Summary
Her beskriver vi en S. pneumoniae serotype 1-stamme 519/43 som kan genmodifiseres ved å bruke sin evne til naturlig å erverve DNA og et selvmordsplasmid. Som prinsippbevis ble det laget en isogen mutant i pneumolysin (ply)-genet.
Abstract
Streptococcus pneumoniae serotype 1 er fortsatt et stort problem i lav- og mellominntektsland, spesielt i Afrika sør for Sahara. Til tross for sin betydning har studier i denne serotypen blitt hindret av mangelen på genetiske verktøy for å modifisere den. I denne studien beskriver vi en metode for genmodifisering av et klinisk isolat av serotype 1 (stamme 519/43). Interessant nok ble dette oppnådd ved å utnytte pneumokokkens evne til naturlig å skaffe seg DNA. Imidlertid, i motsetning til de fleste pneumokokker, var bruken av lineært DNA ikke vellykket; For å mutere denne viktige stammen måtte et selvmordsplasmid brukes. Denne metoden har gitt midler til en dypere forståelse av denne unnvikende serotypen, både når det gjelder biologi og patogenisitet. For å validere metoden ble det viktigste kjente pneumokokktoksinet, pneumolysin, mutert fordi det har en velkjent og lett å følge fenotype. Vi viste at mutanten, som forventet, mistet sin evne til å lyse røde blodlegemer. Ved å kunne mutere et viktig gen i serotypen av interesse, var vi i stand til å observere forskjellige fenotyper for tap av funksjonsmutanter ved intraperitoneale og intranasale infeksjoner fra de som ble observert for andre serotyper. Oppsummert viser denne studien at stamme 519/43 (serotype 1) kan genmodifiseres.
Introduction
Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae, pneumokokker) er en av de viktigste årsakene til sykelighet og dødelighet globalt. Inntil nylig har nærmere 100 serotyper av S. pneumoniae blitt oppdaget 1,2,3,4,5,6,7. Årlig hevder invasiv pneumokokksykdom (IPD) rundt 700 000 dødsfall, av barn yngre enn 5år 8. S. pneumoniae er den viktigste årsaken til bakteriell lungebetennelse, otitis media, meningitt og septikemi over hele verden9.
I det afrikanske meningittbeltet er serotype 1 ansvarlig for meningittutbrudd, hvor sekvenstype (ST) ST217, en ekstremt virulent sekvenstype, er dominerende 10,11,12,13,14,15. Dens betydning i meningittpatologi har blitt sammenlignet med Neisseria meningitidis i det afrikanske meningittbeltet16. Serotype 1 er ofte hovedårsaken til IPD; Det er imidlertid svært sjelden funnet i vogn. Faktisk, i Gambia, er denne serotypen ansvarlig for 20% av all invasiv sykdom, men den ble bare funnet hos 0,5% av friske bærere14,17,18,19. Genetisk utveksling og rekombinasjon i kompetente pneumokokker forekommer vanligvis i vogn snarere enn ved invasiv sykdom20. Videre har serotype 1 vist seg å ha en av de korteste transportratene beskrevet blant pneumokokker (kun 9 dager). Derfor har det blitt foreslått at denne serotypen kan ha en mye lavere rekombinasjonsrate enn andre21.
Dybdestudier er nødvendig for å forstå årsaken til serotype 1-stammenes lave transportrate og dens betydning i invasiv sykdom i Afrika sør for Sahara.
Her rapporterer vi en protokoll som tillater genom-bred mutagenese av en bestemt serotype 1-stamme, 519/43. Denne stammen kan enkelt skaffe seg og rekombinere nytt DNA i genomet. Denne metoden er ennå ikke inter-belastning, men det er svært effektiv når det gjøres i 519/43 bakgrunn (andre mål har blitt mutert, manuskripter under utarbeidelse). Ved ganske enkelt å bruke 519/43-stammen, og utnytte dens naturlige kompetanse, samt erstatte måten det eksogene DNA leveres på, var vi i stand til å mutere pneumolysingenet (ply) i denne serotype 1-stammen. Denne metoden representerer en forbedring av den som presenteres av Harvey et al.22 som det gjøres i ett trinn uten å måtte passere DNA gjennom en annen serotype. Likevel, og på grunn av variasjon mellom stammer, har ingen metode blitt standardisert for alle stammer. Evnen til å mutere spesifikke gener og observere dens effekter vil tillate en dyp forståelse av serotype 1 S. pneumoniae-stammer , og det vil gi svar på rollen til disse stammene i meningitt i Afrika sør for Sahara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generering av muterende amplikon med SOE-PCR23 og amplifisering av spectinomycin-kassetten
- Start med å utføre PCR for amplifisering av homologiarmene (henholdsvis ply 5' (488 bp) og ply3' (715 bp) av de flankerende områdene av ply-genet fra stamme 519/43. Bruk primere plyFw1_NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAATGACTTTATACTAGCTATG), ply5'R1_BamHI (CGAAATATAGACCAAAGGACGC GGATCC AGAACCAAACTTGACCTTGA), ply3'F1_BamHI (TCAAGGTCAAGTTTTTTTCTGGATCC GCGTCCTTTGGTCTATATTTCG) og plyRv2_NotI (TTTGCGGCCGCCATTTTCTACCTTATCCTCTACC).
- Bruk følgende PCR-betingelser for ply5': denaturering ved 94 °C i 60 s, trinn 2: denaturering ved 94 °C i 30 s, trinn 3: glødning ved 58 °C i 30 s, trinn 4: forlengelse ved 72 °C i 30 s, trinn 5: gå tilbake til trinn 2 og gjenta i 35 sykluser, trinn 6: endelig forlengelse ved 72 °C i 30 s.
- Bruk de samme PCR-betingelsene for ply3' med unntak av forlengelsestiden på trinn 4 og trinn 6 der den skal være 60 s.
- Analyser PCR-produktene ved gelelektroforese og skjær amplikonen fra gelen.
- Rens PCR-forsterkerne etter protokollen beskrevet i produsentens instruksjoner (materialfortegnelse).
- Bruk ekvimolære mengder av begge homologiske armer som maler i SOE-PCR. Sikring av de to forsterkerne ved hjelp av primere plyFw1_ NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG) og plyRv2_NotI (TTTGCGGCCGCCATTTTCTACCTTATCCTCCTACC).
- Bruk følgende SOE-PCR-betingelser (trinn 1: denaturering ved 94 °C i 2 minutter, trinn 2: denaturering ved 94 °C i 30 s, trinn 3: glødning 58 °C i 30 s, trinn 4: forlengelse ved 68 °C i 60 s, trinn 5: gå tilbake til trinn 2 og gjenta i 25 sykluser, trinn 6: endelig forlengelse ved 68 °C i 90 s).
- Analyser SOE-PCR-produktet ved gelelektroforese. Skjær den ut av gelen ved hjelp av et gelekstraksjonssett og følg instruksjonene som følger med.
- Forsterk spectinomycin-kassetten fra plasmid pR412 ved å bruke følgende PCR-betingelser: trinn 1: denaturering ved 94 °C i 60 s, trinn 2: denaturering ved 94 °C i 30 s, trinn 3: glødning ved 55 °C i 30 s, trinn 4: forlengelse ved 68 °C i 60 s, trinn 5: gå tilbake til trinn 2 og gjenta i 25 sykluser, trinn 6: endelig forlengelse ved 68 °C i 60 s.
- Bruk primere BamHI_SP2F2 (GGATCC, CTA, GAA, CTA, GTG, GAT, CCC, CC) og BamHI_SP2R2 (GGATCC, AAT, TCT, GCA, GATT, TTT, AC, ATG, ATC). Plasmid pR412 ble kjøpt fra Dr. Marc PrudHomme (CNRS-Universite Paul Sabatier, Toulouse, Frankrike).
- Analyser PCR-amplicons ved gelelektroforese. Unnskyld og rens den resulterende PCR-amplikonen som beskrevet ovenfor.
2. Generering av plasmid pSD1 og kjemisk transformasjon av E. coli Dh5a
- Utfør en ligering i henhold til produsentens instruksjoner for pGEMT-easy system I (materialfortegnelse). I et mikrosentrifugerør tilsettes 5 μL 2x ligeringsbuffer, 1 μL pGEMTeasy, 2 μL av det ply_SOE produktet, 1 μL T4 DNA-ligase og vann til et totalt volum på 20 μL. Inkuber over natten ved 4 °C. Dette genererer plasmid pSD1.
- Transformer kjemisk kompetent E. coli Dh5α med pSD1. Start med å inkubere 50 μL kjemisk kompetent E. coli Dh5α med 3 μL pSD1 ligeringsreaksjon i 15 minutter på is. Fortsett deretter med å utsette cellene for termisk sjokk (42 °C, 30 s). Plasser cellene på is i 2 min.
- Fjern cellene fra isen og tilsett 350 μL S.O.C-medier. Inkuber kulturen i 2 timer ved 37 °C, 120 o / min.
- Plate transformasjonen på Luria Bertani Agar (LBA) supplert med 0,4 mM IPTG, 0,24 mg / ml X-Gal for blå / hvit seleksjon og 100 μg / ml ampicillin for å sikre at alle kolonier som vokser i platen har plasmidryggraden. Hvite kolonier inneholder pSD1.
- Velg tre hvite kolonier og sett opp vekster over natten i 10 ml LB, supplert med 100 μg / ml ampicillin. Inkuber kulturene over natten ved 37 °C med risting.
- Neste dag sentrifugerer kulturene ved 3,082 x g og bruker pelleten til plasmidekstraksjon.
3. Plasmid DNA-ekstraksjon, restriksjonsfordøyelse av pSD1 og spectinomycin-genet og montering av pSD2
- Pakk ut plasmid-DNA ved å følge instruksjonene som følger med det kommersielle settet (materialfortegnelse).
- Sett opp en BamHI-restriksjonsfordøyelse for både pSD1-plasmid og spectinomycin-kassetten som tidligere er forsterket og renset. Bruk følgende betingelser og mengder beskrevet i tabell 1.
- Inkuber restriksjonsfordøyelsesreaksjonene og kontrollene ved 37 °C i 3 timer.
- Analyser begrensningsfordøyelsen ved elektroforese, skjær båndet og rens etter instruksjonene som følger med det kommersielle settet (materialfortegnelse).
- Deretter utarbeider du en ligeringsreaksjon etter produsentens instruksjoner (materialfortegnelse) ved hjelp av BamHI-fordøyd pSD1 og spectinomycin (fra trinn 3.2). I et mikrosentrifugerør tilsettes følgende reaksjonskomponenter: 5 μL 2x ligeringsbuffer, 2 μL pSD1, 2 μL spectinomycinkassett, 1 μL T4 DNA-ligase og inkuberes over natten ved 4 °C. Dette genererer plasmid pSD2.
- Transformer plasmid pSD2 til kjemisk kompetent E. coli Dh5α som beskrevet i trinn 2.2.
- Velg transformantene som bærer plasmid pSD2 basert på deres evne til å vokse i LBA supplert med 100 μg / ml spectinomycin og ampicillin.
- Utfør en plasmid-DNA-ekstraksjon (pSD2) som beskrevet ovenfor og følg produsentens instruksjoner (μL).
4. Transformasjon av S. pneumoniae stamme 519/43
- Forbered en overnattingskultur av S. pneumoniae 519/43 i BHI og la den vokse statisk ved 37 °C, 5% CO2.
- Dagen etter fortynnes kulturene 1:50 og 1:100 i 10 ml fersk BHI-buljong. Inkuber kulturene statisk ved 37 °C til OD595 nm er mellom 0,05 og 0,1 (optimal innsamling av DNA nærmere 0,1 OD).
- Når en OD på 0,1 er nådd, ta 860 μL og overfør til et mikrosentrifugerør. I samme mikrosentrifugerør legg til: 100 μL av 100 mM NaOH, 10 μL av 20% (w / v) BSA, 10 μL av 100 mM CaCl 2,2 μL av 50 ng / ml CSP124 og 500 ng pSD2.
- Inkuber reaksjonen statisk ved 37 °C i 3 timer.
- Plate 330 μL på 5 % blodagarplater (BA) supplert med 100 μg/ml spectinomycin, hver time over de 3 inkubasjonstimene.
- Inkuber plater over natten ved 37 °C, 5% CO2. spektromycinresistente kolonier på en annen BA-plate supplert med 100 μg/ml spectinomycin samt på BA-plater supplert med 100 μg/ml ampicillin. Inkuber begge settene med plater over natten under betingelsene nevnt ovenfor. Ampicillinplatene skal teste for tilstedeværelsen av plasmidryggraden.
- Bekreft tilstedeværelsen av spectinomycin-kassetten ved PCR ved hjelp av primere plyFw1_ NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG) og SPEC_REV (TAATTCCTCTAAGTCATAATTTCCG). Bekreft mutasjonen ved PCR ved hjelp av primere plySCN1 (CCAATGGAAATCGCTAGGCAAGAGATAA) og plySCN2 (ATTACTTAGTCCAACCACGGCTGAT) som fester seg utenfor det muterte området.
- Bekreft integrasjonen på riktig plassering av genomet ved sekvensering ved hjelp av primere plySCN1 (CCAATGGAAATCGCTAGGCAAGAGATAA), plySCN2 (ATTACTTAGTCCAACCACGGCTGAT), samt primere med bindingssted i spectinomycin-kassetten sqr1 (CCTGATCCAAACATGTAAGTACC), sqf2 (CGTAGTTATCTTGGAGAGAATA) spec_sqf1 (GGTACTTACATGTGTGGATCAGG) og spec_sqr2 TATTCTCTCCAAGATAACTACG.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen beskrevet her starter med å bruke PCR for å amplifisere venstre og høyre homologiarm, samtidig som 191 bp slettes fra den midtre regionen av ply-genet . Under PCR-utførelsen introduseres et BamHI-sted ved 3' av venstre homologiarm og i 5'-enden av høyre homologiarm (figur 1A). Deretter følger PCR-SOE der venstre og høyre homologarm smeltes sammen til én amplikon (figur 1B). Denne SOE-PCR-amplikonen klones deretter til pGEMTeasy ved hjelp av TA-kloning for å generere plasmid pSD1 (figur 1C). Vellykket transformasjon vil gi hvite kolonier som er resistente mot ampicillin. Eventuelle blå kolonier vil være transformanter som inneholder et tomt pGEMTeasy-plasmid. pSD1 vil deretter bli fordøyd på BamHI-stedet som ble introdusert på tidspunktet for SOE-PCR (figur 1D) og ligert til en spectinomycin-kassett (også BamHI fordøyd for kompatible ender). Det nye plasmidet kalles pSD2 (figur 1E). Korrekt montering av pSD2 bekreftes ved restriksjonsfordøyelse (figur 2A). pSD2, som fungerer som et selvmordsplasmid siden det ikke inneholder en Gram-positiv kompatibel opprinnelse for replikasjon, ble brukt til å transformere 519/43WT (tidligere forberedt på å være kompetent). Positive transformanter er kolonier som vokser på 100 μg / ml spectinomycin etter en inkubasjon over natten. Alle koloniene lappes på ferske blodagarbaseplater supplert med 100 μg/ml spectinomycin samt blodagarbase supplert med 100 μg/ml ampicillin. Eventuelle kolonier som vokser på de andre overnattingsplatene supplert med spectinomycin er mulige positive. Eventuelle kolonier som vokser på ampicillinplater vil betegne integrasjon av fullt plasmid eller rekombinasjon av ampicillinkassetten andre steder i genomet. Så langt, og ved bruk av stamme 519/43, har ingen kolonier vokst på platene supplert med ampicillin. Alle PCR-positive kolonier må bekreftes ved sekvensering (figur 2C) for å vurdere og bekrefte innsettingens lokalisasjon. For dette formål må primere ha sitt bindingssted utenfor homologiregionen (figur 2C). Det valgte målet har en meget markert fenotype (hemolyse av røde blodlegemer (RBC)), og mutasjonen kan derfor også bekreftes fenotypisk (figur 2B). Mutanten mistet evnen til å lyse RBC.
| Komponenter | Reaksjon (μL) | Kontroll (μL) | Reaksjon (μL) | Kontroll (μL) |
| Buffer | 2 | 2 | 2 | 2 |
| pSD1 | 4 | 4 | - | |
| Spectinomycin kassett | - | - | 6 | 6 |
| BamHI-HF | 1 | - | 1 | - |
| Vann | 13 | 14 | 11 | 12 |
| Totalt volum | 20 | 20 | 20 | 20 |
Tabell 1: Restriksjonsfordøyelsesreaksjonskomponenter for pSD1 og spectinomycinkassett.
Figur 1 Oversikt over mutagenesestrategien. A) Forsterkning av homologiske armer (Ply3' og Ply5' (bane 2 til 5); og skjøting ved overlappende forlengelses-PCR (bane 6 og 7). L- hyperstige I (Bioline), bane 1- negativ kontroll for reaksjonen, bane 2 og 3- ply5' (488 bp) og ply3' (715 bp) homologiske armer forsterket fra D39 gDNA, ban 4 og 5- ply5' (488 bp) og ply3' (715 bp) homologiske armer forsterket fra 519/43 gDNA. Høyre sidefelt 6- D39 SOE PCR-produkt, kjørefelt 7- 519/43 SOE PCR-produkt (1235 bp). B) Skjematisk fremstilling av den endelige SOE-PCR-konstruksjonen som er oppnådd (ply_SOE); Indikert med piler er primerne som brukes til å oppnå homologiregionen mellom begge homologiarmene, samt restriksjonsfordøyelsen som er valgt. C) Plasmid pSD1, som viser kloning av ply_SOE; D) Restriksjonsfordøyelse av pSD1 og spectinomycinkassett. E) Endelig konstruksjon pSD2 som deretter brukes som et selvmordsplasmid for å transformere S. pneumoniae. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: A) Bekreftelse av tilstedeværelsen av spectinomycin-kassetten i pSD2. L- hyperstige 1kb (Bioline); 1- pSD1 fordøyd med BamHI; 2-pSD2 fordøyd med BamHI; L hyperstige 1 kb (Bioline); 3- Spectinomycin kassett forsterket fra pR412, 4- Spectinomycin kassett fordøyd med BamHI; B) Fenotypisk bekreftelse av pneumolysinmutasjonen ved bestemmelse av hemolytisk aktivitet for D39, 519/43WT og mutert 519/43Δply. Dette ble sammenlignet med hemolyse av røde blodlegemer med 0,5 % saponin. Saponinderivert hemolyse regnes som 100 % og ratene for 519/43 vekttonn og 519/43 δply ble beregnet opp mot denne. Hvert datapunkt er gjennomsnittet av 5 tekniske og 3 biologiske replikater. C) Sekvenseringsdata kartlagt til det muterte genomområdet der pneumolysin ble avbrutt. Primere er angitt som piler og etter navn. PLYSCN1 og PLYSCN2 bindes utenfor homologiarmene. Sekvensering hentet fra primere PLYSCN1 og 2 viste at det var uavbrutt sekvens fra naboregionene utenfor homologiområdet til spectinomycin-kassetten, som demonstrerte innsettingen i genomet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Streptococcus pneumoniae, spesielt serotype 1, fortsetter å være en global trussel som forårsaker invasiv pneumokokksykdom og meningitt. Til tross for introduksjonen av ulike vaksiner som skal beskytte mot serotype 1, i Afrika, er denne serotypen fortsatt i stand til å forårsake utbrudd som fører til høy sykelighet og dødelighet13. Evnen til å genetisk manipulere denne serotypen er av kritisk betydning på grunn av dens kliniske relevans. Metoden beskrevet i denne studien tillater genetisk manipulering av en representativ stamme innenfor denne serotypen. En invasiv stamme 519/43 (ST5316), et klinisk isolat fra en meningittpasient i Danmark25.
Metodikken som presenteres her, var vellykket hovedsakelig på grunn av den valgte stammen da den kan skaffe eksogent DNA, men også på grunn av endringer i de tradisjonelle protokollene som brukes til S. pneumoniae-transformasjon , er en typisk suksessrate for vår transformasjonsprotokoll på ca. 70%.
Med denne metoden er det viktig å bruke et selvmordsplasmid i stedet for det vanlige lineære DNA. Konvensjonelt ville lineært DNA26,27,28 blitt brukt; Imidlertid var alle forsøk på å bruke det eksogene DNA i denne formen mislykket. Videre var forsøk på å utnytte den naturlige kompetansen til S. pneumoniae 519/43 ved lavere absorbans ikke vellykket. Feilsøking viste at naturlig kompetanse for stamme 519/43 var høyere når OD595 var 0,1, noe som er forskjellig fra dataene observert for andre serotyper av S. pneumoniae der høyeste naturlige kompetanse ble observert ved svært lav OD24.
For å validere metoden ble en pneumolysinmutant konstruert fordi den viser en lett å følge fenotype; Men for å bevise at metoden kan brukes på et hvilket som helst gen innenfor denne stammen, har andre gener blitt målrettet (manuskripter under forberedelse). En slik metode, ved hjelp av en selvmordsvektor som ikke har noen gram-positiv kompatibel opprinnelse, kan også brukes til kromosomal komplementering, overekspresjon av gener av interesse, samt introduksjon av reportersystemer, alt ved å bruke nabogenene som homologiske regioner.
Utvidelsen av genetiske verktøy til S. pneumoniae serotype 1, stamme 519/43 er viktig fordi vi nå kan genetisk manipulere representative stammer direkte. Stamme 519/43 er av interesse da den er genetisk bøyelig, er patogen som den ble isolert fra en meningittpasient, og manipulasjonen vil gi ledetråder for bedre å forstå utviklingen og etableringen av meningitt. Tidligere ble forståelse av visse determinanter innen arten gjort ved å sette inn det aktuelle genet i en av de meget godt karakteriserte stammene av S. pneumoniae, som D39 (serotype 2). En slik tilnærming ble brukt av Paton et al., på grunn av vanskeligheter med mutagenese på serotype 129. Resultatene rapportert av dem på D39 som bærer et mindre hemolytisk allel av serotype 1-lag sammenlignet med 519/43 ∆lag, er forskjellig fra de som presenteres av oss30, noe som understreker viktigheten av å kunne mutere et gen innenfor den opprinnelige stammebakgrunnen. Senere var den samme gruppen i stand til å mutere en ikke-avstamning A serotype 1-stamme22. Interessant nok er protokollen deres ganske forskjellig fra vår, da det er en to-trinns tilnærming som krever at mutasjonen skal gjøres først i serotype 2-stammer, og dette brukes deretter som en mal som skal transformeres i deres serotype 1-stamme.
Foreløpig er det en begrensning i metoden som presenteres. Foreløpig fungerer denne metoden bare for 519/43 representativ stamme. Den samme nøyaktige protokollen ble prøvd i andre stammer, nemlig kliniske isolater fra ST3081 og ST303, og det var ikke vellykket. Videre ble elektroporering som en metode for levering av eksogent DNA til cellen også forsøkt på alle tre sekvenstyper, med positive resultater observert bare for 519/43. Utvidelse og standardisering av metodikken til alle serotype 1-stammer er av avgjørende betydning, da det er enorm variasjon i hele gruppen. Studier pågår for tiden for å utvide anvendeligheten av metoden til alle stammer innen serotype 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi ønsker å takke Meningitis Trust og MRC for å gi finansiering til dette arbeidet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AccuPrime Pfx DNA polymerase | Invitrogen | 12344024 | Used for amplification of the fragments |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A9518 | Used for bacterial selection on stage 1(pSD1) |
| Blood Agar Base | Oxoid | CM0055 | Used to plate S. pneumoniae transformants |
| Bovine Serum Albumine | sigma | 55470 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Brain Heart Infusion | Oxoid | CM1135 | used to grow S. pneumoniae cells |
| Calcium Chloride Cacl2 | Sigma | 449709 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Competence stimulating peptide 1 | AnaSpec | AS-63779 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Luria Broth Agar | Gibco | 22700025 | used for plating and selection of pSD1 and pSD2 |
| Luria Broth Base (Miller's formulation) | Gibco | 12795027 | used for plating and selection of pSD1 and pSD2 |
| Monarch Gel Extraction Kit | NEB | T1020S | Used to extract the bands from the DNA gel |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | NEB | T1010S | Used to extract plasmid from the cells |
| pGEM T-easy | Promega | A1360 | used as suicide plasmid |
| S.O.C. | Invitrogen | 15544034 | used for recovery of cells after transformation |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma | S0899 | used for S.pneumoniae Transformation |
| Spectinomycin Hydrochloride | SigmaAldrich | PHR1426 | Used for bacterial selection |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Invitrogen | 18265017 | used for the creation of pSD1 and pSD2 |
References
- Bentley, S. D., et al. Genetic Analysis of the Capsular Biosynthetic Locus from All 90 Pneumococcal Serotypes. PLoS Genetics. 2 (3), 31 (2006).
- Calix, J. J., Nahm, M. H. A new pneumococcal serotype, 11E, has a variably inactivated wcjE gene. The Journal of Infectious Diseases. 202 (1), 29-38 (2010).
- Park, I. H., Pritchard, D. G., Cartee, R., Brandao, A., Brandileone, M. C. C., Nahm, M. H. Discovery of a New Capsular Serotype (6C) within Serogroup 6 of Streptococcus pneumoniae. Journal of Clinical Microbiology. 45 (4), 1225-1233 (2007).
- Jin, P., et al. First Report of Putative Streptococcus pneumoniae Serotype 6D among Nasopharyngeal Isolates from Fijian Children. The Journal of Infectious Diseases. 200 (9), 1375-1380 (2009).
- Oliver, M. B., vander Linden, M. P. G., Küntzel, S. A., Saad, J. S., Nahm, M. H. Discovery of Streptococcus pneumoniae Serotype 6 Variants with Glycosyltransferases Synthesizing Two Differing Repeating Units. Journal of Biological Chemistry. 288 (36), 25976-25985 (2013).
- Calix, J. J., et al. Serological Characterization of Two Capsule Subtypes among Streptococcus pneumoniae Serotype 20 Strains. Journal of Biological Chemistry. 287 (33), 27885-27894 (2012).
- Park, I. H., et al. and Serological Characterization of a New Pneumococcal Serotype, 6H, and Generation of a Pneumococcal Strain Producing Three Different Capsular Repeat Units. Clinical and Vaccine Immunology. 22 (3), 313-318 (2015).
- O'Brien, K. L., et al. Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates. The Lancet. 374 (9693), 893-902 (2009).
- Henriques-Normark, B., Tuomanen, E. I. The Pneumococcus: Epidemiology, Microbiology, and Pathogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 3 (7), 010215 (2013).
- Leimkugel, J., et al. An Outbreak of Serotype 1 Streptococcus pneumoniae Meningitis in Northern Ghana with Features That Are Characteristic of Neisseria meningitidis Meningitis Epidemics. The Journal of Infectious Diseases. 192 (2), 192-199 (2005).
- Yaro, S., et al. Epidemiological and Molecular Characteristics of a Highly Lethal Pneumococcal Meningitis Epidemic in Burkina Faso. Clinical Infectious Diseases. 43 (6), 693-700 (2006).
- Antonio, M., et al. Molecular epidemiology of pneumococci obtained from Gambian children aged 2-29 months with invasive pneumococcal disease during a trial of a 9-valent pneumococcal conjugate vaccine. BMC Infectious Diseases. 8 (1), 81 (2008).
- Kwambana-Adams, B. A., et al. An outbreak of pneumococcal meningitis among older children (≥5 years) and adults after the implementation of an infant vaccination programme with the 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in Ghana. BMC Infectious Diseases. 16 (1), 575 (2016).
- Antonio, M., et al. Seasonality and outbreak of a predominant Streptococcus pneumoniae serotype 1 clone from The Gambia: Expansion of ST217 hypervirulent clonal complex in West Africa. BMC Microbiology. 8 (1), 198 (2008).
- Staples, M., et al. Molecular characterization of an Australian serotype 1 Streptococcus pneumoniae outbreak. Epidemiology and Infection. 143 (2), 325-333 (2015).
- Gessner, B. D., Mueller, J. E., Yaro, S. African meningitis belt pneumococcal disease epidemiology indicates a need for an effective serotype 1 containing vaccine, including for older children and adults. BMC Infectious Diseases. 10 (1), 22 (2010).
- Hill, P. C., et al. Nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae in Gambian infants: a longitudinal study. Clinical Infectious Diseases. 46 (6), 807-814 (2008).
- Ebruke, C., et al. Temporal changes in nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae serotype 1 genotypes in healthy Gambians before and after the 7-valent pneumococcal conjugate vaccine. PeerJ. 3, 90 (2015).
- Adegbola, R. A., et al. Serotype and antimicrobial susceptibility patterns of isolates of Streptococcus pneumoniae causing invasive disease in The Gambia 1996-2003. Tropical Medicine and International Health. 11 (7), 1128-1135 (2006).
- Marks, L. R., Reddinger, R. M., Hakansson, A. P. High Levels of Genetic Recombination during Nasopharyngeal Carriage and Biofilm Formation in Streptococcus pneumoniae. mBio. 3 (5), (2012).
- Ritchie, N. D., Mitchell, T. J., Evans, T. J. What is different about serotype 1 pneumococci. Future Microbiology. 7 (1), 33-46 (2012).
- Harvey, R. M., et al. The variable region of pneumococcal pathogenicity island 1 is responsible for unusually high virulence of a serotype 1 isolate. Infection and Immunity. 84 (3), 822-832 (2016).
- Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. BioTechniques. 8 (5), 528-535 (1990).
- Alioing, G., Granadel, C., Morrison, D. A., Claverys, J. P. Competence pheromone, oligopeptide permease, and induction of competence in Streptococcus pneumoniae. Molecular Microbiology. 21 (3), 471-478 (1996).
- Lund, E. Enumeration and description of the strains belonging to the State Serum Institute, Copenhagen Denmark. , (1951).
- Barany, F., Tomasz, A. Genetic transformation of Streptococcus pneumoniae by heterologous plasmid deoxyribonucleic acid. Journal of Bacteriology. 144 (2), 698-709 (1980).
- Terra, V. S., Homer, K. A., Rao, S. G., Andrew, P. W., Yesilkaya, H. Characterization of novel β-galactosidase activity that contributes to glycoprotein degradation and virulence in Streptococcus pneumoniae. Infection and Immunity. 78 (1), (2010).
- Terra, V. S., Zhi, X., Kahya, H. F., Andrew, P. W., Yesilkaya, H. Pneumococcal 6-phospho-β-glucosidase (BglA3) is involved in virulence and nutrient metabolism. Infection and Immunity. 84 (1), (2015).
- Harvey, R. M., Ogunniyi, A. D., Chen, A. Y., Paton, J. C. Pneumolysin with Low Hemolytic Activity Confers an Early Growth Advantage to Streptococcus pneumoniae in the Blood. Infection and Immunity. 79 (10), 4122 (2011).
- Terra, V. S., Plumptre, C. D., Wall, E. C., Brown, J. S., Wren, B. W. Construction of a pneumolysin deficient mutant in Streptococcus pneumoniae serotype 1 strain 519/43 and phenotypic characterisation. Microbial Pathogenesis. 141, 103999 (2020).
