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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

सीरोटाइप 1 स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया स्ट्रेन 519/43 में उत्परिवर्ती का निर्माण

Published: September 11, 2020 doi: 10.3791/61594
Automatic Translation
1, 2, 3, 2, 1
1Faculty of Infections and Tropical Diseases, Department of Infection Biology, London School of Hygiene and Tropical Medicine, 2Division of Medicine, University College London, 3Division of Infection and Immunity, University College London UCL

Summary

यहां, हम एक एस निमोनिया सीरोटाइप 1 स्ट्रेन 519/43 का वर्णन करते हैं जिसे स्वाभाविक रूप से डीएनए और आत्महत्या-प्लास्मिड प्राप्त करने की क्षमता का उपयोग करके आनुवंशिक रूप से संशोधित किया जा सकता है। सिद्धांत के प्रमाण के रूप में, न्यूमोलिसिन (प्लाई) जीन में एक इसोजेनिक उत्परिवर्ती बनाया गया था।

Abstract

स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया सीरोटाइप 1 कम और मध्यम आय वाले देशों में एक बड़ी समस्या बनी हुई है, खासकर उप-सहारा अफ्रीका में। इसके महत्व के बावजूद, इस सीरोटाइप में अध्ययन इसे संशोधित करने के लिए आनुवंशिक उपकरणों की कमी से बाधित हुआ है। इस अध्ययन में, हम आनुवंशिक रूप से एक सीरोटाइप 1 नैदानिक अलगाव (तनाव 519/43) को संशोधित करने की एक विधि का वर्णन करते हैं। दिलचस्प बात यह है कि यह न्यूमोकोकस की स्वाभाविक रूप से डीएनए प्राप्त करने की क्षमता का फायदा उठाकर हासिल किया गया था। हालांकि, अधिकांश न्यूमोकोकी के विपरीत, रैखिक डीएनए का उपयोग सफल नहीं था; इस महत्वपूर्ण तनाव को उत्परिवर्तित करने के लिए, एक आत्मघाती प्लास्मिड का उपयोग किया जाना था। इस पद्धति ने इस मायावी सीरोटाइप की गहरी समझ के लिए साधन प्रदान किए हैं, दोनों इसके जीव विज्ञान और रोगजनकता के संदर्भ में। विधि को मान्य करने के लिए, प्रमुख ज्ञात न्यूमोकोकल विष, न्यूमोलिसिन, उत्परिवर्तित था क्योंकि इसमें एक प्रसिद्ध और पालन करने में आसान फेनोटाइप है। हमने दिखाया कि उत्परिवर्ती, जैसा कि अपेक्षित था, लाल रक्त कोशिकाओं को हटाने की अपनी क्षमता खो देता है। रुचि के सीरोटाइप में एक महत्वपूर्ण जीन को उत्परिवर्तित करने में सक्षम होने से, हम अन्य सीरोटाइप के लिए देखे गए लोगों से इंट्रापरिटोनियल और इंट्रानेसल संक्रमणों पर फ़ंक्शन म्यूटेंट के नुकसान के लिए अलग-अलग फेनोटाइप का निरीक्षण करने में सक्षम थे। सारांश में, यह अध्ययन साबित करता है कि तनाव 519/43 (सीरोटाइप 1) आनुवंशिक रूप से संशोधित किया जा सकता है।

Introduction

स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया (एस निमोनिया, न्यूमोकोकस) विश्व स्तर पर रुग्णता और मृत्यु दर के प्रमुख कारणों में से एक है। हाल ही में, एस निमोनिया के 100 सीरोटाइप के करीब 1,2,3,4,5,6,7 की खोज की गई है। वार्षिक रूप से, इनवेसिव न्यूमोकोकल रोग (आईपीडी) 5 साल से कम उम्र के बच्चों की लगभग 700,000 मौतों का दावा करताहै। एस निमोनिया दुनिया भर में बैक्टीरियल निमोनिया, ओटिटिस मीडिया, मेनिन्जाइटिस और सेप्टिसीमिया का प्रमुख कारणहै।

अफ्रीकी मेनिन्जाइटिस बेल्ट में, सीरोटाइप 1 मेनिन्जाइटिस के प्रकोप के लिए जिम्मेदार है, जहां अनुक्रम प्रकार (एसटी) एसटी 217, एक अत्यंत विषाक्त अनुक्रम प्रकार, प्रमुख 10,11,12,13,14,15 है। मेनिन्जाइटिस पैथोलॉजी में इसके महत्व की तुलना अफ्रीकी मेनिन्जाइटिस बेल्ट16 में नीसेरिया मेनिन्जाइटिस से की गई है। सीरोटाइप 1 अक्सर आईपीडी का मुख्य कारण होता है; हालाँकि, यह गाड़ी में बहुत कम पाया जाता है। वास्तव में, गाम्बिया में, यह सीरोटाइप सभी आक्रामक रोग के 20% के लिए जवाबदेह है, लेकिन यह केवल 14,17,18,19 स्वस्थ वाहक के 0.5% में पाया गया था। सक्षम न्यूमोकोकी में आनुवंशिक विनिमय और पुनर्संयोजन आम तौर पर आक्रामक रोग20 के बजाय गाड़ी में होता है। इसके अलावा, सीरोटाइप 1 को न्यूमोकोकी (केवल 9 दिन) के बीच वर्णित सबसे छोटी गाड़ी दरों में से एक दिखाया गया है। इसलिए, यह प्रस्तावित किया गया है कि इस सीरोटाइप में दूसरों की तुलना में बहुत कम पुनर्संयोजन दर हो सकतीहै।

सीरोटाइप 1 उपभेदों की गाड़ी की कम दर और उप-सहारा अफ्रीका में आक्रामक बीमारी में इसके महत्व के पीछे के कारण को समझने के लिए गहराई से अध्ययन आवश्यक हैं।

यहां हम एक प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करते हैं जो एक विशेष सीरोटाइप 1 स्ट्रेन, 519/43 के जीनोम-वाइड म्यूटेनेसिस की अनुमति देता है। यह स्ट्रेन आसानी से अपने जीनोम में नए डीएनए को प्राप्त और पुनर्संयोजित कर सकता है। यह विधि अभी तक अंतर-तनाव नहीं है, लेकिन यह 519/43 पृष्ठभूमि में किए जाने पर बहुत कुशल है (अन्य लक्ष्यों को उत्परिवर्तित किया गया है, पांडुलिपियां तैयार की गई हैं)। केवल 519/43 तनाव का उपयोग करके, और इसकी प्राकृतिक क्षमता का फायदा उठाकर, साथ ही बहिर्जात डीएनए प्रदान करने के तरीके को प्रतिस्थापित करके, हम इस सीरोटाइप 1 तनाव में न्यूमोलिसिन जीन (प्लाई) को उत्परिवर्तित करने में सक्षम थे। यह विधि हार्वे एट अल.22 द्वारा प्रस्तुत एक पर एक सुधार का प्रतिनिधित्व करती है क्योंकि यह एक अलग सीरोटाइप के माध्यम से डीएनए को पारित करने की आवश्यकता के बिना एक-चरण में किया जाता है। फिर भी, और अंतर-तनाव परिवर्तनशीलता के कारण, सभी उपभेदों के लिए कोई विधि मानकीकृत नहीं की गई है। विशिष्ट जीनों को उत्परिवर्तित करने और इसके प्रभावों का निरीक्षण करने की क्षमता सीरोटाइप 1 एस निमोनिया उपभेदों की गहन समझ की अनुमति देगी और यह उप-सहारा अफ्रीका में मेनिन्जाइटिस में इन उपभेदों की भूमिका के लिए उत्तर प्रदान करेगी।

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Protocol

1. एसओई-पीसीआर23 द्वारा उत्परिवर्तन एम्प्लिकॉन का उत्पादन और स्पेक्टिनोमाइसिन कैसेट का प्रवर्धन

  1. स्ट्रेन 519/43 से प्लाई जीन के फ्लैंकिंग क्षेत्रों के होमोलॉजी आर्म्स (क्रमशः प्लाई 5' (488 बीपी) और प्लाई 3 ' (715 बीपी) के प्रवर्धन के लिए पीसीआर प्रदर्शन करके शुरू करें। प्राइमरों plyFw1_NOTI (TTT GCGGCCCCGTAAATGACTTATATATACTTACTACTCTTG), ply5'R1_BamHI (CGATATAGACCAAGAGAGACGCCGGATCC AGAACCAAACTTGACCTTGATTGATTGA), ply3'F1_BamHI (TCAAGGTCAGTTTTTTTGGATCTCTGGGTCTC ) और plyRv2_NotI (TTTGCCCCCCCCTTTTTTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTTCTC) का उपयोग करें।
  2. प्लाई 5 के लिए निम्नलिखित पीसीआर शर्तों का उपयोग करें: 60 सेकंड के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर डिनेचर करना, चरण 2: 30 सेकंड के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर डिनेचर करना, चरण 3: 30 सेकंड के लिए 58 डिग्री सेल्सियस पर एनीलिंग, चरण 4: 30 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर विस्तार, चरण 5: चरण 2 पर वापस जाएं और 35 चक्रों के लिए दोहराएं, चरण 6: 30 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम विस्तार।
    1. चरण 4 और चरण 6 पर एक्सटेंशन समय के अपवाद के साथ प्लाई 3 के लिए समान पीसीआर शर्तों का उपयोग करें जहां यह 60 सेकंड होना चाहिए।
  3. जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा पीसीआर उत्पादों का विश्लेषण करें और जेल से एम्प्लिकॉन का उत्पादन करें।
  4. निर्माता के निर्देशों (सामग्री की तालिका) में वर्णित प्रोटोकॉल का पालन करते हुए पीसीआर एम्प्लिकॉन को शुद्ध करें।
  5. एसओई-पीसीआर में टेम्प्लेट के रूप में दोनों होमोलॉजी आर्म्स की समान मात्रा का उपयोग करें। दो एम्प्लिकॉन को प्राइमरों plyFw1_ नोटी (टीटीटीजीजीसीसीजीसीसीजीसीएजीटीएसीटीटीएसीटीजी), और plyRv2_NotI (टीटीटीजीसीसीजीसीसीजीसीसीटीसीटीसी) का उपयोग करके फ्यूज करें।
  6. निम्नलिखित एसओई-पीसीआर स्थितियों का उपयोग करें (चरण 1: 2 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर विकृत करना, चरण 2: 30 सेकंड के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर डिनेचरिंग, चरण 3: 30 सेकंड के लिए 58 डिग्री सेल्सियस पर एनीलिंग, चरण 4: 60 सेकंड के लिए 68 डिग्री सेल्सियस पर विस्तार, चरण 5: चरण 2 पर वापस जाएं और 25 चक्रों के लिए दोहराएं, चरण 6: 90 सेकंड के लिए 68 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम विस्तार)।
  7. जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा एसओई-पीसीआर उत्पाद का विश्लेषण करें। जेल निष्कर्षण किट का उपयोग करके जेल से इसे एक्साइज करें और दिए गए निर्देशों का पालन करें।
  8. निम्नलिखित पीसीआर स्थितियों का उपयोग करके प्लास्मिड पीआर 412 से स्पेक्टिनोमाइसिन कैसेट को बढ़ाएं: चरण 1: 60 सेकंड के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर डिनेचरिंग, चरण 2: 30 सेकंड के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर डिनेचरिंग, चरण 3: 30 सेकंड के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर एनीलिंग, चरण 4: 60 सेकंड के लिए 68 डिग्री सेल्सियस पर विस्तार, चरण 5: चरण 2 पर वापस जाएं और 25 चक्रों के लिए दोहराएं, चरण 6: 60 सेकंड के लिए 68 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम विस्तार।
    1. प्राइमर BamHI_SP2F2 (GGATCC CTA GAA CTA GTG GAT CCC CC) और BamHI_SP2R2 (GGATCC AAT TCT GCA GAT TTT AC ATC) का उपयोग करें। प्लास्मिड पीआर 412 को डॉ मार्क प्रूडहोम (सीएनआरएस-यूनिवर्सिट पॉल सबाटियर टूलूज़ फ्रांस) से अधिग्रहित किया गया था।
  9. जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा पीसीआर एम्प्लिकॉन का विश्लेषण करें। ऊपर वर्णित परिणामी पीसीआर एम्प्लिकॉन का उत्पाद शुल्क और शुद्धिकरण करें।

2. प्लास्मिड पीएसडी 1 की उत्पत्ति और ई कोलाई डीएच 5 के रासायनिक परिवर्तन

  1. पीजीईएमटी-आसान सिस्टम I निर्माता निर्देशों (सामग्री की तालिका) का पालन करते हुए एक लिगेशन निष्पादित करें। एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में, 2x लिगेशन बफर का 5 μL, pGEMTeacey का 1 μL, ply_SOE उत्पाद का 2 μL, T4 DNA लिगेज का 1 μL और 20 μL कुल मात्रा में पानी जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें। यह प्लास्मिड पीएसडी 1 उत्पन्न करता है।
  2. रासायनिक रूप से सक्षम ई कोलाई डीएच 5 को पीएसएल 1 के साथ बदलें। बर्फ पर 15 मिनट के लिए 3 μL pSD1 लिगेशन प्रतिक्रिया के साथ रासायनिक रूप से सक्षम E. coli Dh5μ के 50 μL को इंजेक्ट करके शुरू करें। फिर कोशिकाओं को थर्मिक शॉक (42 डिग्री सेल्सियस, 30 एस) के संपर्क में लाकर जारी रखें। कोशिकाओं को 2 मिनट के लिए बर्फ पर रखें।
  3. कोशिकाओं को बर्फ से हटा दें और एस.ओ.सी मीडिया के 350 μL जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस, 120 आरपीएम पर 2 घंटे के लिए संस्कृति को इनक्यूबेट करें।
  4. लुरिया बर्टानी एगर (एलबीए) पर परिवर्तन को 0.4 एमएम आईपीटीजी, नीले/ सफेद चयन के लिए 0.24 मिलीग्राम / एमएल एक्स-गैल और 100 μg / mL एम्पीसिलिन के साथ पूरक किया जाता है ताकि प्लेट में बढ़ने वाली सभी कॉलोनियों में प्लास्मिड बैकबोन हो। सफेद कॉलोनियों में पीएसडी 1 होता है।
  5. तीन सफेद कॉलोनियों को चुनें और 10 एमएल एलबी में रात भर की वृद्धि स्थापित करें, जो 100 μg / mL एम्पीसिलिन के साथ पूरक है। संस्कृतियों को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर झटकों के साथ इनक्यूबेट करें।
  6. अगले दिन 3,082 x g पर संस्कृतियों को सेंट्रीफ्यूज करें और प्लास्मिड निष्कर्षण के लिए गोली का उपयोग करें।

3. प्लास्मिड डीएनए निष्कर्षण, पीएसडी 1 और स्पेक्टिनोमाइसिन जीन के प्रतिबंध पाचन और पीएसएड 2 की असेंबली

  1. वाणिज्यिक किट (सामग्री की तालिका) के साथ प्रदान किए गए निर्देशों के बाद प्लास्मिड डीएनए निकालें।
  2. पीएसडी 1 प्लास्मिड और स्पेक्टिनोमाइसिन कैसेट दोनों के लिए एक बीएएमएचआई-प्रतिबंध पाचन स्थापित करें जो पहले प्रवर्धित और शुद्ध था। तालिका 1 में वर्णित निम्न स्थितियों और मात्राओं का उपयोग करें।
  3. प्रतिबंध पाचन प्रतिक्रियाओं को इनक्यूबेट करें और 3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नियंत्रण करें।
  4. वैद्युतकणसंचलन द्वारा पचने वाले प्रतिबंध का विश्लेषण करें, बैंड का उत्पादन करें और वाणिज्यिक किट (सामग्री की तालिका) के साथ प्रदान किए गए निर्देशों का पालन करते हुए शुद्ध करें।
  5. इसके बाद, बीएएमएचआई-डाइजेस्टेड पीएसएडी 1 और स्पेक्टिनोमाइसिन (चरण 3.2 से) का उपयोग करके निर्माता निर्देशों (सामग्री की तालिका) के बाद एक बंधाव प्रतिक्रिया तैयार करें। एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में, निम्नलिखित प्रतिक्रिया घटक जोड़ें: 2x लिगेशन बफर का 5 μL, 2 μL pSD1, स्पेक्टिनोमाइसिन कैसेट का 2 μL, T4 DNA लिगेज का 1 μL और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें। यह प्लास्मिड पीएसडी 2 उत्पन्न करता है।
  6. प्लास्मिड पीएसडी 2 को रासायनिक रूप से सक्षम ई कोलाई डीएच 5 में बदलें जैसा कि चरण 2.2 में वर्णित है।
  7. प्लास्मिड पीएसडी 2 ले जाने वाले ट्रांसफॉर्मेंट्स का चयन करें, जो एलबीए में बढ़ने की उनकी क्षमता के आधार पर स्पेक्टिनोमाइसिन और एम्पीसिलीन के 100 μg / mL के साथ पूरक हैं।
  8. एक प्लास्मिड डीएनए निष्कर्षण (पीएसडी 2) करें जैसा कि ऊपर वर्णित है और निर्माता के निर्देशों (μL) का पालन करें।

4. एस निमोनिया स्ट्रेन का परिवर्तन 519/43

  1. बीएचआई में एस निमोनिया 519/43 की रातोंरात संस्कृति तैयार करें और इसे 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर स्थिर रूप से बढ़ने दें।
  2. अगले दिन 10 एमएल ताजा बीएचआई शोरबा में 1:50 और 1:100 संस्कृतियों को पतला करें। संस्कृतियों को स्थिर रूप से 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें जब तककि ओडी 595 एनएम 0.05 और 0.1 के बीच न हो (0.1 ओडी के करीब डीएनए का इष्टतम अधिग्रहण)।
  3. एक बार 0.1 का ओडी पहुंचने के बाद, 860 μL लें और एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। इसी माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में जोड़ा गया है: 100 mM NaOH का 100 μL, 20% (w / v) बीएसए का 10 μL, 100 mM CaCl2 का 10 μL, 50 ng / mL CSP124 का 2 μL और pSD2 का 500 ng।
  4. प्रतिक्रिया को 3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर रूप से इनक्यूबेट करें।
  5. 5% रक्त एगर प्लेटों (बीए) पर प्लेट 330 μL, 3 इनक्यूबेशन घंटों में हर घंटे 100 μg / mL स्पेक्टिनोमाइसिन के साथ पूरक है।
  6. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर रात भर प्लेटों को इनक्यूबेट करें। स्पेक्टिनोमाइसिन प्रतिरोधी कॉलोनियों को एक अन्य बीए प्लेट पर 100 μg / mL स्पेक्टिनोमाइसिन के साथ-साथ बीए प्लेटों पर 100 μg / mL एम्पीसिलीन के साथ पूरक किया जाता है। ऊपर बताई गई शर्तों के तहत प्लेटों के दोनों सेटों को रात भर इनक्यूबेट करें। एम्पीसिलीन प्लेटों को प्लास्मिड रीढ़ की हड्डी की उपस्थिति के लिए परीक्षण करना है।
  7. पीसीआर द्वारा स्पेक्टिनोमाइसिन कैसेट की उपस्थिति की पुष्टि प्राइमरों plyFw1_ नोटी (टीटीटीजीजीजीसीसीजीसीजीसीटीएजीटीजी) और SPEC_REV (टीएएटीटीसीटीएटीसीसीजी) का उपयोग करके की जाती है। पीसीआर द्वारा उत्परिवर्तन की पुष्टि प्राइमरों plySCN1 (CCAATGGAAATCTAGGCAAGAGATAA) और plySCN2 (ATTACTTAGTCCAACACGGCTGAT) का उपयोग करके करें जो उत्परिवर्तित क्षेत्र के बाहर संलग्न हैं।
  8. प्राइमरों का उपयोग करके जीनोम के सही स्थान में एकीकरण की पुष्टि करें ( CCAATGGAAATCTAGGAGAGAGA), plySCN2 (ATTACTTAGTCCAACCACGGCTGAT), साथ ही स्पेक्टिनोमाइसिन कैसेट sqr1 (CCTGATCCAAACATGTAAGTACC) sqf2 (CGTagTATTGGGAGAGATAATAGATAA) spec_sqf1 (GGTACTACTTGGGAGAGAGAGAGAGAGAGAGA) और spec_sqr2 TTCATCAGGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGA और spec_sqr2 TTCATCATG

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Representative Results

यहां वर्णित प्रोटोकॉल बाएं और दाएं होमोलॉजी बाहों को बढ़ाने के लिए पीसीआर का उपयोग करके शुरू होता है, जबकि एक साथ प्लाई जीन के मध्य क्षेत्र से 191 बीपी को हटा देता है । पीसीआर का प्रदर्शन करते समय एक बीएएमएचआई साइट को बाएं होमोलॉजी आर्म के 3 ' और दाएं होमोलॉजी आर्म के 5 ' अंत में पेश किया जाता है (चित्रा 1 ए)। इसके बाद पीसीआर-एसओई होता है जहां बाएं और दाएं होमोलॉजी आर्म्स को एक एम्प्लिकॉन (चित्रा 1 बी) में जोड़ा जाता है। इस एसओई-पीसीआर एम्प्लिकॉन को तब प्लास्मिड पीएसडी 1 (चित्रा 1 सी) उत्पन्न करने के लिए टीए क्लोनिंग का उपयोग करके पीजीईएमटीजी में क्लोन किया जाता है। सफल परिवर्तन से सफेद कॉलोनियों का उत्पादन होगा जो एम्पीसिलीन के प्रतिरोधी हैं। कोई भी नीली कॉलोनियां एक खाली पीजीईएमटीजी प्लास्मिड युक्त ट्रांसफॉर्मेंट होंगी। पीएसडी 1 को तब बीएएमएचआई साइट पर पचाया जाएगा जिसे एसओई-पीसीआर (चित्रा 1 डी) के समय पेश किया गया था और एक स्पेक्टिनोमाइसिन कैसेट (संगत सिरों के लिए बीएएमएचआई भी पचाया जाता है) से जोड़ा गया था। नए प्लास्मिड को पीएसएडी 2 (चित्रा 1 ई) कहा जाता है। पीएसडी 2 की सही असेंबली की पुष्टि प्रतिबंध पाचन (चित्रा 2 ए) द्वारा की जाती है। पीएसडी 2, जो एक आत्महत्या प्लास्मिड के रूप में काम करता है क्योंकि इसमें प्रतिकृति का ग्राम-पॉजिटिव संगत मूल नहीं होता है, का उपयोग 519/43डब्ल्यूटी (पहले सक्षम होने के लिए तैयार) को बदलने के लिए किया गया था। सकारात्मक ट्रांसफॉर्मेंट्स रात भर की इनक्यूबेशन के बाद 100 μg / mL स्पेक्टिनोमाइसिन पर बढ़ने वाली कॉलोनियां हैं। सभी कॉलोनियों को नए ताजा रक्त एगर बेस प्लेटों पर पैच किया जाता है, जिसमें 100 μg / mL स्पेक्टिनोमाइसिन के साथ-साथ 100 μg / mL एम्पीसिलीन के साथ पूरक रक्त एगर बेस होता है। स्पेक्टिनोमाइसिन के साथ पूरक दूसरी रात भर की प्लेटों पर बढ़ने वाली कोई भी कॉलोनी संभावित सकारात्मक हैं। एम्पीसिलीन प्लेटों पर बढ़ने वाली कोई भी कॉलोनी जीनोम में कहीं और एम्पीसिलीन कैसेट के पूर्ण प्लास्मिड या पुनर्संयोजन के एकीकरण को निरूपित करेगी। अब तक और स्ट्रेन 519/43 का उपयोग करके एम्पीसिलीन के साथ पूरक प्लेटों पर कोई कॉलोनी नहीं बढ़ी है। पीसीआर द्वारा सकारात्मक सभी कॉलोनियों को अनुक्रमण (चित्रा 2 सी) द्वारा पुष्टि की जानी चाहिए ताकि सम्मिलन के स्थान का आकलन और पुष्टि की जा सके। इसके लिए, प्राइमरों के पास होमोलॉजी क्षेत्र (चित्रा 2 सी) के बाहर उनकी बाध्यकारी साइट होनी चाहिए। चुने गए लक्ष्य में एक बहुत ही चिह्नित फेनोटाइप (लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी) का हेमोलिसिस) है, और इसलिए उत्परिवर्तन की पुष्टि फेनोटाइपिक रूप से भी की जा सकती है (चित्रा 2 बी)। उत्परिवर्ती ने आरबीसी को लाइस करने की अपनी क्षमता खो दी।

घटक अभिक्रिया (μL) Control (μL) अभिक्रिया (μL) Control (μL)
बफ़र 2 2 2 2
pSD1 4 4 -
स्पेक्टिनोमाइसिन कैसेट - - 6 6
BAMHI-HF 1 - 1 -
पानी 13 14 11 12
कुल मात्रा 20 20 20 20

तालिका 1: पीएसडी 1 और स्पेक्टिनोमाइसिन कैसेट के लिए प्रतिबंध पाचन प्रतिक्रिया घटक।

Figure 1
चित्रा 1: म्यूटेनेसिस रणनीति का अवलोकन। ए) होमोलॉजी हथियारों का प्रवर्धन (प्लाई 3' और प्लाई 5 ' (लेन 2 से 5 तक); और ओवरलैपिंग एक्सटेंशन पीसीआर (लेन 6 और 7) द्वारा स्प्लिसिंग। एल-हाइपरलैडर I (बायोलाइन), लेन 1- प्रतिक्रिया के लिए नकारात्मक नियंत्रण, लेन 2 और 3- प्लाई5 '(488 बीपी) और प्लाई 3' (715 बीपी) होमोलॉजी हथियारों को डी 39 जीडीएनए, लेन 4 और 5- प्लाई 5 '(488 बीपी) और प्लाई 3 ' (715 बीपी) होमोलॉजी आर्म्स से प्रवर्धित किया गया है। दाहिने हाथ की लेन 6- डी 39 एसओई पीसीआर उत्पाद, लेन 7- 519/43 एसओई पीसीआर उत्पाद (1235 बीपी)। बी) प्राप्त अंतिम एसओई-पीसीआर निर्माण को दर्शाने वाला योजनाबद्ध (ply_SOE); तीर द्वारा इंगित प्राइमर हैं जिनका उपयोग होमोलॉजी बाहों के साथ-साथ चुने गए प्रतिबंध पाचन दोनों के बीच होमोलॉजी क्षेत्र प्राप्त करने के लिए किया जाता है। सी) प्लास्मिड पीएसडी 1, ply_SOE की क्लोनिंग को दर्शाता है; डी) पीएसडी 1 और स्पेक्टिनोमाइसिन कैसेट के पाचन पर प्रतिबंध। ई) अंतिम निर्माण पीएसएडी 2 जिसे तब एस निमोनिया को बदलने के लिए आत्महत्या प्लास्मिड के रूप में उपयोग किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: A) "पीएसएडी 2 में स्पेक्टिनोमाइसिन कैसेट की उपस्थिति की पुष्टि". एल-हाइपरलैडर 1 केबी (बायोलाइन); 1- पीएसडी 1 बीएएमएचआई के साथ पच जाता है; 2-पीएसडी 2 बीएएमएचआई के साथ पच जाता है; एल हाइपरलैडर 1 केबी (बायोलाइन); 3- स्पेक्टिनोमाइसिन कैसेट को पीआर 412 से प्रवर्धित किया गया, 4- स्पेक्टिनोमाइसिन कैसेट को बीएएमएचआई के साथ पचाया गया; बी) डी 39, 519/43 डब्ल्यूटी और उत्परिवर्ती 519/43 के लिए हेमोलिटिक गतिविधि के निर्धारण द्वारा न्यूमोलिसिन उत्परिवर्तन की फेनोटाइपिक पुष्टि। इसकी तुलना लाल रक्त कोशिकाओं के हेमोलिसिस से 0.5% सैपोनिन द्वारा की गई थी। सैपोनिन-व्युत्पन्न हेमोलिसिस को 100% माना जाता है और इसके खिलाफ 519/43डब्ल्यूटी और 519/43एफवाई की दरों की गणना की गई थी। प्रत्येक डेटा बिंदु 5 तकनीकी और 3 जैविक प्रतिकृतियों का औसत है। सी) अनुक्रमण डेटा उत्परिवर्ती जीनोम क्षेत्र में मैप किया गया जहां न्यूमोलिसिन बाधित था। प्राइमरों को तीर के रूप में और नाम से इंगित किया जाता है। PLYSCN1 और PLYSCN2 होमोलॉजी हथियारों के बाहर बंधते हैं। प्राइमर PLYSCN1 और 2 से प्राप्त अनुक्रमण से पता चला है कि स्पेक्टिनोमाइसिन कैसेट तक होमोलॉजी क्षेत्र के बाहर पड़ोसी क्षेत्रों से निर्बाध अनुक्रम था, जो जीनोम में सम्मिलन का प्रदर्शन करता था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया, विशेष रूप से सीरोटाइप 1, आक्रामक न्यूमोकोकल बीमारी और मेनिन्जाइटिस के कारण एक वैश्विक खतरा बना हुआ है। अफ्रीका में सीरोटाइप 1 के खिलाफ सुरक्षात्मक होने वाले विभिन्न टीकों की शुरूआत के बावजूद, यह सीरोटाइप अभी भी प्रकोप पैदा करने में सक्षम है जो उच्च रुग्णताऔर मृत्यु दर का कारण बनता है। आनुवंशिक रूप से इस सीरोटाइप में हेरफेर करने की क्षमता इसकी नैदानिक प्रासंगिकता के कारण महत्वपूर्ण महत्व की है। इस अध्ययन में वर्णित विधि इस सीरोटाइप के भीतर एक प्रतिनिधि तनाव के आनुवंशिक हेरफेर की अनुमति देती है। एक इनवेसिव स्ट्रेन 519/43 (एसटी 5316), डेनमार्कमें मेनिन्जाइटिस रोगी से एक नैदानिक अलगाव।

यहां प्रस्तुत पद्धति, ज्यादातर चुने हुए तनाव के कारण सफल रही क्योंकि यह बहिर्जात डीएनए प्राप्त कर सकती है, लेकिन एस निमोनिया परिवर्तन के लिए उपयोग किए जाने वाले पारंपरिक प्रोटोकॉल में किए गए परिवर्तनों के कारण, हमारे परिवर्तन प्रोटोकॉल के लिए एक विशिष्ट सफलता दर लगभग 70% है।

इस पद्धति के साथ, सामान्य रैखिक डीएनए के बजाय आत्महत्या प्लास्मिड का उपयोग करना सर्वोपरि है। परंपरागत रूप से, रैखिक डीएनए 26,27,28 का उपयोग किया गया होगा; हालांकि इस रूप में बहिर्जात डीएनए का उपयोग करने के सभी प्रयास असफल रहे। इसके अलावा, कम अवशोषण पर एस निमोनिया 519/43 की प्राकृतिक क्षमता का फायदा उठाने के प्रयास सफल नहीं हुए। समस्या निवारण से पता चला कि तनाव 519/43 के लिए प्राकृतिक क्षमता अधिक थी जब ओडी595 0.1 था, जो एस निमोनिया के अन्य सीरोटाइप के लिए देखे गए आंकड़ों से अलग है जहां उच्चतम प्राकृतिक क्षमता बहुत कम ओडी24 पर देखी गई थी।

विधि को मान्य करने के लिए, एक न्यूमोलिसिन उत्परिवर्ती का निर्माण किया गया था क्योंकि यह फेनोटाइप का पालन करने में आसान प्रदर्शित करता है; हालांकि, यह साबित करने के लिए कि विधि को इस तनाव के भीतर किसी भी जीन पर लागू किया जा सकता है, अन्य जीनों को सफलतापूर्वक लक्षित किया गया है (तैयारी में पांडुलिपियां)। इस तरह की विधि, एक आत्महत्या वेक्टर का उपयोग करके, जिसमें कोई ग्राम-पॉजिटिव संगत मूल नहीं है, का उपयोग क्रोमोसोमल पूरकता, रुचि के जीन के अतिवृद्धि, साथ ही रिपोर्टर सिस्टम की शुरूआत के लिए भी किया जा सकता है, सभी पड़ोसी जीनों को होमोलॉजी क्षेत्रों के रूप में उपयोग करके।

निमोनिया सीरोटाइप 1, स्ट्रेन 519/43 के लिए आनुवंशिक उपकरणों का विस्तार महत्वपूर्ण है क्योंकि, अब हम आनुवंशिक रूप से सीधे प्रतिनिधि उपभेदों में हेरफेर कर सकते हैं। स्ट्रेन 519/43 रुचि का है क्योंकि यह आनुवंशिक रूप से व्यवहार्य है, रोगजनक है क्योंकि यह मेनिन्जाइटिस रोगी से अलग किया गया था, और इसका हेरफेर मेनिन्जाइटिस के विकास और स्थापना को बेहतर ढंग से समझने के लिए सुराग प्रदान करेगा। इससे पहले, प्रजातियों के भीतर कुछ निर्धारकों को समझना एस निमोनिया के बहुत अच्छी तरह से विशेषता वाले उपभेदों में से एक में जीन को सम्मिलित करके किया गया था, जैसे कि डी 39 (सीरोटाइप 2)। सीरोटाइप 129 पर म्यूटेनेसिस के साथ कठिनाइयों के कारण, पैटन एट अल द्वारा इस तरह के दृष्टिकोण का उपयोग किया गया था। 519/43 की तुलना में सीरोटाइप 1 प्लाई के कम हेमोलाइटिक एलील वाले डी 39 परउनके द्वारा रिपोर्ट किए गए परिणाम ∆पैली हमारे द्वारा प्रस्तुत किए गए लोगों से भिन्न हैं जो मूल तनाव पृष्ठभूमि के भीतर जीन को उत्परिवर्तित करने में सक्षम होने के महत्व को उजागर करते हैं। बाद में, वही समूह एक गैर-वंश ए सीरोटाइप 1 स्ट्रेन22 को उत्परिवर्तित करने में सक्षम था। दिलचस्प बात यह है कि उनका प्रोटोकॉल हमारे से काफी अलग है, क्योंकि यह एक दो-चरणीय दृष्टिकोण है जिसके लिए उत्परिवर्तन को पहले सीरोटाइप 2 उपभेदों में करने की आवश्यकता होती है और फिर इसका उपयोग उनके सीरोटाइप 1 तनाव में बदलने के लिए टेम्पलेट के रूप में किया जाता है।

वर्तमान में, प्रस्तुत विधि में एक सीमा है। अभी के लिए, यह विधि केवल 519/43 प्रतिनिधि तनाव के लिए काम करती है। इसी सटीक प्रोटोकॉल को अन्य उपभेदों में आजमाया गया था, अर्थात् एसटी 3081 और एसटी 303 से नैदानिक आइसोलेट्स और यह सफल नहीं हुआ था। इसके अलावा, कोशिका को बहिर्जात डीएनए के वितरण की एक विधि के रूप में इलेक्ट्रोपोरेशन का भी सभी तीन अनुक्रम प्रकारों पर प्रयास किया गया था, जिसमें सकारात्मक परिणाम केवल 519/43 के लिए देखे गए थे। सभी सीरोटाइप 1 उपभेदों के लिए पद्धति का विस्तार और मानकीकरण सर्वोपरि महत्व का है क्योंकि पूरे समूह में भारी परिवर्तनशीलता है। वर्तमान में सीरोटाइप 1 के भीतर सभी उपभेदों के लिए विधि की प्रयोज्यता का विस्तार करने के लिए अध्ययन चल रहे हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम मेनिनजाइटिस ट्रस्ट और एमआरसी को इस काम के लिए धन प्रदान करने के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AccuPrime Pfx DNA polymerase Invitrogen 12344024 Used for amplification of the fragments
Ampicillin sodium salt Sigma Aldrich A9518 Used for bacterial selection on stage 1(pSD1)
Blood Agar Base Oxoid CM0055 Used to plate S. pneumoniae transformants
Bovine Serum Albumine sigma 55470 used for S. pneumoniae Transformation
Brain Heart Infusion Oxoid CM1135 used to grow S. pneumoniae cells
Calcium Chloride Cacl2 Sigma 449709 used for S. pneumoniae Transformation
Competence stimulating peptide 1 AnaSpec AS-63779 used for S. pneumoniae Transformation
Luria Broth Agar Gibco 22700025 used for plating and selection of pSD1 and pSD2
Luria Broth Base (Miller's formulation) Gibco 12795027 used for plating and selection of pSD1 and pSD2
Monarch Gel Extraction Kit NEB T1020S Used to extract the bands from the DNA gel
Monarch Plasmid Miniprep Kit NEB T1010S Used to extract plasmid from the cells
pGEM T-easy Promega A1360 used as suicide plasmid
S.O.C. Invitrogen 15544034 used for recovery of cells after transformation
Sodium Hydroxide (NaOH) Sigma S0899 used for S.pneumoniae Transformation
Spectinomycin Hydrochloride SigmaAldrich PHR1426 Used for bacterial selection
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells Invitrogen 18265017 used for the creation of pSD1 and pSD2

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References

  1. Bentley, S. D., et al. Genetic Analysis of the Capsular Biosynthetic Locus from All 90 Pneumococcal Serotypes. PLoS Genetics. 2 (3), 31 (2006).
  2. Calix, J. J., Nahm, M. H. A new pneumococcal serotype, 11E, has a variably inactivated wcjE gene. The Journal of Infectious Diseases. 202 (1), 29-38 (2010).
  3. Park, I. H., Pritchard, D. G., Cartee, R., Brandao, A., Brandileone, M. C. C., Nahm, M. H. Discovery of a New Capsular Serotype (6C) within Serogroup 6 of Streptococcus pneumoniae. Journal of Clinical Microbiology. 45 (4), 1225-1233 (2007).
  4. Jin, P., et al. First Report of Putative Streptococcus pneumoniae Serotype 6D among Nasopharyngeal Isolates from Fijian Children. The Journal of Infectious Diseases. 200 (9), 1375-1380 (2009).
  5. Oliver, M. B., vander Linden, M. P. G., Küntzel, S. A., Saad, J. S., Nahm, M. H. Discovery of Streptococcus pneumoniae Serotype 6 Variants with Glycosyltransferases Synthesizing Two Differing Repeating Units. Journal of Biological Chemistry. 288 (36), 25976-25985 (2013).
  6. Calix, J. J., et al. Serological Characterization of Two Capsule Subtypes among Streptococcus pneumoniae Serotype 20 Strains. Journal of Biological Chemistry. 287 (33), 27885-27894 (2012).
  7. Park, I. H., et al. and Serological Characterization of a New Pneumococcal Serotype, 6H, and Generation of a Pneumococcal Strain Producing Three Different Capsular Repeat Units. Clinical and Vaccine Immunology. 22 (3), 313-318 (2015).
  8. O'Brien, K. L., et al. Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates. The Lancet. 374 (9693), 893-902 (2009).
  9. Henriques-Normark, B., Tuomanen, E. I. The Pneumococcus: Epidemiology, Microbiology, and Pathogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 3 (7), 010215 (2013).
  10. Leimkugel, J., et al. An Outbreak of Serotype 1 Streptococcus pneumoniae Meningitis in Northern Ghana with Features That Are Characteristic of Neisseria meningitidis Meningitis Epidemics. The Journal of Infectious Diseases. 192 (2), 192-199 (2005).
  11. Yaro, S., et al. Epidemiological and Molecular Characteristics of a Highly Lethal Pneumococcal Meningitis Epidemic in Burkina Faso. Clinical Infectious Diseases. 43 (6), 693-700 (2006).
  12. Antonio, M., et al. Molecular epidemiology of pneumococci obtained from Gambian children aged 2-29 months with invasive pneumococcal disease during a trial of a 9-valent pneumococcal conjugate vaccine. BMC Infectious Diseases. 8 (1), 81 (2008).
  13. Kwambana-Adams, B. A., et al. An outbreak of pneumococcal meningitis among older children (≥5 years) and adults after the implementation of an infant vaccination programme with the 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in Ghana. BMC Infectious Diseases. 16 (1), 575 (2016).
  14. Antonio, M., et al. Seasonality and outbreak of a predominant Streptococcus pneumoniae serotype 1 clone from The Gambia: Expansion of ST217 hypervirulent clonal complex in West Africa. BMC Microbiology. 8 (1), 198 (2008).
  15. Staples, M., et al. Molecular characterization of an Australian serotype 1 Streptococcus pneumoniae outbreak. Epidemiology and Infection. 143 (2), 325-333 (2015).
  16. Gessner, B. D., Mueller, J. E., Yaro, S. African meningitis belt pneumococcal disease epidemiology indicates a need for an effective serotype 1 containing vaccine, including for older children and adults. BMC Infectious Diseases. 10 (1), 22 (2010).
  17. Hill, P. C., et al. Nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae in Gambian infants: a longitudinal study. Clinical Infectious Diseases. 46 (6), 807-814 (2008).
  18. Ebruke, C., et al. Temporal changes in nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae serotype 1 genotypes in healthy Gambians before and after the 7-valent pneumococcal conjugate vaccine. PeerJ. 3, 90 (2015).
  19. Adegbola, R. A., et al. Serotype and antimicrobial susceptibility patterns of isolates of Streptococcus pneumoniae causing invasive disease in The Gambia 1996-2003. Tropical Medicine and International Health. 11 (7), 1128-1135 (2006).
  20. Marks, L. R., Reddinger, R. M., Hakansson, A. P. High Levels of Genetic Recombination during Nasopharyngeal Carriage and Biofilm Formation in Streptococcus pneumoniae. mBio. 3 (5), (2012).
  21. Ritchie, N. D., Mitchell, T. J., Evans, T. J. What is different about serotype 1 pneumococci. Future Microbiology. 7 (1), 33-46 (2012).
  22. Harvey, R. M., et al. The variable region of pneumococcal pathogenicity island 1 is responsible for unusually high virulence of a serotype 1 isolate. Infection and Immunity. 84 (3), 822-832 (2016).
  23. Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. BioTechniques. 8 (5), 528-535 (1990).
  24. Alioing, G., Granadel, C., Morrison, D. A., Claverys, J. P. Competence pheromone, oligopeptide permease, and induction of competence in Streptococcus pneumoniae. Molecular Microbiology. 21 (3), 471-478 (1996).
  25. Lund, E. Enumeration and description of the strains belonging to the State Serum Institute, Copenhagen Denmark. , (1951).
  26. Barany, F., Tomasz, A. Genetic transformation of Streptococcus pneumoniae by heterologous plasmid deoxyribonucleic acid. Journal of Bacteriology. 144 (2), 698-709 (1980).
  27. Terra, V. S., Homer, K. A., Rao, S. G., Andrew, P. W., Yesilkaya, H. Characterization of novel β-galactosidase activity that contributes to glycoprotein degradation and virulence in Streptococcus pneumoniae. Infection and Immunity. 78 (1), (2010).
  28. Terra, V. S., Zhi, X., Kahya, H. F., Andrew, P. W., Yesilkaya, H. Pneumococcal 6-phospho-β-glucosidase (BglA3) is involved in virulence and nutrient metabolism. Infection and Immunity. 84 (1), (2015).
  29. Harvey, R. M., Ogunniyi, A. D., Chen, A. Y., Paton, J. C. Pneumolysin with Low Hemolytic Activity Confers an Early Growth Advantage to Streptococcus pneumoniae in the Blood. Infection and Immunity. 79 (10), 4122 (2011).
  30. Terra, V. S., Plumptre, C. D., Wall, E. C., Brown, J. S., Wren, B. W. Construction of a pneumolysin deficient mutant in Streptococcus pneumoniae serotype 1 strain 519/43 and phenotypic characterisation. Microbial Pathogenesis. 141, 103999 (2020).

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