Summary
ここでは、自然にDNAを獲得する能力を利用して遺伝子改変できる 肺炎球 菌血清型1株519/43と自殺プラスミドについて述べる。原理の証明として、ニューモリシン(プライ)遺伝子の同質変異体が作られました。
Abstract
肺炎連鎖球菌 血清型1は、低中所得国、特にサハラ以南のアフリカで依然として大きな問題となっています。その重要性にもかかわらず、この血清型の研究は、それを改変するための遺伝的ツールの欠如によって妨げられてきました。本研究では、血清型1臨床分離株(株519/43)を遺伝子改変する方法について述べる。興味深いことに、これは肺炎球菌が自然にDNAを取得する能力を利用することによって達成されました。しかし、ほとんどの肺炎球菌とは異なり、線状DNAの使用は成功しませんでした。この重要な株を変異させるには、自殺プラスミドを使用する必要がありました。この方法論は、その生物学と病原性の両方の観点から、このとらえどころのない血清型をより深く理解するための手段を提供しました。この方法を検証するために、主要な既知の肺炎球菌毒素であるニューモリシンは、よく知られたわかりやすい表現型を持っているため、変異しました。予想通り、突然変異体が赤血球を溶解する能力を失ったことを示しました。目的の血清型で重要な遺伝子を変異させることができれば、腹腔内および鼻腔内感染時の機能喪失変異体の表現型が他の血清型で観察されたものとは異なる表現型を観察することができました。要約すると、この研究は、株519/43(血清型1)が遺伝子組み換え可能であることを証明しています。
Introduction
肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae、肺炎球菌)は、世界的に罹患率と死亡率の主な原因の1つです。最近まで、100近くの血清型のS.肺炎が発見されています1,2,3,4,5,6,7。毎年、侵襲性肺炎球菌疾患(IPD)は、5歳未満の子供の約70万人が死亡していると主張しています8。肺炎球菌は、世界中の細菌性肺炎、中耳炎、髄膜炎、敗血症の主な原因です9。
アフリカの髄膜炎ベルトでは、血清型1が髄膜炎の発生の原因であり、非常に毒性の高い配列型である配列型(ST)ST217が優勢です10、11、12、13、14、15。髄膜炎の病理学におけるその重要性は、アフリカの髄膜炎ベルト16における髄膜炎菌の重要性に例えられています。血清型1はしばしばIPDの主な原因です。しかし、それは非常にまれに馬車で見つかります。実際、ガンビアでは、この血清型はすべての侵襲性疾患の20%を占めていますが、健康な保因者の0.5%にしか見られませんでした14,17,18,19。有能な肺炎球菌における遺伝子交換および組換えは、侵襲性疾患ではなくキャリッジで一般的に起こる20。さらに、血清型1は、肺炎球菌の中で説明されている最も短い保菌率の1つ(わずか9日)を有することが示されている。したがって、この血清型は他の血清型よりもはるかに低い組換え率を有する可能性があることが提案されている21。
血清型1株の保菌率が低い理由と、サハラ以南のアフリカの侵襲性疾患におけるその重要性を理解するには、詳細な研究が必要です。
ここでは、特定の血清型1株、519/43のゲノムワイド突然変異誘発を可能にするプロトコルを報告します。この株は、新しいDNAを簡単に取得してゲノムに組み換えることができます。この方法はまだ系統間ではありませんが、519/43バックグラウンドで行うと非常に効率的です(他のターゲットは変異しており、原稿は準備中です)。519/43株を使用し、その自然な能力を利用し、外因性DNAの提供方法を置き換えるだけで、この血清型1株のニューモリシン遺伝子(プライ)を変異させることができました。この方法は、異なる血清型を介してDNAを通過させる必要なしにワンステップで行われるため、Harveyら22 によって提示されたものの改良を表しています。それにもかかわらず、また株間の変動性のために、すべての菌株に標準化された方法はありません。特定の遺伝子を変異させ、その効果を観察する能力は、血清型 1 S. pneumoniae 株の深い理解を可能にし、サハラ以南のアフリカの髄膜炎におけるこれらの株の役割についての答えを提供します。
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Protocol
1. SOE-PCR23による変異アンプリコンの生成とスペクチノマイシンカセットの増幅
- まず、株519/43由来のプライ遺伝子の隣接領域の相同性アーム(それぞれply 5'(488 bp)およびply3'(715 bp))の増幅のためにPCRを実行します。プライマー plyFw1_NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATTACTATCTATG), ply5'R1_BamHI (CGAAATATAGACCAAAGGACGC GGATCC AGAACCAAACTTGACCTTGA), ply3'F1_BamHI (TCAAGGTCAAGTTTGGTTCTGGATCC GCGTCCTTTGGTCTATATTTCG) および plyRv2_NotI (TTTGCGGCCGCCATTTTCTACCTTTTATCCTCTACC).
- ply5'には次のPCR条件を使用します:94°Cで60秒間変性、ステップ2:94°Cで30秒間変性、ステップ3:58°Cで30秒間アニーリング、ステップ4:72°Cで30秒間伸長、ステップ5:ステップ2に戻って35サイクル繰り返し、ステップ6:72°Cで30秒間の最終伸長。
- ply3' には、ステップ 4 とステップ 6 の延長時間が 60 秒であることを除いて、同じ PCR 条件を使用します。
- ゲル電気泳動によりPCR産物を分析し、ゲルからアンプリコンを切除します。
- 製造元の説明書(材料表)に記載されているプロトコルに従ってPCRアンプリコンを精製します。
- SOE-PCRのテンプレートとして、等モル量の両相同性アームを使用します。NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTG plyRv2_NotI GGGGGGTGGTGCCATGGCCATGCCATGCCTGCCTGCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTTGCCTCCTCCTTGCCTCCTCCCCTCCTCCCCTCCTCCTCCTTGCCTGGCCTCCTCCTCCTCCTGGCCTGGCCTGGCCTGGCCTGGTTTCCTGGCCTGGCCTGGTTTCCTCCTGGCCTGGTTTCCTCCTCCTGGCCTGGTTTCCTCCTCCTCCTCCTCCTGGCCTGGTTTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCTCCCTGGTTGCCTGGCCTGGCCTCCTCCTCC plyFw1_
- 以下のSOE-PCR条件を使用します(ステップ1:94°Cで2分間変性、ステップ2:94°Cで30秒間変性、ステップ3:58°Cで30秒間アニーリング、ステップ4:68°Cで60秒間伸長、ステップ5:ステップ2に戻って25サイクル繰り返し、ステップ6:最終伸長を68°Cで90秒間)。
- SOE-PCR産物をゲル電気泳動で分析します。ゲル抽出キットを使用してゲルから切り取り、提供された指示に従ってください。
- 以下のPCR条件を用いてプラスミドpR412からスペクチノマイシンカセットを増幅する: ステップ1:94°Cで60秒間変性、 ステップ2:94°Cで30秒間変性、 ステップ3:55°Cで30秒間アニーリング、 ステップ4:68°Cで60秒間伸長、 ステップ5:ステップ2に戻り、25サイクル繰り返します。 ステップ6:68°Cで60秒間の最終延長。
- プライマー BamHI_SP2F2 (GGATCC CTA GAA CTA GTG GAT CCC CC) および BamHI_SP2R2 (GGATCC AAT TCT GCA GAT TTT AC ATG ATC) を使用してください。プラスミドpR412は、Marc PrudHomme博士(CNRS-ポール・サバティエ・トゥールーズ・フランス大学)から取得しました。
- PCRアンプリコンをゲル電気泳動で解析する。得られたPCRアンプリコンを上記のように切り出し精製する。
2. プラスミドpSD1の生成と 大腸菌 Dh5αの化学変換
- pGEMT-easyシステムIの製造元の指示に従ってライゲーションを実行します(材料表)。マイクロ遠心チューブに、5 μLの2xライゲーションバッファー、1 μLのpGEMTeasy、2 μLのply_SOE産物、1 μLのT4 DNAリガーゼおよび水を20 μLの総容量に加えます。4°Cで一晩インキュベートします。 これによりプラスミドpSD1が生成されます。
- 化学的に有能な 大腸菌 Dh5αをpSD1で変換します。まず、50 μLの化学的に有能な 大腸菌 Dh5αと3 μLのpSD1ライゲーション反応を氷上で15分間インキュベートします。次に、細胞を熱衝撃(42°C、30秒)にさらして続行します。細胞を氷上に2分間置きます。
- 細胞を氷から取り出し、350 μLのS.O.C培地を加えます。培養液を37°C、120rpmで2時間インキュベートする。
- 0.4 mM IPTG、青/白選択用の0.24 mg/mL X-Gal、および100 μg/mLアンピシリンを添加したルリアベルタニ寒天培地(LBA)で形質転換をプレート化し、プレート内で増殖するすべてのコロニーがプラスミド骨格を持つようにします。白色コロニーはpSD1を含む。
- 3つの白いコロニーを選び、100 μg/mLのアンピシリンを添加した10 mLのLBで一晩増殖させます。培養物を振とうしながら37°Cで一晩インキュベートします。
- 翌日、培養液を3,082 x g で遠心分離し、ペレットをプラスミド抽出に使用します。
3. プラスミドDNA抽出、pSD1およびスペクチノマイシン遺伝子の制限消化およびpSD2のアセンブリ
- 市販のキットに付属の説明書に従ってプラスミドDNAを抽出します(材料表)。
- pSD1プラスミドと、以前に増幅および精製したスペクチノマイシンカセットの両方に対してBamHI制限消化をセットアップします。 表 1 に記載されている以下の条件と数量を使用してください。
- 制限酵素処理反応とコントロールを37°Cで3時間インキュベートします。
- 電気泳動で制限ダイジェストを分析し、バンドを切除し、市販のキットに付属の説明書に従って精製します(材料表)。
- 次に、BamHI-消化されたpSD1およびスペクチノマイシン(ステップ3.2から)を使用して、製造元の説明書(材料の表)に従ってライゲーション反応を調製する。マイクロ遠心チューブに、5 μLの2xライゲーションバッファー、2 μL pSD1、2 μLのスペクチノマイシンカセット、1 μLのT4 DNAリガーゼの反応成分を加え、4°Cで一晩インキュベートします。 これによりプラスミドpSD2が生成されます。
- プラスミドpSD2を、ステップ2.2に記載の化学的に有能な 大腸菌 Dh5αに形質転換する。
- プラスミドpSD2を保有する形質転換体は、100 μg/mLのスペクチノマイシンとアンピシリンを添加したLBAでの増殖能に基づいて選択します。
- 上記のようにプラスミドDNA抽出(pSD2)を実行し、製造元の指示に従って(μL)を実行します。
4. 肺炎球菌 519/43株の形質転換
- S. pneumoniae 519/43をBHIで一晩培養し、37°C、5%CO2で静的に増殖させます。
- 翌日、培養物を10 mLの新鮮なBHIブロスで1:50および1:100に希釈します。OD595nm が0.05〜0.1になるまで、培養液を37°Cで静的にインキュベートします(0.1 ODに近いDNAの最適な取得)。
- ODが0.1に達したら、860 μLを取り、マイクロ遠心チューブに移します。この同じマイクロ遠心チューブに、100 μLの100 mM NaOH、10 μLの20%(w/v)BSA、10 μLの100 mM CaCl 2、2 μLの50 ng/mL CSP124 および500 ngのpSD2を追加します。
- 反応液を37°Cで3時間静置インキュベートします。
- 330 μLを、100 μg/mLのスペクチノマイシンを添加した5%血液寒天プレート(BA)に、3時間かけて1時間ごとにプレートします。
- プレートを37°C、5%CO2で一晩インキュベートします。スペクチノマイシン耐性コロニーを、100 μg/mLのスペクチノマイシンを添加した別のBAプレート、および100 μg/mLのアンピシリンを添加したBAプレートにパッチします。上記の条件下で両方のプレートセットを一晩インキュベートします。アンピシリンプレートは、プラスミド骨格の存在について試験するためのものである。
- NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTG) および SPEC_REV (TAATTCCTCTAAGTCTAATTTCCG) plyFw1_プライマーを用いたPCRによりスペクチノマイシンカセットの存在を確認する。変異領域の外側に付着するプライマーplySCN1(CCAATGGAATCGCTAGGCAAGAGATAA)およびplySCN2(ATTACTTAGTCCAACCACGGCTGAT)を用いてPCRにより変異を確認します。
- プライマーplySCN1(CCAATGGAAATCGCTAGGCAAGAGATAA)、plySCN2(ATTACTTAGTCCAACCACGGCTGAT)、およびスペクチノマイシンカセットsqr1(CCTGATCCAACATGTAAGATTACC)sqf2(CGTAGTTATCTTGGAGAATA)spec_sqf1(GGTACTTACATGTTTGGATGGATCAGG)およびspec_sqr2 TATTCTCTCTCCAAGATAACTACGGのそれらの結合部位を有するプライマーを使用してシーケンシングすることにより、ゲノムの正しい位置への組み込みを確認します。
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Representative Results
ここで説明するプロトコルは、PCRを使用して左右の相同性アームを増幅すると同時に、 プライ 遺伝子の中央領域から191 bpを削除することから始まります。PCRを実行している間、BamHI部位が左相同性アームの3'側および右相同性アームの5'末端に導入されます(図1A)。これに続いて、左右の相同性アームが1つのアンプリコンに融合されたPCR-SOEが続きます(図1B)。次に、このSOE-PCRアンプリコンをTAクローニングを使用してpGEMTeasyにクローニングし、プラスミドpSD1を生成します(図1C)。形質転換が成功すると、アンピシリンに耐性のある白いコロニーが得られます。青色コロニーは、空のpGEMTeasyプラスミドを含む形質転換体になります。次に、pSD1は、SOE-PCR時に導入されたBamHI部位で消化され(図1D)、スペクチノマイシンカセットにライゲーションされます(BamHIも互換性のある末端で消化されます)。この新しいプラスミドはpSD2と呼ばれます(図1E)。pSD2の正しい組み立ては、制限酵素処理によって確認されます(図2A)。グラム陽性適合性複製起点を含まないため自殺プラスミドとして機能するpSD2を使用して、519/43WTの形質転換に使用しました(以前に有能になるように調製されました)。ポジティブ形質転換体は、一晩インキュベートした後、100 μg/mLのスペクチノマイシン上で増殖するコロニーです。すべてのコロニーは、100 μg/mLのスペクチノマイシンを添加した新しく新鮮な血液寒天ベースプレートと、100 μg/mLのアンピシリンを添加した血液寒天ベースプレートにパッチを当てます。スペクチノマイシンを添加した2番目の一晩プレートで成長するコロニーは、陽性の可能性があります。アンピシリンプレート上で増殖するコロニーは、完全なプラスミドの統合またはゲノムの他の場所でのアンピシリンカセットの再結合を示します。これまでのところ、株519/43を使用しても、アンピシリンを添加したプレート上にコロニーは成長していません。PCRによって陽性となったすべてのコロニーは、挿入の位置を評価および確認するために、シーケンシング(図2C)によって確認する必要があります。この目的のために、プライマーは相同性領域の外側にそれらの結合部位を有しなければならない(図2C)。選択された標的は非常に顕著な表現型(赤血球溶血(RBC))を有するため、突然変異も表現型的に確認することができる(図2B)。突然変異体はRBCを溶解する能力を失った。
| コンポーネント | 反応反応 (μL) | コントロール(μL) | 反応反応 (μL) | コントロール(μL) |
| バッファ | 2 | 2 | 2 | 2 |
| pSD1 | 4 | 4 | - | |
| スペクチノマイシンカセット | - | - | 6 | 6 |
| バムヒHF | 1 | - | 1 | - |
| 水 | 13 | 14 | 11 | 12 |
| 総量 | 20 | 20 | 20 | 20 |
表1:pSD1およびスペクチノマイシンカセットに対する制限消化反応成分。
図1:突然変異誘発戦略の概要。 A)相同性アームの増幅(Ply3'およびPly5'(レーン2〜5)。 オーバーラップ伸長PCRによるスプライシング(レーン6および7)。L-ハイパーラダーI(Bioline)、レーン1-反応のための陰性対照、レーン2および3-D39 gDNAから増幅された5'(488 bp)およびply3'(715 bp)相同性アーム、レーン4および5-ply5'(488 bp)およびply3'(715 bp)相同性アームは519/43 gDNAから増幅した。右側のレーン6-D39 SOE PCR産物、レーン7-519/43 SOE PCR産物(1235 bp)。 B)得られた最終的なSOE-PCR構築物を描いた概略図(ply_SOE);矢印で示されているのは、両方の相同性アーム間の相同性領域、および選択された制限酵素処理を取得するために使用されるプライマーです。 C)プラスミドpSD1、ply_SOEのクローニングを描写する; D)pSD1およびスペクチノマイシンカセットの制限消化。 E)pSD2を最終構築し、次いで肺 炎球菌を形質転換するための自殺プラスミドとして使用する。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:A)pSD2におけるスペクチノマイシンカセットの存在の確認。L-ハイパーラダー1kb(バイオリン);1-pSD1をBamHIで消化しました。2-pSD2をBamHIで消化;Lハイパーラダー1キロバイト(バイオライン);3−pR412から増幅されたスペクチノマイシンカセット、4−BamHIで消化されたスペクチノマイシンカセット; B)D39、519/43WTおよび変異体519/43Δplyの溶血活性の測定によるニューモリシン変異の表現型確認。これは、0.5%サポニンによる赤血球の溶血と比較されました。サポニン由来の溶血は100%と見なされ、519/43Wtおよび519/43Δplyの割合がそれに対して計算されました。各データポイントは、5つの技術的反復と3つの生物学的反復の平均です。 C)ニューモリシンが中断された変異ゲノム領域にマッピングされたシーケンシングデータ。プライマーは矢印と名前で示されています。PLYSCN1およびPLYSCN2は相同性アームの外側に結合する。プライマーPLYSCN1および2から得られた配列決定は、相同性領域の外側の隣接領域からスペクチノマイシンカセットまで途切れることのない配列があることを示し、ゲノムへの挿入を実証した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
肺炎連鎖球菌、特に血清型1は、侵襲性肺炎球菌疾患および髄膜炎を引き起こす世界的な脅威であり続けている。血清型1に対して保護されるべきさまざまなワクチンの導入にもかかわらず、アフリカでは、この血清型は依然として高い罹患率と死亡率につながる発生を引き起こす可能性があります13。この血清型を遺伝的に操作する能力は、その臨床的関連性のために非常に重要です。この研究に記載されている方法は、この血清型内の代表的な株の遺伝子操作を可能にします。侵襲性株519/43(ST5316)、デンマークの髄膜炎患者からの臨床分離株25。
ここで紹介した方法論は、外因性DNAを取得できるため、主に選択された株によって成功しましたが、肺 炎球菌 の形質転換に使用される従来のプロトコルに加えられた変更により、形質転換プロトコルの典型的な成功率は約70%です。
この方法論では、通常の線状DNAの代わりに自殺プラスミドを使用することが最も重要です。従来、線状DNA26,27,28が使用されていたであろう。しかし、この形で外因性DNAを使用する試みはすべて失敗しました。さらに、より低い吸光度でS. pneumoniae 519/43の自然な能力を利用する試みは成功しなかった。トラブルシューティングの結果、OD595が0.1の場合、株519/43の自然能力が高くなり、非常に低いOD24で最も高い自然能力が観察された肺炎球菌の他の血清型で観察されたデータとは異なります。
この方法を検証するために、ニューモリシン変異体は、わかりやすい表現型を示すため構築されました。しかし、この方法がこの株内の任意の遺伝子に適用できることを証明するために、他の遺伝子を首尾よく標的化している(準備中の原稿)。グラム陽性相溶性起源を持たない自殺ベクターを用いたこのような方法は、隣接する遺伝子を相同性領域として使用することにより、染色体相補、目的遺伝子の過剰発現、およびレポーターシステムの導入にも使用できます。
S. pneumoniae血清型1、株519/43への遺伝的ツールの拡大は、代表的な株を直接遺伝子操作できるようになったため、重要です。株519/43は、遺伝的に柔軟性があり、髄膜炎患者から分離されたため病原性であり、その操作は髄膜炎の発症と確立をよりよく理解するための手がかりを提供するため、興味深いものです。以前は、種内の特定の決定基を理解することは、D39(血清型2)などの非常によく特徴付けられた肺炎球菌株の1つに問題の遺伝子を挿入することによって行われていました。このようなアプローチは、血清型129上の突然変異誘発が困難であるため、Patonらによって使用された。血清型1プライの溶血性対立遺伝子が少ないD39について、519/43プライと比較して彼らが報告した結果は∆、私たち30によって提示されたものとは異なり、元の株のバックグラウンド内で遺伝子を変異させることができることの重要性を強調しています。その後、同じグループが非系統A血清型1株22を変異させることができました。興味深いことに、彼らのプロトコルは、血清型2株で最初に突然変異を行い、これが血清型1株で形質転換されるテンプレートとして使用される2段階のアプローチであるため、私たちのプロトコルとはまったく異なります。
現在、提示された方法には1つの制限があります。今のところ、この方法は519/43代表株に対してのみ機能します。同じ正確なプロトコルが他の株、すなわちST3081およびST303からの臨床分離株でも試みられたが、成功しなかった。さらに、外因性DNAを細胞に送達する方法としてのエレクトロポレーションも3つの配列タイプすべてで試みられ、519/43でのみ陽性の結果が観察されました。方法論をすべての血清型1株に拡大および標準化することは、グループ全体に大きなばらつきがあるため、最も重要です。血清型1内のすべての菌株へのこの方法の適用可能性を拡大するための研究が現在進行中です。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
髄膜炎トラストとMRCがこの作業に資金を提供してくれたことに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AccuPrime Pfx DNA polymerase | Invitrogen | 12344024 | Used for amplification of the fragments |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A9518 | Used for bacterial selection on stage 1(pSD1) |
| Blood Agar Base | Oxoid | CM0055 | Used to plate S. pneumoniae transformants |
| Bovine Serum Albumine | sigma | 55470 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Brain Heart Infusion | Oxoid | CM1135 | used to grow S. pneumoniae cells |
| Calcium Chloride Cacl2 | Sigma | 449709 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Competence stimulating peptide 1 | AnaSpec | AS-63779 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Luria Broth Agar | Gibco | 22700025 | used for plating and selection of pSD1 and pSD2 |
| Luria Broth Base (Miller's formulation) | Gibco | 12795027 | used for plating and selection of pSD1 and pSD2 |
| Monarch Gel Extraction Kit | NEB | T1020S | Used to extract the bands from the DNA gel |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | NEB | T1010S | Used to extract plasmid from the cells |
| pGEM T-easy | Promega | A1360 | used as suicide plasmid |
| S.O.C. | Invitrogen | 15544034 | used for recovery of cells after transformation |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma | S0899 | used for S.pneumoniae Transformation |
| Spectinomycin Hydrochloride | SigmaAldrich | PHR1426 | Used for bacterial selection |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Invitrogen | 18265017 | used for the creation of pSD1 and pSD2 |
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