Summary
Qui, descriviamo un sierotipo 1 di S. pneumoniae ceppo 519/43 che può essere geneticamente modificato utilizzando la sua capacità di acquisire naturalmente DNA e un plasmide suicida. Come prova di principio, è stato creato un mutante isogeno nel gene della pneumolisina (compensato).
Abstract
Il sierotipo 1 di Streptococcus pneumoniae rimane un problema enorme nei paesi a basso e medio reddito, in particolare nell'Africa sub-sahariana. Nonostante la sua importanza, gli studi su questo sierotipo sono stati ostacolati dalla mancanza di strumenti genetici per modificarlo. In questo studio, descriviamo un metodo per modificare geneticamente un isolato clinico del sierotipo 1 (ceppo 519/43). È interessante notare che questo è stato ottenuto sfruttando la capacità dello Pneumococco di acquisire naturalmente il DNA. Tuttavia, a differenza della maggior parte degli pneumococchi, l'uso del DNA lineare non ha avuto successo; Per mutare questo importante ceppo, è stato necessario utilizzare un plasmide suicida. Questa metodologia ha fornito i mezzi per una comprensione più profonda di questo sierotipo elusivo, sia in termini di biologia che di patogenicità. Per convalidare il metodo, la principale tossina pneumococcica conosciuta, la pneumolisina, è stata mutata perché ha un fenotipo ben noto e facile da seguire. Abbiamo dimostrato che il mutante, come previsto, ha perso la sua capacità di lisare i globuli rossi. Essendo in grado di mutare un gene importante nel sierotipo di interesse, siamo stati in grado di osservare diversi fenotipi per la perdita di funzione mutanti su infezioni intraperitoneali e intranasali da quelli osservati per altri sierotipi. In sintesi, questo studio dimostra che il ceppo 519/43 (sierotipo 1) può essere geneticamente modificato.
Introduction
Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae, lo pneumococco) è una delle principali cause di morbilità e mortalità a livello globale. Fino a poco tempo fa, sono stati scoperti quasi 100 sierotipi di S. pneumoniae 1,2,3,4,5,6,7. Ogni anno, la malattia pneumococcica invasiva (IPD) rivendica circa 700.000 decessi, di bambini di età inferiore ai 5 anni8. S. pneumoniae è la principale causa di polmonite batterica, otite media, meningite e setticemia in tutto il mondo9.
Nella cintura africana della meningite, il sierotipo 1 è responsabile delle epidemie di meningite, dove il tipo di sequenza (ST) ST217, un tipo di sequenza estremamente virulento, è dominante 10,11,12,13,14,15. La sua importanza nella patologia della meningite è stata paragonata a quella di Neisseria meningitidis nella cintura africana della meningite16. Il sierotipo 1 è spesso la causa principale dell'IPD; tuttavia, si trova molto raramente in carrozza. Infatti, in Gambia, questo sierotipo è responsabile del 20% di tutte le malattie invasive, ma è stato trovato solo nello 0,5% dei portatori sani14,17,18,19. Lo scambio genetico e la ricombinazione negli pneumococchi competenti avvengono generalmente nel trasporto piuttosto che nella malattia invasiva20. Inoltre, il sierotipo 1 ha dimostrato di avere uno dei tassi di trasporto più brevi descritti tra gli pneumococchi (solo 9 giorni). Pertanto, è stato proposto che questo sierotipo potrebbe avere un tasso di ricombinazione molto più basso rispetto ad altri21.
Sono necessari studi approfonditi per comprendere il motivo del basso tasso di trasporto dei ceppi del sierotipo 1 e la sua importanza nelle malattie invasive nell'Africa sub-sahariana.
Qui riportiamo un protocollo che consente la mutagenesi genome-wide di un particolare ceppo di sierotipo 1, 519/43. Questo ceppo può facilmente acquisire e ricombinare nuovo DNA nel suo genoma. Questo metodo non è ancora inter-sforzo, ma è molto efficiente se fatto in background 519/43 (altri obiettivi sono stati mutati, manoscritti in preparazione). Semplicemente utilizzando il ceppo 519/43 e sfruttando la sua competenza naturale, oltre a sostituire il modo in cui viene fornito il DNA esogeno, siamo stati in grado di mutare il gene della pneumolisina (ply) in questo ceppo sierotipo 1. Questo metodo rappresenta un miglioramento rispetto a quello presentato da Harvey et al.22 in quanto viene fatto in un unico passaggio senza la necessità di far passare il DNA attraverso un sierotipo diverso. Tuttavia, e a causa della variabilità tra i ceppi, nessun metodo è stato standardizzato per tutti i ceppi. La capacità di mutare geni specifici e osservarne gli effetti permetterà una profonda comprensione dei ceppi di sierotipo 1 S. pneumoniae e fornirà risposte per il ruolo di questi ceppi nella meningite nell'Africa sub-sahariana.
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Protocol
1. Generazione dell'amplicone mutante mediante SOE-PCR23 e amplificazione della cassetta della spectinomicina
- Inizia eseguendo la PCR per l'amplificazione dei bracci di omologia (ply 5' (488 bp) e ply3' (715 bp) rispettivamente) delle regioni fiancheggianti del gene ply dal ceppo 519/43. Utilizzare primer plyFw1_NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG), ply5'R1_BamHI (CGAAATATAGACCAAAGGACGC GGATCC AGAACCAAACTTGACCTTGA), ply3'F1_BamHI (TCAAGGTCAAGTTTGGTTCTGGATCC GCGTCCTTTGGTCTATATTTCG) e plyRv2_NotI (TTTGCGGCCCCCCATTTTCTACCTTATCCTACC).
- Utilizzare le seguenti condizioni PCR per ply5': denaturazione a 94 °C per 60 s, fase 2: denaturazione a 94 °C per 30 s, fase 3: ricottura a 58 °C per 30 s, fase 4: estensione a 72 °C per 30 s, fase 5: tornare alla fase 2 e ripetere per 35 cicli, fase 6: estensione finale a 72 °C per 30 s.
- Utilizzare le stesse condizioni PCR per ply3' ad eccezione del tempo di estensione al punto 4 e al passaggio 6 dove dovrebbe essere di 60 s.
- Analizzare i prodotti PCR mediante elettroforesi su gel e asportare l'amplicone dal gel.
- Purificare gli ampliconi PCR seguendo il protocollo descritto nelle istruzioni del produttore (Tabella dei materiali).
- Utilizzare quantità equimolari di entrambi i bracci di omologia come modelli nella SOE-PCR. Fondere i due ampliconi usando primer plyFw1_ NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG) e plyRv2_NotI (TTTGCGGCCCCATTTTCTACCTTATCCTCTACC).
- Utilizzare le seguenti condizioni SOE-PCR (fase 1: denaturazione a 94 °C per 2 minuti, fase 2: denaturazione a 94 °C per 30 s, fase 3: ricottura a 58 °C per 30 s, fase 4: estensione a 68 °C per 60 s, fase 5: tornare alla fase 2 e ripetere per 25 cicli, fase 6: estensione finale a 68 °C per 90 s).
- Analizzare il prodotto SOE-PCR mediante elettroforesi su gel. Prelevarlo dal gel utilizzando un kit di estrazione del gel e seguire le istruzioni fornite.
- Amplificare la cassetta di spectinomicina dal plasmide pR412 utilizzando le seguenti condizioni PCR: fase 1: denaturazione a 94 °C per 60 s, fase 2: denaturazione a 94 °C per 30 s, fase 3: ricottura a 55 °C per 30 s, fase 4: estensione a 68 °C per 60 s, fase 5: tornare al punto 2 e ripetere per 25 cicli, fase 6: estensione finale a 68 °C per 60 s.
- Utilizzare primer BamHI_SP2F2 (GGATCC CTA GAA CTA GTG GAT CCC CC) e BamHI_SP2R2 (GGATCC AAT TCT GCA GAT TTT AC ATG ATC). Il plasmide pR412 è stato acquisito dal Dr. Marc PrudHomme (CNRS-Université Paul Sabatier Tolosa Francia).
- Analizzare gli ampliconi della PCR mediante elettroforesi su gel. Accisare e purificare l'amplicone PCR risultante come descritto sopra.
2. Generazione di plasmide pSD1 e trasformazione chimica di E. coli Dh5α
- Eseguire una legatura seguendo le istruzioni del produttore del sistema pGEMT-easy I (Tabella dei materiali). In una provetta per microcentrifuga, aggiungere 5 μL di tampone di legatura 2x, 1 μL di pGEMTeasy, 2 μL di prodotto ply_SOE, 1 μL di T4 DNA ligasi e acqua per un volume totale di 20 μL. Incubare per una notte a 4 °C. Questo genera plasmide pSD1.
- Trasformare E. coli Dh5α chimicamente competente con pSD1. Inizia incubando 50 μL di E. coli Dh5α chimicamente competente con 3 μL di reazione di legatura pSD1 per 15 minuti su ghiaccio. Quindi continuare esponendo le cellule a shock termico (42 °C, 30 s). Mettere le celle sul ghiaccio per 2 minuti.
- Rimuovere le cellule dal ghiaccio e aggiungere 350 μL di media S.O.C. Incubare la coltura per 2 ore a 37 °C, 120 giri/min.
- Placcare la trasformazione su Luria Bertani Agar (LBA) integrata con 0,4 mM IPTG, 0,24 mg/mL X-Gal per la selezione blu/bianco e 100 μg/mL di ampicillina per garantire che tutte le colonie che crescono nella piastra abbiano la spina dorsale plasmidica. Le colonie bianche contengono pSD1.
- Scegli tre colonie bianche e imposta crescite notturne in 10 ml di LB, integrate con 100 μg / mL di ampicillina. Incubare le colture per una notte a 37 °C agitando.
- Il giorno successivo centrifugare le colture a 3.082 x g e utilizzare il pellet per l'estrazione del plasmide.
3. Estrazione del DNA plasmide, digestione di restrizione del gene pSD1 e spectinomicina e assemblaggio di pSD2
- Estrarre il DNA plasmidico seguendo le istruzioni fornite con il kit commerciale (Table of Materials).
- Impostare una digestione a restrizione BamHI sia per il plasmide pSD1 che per la cassetta di spectinomicina precedentemente amplificata e purificata. Utilizzare le seguenti condizioni e quantità descritte nella tabella 1.
- Incubare le reazioni di digestione di restrizione e controllare a 37 °C per 3 ore.
- Analizzare il digesto di restrizione mediante elettroforesi, asportare la fascia e purificare seguendo le istruzioni fornite con il kit commerciale (Table of Materials).
- Quindi, preparare una reazione di legatura seguendo le istruzioni del produttore (Tabella dei materiali) utilizzando la pSD1 digerita da BamHI e la spectinomicina (dal punto 3.2). In una provetta da microcentrifuga, aggiungere i seguenti componenti di reazione: 5 μL di tampone di legatura 2x, 2 μL di pSD1, 2 μL di cassetta di spectinomicina, 1 μL di T4 DNA ligasi e incubare per una notte a 4 °C. Questo genera plasmide pSD2.
- Trasformare il plasmide pSD2 in E. coli Dh5α chimicamente competente come descritto nella fase 2.2.
- Selezionare i trasformanti portatori di plasmide pSD2 in base alla loro capacità di crescere in LBA integrato con 100 μg/ml di spectinomicina e ampicillina.
- Eseguire un'estrazione del DNA plasmidico (pSD2) come descritto sopra e seguendo le istruzioni del produttore (μL).
4. Trasformazione del ceppo di S. pneumoniae 519/43
- Preparare una coltura notturna di S. pneumoniae 519/43 in BHI e lasciarlo crescere staticamente a 37 °C, 5% CO2.
- Il giorno seguente diluire le colture 1:50 e 1:100 in 10 ml di brodo fresco BHI. Incubare le colture staticamente a 37 °C fino a quando l'OD595nm è compreso tra 0,05 e 0,1 (acquisizione ottimale del DNA più vicina a 0,1 OD).
- Una volta raggiunto un OD di 0,1, prendere 860 μL e trasferirli in una provetta per microcentrifuga. In questo stesso tubo di microcentrifuga aggiungere: 100 μL di 100 mM NaOH, 10 μL di 20% (p/v) BSA, 10 μL di 100 mM CaCl 2,2 μL di 50 ng/mL CSP124 e 500 ng di pSD2.
- Incubare la reazione staticamente a 37 °C per 3 ore.
- Piastra 330 μL su piastre di agar sangue al 5% (BA) integrate con 100 μg/mL di spectinomicina, ogni ora durante le 3 ore di incubazione.
- Incubare le piastre per una notte a 37 °C, 5% CO2. Patch colonie resistenti alla spectinomicina su un'altra piastra BA integrata con 100 μg/mL di spectinomicina e su piastre di BA integrate con 100 μg/mL di ampicillina. Incubare entrambi i set di piastre durante la notte nelle condizioni sopra indicate. Le piastre di ampicillina devono verificare la presenza della spina dorsale plasmide.
- Confermare la presenza della cassetta di spectinomicina mediante PCR utilizzando primer plyFw1_ NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG) e SPEC_REV (TAATTCCTCTAAGTCATAATTTCCG). Confermare la mutazione mediante PCR utilizzando i primer plySCN1 (CCAATGGAAATCGCTAGGCAAGAGATAA) e plySCN2 (ATTACTTAGTCCAACCACGGCTGAT) che si attaccano al di fuori della regione mutata.
- Confermare l'integrazione nella corretta posizione del genoma mediante sequenziamento utilizzando primer plySCN1 (CCAATGGAAATCGCTAGGCAAGAGATAA), plySCN2 (ATTACTTAGTCCAACCACGGCTGAT), nonché primer con il loro sito di legame nella cassetta spectinomicina sqr1 (CCTGATCCAAACATGTAAGTACC) sqf2 (CGTAGTTATCTTGGAGAGAGA) spec_sqf1 (GGTACTTACATGTTTGGATCAGG ) e spec_sqr2 TATTCTCTCCAAGATAACTACG.
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Representative Results
Il protocollo qui descritto inizia utilizzando la PCR per amplificare i bracci di omologia sinistro e destro, eliminando contemporaneamente 191 bp dalla regione centrale del gene ply . Durante l'esecuzione della PCR viene introdotto un sito BamHI al 3' del braccio di omologia sinistro e all'estremità 5' del braccio di omologia destro (Figura 1A). Questo è seguito da PCR-SOE dove i bracci di omologia sinistro e destro sono fusi in un unico amplicone (Figura 1B). Questo amplicone SOE-PCR viene quindi clonato in pGEMTeasy utilizzando la clonazione TA per generare plasmide pSD1 (Figura 1C). Una trasformazione di successo produrrà colonie bianche resistenti all'ampicillina. Tutte le colonie blu saranno trasformanti contenenti un plasmide pGEMTeasy vuoto. pSD1 sarà quindi digerito nel sito BamHI che è stato introdotto al momento della SOE-PCR (Figura 1D) e legato a una cassetta di spectinomicina (anche BamHI digerito per le estremità compatibili). Il nuovo plasmide è chiamato pSD2 (Figura 1E). Il corretto assemblaggio di pSD2 è confermato dalla digestione di restrizione (Figura 2A). pSD2, che funziona come un plasmide suicida poiché non contiene un'origine di replicazione compatibile con Gram-positivi, è stato utilizzato per trasformare 519/43WT (precedentemente preparato per essere competente). I trasformanti positivi sono colonie che crescono su 100 μg/mL di spectinomicina dopo un'incubazione notturna. Tutte le colonie sono rattoppate su piastre di base di agar di sangue fresco integrate con 100 μg / mL di spectinomicina e base di agar sanguigno integrata con 100 μg / ml di ampicillina. Tutte le colonie che crescono sulle seconde piastre notturne integrate con spectinomicina sono possibili positivi. Qualsiasi colonia che cresce su piastre di ampicillina denoterà l'integrazione del plasmide completo o la ricombinazione della cassetta di ampicillina altrove nel genoma. Finora e utilizzando il ceppo 519/43 non sono cresciute colonie sulle piastre integrate con ampicillina. Tutte le colonie positive alla PCR devono essere confermate mediante sequenziamento (Figura 2C) per valutare e confermare la posizione dell'inserimento. A tal fine, i primer devono avere il loro sito di legame al di fuori della regione di omologia (Figura 2C). Il bersaglio scelto ha un fenotipo molto marcato (emolisi dei globuli rossi (RBC)), e quindi la mutazione può anche essere confermata fenotipicamente (Figura 2B). Il mutante ha perso la sua capacità di lisare i globuli rossi.
| Componenti | Reazione (μL) | Controllo (μL) | Reazione (μL) | Controllo (μL) |
| Buffer | 2 | 2 | 2 | 2 |
| pSD1 | 4 | 4 | - | |
| Cassetta di spettinomicina | - | - | 6 | 6 |
| BamHI-HF | 1 | - | 1 | - |
| Acqua | 13 | 14 | 11 | 12 |
| Volume totale | 20 | 20 | 20 | 20 |
Tabella 1: Componenti della reazione di digestione di restrizione per pSD1 e cassetta di spectinomicina.
Figura 1: Panoramica della strategia di mutagenesi. A) Amplificazione dei bracci di omologia (Ply3' e Ply5' (corsie da 2 a 5); e Splicing mediante Overlapping Extension PCR (corsie 6 e 7). L- hyperladder I (Bioline), corsia 1- controllo negativo per la reazione, corsia 2 e 3- ply5' (488 bp) e ply3' (715 bp) bracci di omologia amplificati da D39 gDNA, corsie 4 e 5- ply5' (488 bp) e ply3' (715 bp) bracci di omologia amplificati da 519/43 gDNA. Corsia laterale destra 6- D39 SOE PCR prodotto, corsia 7- 519/43 SOE PCR prodotto (1235 bp). B) Schema raffigurante il costrutto finale SOE-PCR ottenuto (ply_SOE); Indicati da frecce sono i primer utilizzati per ottenere la regione di omologia tra i due bracci di omologia e la digestione di restrizione scelta. C) Plasmide pSD1, raffigurante la clonazione di ply_SOE; D) Digestione restrittiva di pSD1 e cassetta di spectinomicina. E) Costrutto finale pSD2 che viene poi utilizzato come plasmide suicida per trasformare S. pneumoniae. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: A) Conferma della presenza della cassetta di spectinomicina in pSD2. L- hyperladder 1kb (Bioline); 1- pSD1 digerito con BamHI; 2-pSD2 digerito con BamHI; L hyperladder 1 kb (Bioline); 3- Cassetta di spetinomicina amplificata da pR412, 4- Cassetta di spettinomicina digerita con BamHI; B) Conferma fenotipica della mutazione della pneumolisina mediante determinazione dell'attività emolitica per D39, 519/43WT e mutante 519/43Δply. Questo è stato confrontato con l'emolisi dei globuli rossi dello 0,5% di saponina. L'emolisi derivata dalla saponina è considerata al 100% e i tassi per 519/43Wt e 519/43Δply sono stati calcolati rispetto ad essa. Ogni punto dati è la media di 5 repliche tecniche e 3 biologiche. C) Dati di sequenziamento mappati nella regione del genoma mutante in cui la pneumolisina è stata interrotta. I primer sono indicati come frecce e per nome. PLYSCN1 e PLYSCN2 si legano al di fuori dei bracci di omologia. Il sequenziamento ottenuto dai primer PLYSCN1 e 2 ha mostrato che c'era una sequenza ininterrotta dalle regioni vicine al di fuori dell'area di omologia fino alla cassetta di spectinomicina, dimostrando l'inserimento nel genoma. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Streptococcus pneumoniae, in particolare il sierotipo 1, continua ad essere una minaccia globale che causa malattie invasive da pneumococco e meningite. Nonostante l'introduzione di vari vaccini che dovrebbero essere protettivi contro il sierotipo 1, in Africa, questo sierotipo è ancora in grado di causare epidemie che portano ad alta morbilità e mortalità13. La capacità di manipolare geneticamente questo sierotipo è di fondamentale importanza a causa della sua rilevanza clinica. Il metodo descritto in questo studio consente la manipolazione genetica di un ceppo rappresentativo all'interno di questo sierotipo. Un ceppo invasivo 519/43 (ST5316), un isolato clinico da un paziente affetto da meningite in Danimarca25.
La metodologia qui presentata, ha avuto successo soprattutto grazie al ceppo scelto in quanto può acquisire DNA esogeno, ma anche a causa delle modifiche apportate ai protocolli tradizionali utilizzati per la trasformazione di S. pneumoniae , un tasso di successo tipico al nostro protocollo di trasformazione è di circa il 70%.
Con questa metodologia, è fondamentale utilizzare un plasmide suicida invece del solito DNA lineare. Convenzionalmente, sarebbe stato usato il DNA lineare26,27,28; tuttavia tutti i tentativi di utilizzare il DNA esogeno in questa forma non hanno avuto successo. Inoltre, i tentativi di sfruttare la competenza naturale di S. pneumoniae 519/43 a minore assorbanza non hanno avuto successo. La risoluzione dei problemi ha dimostrato che la competenza naturale per il ceppo 519/43 era più elevata quando OD595 era 0,1, che è diverso dai dati osservati per altri sierotipi di S. pneumoniae in cui è stata osservata la massima competenza naturale a OD24 molto basso.
Per convalidare il metodo, è stato costruito un mutante della pneumolisina perché presenta un fenotipo facile da seguire; Tuttavia, per dimostrare che il metodo può essere applicato a qualsiasi gene all'interno di questo ceppo, altri geni sono stati presi di mira con successo (manoscritti in preparazione). Tale metodo, utilizzando un vettore suicida che non ha un'origine compatibile con i Gram-positivi, potrebbe anche essere utilizzato per la complementazione cromosomica, la sovraespressione di geni di interesse, nonché l'introduzione di sistemi reporter, il tutto utilizzando i geni vicini come regioni di omologia.
L'espansione degli strumenti genetici al sierotipo 1 di S. pneumoniae , ceppo 519/43 è importante perché ora possiamo manipolare geneticamente direttamente ceppi rappresentativi. Il ceppo 519/43 è interessante in quanto è geneticamente flessibile, è patogeno in quanto è stato isolato da un paziente affetto da meningite e la sua manipolazione fornirà indizi per comprendere meglio lo sviluppo e l'instaurazione della meningite. In precedenza, la comprensione di alcuni determinanti all'interno della specie è stata effettuata inserendo il gene in questione in uno dei ceppi molto ben caratterizzati di S. pneumoniae, come D39 (sierotipo 2). Tale approccio è stato utilizzato da Paton et al., a causa delle difficoltà con la mutagenesi sul sierotipo 129. I risultati da loro riportati su D39 portatore di un allele meno emolitico del sierotipo 1 ply rispetto al 519/43 ∆ply differiscono da quelli presentati da noi30 evidenziando l'importanza di poter mutare un gene all'interno del ceppo originale. Successivamente, lo stesso gruppo è stato in grado di mutare un ceppo22 del sierotipo 1 non appartenente alla linea A. È interessante notare che il loro protocollo è abbastanza distinto dal nostro, in quanto è un approccio in due fasi che richiede che la mutazione venga eseguita prima nei ceppi del sierotipo 2 e questo viene poi utilizzato come modello da trasformare nel loro ceppo sierotipo 1.
Attualmente, c'è una limitazione nel metodo presentato. Per ora, questo metodo funziona solo per il ceppo rappresentativo 519/43. Lo stesso identico protocollo è stato provato in altri ceppi, vale a dire isolati clinici da ST3081 e ST303 e non ha avuto successo. Inoltre, l'elettroporazione come metodo di consegna del DNA esogeno alla cellula è stata tentata anche su tutti e tre i tipi di sequenza, con risultati positivi osservati solo per 519/43. Espandere e standardizzare la metodologia a tutti i ceppi del sierotipo 1 è di fondamentale importanza in quanto vi è un'enorme variabilità in tutto il gruppo. Sono attualmente in corso studi per espandere l'applicabilità del metodo a tutti i ceppi all'interno del sierotipo 1.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare il Meningitis Trust e il MRC per aver fornito finanziamenti per questo lavoro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AccuPrime Pfx DNA polymerase | Invitrogen | 12344024 | Used for amplification of the fragments |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A9518 | Used for bacterial selection on stage 1(pSD1) |
| Blood Agar Base | Oxoid | CM0055 | Used to plate S. pneumoniae transformants |
| Bovine Serum Albumine | sigma | 55470 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Brain Heart Infusion | Oxoid | CM1135 | used to grow S. pneumoniae cells |
| Calcium Chloride Cacl2 | Sigma | 449709 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Competence stimulating peptide 1 | AnaSpec | AS-63779 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Luria Broth Agar | Gibco | 22700025 | used for plating and selection of pSD1 and pSD2 |
| Luria Broth Base (Miller's formulation) | Gibco | 12795027 | used for plating and selection of pSD1 and pSD2 |
| Monarch Gel Extraction Kit | NEB | T1020S | Used to extract the bands from the DNA gel |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | NEB | T1010S | Used to extract plasmid from the cells |
| pGEM T-easy | Promega | A1360 | used as suicide plasmid |
| S.O.C. | Invitrogen | 15544034 | used for recovery of cells after transformation |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma | S0899 | used for S.pneumoniae Transformation |
| Spectinomycin Hydrochloride | SigmaAldrich | PHR1426 | Used for bacterial selection |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Invitrogen | 18265017 | used for the creation of pSD1 and pSD2 |
References
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