Summary
Здесь мы описываем штамм S. pneumoniae серотипа 1 519/43, который может быть генетически модифицирован, используя его способность естественным образом приобретать ДНК и плазмиду самоубийства. В качестве доказательства принципа был получен изогенный мутант в гене пневмолизина (ply).
Abstract
Streptococcus pneumoniae серотипа 1 остается огромной проблемой в странах с низким и средним уровнем дохода, особенно в странах Африки к югу от Сахары. Несмотря на его важность, исследования этого серотипа были затруднены из-за отсутствия генетических инструментов для его модификации. В этом исследовании мы описываем метод генетической модификации клинического изолята серотипа 1 (штамм 519/43). Интересно, что это было достигнуто за счет использования способности пневмококка естественным образом приобретать ДНК. Однако, в отличие от большинства пневмококков, использование линейной ДНК не было успешным; Чтобы мутировать этот важный штамм, пришлось использовать плазмиду самоубийства. Эта методология предоставила средства для более глубокого понимания этого неуловимого серотипа, как с точки зрения его биологии, так и патогенности. Чтобы проверить метод, основной известный пневмококковый токсин, пневмолизин, был мутирован, потому что он имеет хорошо известный и простой для понимания фенотип. Мы показали, что мутант, как и ожидалось, утратил способность лизировать эритроциты. Имея возможность мутировать важный ген в интересующем серотипе, мы смогли наблюдать различные фенотипы мутантов потери функции при внутрибрюшинных и интраназальных инфекциях от тех, которые наблюдались для других серотипов. Таким образом, это исследование доказывает, что штамм 519/43 (серотип 1) может быть генетически модифицирован.
Introduction
Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae, пневмококк) является одной из основных причин заболеваемости и смертности во всем мире. До недавнего времени было обнаружено около 100 серотипов S. pneumoniae 1,2,3,4,5,6,7. Ежегодно инвазивная пневмококковая инфекция (ИПД) уносит около 700 000 смертей детей в возрасте до 5 лет8. S. pneumoniae является основной причиной бактериальной пневмонии, среднего отита, менингита и сепсиса во всем мире9.
В африканском менингитном поясе серотип 1 ответственен за вспышки менингита, где доминирует тип последовательности (ST) ST217, чрезвычайно вирулентный тип последовательности 10,11,12,13,14,15. Его значение в патологии менингита было сравнимо с значением Neisseria meningitidis в африканском менингитном поясе16. Серотип 1 часто является основной причиной ИПД; Однако он очень редко встречается в карете. Фактически, в Гамбии на этот серотип приходится 20% всех инвазивных заболеваний, но он был обнаружен только у 0,5% здоровых носителей14,17,18,19. Генетический обмен и рекомбинация у компетентных пневмококков происходит, как правило, при носительстве, а не при инвазивном заболевании20. Кроме того, было показано, что серотип 1 имеет одну из самых коротких частот носительства, описанных среди пневмококков (всего 9 дней). Поэтому было высказано предположение, что этот серотип может иметь гораздо более низкую скорость рекомбинации, чем другие21.
Необходимы углубленные исследования, чтобы понять причину низкой скорости носительства штаммов серотипа 1 и ее значение для инвазивных заболеваний в странах Африки к югу от Сахары.
Здесь мы сообщаем о протоколе, который позволяет проводить полногеномный мутагенез конкретного штамма серотипа 1, 519/43. Этот штамм может легко приобретать и рекомбинировать новую ДНК в свой геном. Этот метод еще не является межштаммовым, но он очень эффективен, когда выполняется в фоновом режиме 519/43 (другие мишени были мутированы, рукописи готовятся). Просто используя штамм 519/43 и используя его естественную компетенцию, а также заменяя способ обеспечения экзогенной ДНК, мы смогли мутировать ген пневмолизина (слой) в этом штамме серотипа 1. Этот метод представляет собой усовершенствование по сравнению с методом, представленным Harvey et al.22 , поскольку он выполняется в один этап без необходимости прохождения ДНК через другой серотип. Тем не менее, из-за межштаммовой изменчивости ни один метод не был стандартизирован для всех штаммов. Способность мутировать определенные гены и наблюдать за их эффектами позволит глубже понять штаммы S. pneumoniae серотипа 1 и даст ответы на вопросы о роли этих штаммов в менингите в странах Африки к югу от Сахары.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Генерация мутирующего ампликона методом СОЭ-ПЦР23 и амплификация кассеты спектиномицина
- Начните с проведения ПЦР для амплификации плеч гомологии (ply 5' (488.н.) и ply3' (715.н.) соответственно) фланкирующих областей ply гена штамма 519/43. Используйте праймеры plyFw1_NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG), ply5'R1_BamHI (CGAAATATAGACCAAAGAGGCGGATCC AGAACCAAACTTGACCTTGA), ply3'F1_BamHI (TCAAGGTCAAGTTTTTCTCTGGATCC GCGTCCTTTGGTCTATTCG) и plyRv2_NotI (TTTGCGGCCCCCCTTCTACCTTATCCTCTACC).
- Используйте следующие условия ПЦР для ply5': денатурация при 94 °C в течение 60 с, шаг 2: денатурация при 94 °C в течение 30 с, шаг 3: отжиг при 58 °C в течение 30 с, шаг 4: удлинение при 72 °C в течение 30 с, шаг 5: возврат к шагу 2 и повторение в течение 35 циклов, шаг 6: окончательное удлинение при 72°C в течение 30 с.
- Используйте те же условия ПЦР для ply3', за исключением времени продления на шаге 4 и шаге 6, где оно должно составлять 60 с.
- Проанализируйте продукты ПЦР методом гель-электрофореза и исключите ампликон из геля.
- Очистите ампликоны ПЦР в соответствии с протоколом, описанным в инструкциях производителя (Таблица материалов).
- Используйте эквимолярные количества обоих плеч гомологий в качестве шаблонов в SOE-PCR. Соедините два ампликона с помощью праймеров plyFw1_ NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG) и plyRv2_NotI (TTTGCGGCCCCATTTTCTACCTACCTTATCCTCTACC).
- Используйте следующие условия SOE-PCR (шаг 1: денатурация при 94 °C в течение 2 мин, шаг 2: денатурация при 94 °C в течение 30 с, шаг 3: отжиг при 58 °C в течение 30 с, шаг 4: удлинение при 68 °C в течение 60 с, шаг 5: возврат к шагу 2 и повторение в течение 25 циклов, шаг 6: окончательное продление при 68 °C в течение 90 с).
- Анализ продукта SOE-PCR методом гель-электрофореза. Исключите его из геля с помощью набора для экстракции геля и следуйте прилагаемым инструкциям.
- Амплифицируют кассету со спектиномицином из плазмиды pR412 с использованием следующих условий ПЦР: шаг 1: денатурация при 94 °C в течение 60 с, шаг 2: денатурация при 94 °C в течение 30 с, шаг 3: отжиг при 55 °C в течение 30 с, шаг 4: удлинение при 68 °C в течение 60 с, шаг 5: вернуться к шагу 2 и повторять в течение 25 циклов, шаг 6: окончательное продление при 68 °C в течение 60 с.
- Используйте праймеры BamHI_SP2F2 (GGATCC, CTA, GAA, CTA, GTG, GAT, CCC) и BamHI_SP2R2 (GGATCC, AAT, TCT, GCA, GAT, TTT, AC, ATG, ATC). Плазмида pR412 была получена у доктора Marc PrudHomme (CNRS-Universite Paul Sabatier, Тулуза, Франция).
- Анализ ампликонов ПЦР методом гель-электрофореза. Иссеките и очистите полученный ампликон ПЦР, как описано выше.
2. Генерация плазмиды pSD1 и химическая трансформация E. coli Dh5α
- Выполните лигирование в соответствии с инструкциями производителя pGEMT-easy system I (таблица материалов). В микроцентрифужную пробирку добавьте 5 мкл 2-кратного лигирующего буфера, 1 мкл pGEMTeasy, 2 мкл продукта ply_SOE, 1 мкл ДНК-лигазы Т4 и воды к общему объему 20 мкл. Инкубировать в течение ночи при температуре 4 °C. При этом генерируется плазмида pSD1.
- Трансформирует химически компетентную кишечную палочку Dh5α с помощью pSD1. Начните с инкубации 50 мкл химически компетентной E. coli Dh5α с 3 мкл реакции лигирования pSD1 в течение 15 минут на льду. Затем продолжайте подвергать клетки термическому удару (42 °C, 30 с). Поместите клетки на лед на 2 мин.
- Извлеките клетки изо льда и добавьте 350 мкл среды S.O.C. Инкубируют культуру в течение 2 ч при 37 °C, 120 об/мин.
- Планшет трансформации на агаре Лурия Бертани (LBA) дополнен 0,4 мМ IPTG, 0,24 мг / мл X-Gal для синего / белого отбора и 100 мкг / мл ампициллина, чтобы убедиться, что все колонии, растущие в планшете, имеют плазмидный остов. Белые колонии содержат pSD1.
- Выберите три белые колонии и создайте ночные наросты в 10 мл LB с добавлением 100 мкг / мл ампициллина. Инкубируют культуры в течение ночи при температуре 37 °C встряхиванием.
- На следующий день центрифугируют культуры в дозе 3,082 x g и используют гранулы для плазмидной экстракции.
3. Экстракция плазмидной ДНК, рестрикционное расщепление гена pSD1 и спектиномицина и сборка pSD2
- Извлеките плазмидную ДНК в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к коммерческому набору (Таблица материалов).
- Установите BamHI-рестрикционное разложение как для плазмиды pSD1, так и для предварительно усиленной и очищенной кассеты со спектиномицином. Используйте следующие условия и количества, описанные в таблице 1.
- Инкубируют реакцию ограничения и контроля пищеварения при 37 °C в течение 3 ч.
- Проанализируйте рестрикционный дайджест с помощью электрофореза, иссеките полосу и очистите, следуя инструкциям, прилагаемым к коммерческому набору (Таблица материалов).
- Затем приготовьте реакцию лигирования в соответствии с инструкциями производителя (Таблица материалов) с использованием BamHI-расщепленного pSD1 и спектиномицина (из шага 3.2). В микроцентрифужную пробирку добавляют следующие компоненты реакции: 5 мкл 2-кратного лигирующего буфера, 2 мкл pSD1, 2 мкл спектиномициновой кассеты, 1 мкл ДНК-лигазы Т4 и инкубируют в течение ночи при 4 °C. При этом генерируется плазмида pSD2.
- Трансформируйте плазмиду pSD2 в химически компетентную E. coli Dh5α, как описано на шаге 2.2.
- Выбор трансформантов, несущих плазмиду pSD2, основан на их способности расти в LBA с добавлением 100 мкг/мл спектиномицина и ампициллина.
- Выполните экстракцию плазмидной ДНК (pSD2), как описано выше, и следуя инструкциям производителя (мкл).
4. Трансформация штамма S. pneumoniae 519/43
- Подготовьте ночную культуру S. pneumoniae 519/43 в BHI и дайте ей расти статически при 37 ° C, 5% CO2.
- На следующий день разбавьте культуры 1:50 и 1:100 в 10 мл свежего бульона BHI. Инкубируют культуры статически при 37 ° C до тех пор, пока OD595 нм не составит от 0,05 до 0,1 (оптимальное получение ДНК ближе к 0,1 OD).
- Как только OD 0,1 достигнут, возьмите 860 мкл и переложите в микроцентрифужную пробирку. В эту же микроцентрифужную пробирку добавляют: 100 мкл 100 мМ NaOH, 10 мкл 20% (мас./об.) BSA, 10 мкл 100 мМ CaCl2, 2 мкл 50 нг/мл CSP124 и 500 нг pSD2.
- Инкубируйте реакцию статически при 37 °C в течение 3 ч.
- Планшет 330 мкл на 5% пластины с кровяным агаром (BA) с добавлением 100 мкг / мл спектиномицина каждый час в течение 3 инкубационных часов.
- Инкубировать пластины в течение ночи при 37 °C, 5% CO2. Пластырь колоний, устойчивых к спектиномицину, на другую пластину БА с добавлением 100 мкг/мл спектиномицина, а также на пластины БА с добавлением 100 мкг/мл ампициллина. Инкубируйте оба набора пластин в течение ночи в условиях, указанных выше. Ампициллиновые пластины предназначены для проверки на наличие плазмидного остова.
- Подтвердить наличие кассеты со спектиномицином методом ПЦР с использованием праймеров plyFw1_ NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG) и SPEC_REV (TAATTCCTCTAAGTCATAATTTCCG). Подтвердите мутацию методом ПЦР с использованием праймеров plySCN1 (CCAATGGAAATCGCTAGGCAAGAGATAA) и plySCN2 (ATTACTTAGTCCAACCACGGCTGAT), которые прикрепляются за пределами мутировавшей области.
- Подтвердить интеграцию в правильном расположении генома можно секвенированием с использованием праймеров plySCN1 (CCAATGGAAATCGCTAGGCAAGAGATAA), plySCN2 (ATTACTTAGTCCAACCACGGCTGAT), а также праймеров с их сайтом связывания в кассете спектиномицина sqr1 (CCTGATCCAAACATGTAAGTACC) sqf2 (CGTAGTTATCTTGGAGAGAATA) spec_sqf1 (GGTACTTACATGTTTGGATCAGG) и spec_sqr2 TATTCTCTCCAAGATAACTACG.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Описанный здесь протокол начинается с использования ПЦР для амплификации левого и правого плеч гомологии с одновременным удалением 191.н. из средней области гена ply . При выполнении ПЦР сайт BamHI вводится в 3' левого плеча гомологии и в 5'-конце правого плеча гомологии (рис. 1A). Затем следует ПЦР-SOE, где левое и правое плечи гомологии сливаются в один ампликон (рис. 1B). Затем этот ампликон SOE-PCR клонируют в pGEMTeasy с помощью клонирования TA для получения плазмиды pSD1 (рис. 1C). Успешная трансформация даст белые колонии, устойчивые к ампициллину. Любые голубые колонии будут трансфорпорантами, содержащими пустую плазмиду pGEMTeasy. Затем pSD1 будет расщеплен на участке BamHI, который был введен во время SOE-PCR (рис. 1D), и лигирован в кассету со спектиномицином (также BamHI переваривается для совместимых целей). Новая плазмида называется pSD2 (рис. 1E). Правильная сборка pSD2 подтверждается рестрикционным расщеплением (рис. 2А). pSD2, который работает как плазмида-самоубийство, поскольку он не содержит грамположительно-совместимого происхождения репликации, был использован для преобразования 519/43WT (ранее подготовленного к компетентности). Положительные трансформанты представляют собой колонии, растущие на 100 мкг / мл спектиномицина после ночной инкубации. Все колонии наносятся на новые свежие базовые пластины кровяного агара с добавлением 100 мкг/мл спектиномицина, а также на основание кровяного агара с добавлением 100 мкг/мл ампициллина. Любые колонии, которые растут на вторых ночных пластинах, дополненных спектиномицином, являются возможными положительными результатами. Любые колонии, которые растут на ампициллиновых пластинах, будут обозначать интеграцию полной плазмиды или рекомбинацию ампициллиновой кассеты в другом месте генома. До сих пор и при использовании штамма 519/43 на пластинах, дополненных ампициллином, не выросло ни одной колонии. Все колонии, положительные с помощью ПЦР, должны быть подтверждены секвенированием (рис. 2C) для оценки и подтверждения места вставки. Для этого праймеры должны иметь свой сайт связывания за пределами области гомологии (рис. 2C). Выбранная мишень имеет очень выраженный фенотип (гемолиз эритроцитов (эритроцитов)), и поэтому мутация также может быть подтверждена фенотипически (рис. 2B). Мутант утратил способность лизировать эритроциты.
| Компоненты | Реакция (мкл) | Контроль (мкл) | Реакция (мкл) | Контроль (мкл) |
| Буфер | 2 | 2 | 2 | 2 |
| pSD1 | 4 | 4 | - | |
| Кассета со спектиномицином | - | - | 6 | 6 |
| БамХИ-ВЧ | 1 | - | 1 | - |
| Вода | 13 | 14 | 11 | 12 |
| Общий объем | 20 | 20 | 20 | 20 |
Таблица 1: Компоненты реакции рестрикционного сбраживания для кассеты pSD1 и спектиномицина.
Рисунок 1: Обзор стратегии мутагенеза. А) Амплификация гомологических плеч (Ply3' и Ply5' (полосы со 2 по 5); и сплайсинг с помощью перекрывающейся удлинительной ПЦР (полосы 6 и 7). L-гиперлестница I (Bioline), полоса 1 - отрицательный контроль реакции, полосы 2 и 3-ply5' (488.н.) и ply3' (715.н.) плечи гомологии, амплифицированные из D39 гДНК, полосы 4 и 5-ply5' (488.н.) и ply3' (715.н.) плечи гомологии, амплифицированные из 519/43 гДНК. Правая боковая полоса 6 - D39 SOE PCR продукт, полоса 7 - 519/43 SOE PCR продукт (1235.н.). Б) Схема, изображающая полученную окончательную конструкцию ГП-ПЦР (ply_SOE); Стрелками обозначены праймеры, используемые для получения области гомологии между обоими плечами гомологии, а также выбранного рестрикционного расщепления. В) плазмида pSD1, изображающая клонирование ply_SOE; D) Рестрикционное расщепление pSD1 и кассеты спектиномицина. E) Окончательная конструкция pSD2, которая затем используется в качестве самоубийственной плазмиды для трансформации S. pneumoniae. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: А) Подтверждение присутствия кассеты спектиномицина в pSD2. L- гиперлестница 1kb (Bioline); 1- pSD1 расщепляют с помощью BamHI; 2-pSD2 расщепляют с помощью BamHI; L гиперлестница 1 кб (Биолайн); 3- кассета со спектиномицином, усиленная из pR412, 4- кассета со спектиномицином, расщепленная с помощью BamHI; Б) Фенотипическое подтверждение мутации пневмолизина путем определения гемолитической активности для D39, 519/43WT и мутанта 519/43Δply. Это сравнивали с гемолизом эритроцитов на 0,5% сапонина. Гемолиз, полученный из сапонина, считается 100%, и по нему были рассчитаны показатели для 519/43Wt и 519/43Δply. Каждая точка данных представляет собой среднее значение 5 технических и 3 биологических реплик. C ) Данные секвенирования, сопоставленные с мутантной областью генома, где пневмолизин был прерван. Буквари обозначаются стрелками и по названию. PLYSCN1 и PLYSCN2 связываются вне плеч гомологий. Секвенирование, полученное из праймеров PLYSCN1 и 2, показало, что существовала непрерывная последовательность из соседних областей за пределами области гомологии до кассеты спектиномицина, демонстрирующая вставку в геном. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Streptococcus pneumoniae, в частности серотип 1, по-прежнему представляет собой глобальную угрозу, вызывающую инвазивную пневмококковую инфекцию и менингит. Несмотря на внедрение различных вакцин, которые должны защищать от серотипа 1, в Африке этот серотип все еще способен вызывать вспышки, которые приводят к высокой заболеваемости и смертности13. Способность генетически манипулировать этим серотипом имеет решающее значение из-за его клинической значимости. Метод, описанный в этом исследовании, позволяет генетически манипулировать репрезентативным штаммом в пределах этого серотипа. Инвазивный штамм 519/43 (ST5316), клинический изолят от пациента с менингитом в Дании25.
Методология, представленная здесь, была успешной в основном из-за выбранного штамма, поскольку он может приобретать экзогенную ДНК, а также из-за изменений, внесенных в традиционные протоколы, используемые для трансформации S. pneumoniae , типичный показатель успеха нашего протокола трансформации составляет около 70%.
При использовании этой методики первостепенное значение имеет использование самоубийственной плазмиды вместо обычной линейной ДНК. Обычно использовалась бы линейная ДНК26,27,28; однако все попытки использовать экзогенную ДНК в этой форме не увенчались успехом. Кроме того, попытки использовать естественную способность S. pneumoniae 519/43 при более низком поглощении не увенчались успехом. Поиск и устранение неисправностей показали, что естественная компетентность штамма 519/43 была выше, когда OD595 составлял 0,1, что отличается от данных, наблюдаемых для других серотипов S. pneumoniae, где наибольшая естественная компетентность наблюдалась при очень низком OD24.
Чтобы проверить метод, был сконструирован мутант пневмолизина, поскольку он демонстрирует простой для понимания фенотип; Однако, чтобы доказать, что метод может быть применен к любому гену в этом штамме, другие гены были успешно нацелены (рукописи в стадии подготовки). Такой метод, использующий самоубийственный вектор, который не имеет грамположительно-совместимого происхождения, может быть также использован для хромосомной комплементации, сверхэкспрессии интересующих генов, а также для введения репортерных систем, и все это с использованием соседних генов в качестве областей гомологии.
Расширение генетических инструментов до S. pneumoniae серотипа 1, штамм 519/43, важно, потому что теперь мы можем генетически манипулировать репрезентативными штаммами напрямую. Штамм 519/43 представляет интерес, поскольку он генетически податлив, является патогенным, поскольку он был выделен от пациента с менингитом, и манипуляции с ним дадут подсказки для лучшего понимания развития и установления менингита. Ранее понимание некоторых детерминант внутри вида осуществлялось путем вставки рассматриваемого гена в один из очень хорошо охарактеризованных штаммов S. pneumoniae, таких как D39 (серотип 2). Такой подход был использован Paton et al. из-за трудностей с мутагенезом на серотипе 129. Результаты, представленные ими на D39, несущем меньший гемолитический аллель серотипа 1 по сравнению с 519/43 ∆слой , отличаются от результатов, представленных нами30 , что подчеркивает важность возможности мутации гена в исходном фоне штамма. Позже та же группа смогла мутировать штаммсеротипа 1 22, не относящийся к линии А. Интересно, что их протокол сильно отличается от нашего, поскольку это двухэтапный подход, который требует, чтобы мутация была сначала сделана в штаммах серотипа 2, а затем используется в качестве шаблона для трансформации в их штамм серотипа 1.
В настоящее время в представленном методе есть одно ограничение. На данный момент этот метод работает только для репрезентативного штамма 519/43. Тот же протокол был опробован в других штаммах, а именно в клинических изолятах из ST3081 и ST303, и он не увенчался успехом. Кроме того, электропорация как метод доставки экзогенной ДНК в клетку также была предпринята на всех трех типах последовательностей, с положительными результатами, наблюдаемыми только для 519/43. Расширение и стандартизация методологии для всех штаммов серотипа 1 имеет первостепенное значение, поскольку существует огромная вариабельность во всей группе. В настоящее время проводятся исследования по расширению применимости метода ко всем штаммам серотипа 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам раскрывать нечего.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Фонд менингита и MRC за предоставление финансирования для этой работы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AccuPrime Pfx DNA polymerase | Invitrogen | 12344024 | Used for amplification of the fragments |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A9518 | Used for bacterial selection on stage 1(pSD1) |
| Blood Agar Base | Oxoid | CM0055 | Used to plate S. pneumoniae transformants |
| Bovine Serum Albumine | sigma | 55470 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Brain Heart Infusion | Oxoid | CM1135 | used to grow S. pneumoniae cells |
| Calcium Chloride Cacl2 | Sigma | 449709 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Competence stimulating peptide 1 | AnaSpec | AS-63779 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Luria Broth Agar | Gibco | 22700025 | used for plating and selection of pSD1 and pSD2 |
| Luria Broth Base (Miller's formulation) | Gibco | 12795027 | used for plating and selection of pSD1 and pSD2 |
| Monarch Gel Extraction Kit | NEB | T1020S | Used to extract the bands from the DNA gel |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | NEB | T1010S | Used to extract plasmid from the cells |
| pGEM T-easy | Promega | A1360 | used as suicide plasmid |
| S.O.C. | Invitrogen | 15544034 | used for recovery of cells after transformation |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma | S0899 | used for S.pneumoniae Transformation |
| Spectinomycin Hydrochloride | SigmaAldrich | PHR1426 | Used for bacterial selection |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Invitrogen | 18265017 | used for the creation of pSD1 and pSD2 |
References
- Bentley, S. D., et al. Genetic Analysis of the Capsular Biosynthetic Locus from All 90 Pneumococcal Serotypes. PLoS Genetics. 2 (3), 31 (2006).
- Calix, J. J., Nahm, M. H. A new pneumococcal serotype, 11E, has a variably inactivated wcjE gene. The Journal of Infectious Diseases. 202 (1), 29-38 (2010).
- Park, I. H., Pritchard, D. G., Cartee, R., Brandao, A., Brandileone, M. C. C., Nahm, M. H. Discovery of a New Capsular Serotype (6C) within Serogroup 6 of Streptococcus pneumoniae. Journal of Clinical Microbiology. 45 (4), 1225-1233 (2007).
- Jin, P., et al. First Report of Putative Streptococcus pneumoniae Serotype 6D among Nasopharyngeal Isolates from Fijian Children. The Journal of Infectious Diseases. 200 (9), 1375-1380 (2009).
- Oliver, M. B., vander Linden, M. P. G., Küntzel, S. A., Saad, J. S., Nahm, M. H. Discovery of Streptococcus pneumoniae Serotype 6 Variants with Glycosyltransferases Synthesizing Two Differing Repeating Units. Journal of Biological Chemistry. 288 (36), 25976-25985 (2013).
- Calix, J. J., et al. Serological Characterization of Two Capsule Subtypes among Streptococcus pneumoniae Serotype 20 Strains. Journal of Biological Chemistry. 287 (33), 27885-27894 (2012).
- Park, I. H., et al. and Serological Characterization of a New Pneumococcal Serotype, 6H, and Generation of a Pneumococcal Strain Producing Three Different Capsular Repeat Units. Clinical and Vaccine Immunology. 22 (3), 313-318 (2015).
- O'Brien, K. L., et al. Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates. The Lancet. 374 (9693), 893-902 (2009).
- Henriques-Normark, B., Tuomanen, E. I. The Pneumococcus: Epidemiology, Microbiology, and Pathogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 3 (7), 010215 (2013).
- Leimkugel, J., et al. An Outbreak of Serotype 1 Streptococcus pneumoniae Meningitis in Northern Ghana with Features That Are Characteristic of Neisseria meningitidis Meningitis Epidemics. The Journal of Infectious Diseases. 192 (2), 192-199 (2005).
- Yaro, S., et al. Epidemiological and Molecular Characteristics of a Highly Lethal Pneumococcal Meningitis Epidemic in Burkina Faso. Clinical Infectious Diseases. 43 (6), 693-700 (2006).
- Antonio, M., et al. Molecular epidemiology of pneumococci obtained from Gambian children aged 2-29 months with invasive pneumococcal disease during a trial of a 9-valent pneumococcal conjugate vaccine. BMC Infectious Diseases. 8 (1), 81 (2008).
- Kwambana-Adams, B. A., et al. An outbreak of pneumococcal meningitis among older children (≥5 years) and adults after the implementation of an infant vaccination programme with the 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in Ghana. BMC Infectious Diseases. 16 (1), 575 (2016).
- Antonio, M., et al. Seasonality and outbreak of a predominant Streptococcus pneumoniae serotype 1 clone from The Gambia: Expansion of ST217 hypervirulent clonal complex in West Africa. BMC Microbiology. 8 (1), 198 (2008).
- Staples, M., et al. Molecular characterization of an Australian serotype 1 Streptococcus pneumoniae outbreak. Epidemiology and Infection. 143 (2), 325-333 (2015).
- Gessner, B. D., Mueller, J. E., Yaro, S. African meningitis belt pneumococcal disease epidemiology indicates a need for an effective serotype 1 containing vaccine, including for older children and adults. BMC Infectious Diseases. 10 (1), 22 (2010).
- Hill, P. C., et al. Nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae in Gambian infants: a longitudinal study. Clinical Infectious Diseases. 46 (6), 807-814 (2008).
- Ebruke, C., et al. Temporal changes in nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae serotype 1 genotypes in healthy Gambians before and after the 7-valent pneumococcal conjugate vaccine. PeerJ. 3, 90 (2015).
- Adegbola, R. A., et al. Serotype and antimicrobial susceptibility patterns of isolates of Streptococcus pneumoniae causing invasive disease in The Gambia 1996-2003. Tropical Medicine and International Health. 11 (7), 1128-1135 (2006).
- Marks, L. R., Reddinger, R. M., Hakansson, A. P. High Levels of Genetic Recombination during Nasopharyngeal Carriage and Biofilm Formation in Streptococcus pneumoniae. mBio. 3 (5), (2012).
- Ritchie, N. D., Mitchell, T. J., Evans, T. J. What is different about serotype 1 pneumococci. Future Microbiology. 7 (1), 33-46 (2012).
- Harvey, R. M., et al. The variable region of pneumococcal pathogenicity island 1 is responsible for unusually high virulence of a serotype 1 isolate. Infection and Immunity. 84 (3), 822-832 (2016).
- Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. BioTechniques. 8 (5), 528-535 (1990).
- Alioing, G., Granadel, C., Morrison, D. A., Claverys, J. P. Competence pheromone, oligopeptide permease, and induction of competence in Streptococcus pneumoniae. Molecular Microbiology. 21 (3), 471-478 (1996).
- Lund, E. Enumeration and description of the strains belonging to the State Serum Institute, Copenhagen Denmark. , (1951).
- Barany, F., Tomasz, A. Genetic transformation of Streptococcus pneumoniae by heterologous plasmid deoxyribonucleic acid. Journal of Bacteriology. 144 (2), 698-709 (1980).
- Terra, V. S., Homer, K. A., Rao, S. G., Andrew, P. W., Yesilkaya, H. Characterization of novel β-galactosidase activity that contributes to glycoprotein degradation and virulence in Streptococcus pneumoniae. Infection and Immunity. 78 (1), (2010).
- Terra, V. S., Zhi, X., Kahya, H. F., Andrew, P. W., Yesilkaya, H. Pneumococcal 6-phospho-β-glucosidase (BglA3) is involved in virulence and nutrient metabolism. Infection and Immunity. 84 (1), (2015).
- Harvey, R. M., Ogunniyi, A. D., Chen, A. Y., Paton, J. C. Pneumolysin with Low Hemolytic Activity Confers an Early Growth Advantage to Streptococcus pneumoniae in the Blood. Infection and Immunity. 79 (10), 4122 (2011).
- Terra, V. S., Plumptre, C. D., Wall, E. C., Brown, J. S., Wren, B. W. Construction of a pneumolysin deficient mutant in Streptococcus pneumoniae serotype 1 strain 519/43 and phenotypic characterisation. Microbial Pathogenesis. 141, 103999 (2020).
