μL) | Réaction (μL) | Contrôle (μL) |
| Tampon | 2 | 2 | 2 | 2 |
| pSD1 | 4 | 4 | - | |
| Cassette de spectinomycine | - | - | 6 | 6 |
| BamHI-HF | 1 | - | 1 | - |
| Eau | 13 | 14 | 11 | 12 |
| Total Volume | 20 | 20 | 20 | 20 |
Tableau 1 : Composants de réaction de digestion de restriction pour la cassette de pSD1 et de spectinomycine.
Figure 1 : Vue d’ensemble de la stratégie de mutagénèse. A) Amplification des bras d’homologie (Ply3' et Ply5' (voies 2 à 5); et épissage par chevauchement Extension PCR (voies 6 et 7). L- hyperéchelle I (Bioline), voie 1- contrôle négatif pour la réaction, bras d’homologie lane 2 et 3- ply5' (488 bp) et ply3' (715 bp) amplifiés à partir de D39 gDNA, voies 4 et 5- ply5' (488 bp) et ply3' (715 bp) bras d’homologie amplifiés à partir de 519/43 gDNA. Voie de droite 6- D39 SOE PCR produit, voie 7- 519/43 SOE PCR produit (1235 pb). B) Schéma illustrant la construction finale SOE-PCR obtenue (ply_SOE); Les amorces utilisées pour obtenir la région d’homologie entre les deux bras d’homologie ainsi que la digestion de restriction choisie sont indiquées par des flèches. C) Plasmide pSD1, représentant le clonage de ply_SOE; D) Digestion de restriction de la cassette pSD1 et spectinomycine. E) Construction finale pSD2 qui est ensuite utilisée comme plasmide suicide pour transformer S. pneumoniae. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : A) Confirmation de la présence de la cassette de spectinomycine dans pSD2. L- hyperéchelle 1kb (Bioline); 1- pSD1 digéré avec BamHI; 2-pSD2 digéré avec BamHI; L hyperéchelle 1 kb (Bioline); 3- Cassette de spectinomycine amplifiée à partir de pR412, cassette de spectinomycine 4- digérée avec BamHI ; B) Confirmation phénotypique de la mutation de la pneumolysine par détermination de l’activité hémolytique pour D39, 519/43WT et 519/43Δply mutant. Cela a été comparé à l’hémolyse des globules rouges par 0,5% de saponine. L’hémolyse dérivée de la saponine est considérée à 100% et les taux pour 519/43Wt et 519/43Δply ont été calculés en fonction de celle-ci. Chaque point de données est la moyenne de 5 réplications techniques et de 3 réplications biologiques. C) Données de séquençage cartographiées à la région du génome mutant où la pneumolysine a été interrompue. Les amorces sont indiquées par des flèches et par leur nom. PLYSCN1 et PLYSCN2 se lient en dehors des bras d’homologie. Le séquençage obtenu à partir des amorces PLYSCN1 et 2 a montré qu’il y avait une séquence ininterrompue des régions voisines en dehors de la zone d’homologie jusqu’à la cassette de spectinomycine, démontrant l’insertion dans le génome. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Streptococcus pneumoniae, en particulier le sérotype 1, continue d’être une menace mondiale causant des pneumococcies invasives et la méningite. Malgré l’introduction de divers vaccins qui devraient protéger contre le sérotype 1, en Afrique, ce sérotype est encore capable de provoquer des épidémies entraînant une morbidité et une mortalité élevées13. La capacité de manipuler génétiquement ce sérotype est d’une importance cruciale en raison de sa pertinence clinique. La méthode décrite dans cette étude permet la manipulation génétique d’une souche représentative au sein de ce sérotype. Une souche invasive 519/43 (ST5316), un isolat clinique provenant d’une méningite au Danemark25.
La méthodologie présentée ici a été couronnée de succès principalement en raison de la souche choisie car elle peut acquérir de l’ADN exogène, mais aussi en raison des modifications apportées aux protocoles traditionnels utilisés pour la transformation de S. pneumoniae , un taux de réussite typique de notre protocole de transformation est d’environ 70%.
Avec cette méthodologie, il est primordial d’utiliser un plasmide suicide au lieu de l’ADN linéaire habituel. Classiquement, l’ADN linéaire26,27,28 aurait été utilisé; cependant, toutes les tentatives d’utilisation de l’ADN exogène sous cette forme ont été infructueuses. En outre, les tentatives d’exploitation de la compétence naturelle de S. pneumoniae 519/43 à une absorbance inférieure n’ont pas abouti. Le dépannage a démontré que la compétence naturelle pour la souche 519/43 était plus élevée lorsque la DO595 était de 0,1, ce qui est différent des données observées pour d’autres sérotypes de S. pneumoniae où la compétence naturelle la plus élevée a été observée à une très faible DO24.
Afin de valider la méthode, un mutant de pneumolysine a été construit parce qu’il présente un phénotype facile à suivre; Cependant, pour prouver que la méthode peut être appliquée à n’importe quel gène de cette souche, d’autres gènes ont été ciblés avec succès (manuscrits en préparation). Une telle méthode, utilisant un vecteur suicide qui n’a pas d’origine compatible à Gram positif, pourrait également être utilisée pour la complémentation chromosomique, la surexpression de gènes d’intérêt, ainsi que l’introduction de systèmes rapporteurs, le tout en utilisant les gènes voisins comme régions d’homologie.
L’expansion des outils génétiques à la souche 519/43 de S. pneumoniae sérotype 1 est importante parce que nous pouvons maintenant manipuler génétiquement directement des souches représentatives. La souche 519/43 est intéressante car elle est génétiquement souple, pathogène car elle a été isolée chez un patient méningite, et sa manipulation fournira des indices pour mieux comprendre le développement et l’établissement de la méningite. Auparavant, la compréhension de certains déterminants au sein de l’espèce se faisait en insérant le gène en question dans l’une des souches très bien caractérisées de S. pneumoniae, comme D39 (sérotype 2). Une telle approche a été utilisée par Paton et coll., en raison des difficultés liées à la mutagénèse sur le sérotype 129. Les résultats rapportés par eux sur D39 portant un allèle moins hémolytique de sérotype 1 par rapport au pli 519/43 ∆ diffèrent de ceux présentés par nous30 , soulignant l’importance de pouvoir muter un gène dans le contexte de la souche d’origine. Plus tard, le même groupe a pu muter une souche 22 du sérotypeA non lignée. Fait intéressant, leur protocole est assez distinct du nôtre, car il s’agit d’une approche en deux étapes qui exige que la mutation soit d’abord effectuée dans les souches de sérotype 2 et qu’elle soit ensuite utilisée comme modèle pour être transformée dans leur souche de sérotype 1.
Actuellement, il y a une limite dans la méthode présentée. Pour l’instant, cette méthode ne fonctionne que pour la souche représentative 519/43. Le même protocole exact a été essayé dans d’autres souches, à savoir les isolats cliniques de ST3081 et ST303 et il n’a pas réussi. En outre, l’électroporation comme méthode d’administration de l’ADN exogène à la cellule a également été tentée sur les trois types de séquences, avec des résultats positifs observés seulement pour 519/43. L’élargissement et la normalisation de la méthodologie à toutes les souches de sérotype 1 sont d’une importance primordiale, car il existe une énorme variabilité au sein du groupe. Des études sont actuellement en cours pour étendre l’applicabilité de la méthode à toutes les souches du sérotype 1.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier le Meningitis Trust et le MRC d’avoir financé ce travail.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AccuPrime Pfx DNA polymerase | Invitrogen | 12344024 | Used for amplification of the fragments |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A9518 | Used for bacterial selection on stage 1(pSD1) |
| Blood Agar Base | Oxoid | CM0055 | Used to plate S. pneumoniae transformants |
| Bovine Serum Albumine | sigma | 55470 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Brain Heart Infusion | Oxoid | CM1135 | used to grow S. pneumoniae cells |
| Calcium Chloride Cacl2 | Sigma | 449709 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Competence stimulating peptide 1 | AnaSpec | AS-63779 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Luria Broth Agar | Gibco | 22700025 | used for plating and selection of pSD1 and pSD2 |
| Luria Broth Base (Miller's formulation) | Gibco | 12795027 | used for plating and selection of pSD1 and pSD2 |
| Monarch Gel Extraction Kit | NEB | T1020S | Used to extract the bands from the DNA gel |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | NEB | T1010S | Used to extract plasmid from the cells |
| pGEM T-easy | Promega | A1360 | used as suicide plasmid |
| S.O.C. | Invitrogen | 15544034 | used for recovery of cells after transformation |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma | S0899 | used for S.pneumoniae Transformation |
| Spectinomycin Hydrochloride | SigmaAldrich | PHR1426 | Used for bacterial selection |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Invitrogen | 18265017 | used for the creation of pSD1 and pSD2 |
References
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