Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

בניית מוטנטים בסרוטיפ 1 סטרפטוקוקוס דלקת ריאות זן 519/43

Published: September 11, 2020 doi: 10.3791/61594
Automatic Translation
1, 2, 3, 2, 1
1Faculty of Infections and Tropical Diseases, Department of Infection Biology, London School of Hygiene and Tropical Medicine, 2Division of Medicine, University College London, 3Division of Infection and Immunity, University College London UCL

Summary

כאן אנו מתארים זן סרוטיפ 1 של S. pneumoniae serotype 1 519/43 שניתן להנדס גנטית באמצעות יכולתו לרכוש באופן טבעי DNA ופלסמיד מתאבד. כהוכחה עקרונית נוצרה מוטציה איזוגנית בגן הפנאומוליזין (ply).

Abstract

Streptococcus pneumoniae serotype 1 נותר בעיה עצומה במדינות בעלות הכנסה נמוכה ובינונית, במיוחד באפריקה שמדרום לסהרה. למרות חשיבותו, מחקרים בסרוטיפ זה עוכבו על ידי היעדר כלים גנטיים כדי לשנות אותו. במחקר זה אנו מתארים שיטה לשינוי גנטי של איזולט קליני של סרוטיפ 1 (זן 519/43). באופן מעניין, זה הושג על ידי ניצול יכולתו של הפנאומוקוק לרכוש דנ"א באופן טבעי. עם זאת, בניגוד לרוב הפנאומוקוקים, השימוש בדנ"א ליניארי לא היה מוצלח; כדי לשנות את הזן החשוב הזה, היה צורך להשתמש בפלסמיד מתאבד. מתודולוגיה זו סיפקה את האמצעים להבנה עמוקה יותר של סרוטיפ חמקמק זה, הן מבחינת הביולוגיה והן מבחינת הפתוגנים שלו. כדי לאמת את השיטה, הרעלן העיקרי הידוע של פנאומוקוק, פנאומוליזין, עבר מוטציה מכיוון שיש לו פנוטיפ ידוע וקל למעקב. הראינו שהמוטציה, כצפוי, איבדה את יכולתה ללדת תאי דם אדומים. על ידי היכולת לבצע מוטציה בגן חשוב בסרוטיפ המעניין, הצלחנו לצפות בפנוטיפים שונים לאובדן מוטציות תפקודיות בזיהומים תוך צפקיים ותוך אפיים מאלה שנצפו עבור סרוטיפים אחרים. לסיכום, מחקר זה מוכיח כי זן 519/43 (סרוטיפ 1) יכול להיות מהונדס גנטית.

Introduction

סטרפטוקוקוס דלקת ריאות (S. pneumoniae, הפנאומוקוקוס) הוא אחד הגורמים העיקריים לתחלואה ולתמותה ברחבי העולם. עד לאחרונה התגלו קרוב ל-100 סרוטיפים של S. pneumoniae 1,2,3,4,5,6,7. מדי שנה, מחלת פנאומוקוק פולשנית (IPD) טוענת לכ -700,000 מקרי מוות, של ילדים מתחת לגיל5 שנים 8. S. pneumoniae הוא הגורם העיקרי לדלקת ריאות חיידקית, דלקת אוזניים, דלקת קרום המוח ואלח דם ברחבי העולם9.

בחגורת דלקת קרום המוח האפריקאית, סרוטיפ 1 אחראי להתפרצויות דלקת קרום המוח, כאשר סוג הרצף (ST) ST217, סוג רצף אלים ביותר, דומיננטי 10,11,12,13,14,15. חשיבותו בפתולוגיה של דלקת קרום המוח הושוותה לזו של Neisseria meningitidis בחגורת דלקת קרום המוח האפריקאית16. סרוטיפ 1 הוא לעתים קרובות הגורם העיקרי ל- IPD; עם זאת, הוא נמצא לעתים רחוקות מאוד בכרכרה. למעשה, בגמביה, סרוטיפ זה אחראי ל -20% מכלל המחלות הפולשניות, אך הוא נמצא רק ב -0.5% מהנשאים הבריאים 14,17,18,19. החלפה גנטית ורקומבינציה בפנאומוקוקים מוסמכים מתרחשת בדרך כלל בהובלה ולא במחלה פולשנית20. יתר על כן, סרוטיפ 1 הוכח כאחד משיעורי ההובלה הקצרים ביותר המתוארים בקרב פנאומוקוקים (9 ימים בלבד). לכן, הוצע כי סרוטיפ זה עשוי להיות בעל שיעור רקומבינציה נמוך בהרבה מאחרים21.

יש צורך במחקרי עומק כדי להבין את הסיבה לשיעור ההובלה הנמוך של זני סרוטיפ 1 ואת חשיבותו במחלות פולשניות באפריקה שמדרום לסהרה.

כאן אנו מדווחים על פרוטוקול המאפשר מוטגנזה כלל-גנומית של זן סרוטיפ 1 מסוים, 519/43. זן זה יכול בקלות לרכוש ולשלב מחדש דנ"א חדש בגנום שלו. שיטה זו עדיין אינה בין-זנית, אך היא יעילה מאוד כאשר היא נעשית ברקע 519/43 (מטרות אחרות עברו מוטציה, כתבי יד בהכנה). פשוט על ידי שימוש בזן 519/43, וניצול היכולת הטבעית שלו, כמו גם החלפת האופן שבו הדנ"א האקסוגני מסופק, הצלחנו לשנות את הגן pneumolysin (ply) בזן סרוטיפ 1 זה. שיטה זו מייצגת שיפור מזה שהוצג על ידי Harvey et al.22 כפי שהוא נעשה בשלב אחד ללא צורך להעביר את הדנ"א דרך סרוטיפ אחר. עם זאת, ובשל השונות בין הזנים, אף שיטה לא תוקנה לכל הזנים. היכולת לבצע מוטציה בגנים ספציפיים ולצפות בהשפעותיהם תאפשר הבנה מעמיקה של זני סרוטיפ 1 S. pneumoniae ותספק תשובות לתפקידם של זנים אלה בדלקת קרום המוח באפריקה שמדרום לסהרה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. יצירת אמפליקון מוטציה על ידי SOE-PCR23 והגברה של קלטת ספקטינומיצין

  1. התחל בביצוע PCR להגברה של זרועות ההומולוגיה (ply 5' (488 bp) ו- ply3' (715 bp) בהתאמה) של אזורי האיגוף של גן הרובד מזן 519/43. השתמש פריימרים plyFw1_NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG), ply5'R1_BamHI (CGAAATATAGACCAAAGGACGCCGGATCC AGAACCAAACTTGACCTTGA), ply3'F1_BamHI (TCAAGGTCAAGTTTGGTTCTGGATCC GCGTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTTTTTC) ו- plyRv2_NotI (TTTGCGGCCGCCATTTTACCTTATCCTCTACC).
  2. השתמש בתנאי ה-PCR הבאים עבור ply5': דנטורציה ב-94°C למשך 60 שניות, שלב 2: דנטורציה ב-94°C למשך 30 שניות, שלב 3: חישול ב-58°C למשך 30 שניות, שלב 4: הארכה ב-72°C למשך 30 שניות, שלב 5: חזור לשלב 2 וחזור על הפעולה במשך 35 מחזורים, שלב 6: הארכה סופית ב-72°C למשך 30 שניות.
    1. השתמש באותם תנאי PCR עבור ply3' למעט זמן ההארכה בשלב 4 ושלב 6 שבו הוא אמור להיות 60 שניות.
  3. לנתח את מוצרי PCR על ידי אלקטרופורזה ג'ל הבלו את אמפליקון מן הג'ל.
  4. לטהר את אמפליקוני ה-PCR בהתאם לפרוטוקול המתואר בהוראות היצרן (טבלת חומרים).
  5. השתמש בכמויות שוות ערך של שתי זרועות ההומולוגיה כתבניות ב- SOE-PCR. התיך את שני האמפליקונים באמצעות פריימרים plyFw1_ NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG), ו- plyRv2_NotI (TTTGCGGCCGCCATTTTTTACCTTATCCTCTACC).
  6. השתמש בתנאי SOE-PCR הבאים (שלב 1: דנטורינג ב 94 ° C במשך 2 דקות, שלב 2: denaturing ב 94 ° C במשך 30 שניות, שלב 3: חישול 58 ° C עבור 30 שניות, שלב 4: הארכה ב 68 ° C עבור 60 שניות, שלב 5: לחזור לשלב 2 ולחזור במשך 25 מחזורים, שלב 6: הארכה סופית ב 68 ° C עבור 90 שניות).
  7. לנתח את המוצר SOE-PCR על ידי אלקטרופורזה ג'ל. הבלו אותו מן הג'ל באמצעות ערכת מיצוי ג'ל ופעל לפי ההוראות שסופקו.
  8. הגבירו את קלטת הספקטינומיצין מפלסמיד pR412 באמצעות תנאי ה-PCR הבאים: שלב 1: דנטורינג ב-94 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות, שלב 2: דנטורינג ב-94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, שלב 3: חישול ב-55 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, שלב 4: הארכה ב-68 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות, שלב 5: חזור לשלב 2 וחזור על הפעולה במשך 25 מחזורים, שלב 6: הארכה סופית ב-68°C למשך 60 שניות.
    1. השתמש פריימרים BamHI_SP2F2 (GGATCC, CTA, GAA, CTA, GTG, GAT, CCC CC) ו- BamHI_SP2R2 (GGATCC, AAT, TCT, GCA, GAT, TTT, AC, ATG ATC). פלסמיד pR412 נרכשה מד"ר מארק פרודהום (CNRS-Universite Paul Sabatier, טולוז, צרפת).
  9. לנתח את אמפליקונים PCR על ידי אלקטרופורזה ג'ל. הבלו ולטהר את אמפליקון PCR המתקבל כמתואר לעיל.

2. יצירת פלסמיד pSD1 וטרנספורמציה כימית של E. coli Dh5α

  1. ביצוע קשירה בהתאם להוראות היצרן של מערכת pGEMT-easy I (טבלת חומרים). בצינור מיקרוצנטריפוגה, הוסף 5 μL של 2x חיץ קשירה, 1 μL של pGEMTeasy, 2 μL של המוצר ply_SOE, 1 μL של T4 DNA ligase ומים לנפח כולל של 20 μL. לדגור לילה ב 4 °C (75 °F). זה מייצר פלסמיד pSD1.
  2. הפוך E. coli Dh5α בעל יכולת כימית עם pSD1. התחל על ידי דגירה של 50 μL של E. coli Dh5α בעל כשירות כימית עם 3 μL של תגובת קשירה pSD1 למשך 15 דקות על קרח. לאחר מכן המשך על ידי חשיפת התאים להלם תרמי (42 ° C, 30 שניות). מניחים את התאים על קרח למשך 2 דקות.
  3. הסר את התאים מקרח והוסף 350 μL של מדיה S.O.C. לדגור את התרבות במשך 2 שעות ב 37 ° C, 120 סל"ד.
  4. צלחת את השינוי על לוריא ברטאני אגר (LBA) בתוספת 0.4 mM IPTG, 0.24 מ"ג / מ"ל X-Gal עבור בחירה כחול/לבן ו 100 מיקרוגרם / מ"ל אמפיצילין כדי להבטיח שכל המושבות הגדלות בצלחת יש את עמוד השדרה פלסמיד. מושבות לבנות מכילות pSD1.
  5. בחרו שלוש מושבות לבנות והקימו גידולי לילה ב-10 מ"ל ליברות, בתוספת אמפיצילין של 100 מיקרוגרם/מ"ל. לדגור על התרביות במשך הלילה ב 37 °C (77 °F) עם רעידות.
  6. למחרת צנטריפוגו את התרביות בגודל 3,082 x גרם והשתמשו בגלולה להפקת פלסמיד.

3. מיצוי DNA פלסמיד, הגבלת עיכול הגן pSD1 וספקטינומיצין והרכבת pSD2

  1. לחלץ את DNA פלסמיד בהתאם להוראות שסופקו עם הערכה המסחרית (טבלה של חומרים).
  2. הגדר עיכול הגבלת BamHI הן עבור פלסמיד pSD1 והן עבור קלטת ספקטינומיצין שהוגברה וטוהרה בעבר. השתמש בתנאים ובכמויות הבאים המתוארים בטבלה 1.
  3. לדגור את הגבלת העיכול תגובות ובקרות ב 37 ° C במשך 3 שעות.
  4. לנתח את העיכול הגבלה על ידי אלקטרופורזה, הבלו את הרצועה ולטהר בהתאם להוראות שסופקו עם הערכה המסחרית (טבלה של חומרים).
  5. לאחר מכן, הכינו תגובת קשירה בהתאם להוראות היצרן (טבלת חומרים) באמצעות pSD1 וספקטינומיצין מעוכל BamHI (משלב 3.2). בצינור מיקרוצנטריפוגה, הוסף את רכיבי התגובה הבאים: 5 μL של 2x חיץ קשירה, 2 μL pSD1, 2 μL של קלטת ספקטינומיצין, 1 μL של T4 DNA ligase ודגור לילה ב 4 ° C. זה מייצר פלסמיד pSD2.
  6. הפוך פלסמיד pSD2 ל- E. coli Dh5α בעל יכולת כימית כמתואר בשלב 2.2.
  7. בחר את הטרנספורמנטים הנושאים פלסמיד pSD2 בהתבסס על יכולתם לגדול ב- LBA בתוספת 100 מיקרוגרם / מ"ל של ספקטינומיצין ואמפיצילין.
  8. ביצוע מיצוי DNA פלסמיד (pSD2) כמתואר לעיל ובהתאם להוראות היצרן (μL).

4. טרנספורמציה של זן S. pneumoniae 519/43

  1. הכינו תרבית לילה של S. pneumoniae 519/43 ב- BHI ואפשרו לו לגדול באופן סטטי ב 37 °C, 5% CO2.
  2. למחרת לדלל את התרביות 1:50 ו 1:100 ב 10 מ"ל של מרק BHI טרי. לדגור על התרביות באופן סטטי ב 37 ° C עד OD595nm הוא בין 0.05 ל 0.1 (רכישה אופטימלית של DNA קרוב יותר 0.1 OD).
  3. ברגע שמגיעים ל-OD של 0.1, לוקחים 860 μL ומעבירים לצינור מיקרוצנטריפוגה. באותו צינור מיקרוצנטריפוגה להוסיף: 100 μL של 100 mM NaOH, 10 μL של 20% (w/v) BSA, 10 μL של 100 mM CaCl 2,2 μL של 50 ng/mL CSP124 ו 500 ng של pSD2.
  4. לדגור את התגובה באופן סטטי ב 37 ° C במשך 3 שעות.
  5. צלחת 330 μL על 5% צלחות אגר דם (BA) בתוספת ספקטינומיצין 100 מיקרוגרם / מ"ל, כל שעה במשך 3 שעות הדגירה.
  6. לדגור על צלחות לילה ב 37 ° C, 5% CO2. מושבות עמידות בפני ספקטינומיצין טלאי על צלחת BA אחרת בתוספת ספקטינומיצין של 100 מיקרוגרם/מ"ל וכן על לוחות BA בתוספת 100 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין. יש לדגור על שתי מערכות הצלחות למשך הלילה בתנאים שצוינו לעיל. לוחות ampicillin הם לבדוק את נוכחותו של עמוד השדרה פלסמיד.
  7. אשר את נוכחותה של קלטת spectinomycin על ידי PCR באמצעות פריימרים plyFw1_ NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG) ו- SPEC_REV (TAATTCCTCTAAGTCATAATTTCCG). אשר את המוטציה על ידי PCR באמצעות פריימרים plySCN1 (CCAATGGAAATCGCTAGGCAAGAGATAA) ו- plySCN2 (ATTACTTAGTCCAACCACGGCTGAT) המתחברים מחוץ לאזור שעבר מוטציה.
  8. אשר את האינטגרציה במיקום הנכון של הגנום על ידי ריצוף באמצעות פריימרים plySCN1 (CCAATGGAAATCGCTAGGCAAGAGATAA), plySCN2 (ATTACTTAGTCCAACCACGGCTGAT), כמו גם פריימרים עם אתר הקישור שלהם בקלטת spectinomycin sqr1 (CCTGATCCAAACATGTAAGTACC) sqf2 (CGTAGTTATCTTGGAGAGAATA) spec_sqf1 (GGTACTTACATGTTTGGATCAGG ) ו- spec_sqr2 TATTCTCTCCAAGATAACTACG.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הפרוטוקול המתואר כאן מתחיל בשימוש ב- PCR כדי להגביר את זרועות ההומולוגיה השמאלית והימנית, תוך מחיקת 191 bp מהאזור האמצעי של גן הרובד . בעת ביצוע ה-PCR מציגים אתר BamHI ב-3' של זרוע ההומולוגיה השמאלית ובקצה ה-5' של זרוע ההומולוגיה הימנית (איור 1A). אחריו מגיע PCR-SOE, שבו זרועות הומולוגיה שמאליות וימניות מאוחות לאמפליקון אחד (איור 1B). אמפליקון SOE-PCR זה משובט לאחר מכן לתוך pGEMTeasy באמצעות שיבוט TA כדי ליצור פלסמיד pSD1 (איור 1C). טרנספורמציה מוצלחת תניב מושבות לבנות עמידות לאמפיצילין. כל מושבה כחולה תהיה טרנספורמציה המכילה פלסמיד pGEMTeasy ריק. לאחר מכן, pSD1 יעוכל באתר BamHI שהוצג בזמן ה-SOE-PCR (איור 1D) ויוצמד לקסטת ספקטינומיצין (גם BamHI מתעכלת למטרות תואמות). הפלסמיד החדש נקרא pSD2 (איור 1E). הרכבה נכונה של pSD2 מאושרת על-ידי הגבלת העיכול (איור 2A). pSD2, הפועל כפלסמיד התאבדות מכיוון שאינו מכיל מקור תואם גראם-חיובי של שכפול, שימש לשינוי 519/43WT (מוכן בעבר להיות מוכשר). טרנספורמנטים חיוביים הם מושבות הגדלות על ספקטינומיצין של 100 מיקרוגרם/מ"ל לאחר דגירה של לילה. כל המושבות מודבקות על לוחות בסיס אגר דם טריים חדשים בתוספת ספקטינומיצין של 100 מיקרוגרם/מ"ל וכן בסיס אגר דם בתוספת 100 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין. כל מושבה שגדלה על צלחות הלילה השנייה בתוספת ספקטינומיצין הן חיוביות אפשריות. כל מושבה שגדלה על לוחות אמפיצילין תציין אינטגרציה של פלסמיד מלא או רקומבינציה של קלטת אמפיצילין במקום אחר בגנום. עד כה ובאמצעות זן 519/43 לא גדלו מושבות על הצלחות בתוספת אמפיצילין. כל המושבות החיוביות ב-PCR חייבות להיות מאושרות על-ידי ריצוף (איור 2C) כדי להעריך ולאשר את מיקום ההחדרה. לשם כך, פריימרים חייבים להיות בעלי אתר קישור מחוץ לאזור ההומולוגיה (איור 2C). למטרה שנבחרה יש פנוטיפ מאוד מסומן (המוליזה של תאי דם אדומים (RBC)), ולכן ניתן לאשר את המוטציה גם פנוטיפית (איור 2B). המוטאנט איבד את יכולתו לשקר RBC's.

רכיבים תגובה (μL) בקרה (μL) תגובה (μL) בקרה (μL)
מאגר 2 2 2 2
pSD1 4 4 -
קלטת ספקטינומיצין - - 6 6
BamHI-HF 1 - 1 -
מים 13 14 11 12
נפח כולל 20 20 20 20

טבלה 1: רכיבי תגובת עיכול הגבלה עבור קלטת pSD1 וספקטינומיצין.

Figure 1
איור 1: סקירה כללית של אסטרטגיית המוטגנזה. A) הגברה של זרועות הומולוגיה (Ply3' ו-Ply5' (נתיבים 2 עד 5); וחבור על ידי PCR הארכה חופפת (נתיבים 6 ו-7). L- היפרסולם I (ביוליין), נתיב 1- שליטה שלילית לתגובה, נתיב 2 ו- 3- ply5' (488 bp) ו- ply3' (715 bp) זרועות הומולוגיה מוגברות מ- D39 gDNA, נתיבים 4 ו- 5- ply5' (488 bp) ו- ply3' (715 bp) זרועות הומולוגיה מוגברות מ- 519/43 gDNA. נתיב ימני 6- D39 SOE PCR product, נתיב 7- 519/43 SOE PCR מוצר (1235 bp). ב) סכמטי המתאר את מבנה SOE-PCR הסופי שהתקבל (ply_SOE); מסומנים על ידי חצים הם פריימרים המשמשים להשגת אזור ההומולוגיה בין שתי זרועות ההומולוגיה, כמו גם את עיכול ההגבלה שנבחר. ג) פלסמיד pSD1, המתאר שיבוט של ply_SOE; ד) הגבלת העיכול של קלטת pSD1 וספקטינומיצין. E) מבנה סופי pSD2 המשמש לאחר מכן כפלסמיד התאבדות כדי להפוך את S. pneumoniae. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: A) אישור על נוכחות קלטת ספקטינומיצין ב- pSD2. L- היפרסולם 1kb (ביוליין); 1- pSD1 מעוכל עם BamHI; 2-pSD2 מעוכל עם BamHI; L hyperladder 1 kb (ביוליין); 3- קלטת ספקטינומיצין מוגברת מ-pR412, 4- קלטת ספקטינומיצין מעוכלת עם BamHI; B) אישור פנוטיפי למוטציה בפנאומוליזין על ידי קביעת פעילות המוליטית עבור D39, 519/43WT ומוטציה 519/43Δply. זה הושווה להמוליזה של תאי דם אדומים על ידי 0.5% saponin. המוליזה שמקורה בספונין נחשבת ל-100% והתעריפים עבור 519/43Wt ו-519/43Δply חושבו מולה. כל נקודת נתונים היא הממוצע של 5 עותקים טכניים ו-3 משוכפלים ביולוגיים. C) נתוני ריצוף שמופו לאזור הגנום המוטנטי שבו הופסקה דלקת ריאות. פריימרים מסומנים כחצים ובשם. PLYSCN1 ו-PLYSCN2 נקשרים מחוץ לזרועות ההומולוגיה. ריצוף שהתקבל מפריימרים PLYSCN1 ו-2 הראה שהיה רצף רצוף מהאזורים השכנים מחוץ לאזור ההומולוגיה עד לקלטת הספקטינומיצין, מה שמדגים את החדרת הגנום. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

דלקת ריאות סטרפטוקוקוס, במיוחד סרוטיפ 1, ממשיכה להוות איום עולמי הגורם למחלת פנאומוקוק פולשנית ולדלקת קרום המוח. למרות הכנסת חיסונים שונים שאמורים להגן מפני סרוטיפ 1, באפריקה סרוטיפ זה עדיין מסוגל לגרום להתפרצויות שיובילו לתחלואה ותמותה גבוהה13. היכולת לבצע מניפולציה גנטית בסרוטיפ זה היא בעלת חשיבות קריטית בגלל הרלוונטיות הקלינית שלו. השיטה המתוארת במחקר זה מאפשרת מניפולציה גנטית של זן מייצג בתוך סרוטיפ זה. זן פולשני 519/43 (ST5316), מבודד קליני מחולה דלקת קרום המוח בדנמרק25.

המתודולוגיה שהוצגה כאן, הצליחה בעיקר בשל הזן הנבחר שכן הוא יכול לרכוש DNA אקסוגני, אך גם בשל שינויים שנעשו בפרוטוקולים המסורתיים המשמשים להתמרת S. pneumoniae , שיעור הצלחה טיפוסי לפרוטוקול הטרנספורמציה שלנו הוא כ -70%.

עם מתודולוגיה זו, חשוב ביותר להשתמש פלסמיד התאבדות במקום DNA ליניארי הרגיל. באופן קונבנציונלי, דנ"א ליניארי26,27,28 היה משמש; עם זאת, כל הניסיונות להשתמש בדנ"א האקסוגני בצורה זו לא צלחו. יתר על כן, ניסיונות לנצל את היכולת הטבעית של S. pneumoniae 519/43 בספיגה נמוכה יותר לא צלחו. פתרון בעיות הראה כי היכולת הטבעית לזן 519/43 הייתה גבוהה יותר כאשר OD595 היה 0.1, וזה שונה מהנתונים שנצפו עבור סרוטיפים אחרים של S. pneumoniae שבהם היכולת הטבעית הגבוהה ביותר נצפתה ב OD24 נמוך מאוד.

על מנת לאמת את השיטה, נבנה מוטנט פנאומוליזין מכיוון שהוא מציג פנוטיפ קל למעקב; עם זאת, כדי להוכיח כי השיטה יכולה להיות מיושמת על כל גן בתוך זן זה, גנים אחרים היו ממוקדים בהצלחה (כתבי יד בהכנה). שיטה כזו, תוך שימוש בווקטור התאבדות שאין לו מקור תואם גראם-חיובי, יכולה לשמש גם להשלמה כרומוזומלית, ביטוי יתר של גנים מעניינים, כמו גם החדרת מערכות כתב, כל זאת על ידי שימוש בגנים השכנים כאזורי הומולוגיה.

הרחבת הכלים הגנטיים ל- S. pneumoniae serotype 1, זן 519/43 חשובה מכיוון שכעת אנו יכולים לבצע מניפולציה גנטית ישירות בזנים מייצגים. זן 519/43 מעניין מכיוון שהוא גמיש גנטית, הוא פתוגני מכיוון שבודד מחולה דלקת קרום המוח, והמניפולציה שלו תספק רמזים להבנה טובה יותר של התפתחות והתבססות של דלקת קרום המוח. בעבר, הבנת דטרמיננטים מסוימים בתוך המין נעשתה על ידי החדרת הגן המדובר לאחד הזנים המאופיינים היטב של S. pneumoniae, כגון D39 (סרוטיפ 2). גישה כזו שימשה את Paton et al., בשל קשיים עם מוטגנזה על סרוטיפ 129. התוצאות שדווחו על ידם על D39 הנושא אלל פחות המוליטי של סרוטיפ 1 רובד בהשוואה ל- 519/43 ∆ply שונות מאלה שהוצגו על ידינו30 , ומדגישות את החשיבות של היכולת לבצע מוטציה בגן בתוך רקע הזן המקורי. מאוחר יותר, אותה קבוצה הצליחה לבצע מוטציה בזן סרוטיפ 1 שאינו שושלת22. באופן מעניין, הפרוטוקול שלהם שונה למדי משלנו, שכן זוהי גישה דו-שלבית הדורשת שהמוטציה תיעשה תחילה בזני סרוטיפ 2 ולאחר מכן זה משמש כתבנית לשינוי בזן סרוטיפ 1 שלהם.

נכון לעכשיו, יש מגבלה אחת בשיטה המוצגת. לעת עתה, שיטה זו עובדת רק עבור הזן המייצג 519/43. אותו פרוטוקול בדיוק נוסה בזנים אחרים, כלומר מבודדים קליניים מ-ST3081 ו-ST303 ולא הצליח. יתר על כן, אלקטרופורציה כשיטה להעברת DNA אקסוגני לתא נוסתה גם על כל שלושת סוגי הרצפים, עם תוצאות חיוביות שנצפו רק עבור 519/43. הרחבה וסטנדרטיזציה של המתודולוגיה לכל זני סרוטיפ 1 היא בעלת חשיבות עליונה מכיוון שיש שונות עצומה בכל הקבוצה. בימים אלה נערכים מחקרים להרחבת תחולת השיטה על כל הזנים בסרוטיפ 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

ברצוננו להודות לקרן דלקת קרום המוח ול-MRC על מתן המימון לעבודה זו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AccuPrime Pfx DNA polymerase Invitrogen 12344024 Used for amplification of the fragments
Ampicillin sodium salt Sigma Aldrich A9518 Used for bacterial selection on stage 1(pSD1)
Blood Agar Base Oxoid CM0055 Used to plate S. pneumoniae transformants
Bovine Serum Albumine sigma 55470 used for S. pneumoniae Transformation
Brain Heart Infusion Oxoid CM1135 used to grow S. pneumoniae cells
Calcium Chloride Cacl2 Sigma 449709 used for S. pneumoniae Transformation
Competence stimulating peptide 1 AnaSpec AS-63779 used for S. pneumoniae Transformation
Luria Broth Agar Gibco 22700025 used for plating and selection of pSD1 and pSD2
Luria Broth Base (Miller's formulation) Gibco 12795027 used for plating and selection of pSD1 and pSD2
Monarch Gel Extraction Kit NEB T1020S Used to extract the bands from the DNA gel
Monarch Plasmid Miniprep Kit NEB T1010S Used to extract plasmid from the cells
pGEM T-easy Promega A1360 used as suicide plasmid
S.O.C. Invitrogen 15544034 used for recovery of cells after transformation
Sodium Hydroxide (NaOH) Sigma S0899 used for S.pneumoniae Transformation
Spectinomycin Hydrochloride SigmaAldrich PHR1426 Used for bacterial selection
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells Invitrogen 18265017 used for the creation of pSD1 and pSD2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bentley, S. D., et al. Genetic Analysis of the Capsular Biosynthetic Locus from All 90 Pneumococcal Serotypes. PLoS Genetics. 2 (3), 31 (2006).
  2. Calix, J. J., Nahm, M. H. A new pneumococcal serotype, 11E, has a variably inactivated wcjE gene. The Journal of Infectious Diseases. 202 (1), 29-38 (2010).
  3. Park, I. H., Pritchard, D. G., Cartee, R., Brandao, A., Brandileone, M. C. C., Nahm, M. H. Discovery of a New Capsular Serotype (6C) within Serogroup 6 of Streptococcus pneumoniae. Journal of Clinical Microbiology. 45 (4), 1225-1233 (2007).
  4. Jin, P., et al. First Report of Putative Streptococcus pneumoniae Serotype 6D among Nasopharyngeal Isolates from Fijian Children. The Journal of Infectious Diseases. 200 (9), 1375-1380 (2009).
  5. Oliver, M. B., vander Linden, M. P. G., Küntzel, S. A., Saad, J. S., Nahm, M. H. Discovery of Streptococcus pneumoniae Serotype 6 Variants with Glycosyltransferases Synthesizing Two Differing Repeating Units. Journal of Biological Chemistry. 288 (36), 25976-25985 (2013).
  6. Calix, J. J., et al. Serological Characterization of Two Capsule Subtypes among Streptococcus pneumoniae Serotype 20 Strains. Journal of Biological Chemistry. 287 (33), 27885-27894 (2012).
  7. Park, I. H., et al. and Serological Characterization of a New Pneumococcal Serotype, 6H, and Generation of a Pneumococcal Strain Producing Three Different Capsular Repeat Units. Clinical and Vaccine Immunology. 22 (3), 313-318 (2015).
  8. O'Brien, K. L., et al. Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates. The Lancet. 374 (9693), 893-902 (2009).
  9. Henriques-Normark, B., Tuomanen, E. I. The Pneumococcus: Epidemiology, Microbiology, and Pathogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 3 (7), 010215 (2013).
  10. Leimkugel, J., et al. An Outbreak of Serotype 1 Streptococcus pneumoniae Meningitis in Northern Ghana with Features That Are Characteristic of Neisseria meningitidis Meningitis Epidemics. The Journal of Infectious Diseases. 192 (2), 192-199 (2005).
  11. Yaro, S., et al. Epidemiological and Molecular Characteristics of a Highly Lethal Pneumococcal Meningitis Epidemic in Burkina Faso. Clinical Infectious Diseases. 43 (6), 693-700 (2006).
  12. Antonio, M., et al. Molecular epidemiology of pneumococci obtained from Gambian children aged 2-29 months with invasive pneumococcal disease during a trial of a 9-valent pneumococcal conjugate vaccine. BMC Infectious Diseases. 8 (1), 81 (2008).
  13. Kwambana-Adams, B. A., et al. An outbreak of pneumococcal meningitis among older children (≥5 years) and adults after the implementation of an infant vaccination programme with the 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in Ghana. BMC Infectious Diseases. 16 (1), 575 (2016).
  14. Antonio, M., et al. Seasonality and outbreak of a predominant Streptococcus pneumoniae serotype 1 clone from The Gambia: Expansion of ST217 hypervirulent clonal complex in West Africa. BMC Microbiology. 8 (1), 198 (2008).
  15. Staples, M., et al. Molecular characterization of an Australian serotype 1 Streptococcus pneumoniae outbreak. Epidemiology and Infection. 143 (2), 325-333 (2015).
  16. Gessner, B. D., Mueller, J. E., Yaro, S. African meningitis belt pneumococcal disease epidemiology indicates a need for an effective serotype 1 containing vaccine, including for older children and adults. BMC Infectious Diseases. 10 (1), 22 (2010).
  17. Hill, P. C., et al. Nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae in Gambian infants: a longitudinal study. Clinical Infectious Diseases. 46 (6), 807-814 (2008).
  18. Ebruke, C., et al. Temporal changes in nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae serotype 1 genotypes in healthy Gambians before and after the 7-valent pneumococcal conjugate vaccine. PeerJ. 3, 90 (2015).
  19. Adegbola, R. A., et al. Serotype and antimicrobial susceptibility patterns of isolates of Streptococcus pneumoniae causing invasive disease in The Gambia 1996-2003. Tropical Medicine and International Health. 11 (7), 1128-1135 (2006).
  20. Marks, L. R., Reddinger, R. M., Hakansson, A. P. High Levels of Genetic Recombination during Nasopharyngeal Carriage and Biofilm Formation in Streptococcus pneumoniae. mBio. 3 (5), (2012).
  21. Ritchie, N. D., Mitchell, T. J., Evans, T. J. What is different about serotype 1 pneumococci. Future Microbiology. 7 (1), 33-46 (2012).
  22. Harvey, R. M., et al. The variable region of pneumococcal pathogenicity island 1 is responsible for unusually high virulence of a serotype 1 isolate. Infection and Immunity. 84 (3), 822-832 (2016).
  23. Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. BioTechniques. 8 (5), 528-535 (1990).
  24. Alioing, G., Granadel, C., Morrison, D. A., Claverys, J. P. Competence pheromone, oligopeptide permease, and induction of competence in Streptococcus pneumoniae. Molecular Microbiology. 21 (3), 471-478 (1996).
  25. Lund, E. Enumeration and description of the strains belonging to the State Serum Institute, Copenhagen Denmark. , (1951).
  26. Barany, F., Tomasz, A. Genetic transformation of Streptococcus pneumoniae by heterologous plasmid deoxyribonucleic acid. Journal of Bacteriology. 144 (2), 698-709 (1980).
  27. Terra, V. S., Homer, K. A., Rao, S. G., Andrew, P. W., Yesilkaya, H. Characterization of novel β-galactosidase activity that contributes to glycoprotein degradation and virulence in Streptococcus pneumoniae. Infection and Immunity. 78 (1), (2010).
  28. Terra, V. S., Zhi, X., Kahya, H. F., Andrew, P. W., Yesilkaya, H. Pneumococcal 6-phospho-β-glucosidase (BglA3) is involved in virulence and nutrient metabolism. Infection and Immunity. 84 (1), (2015).
  29. Harvey, R. M., Ogunniyi, A. D., Chen, A. Y., Paton, J. C. Pneumolysin with Low Hemolytic Activity Confers an Early Growth Advantage to Streptococcus pneumoniae in the Blood. Infection and Immunity. 79 (10), 4122 (2011).
  30. Terra, V. S., Plumptre, C. D., Wall, E. C., Brown, J. S., Wren, B. W. Construction of a pneumolysin deficient mutant in Streptococcus pneumoniae serotype 1 strain 519/43 and phenotypic characterisation. Microbial Pathogenesis. 141, 103999 (2020).

Tags

אימונולוגיה וזיהום גיליון 163 סרוטיפ 1 S. דלקת ריאות מוטגנזה כשירות טבעית חגורת דלקת קרום המוח
בניית מוטנטים בסרוטיפ 1 <em>סטרפטוקוקוס דלקת ריאות</em> זן 519/43
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Terra, V. S., Plumptre, C. D., Wall, … More

Terra, V. S., Plumptre, C. D., Wall, E. C., Brown, J. S., Wren, B. W. Constructing Mutants in Serotype 1 Streptococcus pneumoniae strain 519/43. J. Vis. Exp. (163), e61594, doi:10.3791/61594 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter