Summary
Aqui, descrevemos uma cepa 519/43 do sorotipo 1 de S. pneumoniae que pode ser geneticamente modificada usando sua capacidade de adquirir naturalmente DNA e um plasmídeo suicida. Como prova de princípio, um mutante isogênico no gene da pneumolisina (plys) foi feito.
Abstract
O sorotipo 1 do Streptococcus pneumoniae continua sendo um enorme problema em países de baixa e média renda, particularmente na África Subsaariana. Apesar de sua importância, os estudos nesse sorotipo têm sido dificultados pela falta de ferramentas genéticas para modificá-lo. Neste estudo, descrevemos um método para modificar geneticamente um isolado clínico do sorotipo 1 (cepa 519/43). Curiosamente, isso foi conseguido explorando a capacidade do pneumococo de adquirir DNA naturalmente. No entanto, ao contrário da maioria dos pneumococos, o uso de DNA linear não foi bem sucedido; para mutar essa importante cepa, um plasmídeo suicida teve que ser usado. Essa metodologia forneceu os meios para uma compreensão mais profunda desse sorotipo indescritível, tanto em termos de biologia quanto de patogenicidade. Para validar o método, a principal toxina pneumocócica conhecida, a pneumolisina, sofreu mutação por ter um fenótipo bem conhecido e fácil de seguir. Mostramos que o mutante, como esperado, perdeu sua capacidade de lisar glóbulos vermelhos. Ao sermos capazes de mutar um gene importante no sorotipo de interesse, pudemos observar fenótipos diferentes para a perda de função mutantes em infecções intraperitoneais e intranasais daqueles observados para outros sorotipos. Em resumo, este estudo prova que a estirpe 519/43 (serotipo 1) pode ser geneticamente modificada.
Introduction
Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae, o pneumococo) é uma das principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo. Até recentemente, cerca de 100 sorotipos de S. pneumoniae foram descobertos 1,2,3,4,5,6,7. Anualmente, a doença pneumocócica invasiva (DPI) reivindica cerca de 700.000 mortes, de crianças menores de 5 anos8. S. pneumoniae é a principal causa de pneumonia bacteriana, otite média, meningite e septicemia em todo o mundo9.
No cinturão africano de meningite, o sorotipo 1 é responsável por surtos de meningite, onde o tipo de sequência (ST) ST217, um tipo de sequência extremamente virulento, é dominante 10,11,12,13,14,15. Sua importância na patologia da meningite tem sido comparada à de Neisseria meningitidis no cinturão africano de meningite16. O sorotipo 1 é frequentemente a principal causa de DPI; no entanto, é muito raramente encontrado em carruagens. De fato, na Gâmbia, esse sorotipo é responsável por 20% de todas as doenças invasivas, mas só foi encontrado em 0,5% dos portadores saudáveis14,17,18,19. A troca genética e a recombinação em pneumococos competentes ocorrem geralmente no transporte e não na doença invasiva20. Além disso, o sorotipo 1 demonstrou ter uma das taxas de transporte mais curtas descritas entre os pneumococos (apenas 9 dias). Portanto, tem sido proposto que esse sorotipo pode ter uma taxa de recombinação muito menor do que outros21.
Estudos aprofundados são necessários para entender a razão por trás da baixa taxa de transporte das cepas do sorotipo 1 e sua importância na doença invasiva na África Subsaariana.
Aqui relatamos um protocolo que permite a mutagênese em todo o genoma de uma cepa específica do sorotipo 1, 519/43. Esta estirpe pode facilmente adquirir e recombinar novo ADN no seu genoma. Este método ainda não é inter-tensão, mas é muito eficiente quando feito em fundo 519/43 (outros alvos foram mutados, manuscritos em preparação). Simplesmente usando a cepa 519/43 e explorando sua competência natural, bem como substituindo a maneira como o DNA exógeno é fornecido, fomos capazes de mutar o gene da pneumolisina (ply) nesta cepa do sorotipo 1. Esse método representa uma melhoria em relação ao apresentado por Harvey et al.22 , pois é feito em uma única etapa, sem a necessidade de passar o DNA por um sorotipo diferente. No entanto, e devido à variabilidade entre as cepas, nenhum método foi padronizado para todas as cepas. A capacidade de mutar genes específicos e observar seus efeitos permitirá uma compreensão profunda das cepas de S. pneumoniae do sorotipo 1 e fornecerá respostas para o papel dessas cepas na meningite na África Subsaariana.
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Protocol
1. Geração do amplificador mutante por SOE-PCR23 e amplificação do de espectinomicina
- Comece realizando a PCR para a amplificação dos braços de homologia (ply 5' (488 pb) e ply3' (715 bp) respectivamente) das regiões de flanco do gene da camada da cepa 519/43. Use primers plyFw1_NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG), ply5'R1_BamHI (CGAAATATAGACCAAAGGACCC GGATCC AGAACCAAACTTGACCTTGA), ply3'F1_BamHI (TCAAGGTCAAGTTTGGTTCTCTGGATCC GCGTCCTTTGGTCTATATTTCG) e plyRv2_NotI (TTTGCGGCCCCATTTTCTCTATTCTATTCTATTCTATTCTATTCTCTCT).
- Utilizar as seguintes condições de PCR para a ply5': desnaturação a 94 °C durante 60 s, passo 2: desnaturação a 94 °C durante 30 s, passo 3: recozimento a 58 °C durante 30 s, passo 4: extensão a 72 °C durante 30 s, passo 5: voltar ao passo 2 e repetir durante 35 ciclos, passo 6: extensão final a 72°C durante 30 s.
- Use as mesmas condições de PCR para ply3', com exceção do tempo de extensão na etapa 4 e na etapa 6, onde deve ser de 60 s.
- Analise os produtos de PCR por eletroforese em gel e extirpe o amplificão do gel.
- Purificar os amplificadores de PCR seguindo o protocolo descrito nas instruções do fabricante (Tabela de Materiais).
- Use quantidades equimolares de ambos os braços de homologia como modelos no SOE-PCR. Fundir os dois amplificadores usando primers plyFw1_ NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG) e plyRv2_NotI (TTTGCGGCCCCATTTTCTACCTTATCCTCTACC).
- Utilize as seguintes condições SOE-PCR (passo 1: desnaturação a 94 °C durante 2 min, passo 2: desnaturação a 94 °C durante 30 s, passo 3: recozimento a 58 °C durante 30 s, Passo 4: extensão a 68 °C durante 60 s, passo 5: voltar ao passo 2 e repetir durante 25 ciclos, passo 6: extensão final a 68 °C durante 90 s).
- Analisar o produto SOE-PCR por eletroforese em gel. Retire-o do gel usando um kit de extração de gel e siga as instruções fornecidas.
- Amplificar o de espectinomicina do plasmídeo pR412 utilizando as seguintes condições de PCR: passo 1: desnaturação a 94 °C durante 60 s, passo 2: desnaturação a 94 °C durante 30 s, passo 3: recozimento a 55 °C durante 30 s, passo 4: extensão a 68 °C durante 60 s, passo 5: voltar ao passo 2 e repetir durante 25 ciclos, passo 6: extensão final a 68 °C durante 60 s.
- Use primers BamHI_SP2F2 (GGATCC CTA GAA CTA GTG GAT CCC CC) e BamHI_SP2R2 (GGATCC AAT TCT GCA GAT TTT AC ATG ATC). O Plasmid pR412 foi adquirido do Dr. Marc PrudHomme (CNRS-Universite Paul Sabatier Toulouse França).
- Analisar os amplificadores de PCR por eletroforese em gel. Aumentar e purificar o amplificador de PCR resultante, conforme descrito acima.
2. Geração de plasmídeo pSD1 e Transformação química de E. coli Dh5α
- Realizar uma ligadura seguindo as instruções do fabricante do sistema pGEMT I (Tabela de Materiais). Em um tubo de microcentrífuga, adicione 5 μL de tampão de ligadura 2x, 1 μL de pGEMTeasy, 2 μL do produto ply_SOE, 1 μL de ligase de DNA T4 e água a um volume total de 20 μL. Incubar durante a noite a 4 °C. Isso gera o plasmídeo pSD1.
- Transformar E. coli Dh5α quimicamente competente com pSD1. Comece incubando 50 μL de E. coli Dh5α quimicamente competente com 3 μL de reação de ligadura pSD1 por 15 min no gelo. Em seguida, continue expondo as células ao choque térmico (42 °C, 30 s). Coloque as células no gelo por 2 min.
- Remova as células do gelo e adicione 350 μL de meio S.O.C. Incubar a cultura por 2 h a 37 °C, 120 rpm.
- Placa de transformação em ágar Luria Bertani (LBA) suplementado com 0,4 mM IPTG, 0,24 mg/mL X-Gal para seleção azul/branca e 100 μg/mL de ampicilina para garantir que todas as colônias que crescem na placa tenham a espinha dorsal do plasmídeo. As colônias brancas contêm pSD1.
- Escolher três colónias brancas e estabelecer crescimentos durante a noite em 10 ml de LB, suplementados com 100 μg/ml de ampicilina. Incubar as culturas durante a noite a 37 °C com agitação.
- No dia seguinte, centrifugar as culturas a 3.082 x g e usar o pellet para extração de plasmídeos.
3. Extração de DNA plasmídico, digestão de restrição de pSD1 e gene de espectinomicina e montagem de pSD2
- Extraia o DNA plasmídico seguindo as instruções fornecidas com o kit comercial (Tabela de Materiais).
- Configure uma digestão de restrição de BamHI para o plasmídeo pSD1 e o de espectinomicina previamente amplificado e purificado. Utilizar as seguintes condições e quantidades descritas no quadro 1.
- Incubar as reações de digestão de restrição e os controles a 37 °C por 3 h.
- Analisar o digesto de restrição por eletroforese, extirpar a banda e purificar seguindo as instruções fornecidas com o kit comercial (Tabela de Materiais).
- Em seguida, prepare uma reação de ligadura seguindo as instruções do fabricante (Tabela de Materiais) usando o pSD1 digerido por BamHI e a espectinomicina (a partir da etapa 3.2). Num tubo de microcentrífuga, adicionar os seguintes componentes de reacção: 5 μL de tampão de ligadura 2x, 2 μL pSD1, 2 μL de de espectinomicina, 1 μL de DNA ligase T4 e incubar durante a noite a 4 °C. Isso gera o plasmídeo pSD2.
- Transformar o plasmídeo pSD2 em E. coli Dh5α quimicamente competente, conforme descrito no passo 2.2.
- Selecione os transformadores portadores de plasmídeo pSD2 com base em sua capacidade de crescer em LBA suplementado com 100 μg/mL de espectinomicina e ampicilina.
- Realizar uma extração de DNA plasmídico (pSD2) conforme descrito acima e seguindo as instruções do fabricante (μL).
4. Transformação da estirpe 519/43 de S. pneumoniae
- Preparar uma cultura noturna de S. pneumoniae 519/43 em BHI e permitir que ela cresça estaticamente a 37 °C, 5% de CO2.
- No dia seguinte, diluir as culturas 1:50 e 1:100 em 10 mL de caldo BHI fresco. Incubar as culturas estaticamente a 37 °C até que a OD595nm esteja entre 0,05 e 0,1 (aquisição ótima de DNA mais próxima de 0,1 OD).
- Uma vez que uma OD de 0,1 é atingida, pegue 860 μL e transfira para um tubo de microcentrífuga. Neste mesmo tubo de microcentrífuga adicionar: 100 μL de 100 mM de NaOH, 10 μL de 20% (p/v) BSA, 10 μL de 100 mM CaCl 2,2 μL de 50 ng/mL CSP124 e 500 ng de pSD2.
- Incubar a reacção estaticamente a 37 °C durante 3 h.
- Placa de 330 μL em placas de ágar sangue (BA) a 5% suplementadas com 100 μg/mL de espectinomicina, a cada hora durante as 3 horas de incubação.
- Incubar as placas durante a noite a 37 °C, 5% de CO2. Colomendo colônias resistentes à espectromicina em outra placa de BA suplementada com 100 μg/mL de espectinomicina, bem como em placas de BA suplementadas com 100 μg/mL de ampicilina. Incubar ambos os conjuntos de placas durante a noite sob as condições indicadas acima. As placas de ampicilina devem testar a presença da espinha dorsal do plasmídeo.
- Confirmar a presença do de espectinomicina por PCR utilizando primers plyFw1_ NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG) e SPEC_REV (TAATTCCTCTAAGTCATAATTTCCG). Confirme a mutação por PCR usando os primers plySCN1 (CCAATGGAAATCGCTAGGCAAGAGATAA) e plySCN2 (ATTACTTAGTCCAACCACGGCTGAT) que se ligam fora da região mutada.
- Confirmar a integração na localização correta do genoma por sequenciamento usando primers plySCN1 (CCAATGGAAATCGCTAGGCAAGAGATAA), plySCN2 (ATTACTTAGTCCAACCACGGCTGAT), bem como primers com seu local de ligação no de espectinomicina sqr1 (CCTGATCCAAACATGTAAGTACC) sqf2 (CGTAGTTATCTTGGAGAGAATA) spec_sqf1 (GGTACTTACATGTTTGGATCAGG ) e spec_sqr2 TATTCTCTCCAAGATAACTACG.
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Representative Results
O protocolo descrito aqui começa usando a PCR para amplificar os braços de homologia esquerdo e direito, enquanto simultaneamente exclui 191 pb da região média do gene da dobra . Durante a realização da PCR, um sítio BamHI é introduzido no 3' do braço de homologia esquerdo e no final de 5' do braço de homologia direito (Figura 1A). Segue-se a PCR-SOE, onde os braços de homologia esquerdo e direito são fundidos em um amplicon (Figura 1B). Este amplificador SOE-PCR é então clonado em pGEMTeasy usando clonagem TA para gerar plasmídeo pSD1 (Figura 1C). A transformação bem-sucedida produzirá colônias brancas resistentes à ampicilina. Quaisquer colônias azuis serão transformantes contendo um plasmídeo pGEMTeasy vazio. O pSD1 será então digerido no sítio BamHI que foi introduzido no momento da SOE-PCR (Figura 1D) e ligado a um de espectinomicina (também BamHI digerido para fins compatíveis). O novo plasmídeo é denominado pSD2 (Figura 1E). A montagem correta da pSD2 é confirmada pela digestão por restrição (Figura 2A). O pSD2, que funciona como um plasmídeo suicida, uma vez que não contém uma origem de replicação compatível com Gram-positivo, foi usado para transformar 519/43WT (previamente preparado para ser competente). Transformadores positivos são colônias que crescem com 100 μg/mL de espectinomicina após uma incubação noturna. Todas as colônias são remendadas em placas de base de ágar sangue recém-fresco suplementadas com 100 μg/mL de espectinomicina, bem como base de ágar sangue suplementada com 100 μg/mL de ampicilina. Quaisquer colônias que crescem nas segundas placas noturnas suplementadas com espectinomicina são possíveis positivos. Quaisquer colônias que cresçam em placas de ampicilina denotarão integração do plasmídeo completo ou recombinação do de ampicilina em outras partes do genoma. Até agora e usando a cepa 519/43 nenhuma colônia cresceu nas placas suplementadas com ampicilina. Todas as colônias positivas por PCR devem ser confirmadas por sequenciamento (Figura 2C) para avaliar e confirmar a localização da inserção. Para tanto, os primers devem ter seu sítio de ligação fora da região de homologia (Figura 2C). O alvo escolhido tem um fenótipo muito acentuado (hemólise de hemácias (hemácias)), e, portanto, a mutação também pode ser confirmada fenotipicamente (Figura 2B). O mutante perdeu sua capacidade de lisar RBC's.
| Componentes | Reação (μL) | Controle (μL) | Reação (μL) | Controle (μL) |
| Buffer | 2 | 2 | 2 | 2 |
| pSD1 | 4 | 4 | - | |
| de espectinomicina | - | - | 6 | 6 |
| BamHI-HF | 1 | - | 1 | - |
| Água | 13 | 14 | 11 | 12 |
| Total Volume | 20 | 20 | 20 | 20 |
Tabela 1: Componentes da reação de digestão de restrição para pSD1 e de espectinomicina.
Figura 1: Visão geral da estratégia de mutagênese. A) Amplificação dos braços de homologia (Ply3' e Ply5' (faixas 2 a 5); e Emenda por PCR de Extensão Sobreposta (Faixas 6 e 7). L- hiperescada I (Biolinha), faixa 1- controlo negativo para a reacção, lane 2 e 3- ply5' (488 pb) e ply3' (715 pp) braços de homologia amplificados a partir de D39 gDNA, faixas 4 e 5- ply5' (488 pp) e braços de homologia ply3' (715 pb) amplificados a partir de 519/43 gDNA. Faixa do lado direito 6- D39 SOE PCR produto, pista 7- 519/43 SOE PCR produto (1235 pb). B) Esquema representando o construto final SOE-PCR obtido (ply_SOE); Indicados por setas são os primers utilizados para obter a região de homologia entre ambos os braços de homologia, bem como a digestão de restrição escolhida. C) Plasmídeo pSD1, representando a clonagem de ply_SOE; D) Restrição da digestão de pSD1 e de espectinomicina. E) Construto final pSD2 que é então usado como um plasmídeo suicida para transformar S. pneumoniae. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A) Confirmação da presença do de espectinomicina em pSD2. L- hiperladder 1kb (Bioline); 1- pSD1 digerido com BamHI; 2-pSD2 digerido com BamHI; L hiperladder 1 kb (Bioline); 3- de espectinomicina amplificado a partir de pR412, 4- de espectinomicina digerido com BamHI; B) Confirmação fenotípica da mutação da pneumolisina pela determinação da atividade hemolítica para D39, 519/43WT e 519/43Δply mutante. Isto foi comparado com a hemólise dos glóbulos vermelhos por saponina a 0,5%. A hemólise derivada da saponina é considerada 100% e as taxas de 519/43Wt e 519/43Δply foram calculadas em relação a ela. Cada ponto de dados é a média de 5 replicações técnicas e 3 biológicas. C) Dados de sequenciamento mapeados para a região do genoma mutante onde a pneumolisina foi interrompida. Os primers são indicados como setas e pelo nome. PLYSCN1 e PLYSCN2 ligam-se fora dos braços de homologia. O sequenciamento obtido dos primers PLYSCN1 e 2 mostrou que houve sequência ininterrupta desde as regiões vizinhas fora da área de homologia até o de espectinomicina, demonstrando a inserção no genoma. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O Streptococcus pneumoniae, em particular o sorotipo 1, continua a ser uma ameaça global que causa doença pneumocócica invasiva e meningite. Apesar da introdução de várias vacinas que deveriam ser protetoras contra o sorotipo 1, na África, esse sorotipo ainda é capaz de causar surtos que levam a alta morbidade e mortalidade13. A capacidade de manipular geneticamente este sorotipo é de importância crítica devido à sua relevância clínica. O método descrito neste estudo permite a manipulação genética de uma cepa representativa dentro deste sorotipo. Uma cepa invasiva 519/43 (ST5316), um isolado clínico de um paciente com meningite na Dinamarca25.
A metodologia aqui apresentada, foi bem sucedida principalmente devido à cepa escolhida, pois pode adquirir DNA exógeno, mas também devido às mudanças feitas nos protocolos tradicionais utilizados para a transformação de S. pneumoniae , uma taxa de sucesso típica para o nosso protocolo de transformação é de cerca de 70%.
Com essa metodologia, é fundamental usar um plasmídeo suicida em vez do DNA linear usual. Convencionalmente, o DNA linear26,27,28 teria sido utilizado; no entanto, todas as tentativas de usar o DNA exógeno nesta forma foram infrutíferas. Além disso, as tentativas de explorar a competência natural de S. pneumoniae 519/43 em menor absorbância não foram bem-sucedidas. A solução de problemas demonstrou que a competência natural para a cepa 519/43 foi maior quando a OD595 foi de 0,1, o que é diferente dos dados observados para outros sorotipos de S. pneumoniae, onde a maior competência natural foi observada na DO24 muito baixa.
Para validar o método, foi construído um mutante pneumolisina por apresentar fenótipo de fácil seguimento; no entanto, para provar que o método pode ser aplicado a qualquer gene dentro desta estirpe, outros genes foram alvo com sucesso (manuscritos em preparação). Tal método, usando um vetor suicida que não tem origem compatível com Gram-positivo, também poderia ser usado para complementação cromossômica, superexpressão de genes de interesse, bem como introdução de sistemas repórteres, tudo usando os genes vizinhos como regiões de homologia.
A expansão de ferramentas genéticas para o sorotipo 1 de S. pneumoniae, cepa 519/43 é importante porque, agora podemos manipular geneticamente cepas representativas diretamente. A cepa 519/43 é de interesse, pois é geneticamente flexível, é patogênica, pois foi isolada de um paciente com meningite e sua manipulação fornecerá pistas para entender melhor o desenvolvimento e o estabelecimento da meningite. Anteriormente, a compreensão de certos determinantes dentro da espécie era feita através da inserção do gene em questão em uma das cepas muito bem caracterizadas de S. pneumoniae, como D39 (sorotipo 2). Tal abordagem foi utilizada por Paton et al., devido às dificuldades com a mutagênese no sorotipo 129. Os resultados relatados por eles no D39 portador de um alelo menos hemolítico do sorotipo 1 ply em comparação com 519/43 ∆ply diferem dos apresentados por nós30 destacando a importância de ser capaz de mutar um gene dentro do fundo original da cepa. Mais tarde, o mesmo grupo foi capaz de mutar uma cepa22 do sorotipo 1 da linhagem A. Curiosamente, o protocolo deles é bastante distinto do nosso, pois é uma abordagem de duas etapas que requer que a mutação seja feita primeiro em cepas do sorotipo 2 e isso é então usado como um modelo a ser transformado em sua cepa do sorotipo 1.
Atualmente, há uma limitação no método apresentado. Por enquanto, este método funciona apenas para a cepa representativa 519/43. O mesmo protocolo exato foi tentado em outras cepas, a saber, isolados clínicos de ST3081 e ST303 e não foi bem sucedido. Além disso, a eletroporação como método de entrega de DNA exógeno à célula também foi tentada em todos os três tipos de sequência, com resultados positivos observados apenas para 519/43. Expandir e padronizar a metodologia para todas as cepas do sorotipo 1 é de suma importância, pois há uma enorme variabilidade em todo o grupo. Estudos estão em andamento para expandir a aplicabilidade do método a todas as cepas do sorotipo 1.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer ao Meningitis Trust e ao MRC por fornecerem financiamento para este trabalho.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AccuPrime Pfx DNA polymerase | Invitrogen | 12344024 | Used for amplification of the fragments |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A9518 | Used for bacterial selection on stage 1(pSD1) |
| Blood Agar Base | Oxoid | CM0055 | Used to plate S. pneumoniae transformants |
| Bovine Serum Albumine | sigma | 55470 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Brain Heart Infusion | Oxoid | CM1135 | used to grow S. pneumoniae cells |
| Calcium Chloride Cacl2 | Sigma | 449709 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Competence stimulating peptide 1 | AnaSpec | AS-63779 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Luria Broth Agar | Gibco | 22700025 | used for plating and selection of pSD1 and pSD2 |
| Luria Broth Base (Miller's formulation) | Gibco | 12795027 | used for plating and selection of pSD1 and pSD2 |
| Monarch Gel Extraction Kit | NEB | T1020S | Used to extract the bands from the DNA gel |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | NEB | T1010S | Used to extract plasmid from the cells |
| pGEM T-easy | Promega | A1360 | used as suicide plasmid |
| S.O.C. | Invitrogen | 15544034 | used for recovery of cells after transformation |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma | S0899 | used for S.pneumoniae Transformation |
| Spectinomycin Hydrochloride | SigmaAldrich | PHR1426 | Used for bacterial selection |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Invitrogen | 18265017 | used for the creation of pSD1 and pSD2 |
References
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