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Immunology and Infection

Konstruktion von Mutanten im Serotyp 1 Streptococcus pneumoniae Stamm 519/43

Published: September 11, 2020 doi: 10.3791/61594
Automatic Translation
1, 2, 3, 2, 1
1Faculty of Infections and Tropical Diseases, Department of Infection Biology, London School of Hygiene and Tropical Medicine, 2Division of Medicine, University College London, 3Division of Infection and Immunity, University College London UCL

Summary

Hier beschreiben wir einen S. pneumoniae Serotyp 1 Stamm 519/43, der genetisch verändert werden kann, indem er seine Fähigkeit nutzt, DNA und ein Suizid-Plasmid auf natürliche Weise zu erwerben. Als Prinzipienbeweis wurde eine isogene Mutante im Pneumolysin-Gen (Ply) hergestellt.

Abstract

Streptococcus pneumoniae Serotyp 1 ist nach wie vor ein großes Problem in Ländern mit niedrigem und mittlerem Einkommen, insbesondere in Afrika südlich der Sahara. Trotz seiner Bedeutung wurden Studien zu diesem Serotyp durch den Mangel an genetischen Werkzeugen behindert, um ihn zu modifizieren. In dieser Studie beschreiben wir eine Methode zur genetischen Modifikation eines klinischen Serotyp-1-Isolats (Stamm 519/43). Interessanterweise wurde dies erreicht, indem die Fähigkeit der Pneumokokken ausgenutzt wurde, DNA auf natürliche Weise zu erwerben. Im Gegensatz zu den meisten Pneumokokken war die Verwendung von linearer DNA jedoch nicht erfolgreich; Um diesen wichtigen Stamm zu mutieren, musste ein Selbstmord-Plasmid verwendet werden. Diese Methodik hat die Mittel für ein tieferes Verständnis dieses schwer fassbaren Serotyps geschaffen, sowohl in Bezug auf seine Biologie als auch auf seine Pathogenität. Um die Methode zu validieren, wurde das wichtigste bekannte Pneumokokken-Toxin, Pneumolysin, mutiert, da es einen bekannten und leicht zu verfolgenden Phänotyp aufweist. Wir zeigten, dass die Mutante erwartungsgemäß ihre Fähigkeit verlor, rote Blutkörperchen zu lysieren. Indem wir in der Lage waren, ein wichtiges Gen im interessierenden Serotyp zu mutieren, konnten wir verschiedene Phänotypen für Funktionsverlustmutanten bei intraperitonealen und intranasalen Infektionen beobachten, die für andere Serotypen beobachtet wurden. Zusammenfassend belegt diese Studie, dass der Stamm 519/43 (Serotyp 1) genetisch verändert werden kann.

Introduction

Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae, der Pneumokokkus) ist weltweit eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität. Bis vor kurzem wurden fast 100 Serotypen von S. pneumoniae entdeckt 1,2,3,4,5,6,7. Jährlich sterben rund 700.000 Kinder unter 5 Jahrenan der invasiven Pneumokokkenerkrankung (IPD) 8. S. pneumoniae ist weltweit die Hauptursache für bakterielle Pneumonie, Mittelohrentzündung, Meningitis und Septikämie9.

Im afrikanischen Meningitis-Gürtel ist Serotyp 1 für Meningitis-Ausbrüche verantwortlich, bei denen der Sequenztyp (ST) ST217, ein extrem virulenter Sequenztyp, 10,11,12,13,14,15 dominant ist. Seine Bedeutung in der Meningitis-Pathologie wurde mit der von Neisseria meningitidis im afrikanischen Meningitis-Gürtelverglichen 16. Serotyp 1 ist oft die Hauptursache für IPD; Es ist jedoch sehr selten in der Kutsche zu finden. Tatsächlich ist dieser Serotyp in Gambia für 20% aller invasiven Erkrankungen verantwortlich, wurde jedoch nur bei 0,5% der gesunden Träger gefunden14,17,18,19. Genetischer Austausch und Rekombination in kompetenten Pneumokokken erfolgt im Allgemeinen eher bei der Beförderung als bei invasiven Erkrankungen20. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Serotyp 1 eine der kürzesten Trageraten aufweist, die bei Pneumokokken beschrieben wurden (nur 9 Tage). Daher wurde vorgeschlagen, dass dieser Serotyp eine viel niedrigere Rekombinationsrate aufweisen könnte als andere21.

Eingehende Studien sind notwendig, um den Grund für die niedrige Beförderungsrate von Serotyp-1-Stämmen und ihre Bedeutung für invasive Erkrankungen in Afrika südlich der Sahara zu verstehen.

Hier berichten wir über ein Protokoll, das eine genomweite Mutagenese eines bestimmten Serotyp-1-Stammes ermöglicht, 519/43. Dieser Stamm kann leicht neue DNA erwerben und in sein Genom rekombinieren. Diese Methode ist noch nicht übergreifend, aber sie ist sehr effizient, wenn sie im 519/43-Hintergrund durchgeführt wird (andere Ziele wurden mutiert, Manuskripte sind in Vorbereitung). Durch die einfache Verwendung des 519/43-Stammes und die Nutzung seiner natürlichen Kompetenz sowie die Substitution der Art und Weise, wie die exogene DNA bereitgestellt wird, konnten wir das Pneumolysin-Gen (ply) in diesem Serotyp-1-Stamm mutieren. Diese Methode stellt eine Verbesserung gegenüber der von Harvey et al.22 vorgestellten Methode dar, da sie in einem Schritt durchgeführt wird, ohne dass die DNA durch einen anderen Serotyp geleitet werden muss. Nichtsdestotrotz und aufgrund der Variabilität zwischen den Stämmen wurde keine Methode für alle Stämme standardisiert. Die Fähigkeit, bestimmte Gene zu mutieren und ihre Auswirkungen zu beobachten, wird ein tiefgreifendes Verständnis der Serotyp 1 S. pneumoniae-Stämme ermöglichen und Antworten auf die Rolle dieser Stämme bei Meningitis in Afrika südlich der Sahara liefern.

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Protocol

1. Erzeugung des mutierenden Amplikons mittels SOE-PCR23 und Amplifikation der Spectinomycin-Kassette

  1. Beginnen Sie mit der Durchführung einer PCR zur Amplifikation der Homologiearme (Ply 5' (488 bp) bzw. Ply3' (715 bp)) der flankierenden Regionen des Ply-Gens aus dem Stamm 519/43. Verwenden Sie die Primer plyFw1_NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG), ply5'R1_BamHI (CGAAATATAGACCAAAGGACGC GGATCC AGAACCAAACTTGACCTTGA), ply3'F1_BamHI (TCAAGGTCAAGTTTGGTTCTCTGGATCC GCGTCCTTTGGTCTATATTTCG) und plyRv2_NotI (TTTGCGGCCGCCATTTTCTCTCTTATCCTCTACC).
  2. Verwenden Sie die folgenden PCR-Bedingungen für Schicht5': Denaturierung bei 94 °C für 60 s, Schritt 2: Denaturierung bei 94 °C für 30 s, Schritt 3: Glühen bei 58 °C für 30 s, Schritt 4: Verlängerung bei 72 °C für 30 s, Schritt 5: Zurück zu Schritt 2 und Wiederholung für 35 Zyklen, Schritt 6: endgültige Verlängerung bei 72 °C für 30 s.
    1. Verwenden Sie die gleichen PCR-Bedingungen für ply3' mit Ausnahme der Verlängerungszeit in Schritt 4 und Schritt 6, wo sie 60 s betragen sollte.
  3. Analysieren Sie die PCR-Produkte durch Gelelektrophorese und entfernen Sie das Amplikon aus dem Gel.
  4. Reinigen Sie die PCR-Amplikons gemäß dem Protokoll, das in den Anweisungen des Herstellers (Materialtabelle) beschrieben ist.
  5. Verwenden Sie äquimolare Mengen beider Homologiearme als Vorlagen in der SOE-PCR. Verschmelzen Sie die beiden Amplikons mit den Primern plyFw1_ NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG) und plyRv2_NotI (TTTGCGGCCGCCATTTTCTCTCTCTTATCCTCTACC).
  6. Verwenden Sie die folgenden SOE-PCR-Bedingungen (Schritt 1: Denaturierung bei 94 °C für 2 min, Schritt 2: Denaturierung bei 94 °C für 30 s, Schritt 3: Glühen bei 58 °C für 30 s, Schritt 4: Verlängerung bei 68 °C für 60 s, Schritt 5: Zurück zu Schritt 2 und Wiederholung für 25 Zyklen, Schritt 6: endgültige Verlängerung bei 68 °C für 90 s).
  7. Analysieren Sie das SOE-PCR-Produkt durch Gelelektrophorese. Entfernen Sie es mit einem Gel-Extraktionskit aus dem Gel und befolgen Sie die Anweisungen.
  8. Amplifizieren Sie die Spectinomycin-Kassette aus dem Plasmid pR412 unter den folgenden PCR-Bedingungen: Schritt 1: Denaturierung bei 94 °C für 60 s, Schritt 2: Denaturierung bei 94 °C für 30 s, Schritt 3: Glühen bei 55 °C für 30 s, Schritt 4: Verlängerung bei 68 °C für 60 s, Schritt 5: Gehen Sie zurück zu Schritt 2 und wiederholen Sie den Vorgang für 25 Zyklen, Schritt 6: Endverlängerung bei 68 °C für 60 s.
    1. Verwenden Sie die Primer BamHI_SP2F2 (GGATCC, CTA, GAA, CTA, GTG, GAT, CCC, CC) und BamHI_SP2R2 (GGATCC, AA, TCT, TCT, GCA, GAT, TTT, AC, ATG, ATC, ATC). Das Plasmid pR412 wurde von Dr. Marc PrudHomme (CNRS-Université Paul Sabatier, Toulouse, Frankreich) erworben.
  9. Analysieren Sie die PCR-Amplikons durch Gelelektrophorese. Das resultierende PCR-Amplikon wird wie oben beschrieben entfernt und gereinigt.

2. Erzeugung des Plasmids pSD1 und chemische Umwandlung von E. coli Dh5α

  1. Führen Sie eine Ligatur gemäß den Herstellerangaben des pGEMT-easy system I (Materialtabelle) durch. In einem Mikrozentrifugenröhrchen werden 5 μl 2x Ligationspuffer, 1 μl pGEMTeasy, 2 μl des ply_SOE Produkts, 1 μl T4-DNA-Ligase und Wasser zu einem Gesamtvolumen von 20 μl gegeben. Über Nacht bei 4 °C inkubieren. Dadurch entsteht das Plasmid pSD1.
  2. Transformieren Sie chemisch kompetente E. coli Dh5α mit pSD1. Beginnen Sie mit der Inkubation von 50 μl chemisch kompetentem E. coli Dh5α mit 3 μl pSD1-Ligationsreaktion für 15 Minuten auf Eis. Anschließend werden die Zellen einem thermischen Schock (42 °C, 30 s) ausgesetzt. Legen Sie die Zellen für 2 Minuten auf Eis.
  3. Entfernen Sie die Zellen aus dem Eis und fügen Sie 350 μl S.O.C.-Medien hinzu. Inkubation der Kultur für 2 h bei 37 °C, 120 U/min.
  4. Platte der Transformation auf Luria Bertani Agar (LBA) ergänzt mit 0,4 mM IPTG, 0,24 mg/ml X-Gal für die Blau/Weiß-Selektion und 100 μg/ml Ampicillin, um sicherzustellen, dass alle in der Platte wachsenden Kolonien das Plasmid-Rückgrat haben. Weiße Kolonien enthalten pSD1.
  5. Wählen Sie drei weiße Kolonien und richten Sie über Nacht ein Wachstum in 10 ml LB ein, ergänzt mit 100 μg/ml Ampicillin. Die Kulturen werden über Nacht bei 37 °C unter Schütteln inkubiert.
  6. Am nächsten Tag zentrifugieren Sie die Kulturen bei 3.082 x g und verwenden Sie das Pellet zur Plasmidextraktion.

3. Plasmid-DNA-Extraktion, Restriktionsverdau von pSD1 und Spectinomycin-Gen und Assemblierung von pSD2

  1. Extrahieren Sie die Plasmid-DNA gemäß den Anweisungen, die mit dem kommerziellen Kit geliefert werden (Materialtabelle).
  2. Richten Sie einen BamHI-Restriktionsaufschluss sowohl für das pSD1-Plasmid als auch für die zuvor amplifizierte und gereinigte Spectinomycin-Kassette ein. Verwenden Sie die folgenden Bedingungen und Mengen, die in Tabelle 1 beschrieben sind.
  3. Inkubation der Restriktionsaufschlussreaktionen und Kontrollen bei 37 °C für 3 h.
  4. Analysieren Sie den Restriktionsaufschluss durch Elektrophorese, entfernen Sie die Bande und reinigen Sie sie gemäß den Anweisungen, die mit dem handelsüblichen Kit geliefert werden (Materialtabelle).
  5. Als nächstes bereiten Sie eine Ligationsreaktion gemäß den Anweisungen des Herstellers (Materialtabelle) unter Verwendung des BamHI-verdauten pSD1 und Spectinomycin (aus Schritt 3.2) vor. In einem Mikrozentrifugenröhrchen die folgenden Reaktionskomponenten zugeben: 5 μl 2x Ligationspuffer, 2 μL pSD1, 2 μl Spectinomycin-Kassette, 1 μl T4-DNA-Ligase und über Nacht bei 4 °C inkubieren. Dadurch entsteht das Plasmid pSD2.
  6. Umwandlung des Plasmids pSD2 in chemisch kompetentes E. coli Dh5α, wie in Schritt 2.2 beschrieben.
  7. Wählen Sie die Transformanten, die das Plasmid pSD2 tragen, basierend auf ihrer Fähigkeit aus, in LBA zu wachsen, das mit 100 μg/ml Spectinomycin und Ampicillin ergänzt wird.
  8. Führen Sie eine Plasmid-DNA-Extraktion (pSD2) wie oben beschrieben und gemäß den Anweisungen des Herstellers (μl) durch.

4. Transformation des Stammes 519/43 von S. pneumoniae

  1. Bereiten Sie eine Nachtkultur von S. pneumoniae 519/43 in BHI vor und lassen Sie sie bei 37 °C, 5% CO2 statisch wachsen.
  2. Am nächsten Tag werden die Kulturen 1:50 und 1:100 in 10 ml frischer BHI-Brühe verdünnt. Inkubieren Sie die Kulturen statisch bei 37 °C, bis der OD595 nm zwischen 0,05 und 0,1 liegt (optimale DNA-Erfassung näher an 0,1 OD).
  3. Sobald ein OD von 0,1 erreicht ist, nehmen Sie 860 μl und füllen Sie es in ein Mikrozentrifugenröhrchen um. In dasselbe Mikrozentrifugenröhrchen geben Sie: 100 μl 100 mM NaOH, 10 μl 20% (w/v) BSA, 10 μl 100 mM CaCl 2,2 μl 50 ng/ml CSP124 und 500 ng pSD2.
  4. Die Reaktion wird statisch bei 37 °C für 3 h inkubiert.
  5. Platte 330 μl auf 5% Blutagarplatten (BA), ergänzt mit 100 μg/ml Spectinomycin, stündlich über die 3 Inkubationsstunden.
  6. Inkubation der Platten über Nacht bei 37 °C, 5% CO2. Patchen Sie Spectinomycin-resistente Kolonien auf eine andere BA-Platte, die mit 100 μg/ml Spectinomycin ergänzt wurde, sowie auf BA-Platten, die mit 100 μg/ml Ampicillin ergänzt wurden. Inkubieren Sie beide Plattensätze über Nacht unter den oben genannten Bedingungen. Die Ampicillinplatten sollen auf das Vorhandensein des Plasmidrückgrats getestet werden.
  7. Bestätigen Sie das Vorhandensein der Spectinomycin-Kassette durch PCR unter Verwendung der Primer plyFw1_ NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG) und SPEC_REV (TAATTCCTCTAAGTCATAATTTCCG). Bestätigen Sie die Mutation durch PCR mit den Primern plySCN1 (CCAATGGAAATCGCTAGGCAAGAGATAA) und plySCN2 (ATTACTTAGTCCAACCACCCTGAT), die außerhalb der mutierten Region anhaften.
  8. Bestätigen Sie die Integration an der richtigen Stelle des Genoms durch Sequenzierung mit den Primern plySCN1 (CCAATGGAAATCGCTAGGCAAGAGATAA), plySCN2 (ATTACTTAGTCCAACCACGGCTGAT) sowie Primern mit ihrer Bindungsstelle in der Spectinomycin-Kassette sqr1 (CCTGATCCAAACATGTAAGTACCACC), sqf2 (CGTAGTTATCTTGGAGAGAATA) spec_sqf1 (GGTACTTACATGTTTGGATCAGG) und spec_sqr2 TATTCTCTCCAAGATAACTACG.

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Representative Results

Das hier beschriebene Protokoll beginnt mit der Verwendung von PCR zur Amplifikation des linken und rechten Homologiearms, während gleichzeitig 191 bp aus der mittleren Region des Lagengens gelöscht werden. Während der Durchführung der PCR wird eine BamHI-Stelle am 3'-Ende des linken Homologiearms und am 5'-Ende des rechten Homologiearms eingeführt (Abbildung 1A). Darauf folgt die PCR-SOE, bei der linke und rechte Homologiearme zu einem Amplikon fusioniert werden (Abbildung 1B). Dieses SOE-PCR-Amplikon wird dann mittels TA-Klonierung in pGEMTeasy kloniert, um das Plasmid pSD1 zu erzeugen (Abbildung 1C). Eine erfolgreiche Transformation führt zu weißen Kolonien, die gegen Ampicillin resistent sind. Alle blauen Kolonien sind Transformanten, die ein leeres pGEMTeasy-Plasmid enthalten. pSD1 wird dann an der BamHI-Stelle verdaut, die zum Zeitpunkt der SOE-PCR eingeführt wurde (Abbildung 1D) und an eine Spectinomycin-Kassette ligiert (ebenfalls BamHI für kompatible Enden verdaut). Das neue Plasmid wird als pSD2 bezeichnet (Abbildung 1E). Die korrekte Assemblierung von pSD2 wird durch Restriktionsaufschluss bestätigt (Abbildung 2A). pSD2, das als Selbstmord-Plasmid wirkt, da es keinen grampositiv-kompatiblen Replikationsursprung enthält, wurde verwendet, um 519/43WT zu transformieren (zuvor vorbereitet, um kompetent zu sein). Positive Transformanten sind Kolonien, die nach einer Inkubation über Nacht auf 100 μg/ml Spectinomycin wachsen. Alle Kolonien werden auf frisch gefrischte Blutagar-Basisplatten gepatcht, die mit 100 μg/ml Spectinomycin sowie mit 100 μg/ml Ampicillin ergänzter Blutagar-Base ergänzt sind. Alle Kolonien, die auf den zweiten Nachtplatten wachsen, die mit Spectinomycin ergänzt werden, sind mögliche positive Aspekte. Alle Kolonien, die auf Ampicillinplatten wachsen, bedeuten die Integration des vollständigen Plasmids oder die Rekombination der Ampicillinkassette an anderer Stelle im Genom. Bisher sind mit dem Stamm 519/43 keine Kolonien auf den mit Ampicillin ergänzten Platten gewachsen. Alle PCR-positiven Kolonien müssen durch Sequenzierung bestätigt werden (Abbildung 2C), um den Ort der Insertion zu beurteilen und zu bestätigen. Zu diesem Zweck müssen Primer ihre Bindungsstelle außerhalb der Homologieregion haben (Abbildung 2C). Das gewählte Ziel hat einen sehr ausgeprägten Phänotyp (Hämolyse der roten Blutkörperchen (RBC)), und daher kann die Mutation auch phänotypisch bestätigt werden (Abbildung 2B). Die Mutante verlor ihre Fähigkeit, Erythrozyten zu lysieren.

Komponenten Reaktion (μL) Kontrolle (μL) Reaktion (μL) Kontrolle (μL)
Puffer 2 2 2 2
pSD1 4 4 -
Spectinomycin-Kassette - - 6 6
BamHI-HF 1 - 1 -
Wasser 13 14 11 12
Gesamtvolumen 20 20 20 20

Tabelle 1: Komponenten der Restriktionsaufschlussreaktion für pSD1 und Spectinomycin-Kassette.

Figure 1
Abbildung 1: Überblick über die Mutagenese-Strategie. A) Amplifikation von Homologiearmen (Ply3' und Ply5' (Bahnen 2 bis 5); und Spleißen durch überlappende Erweiterungs-PCR (Bahnen 6 und 7). L- Hyperleiter I (Bioline), Spur 1 - Negativkontrolle für die Reaktion, Spur 2 und 3 - Homologiearme 5' (488 bp) und ply3' (715 bp) amplifiziert aus D39 gDNA, Bahnen 4 und 5 - Schichten 5' (488 bp) und ply3' (715 bp) Homologiearme amplifiziert aus 519/43 gDNA. Rechte Seite Spur 6 - D39 SOE PCR Produkt, Spur 7 - 519/43 SOE PCR Produkt (1235 bp). B) Schematische Darstellung des erhaltenen endgültigen SOE-PCR-Konstrukts (ply_SOE); Durch Pfeile gekennzeichnet sind die Primer, die verwendet werden, um die Homologieregion zwischen beiden Homologiearmen sowie den gewählten Restriktionsverdau zu erhalten. C) Plasmid pSD1, das das Klonen von ply_SOE darstellt; D) Restriktionsverdau von pSD1 und Spectinomycin-Kassette. E) Endgültiges Konstrukt pSD2, das dann als Selbstmordplasmid zur Transformation von S. pneumoniae verwendet wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: A) Bestätigung des Vorhandenseins der Spectinomycin-Kassette in pSD2. L- Hyperleiter 1kb (Bioline); 1- pSD1 verdaut mit BamHI; 2-pSD2 verdaut mit BamHI; L Hyperleiter 1 kb (Bioline); 3- Spectinomycin-Kassette amplifiziert aus pR412, 4-Spectinomycin-Kassette verdaut mit BamHI; B) Phänotypische Bestätigung der Pneumolysin-Mutation durch Bestimmung der hämolytischen Aktivität für D39, 519/43WT und Mutante 519/43Δply. Dies wurde mit der Hämolyse der roten Blutkörperchen um 0,5% Saponin verglichen. Die aus Saponin gewonnene Hämolyse wird als 100% betrachtet und die Raten für 519/43Wt und 519/43Δply wurden dagegen berechnet. Jeder Datenpunkt ist der Mittelwert von 5 technischen und 3 biologischen Replikaten. C) Sequenzierungsdaten, die der mutierten Genomregion zugeordnet wurden, in der Pneumolysin unterbrochen wurde. Primer sind als Pfeile und mit Namen gekennzeichnet. PLYSCN1 und PLYSCN2 binden außerhalb der Homologiearme. Die Sequenzierung der Primer PLYSCN1 und 2 zeigte, dass es eine ununterbrochene Sequenz aus den benachbarten Regionen außerhalb des Homologiebereichs bis zur Spectinomycin-Kassette gab, was die Insertion in das Genom demonstrierte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Discussion

Streptococcus pneumoniae, insbesondere Serotyp 1, ist nach wie vor eine globale Bedrohung, die invasive Pneumokokkenerkrankungen und Meningitis verursacht. Trotz der Einführung verschiedener Impfstoffe, die vor Serotyp 1 schützen sollten, ist dieser Serotyp in Afrika immer noch in der Lage, Ausbrüche zu verursachen, die zu einer hohen Morbidität und Mortalität führen13. Die Fähigkeit, diesen Serotyp genetisch zu manipulieren, ist aufgrund seiner klinischen Relevanz von entscheidender Bedeutung. Die in dieser Studie beschriebene Methode ermöglicht die genetische Manipulation eines repräsentativen Stammes innerhalb dieses Serotyps. Ein invasiver Stamm 519/43 (ST5316), ein klinisches Isolat von einem Meningitis-Patienten in Dänemark25.

Die hier vorgestellte Methodik war vor allem aufgrund des gewählten Stammes erfolgreich, da er exogene DNA erwerben kann, aber auch aufgrund von Änderungen an den traditionellen Protokollen, die für die Transformation von S. pneumoniae verwendet werden, eine typische Erfolgsrate für unser Transformationsprotokoll liegt bei etwa 70%.

Bei dieser Methodik ist es von größter Bedeutung, ein Selbstmord-Plasmid anstelle der üblichen linearen DNA zu verwenden. Herkömmlicherweise wäre lineare DNA26,27,28 verwendet worden; Alle Versuche, die exogene DNA in dieser Form zu verwenden, waren jedoch erfolglos. Darüber hinaus waren Versuche, die natürliche Kompetenz von S. pneumoniae 519/43 bei geringerer Absorption auszunutzen, nicht erfolgreich. Die Fehlerbehebung zeigte, dass die natürliche Kompetenz für den Stamm 519/43 höher war, wenn OD595 0,1 betrug, was sich von den Daten unterscheidet, die für andere Serotypen von S. pneumoniae beobachtet wurden, bei denen die höchste natürliche Kompetenz bei sehr niedrigem OD24 beobachtet wurde.

Um die Methode zu validieren, wurde eine Pneumolysin-Mutante konstruiert, da sie einen leicht zu verfolgenden Phänotyp aufweist; Um jedoch zu beweisen, dass die Methode auf jedes Gen innerhalb dieses Stammes angewendet werden kann, wurden andere Gene erfolgreich ins Visier genommen (Manuskripte in Vorbereitung). Eine solche Methode, bei der ein Suizidvektor verwendet wird, der keinen grampositiv-kompatiblen Ursprung hat, könnte auch für die chromosomale Komplementierung, die Überexpression von Genen von Interesse sowie die Einführung von Reportersystemen verwendet werden, indem die benachbarten Gene als Homologieregionen verwendet werden.

Die Erweiterung der genetischen Werkzeuge auf S. pneumoniae Serotyp 1, Stamm 519/43 ist wichtig, weil wir nun repräsentative Stämme direkt genetisch manipulieren können. Stamm 519/43 ist von Interesse, da er genetisch biegsam ist, pathogen ist, da er von einem Meningitis-Patienten isoliert wurde, und seine Manipulation Hinweise liefert, um die Entwicklung und Etablierung von Meningitis besser zu verstehen. Bisher erfolgte das Verständnis bestimmter Determinanten innerhalb der Spezies durch Einfügen des fraglichen Gens in einen der sehr gut charakterisierten Stämme von S. pneumoniae, wie z.B. D39 (Serotyp 2). Ein solcher Ansatz wurde von Paton et al. aufgrund von Schwierigkeiten mit der Mutagenese auf Serotyp 129 verwendet. Die von ihnen berichteten Ergebnisse zu D39, das im Vergleich zu 519/43 ∆ ein weniger hämolytisches Allel des Serotyps 1 trägt, unterscheiden sich von denen, die von uns30 vorgestellt wurden, was die Bedeutung der Mutation eines Gens innerhalb des ursprünglichen Stammhintergrunds unterstreicht. Später war dieselbe Gruppe in der Lage, einen Nicht-Lineage-A-Serotyp 1-Stamm22 zu mutieren. Interessanterweise unterscheidet sich ihr Protokoll deutlich von unserem, da es sich um einen zweistufigen Ansatz handelt, bei dem die Mutation zuerst in Serotyp-2-Stämmen durchgeführt werden muss und dies dann als Vorlage für die Transformation in ihren Serotyp-1-Stamm verwendet wird.

Derzeit gibt es eine Einschränkung in der vorgestellten Methode. Im Moment funktioniert diese Methode nur für den repräsentativen Stamm 519/43. Das gleiche Protokoll wurde in anderen Stämmen ausprobiert, nämlich in klinischen Isolaten aus ST3081 und ST303, und es war nicht erfolgreich. Darüber hinaus wurde die Elektroporation als Methode zur Abgabe exogener DNA an die Zelle auch an allen drei Sequenztypen versucht, wobei nur für 519/43 positive Ergebnisse beobachtet wurden. Die Erweiterung und Standardisierung der Methodik auf alle Serotyp-1-Stämme ist von größter Bedeutung, da es innerhalb der Gruppe eine enorme Variabilität gibt. Derzeit werden Studien durchgeführt, um die Anwendbarkeit der Methode auf alle Stämme innerhalb des Serotyps 1 auszudehnen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Wir danken dem Meningitis Trust und dem MRC für die Finanzierung dieser Arbeit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AccuPrime Pfx DNA polymerase Invitrogen 12344024 Used for amplification of the fragments
Ampicillin sodium salt Sigma Aldrich A9518 Used for bacterial selection on stage 1(pSD1)
Blood Agar Base Oxoid CM0055 Used to plate S. pneumoniae transformants
Bovine Serum Albumine sigma 55470 used for S. pneumoniae Transformation
Brain Heart Infusion Oxoid CM1135 used to grow S. pneumoniae cells
Calcium Chloride Cacl2 Sigma 449709 used for S. pneumoniae Transformation
Competence stimulating peptide 1 AnaSpec AS-63779 used for S. pneumoniae Transformation
Luria Broth Agar Gibco 22700025 used for plating and selection of pSD1 and pSD2
Luria Broth Base (Miller's formulation) Gibco 12795027 used for plating and selection of pSD1 and pSD2
Monarch Gel Extraction Kit NEB T1020S Used to extract the bands from the DNA gel
Monarch Plasmid Miniprep Kit NEB T1010S Used to extract plasmid from the cells
pGEM T-easy Promega A1360 used as suicide plasmid
S.O.C. Invitrogen 15544034 used for recovery of cells after transformation
Sodium Hydroxide (NaOH) Sigma S0899 used for S.pneumoniae Transformation
Spectinomycin Hydrochloride SigmaAldrich PHR1426 Used for bacterial selection
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells Invitrogen 18265017 used for the creation of pSD1 and pSD2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Immunologie und Infektion Heft 163 Serotyp 1 S. pneumoniae Mutagenese natürliche Kompetenz Meningitisgürtel
Konstruktion von Mutanten im Serotyp 1 <em>Streptococcus pneumoniae</em> Stamm 519/43
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Terra, V. S., Plumptre, C. D., Wall, E. C., Brown, J. S., Wren, B. W. Constructing Mutants in Serotype 1 Streptococcus pneumoniae strain 519/43. J. Vis. Exp. (163), e61594, doi:10.3791/61594 (2020).

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