Summary
Aquí, describimos una cepa 519/43 del serotipo 1 de S. pneumoniae que puede modificarse genéticamente utilizando su capacidad para adquirir ADN de forma natural y un plásmido suicida. Como prueba de principio, se hizo un mutante isogénico en el gen de la neumolisina (ply).
Abstract
Streptococcus pneumoniae serotipo 1 sigue siendo un gran problema en los países de ingresos bajos y medios, particularmente en el África subsahariana. A pesar de su importancia, los estudios en este serotipo se han visto obstaculizados por la falta de herramientas genéticas para modificarlo. En este estudio, describimos un método para modificar genéticamente un aislado clínico de serotipo 1 (cepa 519/43). Curiosamente, esto se logró explotando la capacidad del neumococo para adquirir ADN de forma natural. Sin embargo, a diferencia de la mayoría de los neumococos, el uso de ADN lineal no tuvo éxito; Para mutar esta importante cepa, se tuvo que usar un plásmido suicida. Esta metodología ha proporcionado los medios para una comprensión más profunda de este esquivo serotipo, tanto en términos de su biología como de patogenicidad. Para validar el método, la principal toxina neumocócica conocida, la neumolisina, fue mutada porque tiene un fenotipo bien conocido y fácil de seguir. Demostramos que el mutante, como era de esperar, perdió su capacidad de lisar los glóbulos rojos. Al poder mutar un gen importante en el serotipo de interés, pudimos observar diferentes fenotipos para la pérdida de función mutantes en infecciones intraperitoneales e intranasales de los observados para otros serotipos. En resumen, este estudio demuestra que la cepa 519/43 (serotipo 1) puede ser modificada genéticamente.
Introduction
Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae, el neumococo) es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad a nivel mundial. Hasta hace poco, se han descubierto cerca de 100 serotipos de S. pneumoniae 1,2,3,4,5,6,7. Anualmente, la enfermedad neumocócica invasiva (EPI) se cobra alrededor de 700.000 muertes, de niños menores de 5 años8. S. pneumoniae es la principal causa de neumonía bacteriana, otitis media, meningitis y septicemia en todo el mundo9.
En el cinturón africano de la meningitis, el serotipo 1 es responsable de los brotes de meningitis, donde el tipo de secuencia (ST) ST217, un tipo de secuencia extremadamente virulento, es dominante 10,11,12,13,14,15. Su importancia en la patología de la meningitis ha sido comparada con la de Neisseria meningitidis en el cinturón africano de la meningitis16. El serotipo 1 es a menudo la causa principal de la EPI; Sin embargo, rara vez se encuentra en el transporte. De hecho, en Gambia, este serotipo es responsable del 20% de todas las enfermedades invasivas, pero solo se encontró en el 0,5% de los portadores sanos14,17,18,19. El intercambio genético y la recombinación en neumococos competentes ocurren generalmente en el transporte más que en la enfermedad invasiva20. Además, se ha demostrado que el serotipo 1 tiene una de las tasas de transporte más cortas descritas entre los neumococos (solo 9 días). Por lo tanto, se ha propuesto que este serotipo podría tener una tasa de recombinación mucho menor que otros21.
Se necesitan estudios en profundidad para comprender la razón detrás de la baja tasa de transporte de las cepas del serotipo 1 y su importancia en la enfermedad invasiva en el África subsahariana.
Aquí informamos un protocolo que permite la mutagénesis de todo el genoma de una cepa particular del serotipo 1, 519/43. Esta cepa puede adquirir y recombinar fácilmente nuevo ADN en su genoma. Este método aún no está inter-cepa, pero es muy eficiente cuando se hace en 519/43 fondo (otros objetivos han sido mutados, manuscritos en preparación). Simplemente utilizando la cepa 519/43 y explotando su competencia natural, así como sustituyendo la forma en que se proporciona el ADN exógeno, pudimos mutar el gen de la neumolisina (ply) en esta cepa del serotipo 1. Este método representa una mejora respecto al presentado por Harvey et al.22 ya que se realiza en un solo paso sin necesidad de pasar el ADN a través de un serotipo diferente. Sin embargo, y debido a la variabilidad entre cepas, no se ha estandarizado ningún método para todas las cepas. La capacidad de mutar genes específicos y observar sus efectos permitirá una comprensión profunda de las cepas de S. pneumoniae del serotipo 1 y proporcionará respuestas para el papel de estas cepas en la meningitis en el África subsahariana.
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Protocol
1. Generación del amplicón mutante por SOE-PCR23 y amplificación del casete de espectinomicina
- Comience realizando PCR para la amplificación de los brazos de homología (ply 5' (488 pb) y ply3' (715 pb) respectivamente) de las regiones flanqueantes del gen ply de la cepa 519/43. Use imprimaciones plyFw1_NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG), ply5'R1_BamHI (CGAAATATAGACCAAAGGACGCGGATCC AGAACCAAACTTGTTGA), ply3'F1_BamHI (TCAAGGTCAAGTTTGGTTCTGGATCC GCGTCCTGTGTCTATATTTCG) y plyRv2_NotI (TTTGCGGCCGCCATTTTCTACCTTATCCTCTACCACC).
- Utilice las siguientes condiciones de PCR para la capa 5': desnaturalización a 94 °C durante 60 s, paso 2: desnaturalización a 94 °C durante 30 s, paso 3: recocido a 58 °C durante 30 s, paso 4: extensión a 72 °C durante 30 s, paso 5: volver al paso 2 y repetir durante 35 ciclos, paso 6: extensión final a 72 °C durante 30 s.
- Utilice las mismas condiciones de PCR para ply3' con la excepción del tiempo de extensión en el paso 4 y el paso 6, donde debe ser de 60 s.
- Analizar los productos de PCR mediante electroforesis en gel y extirpar el amplicón del gel.
- Purificar los amplicones de PCR siguiendo el protocolo descrito en las instrucciones del fabricante (Tabla de materiales).
- Utilizar cantidades equimolares de ambos brazos de homología como plantillas en la SOE-PCR. Fusione los dos amplicones usando cebadores plyFw1_ NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG) y plyRv2_NotI (TTTGCGGCCGCCATTTTCTACCTTATCCTCTACC).
- Utilice las siguientes condiciones SOE-PCR (paso 1: desnaturalización a 94 °C durante 2 min, paso 2: desnaturalización a 94 °C durante 30 s, paso 3: recocido a 58 °C durante 30 s, paso 4: extensión a 68 °C durante 60 s, paso 5: volver al paso 2 y repetir durante 25 ciclos, paso 6: extensión final a 68 °C durante 90 s).
- Analizar el producto SOE-PCR mediante electroforesis en gel. Extirparlo del gel con un kit de extracción en gel y seguir las instrucciones proporcionadas.
- Amplificar el casete de espectinomicina del plásmido pR412 utilizando las siguientes condiciones de PCR: paso 1: desnaturalización a 94 °C durante 60 s, paso 2: desnaturalización a 94 °C durante 30 s, paso 3: recocido a 55 °C durante 30 s, paso 4: extensión a 68 °C durante 60 s, paso 5: volver al paso 2 y repetir durante 25 ciclos, paso 6: extensión final a 68 °C durante 60 s.
- Utilice cebadores BamHI_SP2F2 (GGATCC CTA GAA CTA GTG GAT CCC CC) y BamHI_SP2R2 (GGATCC AAT TCT GCA GAT TTT AC ATG ATC). El plásmido pR412 fue adquirido del Dr. Marc PrudHomme (CNRS-Universite Paul Sabatier Toulouse France).
- Analizar los amplicones de PCR mediante electroforesis en gel. Extirpar y purificar el amplicón de PCR resultante como se describió anteriormente.
2. Generación del plásmido pSD1 y transformación química de E. coli Dh5α
- Realizar una ligadura siguiendo las instrucciones del fabricante del sistema pGEMT-easy I (Tabla de Materiales). En un tubo de microcentrífuga, añadir 5 μL de tampón de ligadura 2x, 1 μL de pGEMTeasy, 2 μL del producto ply_SOE, 1 μL de ADN ligasa T4 y agua a un volumen total de 20 μL. Incubar durante la noche a 4 °C. Esto genera el plásmido pSD1.
- Transformar E. coli Dh5α químicamente competente con pSD1. Comience incubando 50 μL de E. coli Dh5α químicamente competente con 3 μL de reacción de ligadura pSD1 durante 15 minutos en hielo. A continuación, continúe exponiendo las células a un choque térmico (42 °C, 30 s). Coloque las celdas en hielo durante 2 minutos.
- Retire las células del hielo y agregue 350 μL de medios S.O.C. Incubar el cultivo durante 2 h a 37 °C, 120 rpm.
- Placa de la transformación en agar Luria Bertani (LBA) suplementado con 0,4 mM de IPTG, 0,24 mg/ml de X-Gal para la selección azul/blanca y 100 μg/ml de ampicilina para asegurar que todas las colonias que crecen en la placa tengan la columna vertebral del plásmido. Las colonias blancas contienen pSD1.
- Elija tres colonias blancas y establezca crecimientos durante la noche en 10 ml de LB, complementados con ampicilina de 100 μg / ml. Incubar los cultivos durante la noche a 37 °C con agitación.
- Al día siguiente centrifugar los cultivos a 3.082 x g y utilizar el pellet para la extracción de plásmidos.
3. Extracción de ADN plásmido, digestión restrictiva del gen pSD1 y espectinomicina y ensamblaje de pSD2
- Extraiga el ADN plásmido siguiendo las instrucciones proporcionadas con el kit comercial (Tabla de materiales).
- Establezca una digestión de restricción BamHI tanto para el plásmido pSD1 como para el casete de espectinomicina previamente amplificado y purificado. Utilice las siguientes condiciones y cantidades descritas en la Tabla 1.
- Incubar las reacciones de digestión restrictiva y los controles a 37 °C durante 3 h.
- Analizar el digest de restricción por electroforesis, extirpar la banda y purificar siguiendo las instrucciones proporcionadas con el kit comercial (Tabla de Materiales).
- A continuación, prepare una reacción de ligadura siguiendo las instrucciones del fabricante (Tabla de materiales) utilizando la pSD1 digerida por BamHI y la espectinomicina (a partir del paso 3.2). En un tubo de microcentrífuga, añadir los siguientes componentes de reacción: 5 μL de tampón de ligadura 2x, 2 μL de pSD1, 2 μL de casete de espectinomicina, 1 μL de ADN ligasa T4 e incubar durante la noche a 4 °C. Esto genera el plásmido pSD2.
- Transformar el plásmido pSD2 en E. coli Dh5α químicamente competente como se describe en el paso 2.2.
- Seleccione los transformadores que transportan plásmido pSD2 en función de su capacidad para crecer en LBA suplementado con 100 μg/ml de espectinomicina y ampicilina.
- Realice una extracción de ADN plásmido (pSD2) como se describe anteriormente y siguiendo las instrucciones del fabricante (μL).
4. Transformación de la cepa 519/43 de S. pneumoniae
- Preparar un cultivo nocturno de S. pneumoniae 519/43 en BHI y dejar que crezca estáticamente a 37 °C, 5% CO2.
- Al día siguiente diluir los cultivos 1:50 y 1:100 en 10 mL de caldo fresco de BHI. Incubar los cultivos estáticamente a 37 °C hasta que el OD595nm esté entre 0,05 y 0,1 (adquisición óptima de ADN más cercana a 0,1 OD).
- Una vez que se alcanza un OD de 0,1, tomar 860 μL y transferir a un tubo de microcentrífuga. En este mismo tubo de microcentrífuga añadir: 100 μL de NaOH de 100 mM, 10 μL de BSA al 20% (p/v), 10 μL de CaCl 2 de 100 mM,2 μL de CSP1 de 50 ng/mL de24 y 500 ng de pSD2.
- Incubar la reacción estáticamente a 37 °C durante 3 h.
- Placa 330 μL en placas de agar sangre al 5% (BA) suplementadas con espectinomicina de 100 μg/ml, cada hora durante las 3 horas de incubación.
- Incubar las placas durante la noche a 37 °C, 5%CO2. Parche colonias resistentes a la espectromicina en otra placa BA suplementada con 100 μg/ml de espectinomicina, así como en placas BA suplementadas con 100 μg/ml de ampicilina. Incubar ambos juegos de placas durante la noche en las condiciones indicadas anteriormente. Las placas de ampicilina son para probar la presencia de la columna vertebral del plásmido.
- Confirmar la presencia del casete de espectinomicina mediante PCR utilizando cebadores plyFw1_ NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG) y SPEC_REV (TAATTCCTCTAAGTCATAATTTCCG). Confirmar la mutación mediante PCR utilizando cebadores plySCN1 (CCAATGGAAATCGCTAGGCAAGAGATAA) y plySCN2 (ATTACTTAGTCCAACCACGGCTGAT) que se adhieren fuera de la región mutada.
- Confirmar la integración en la correcta localización del genoma mediante secuenciación mediante cebadores plySCN1 (CCAATGGAAATCGCTAGGCAAGAGATAA), plySCN2 (ATTACTTAGTCCAACCACGGCTGAT), así como cebadores con su sitio de unión en el casete de espectinomicina sqr1 (CCTGATCCAAACATGTAAGTACC) sqf2 (CGTAGTTATCTTGGAGAGAATA) spec_sqf1 (GGTACTTACATGTTTGGATCAGG) y spec_sqr2 TATTCTCTCCAAGATAACTACG.
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Representative Results
El protocolo descrito aquí comienza utilizando PCR para amplificar los brazos de homología izquierda y derecha, mientras que simultáneamente elimina 191 pb de la región media del gen ply . Durante la realización de la PCR se introduce un sitio BamHI en los 3' del brazo de homología izquierdo y en el extremo 5' del brazo de homología derecho (Figura 1A). Esto es seguido por PCR-SOE donde los brazos de homología izquierda y derecha se fusionan en un amplicón (Figura 1B). Este amplicón SOE-PCR se clona en pGEMTeasy utilizando la clonación de TA para generar el plásmido pSD1 (Figura 1C). La transformación exitosa producirá colonias blancas que son resistentes a la ampicilina. Cualquier colonia azul será transformante que contenga un plásmido pGEMTeasy vacío. pSD1 luego se digerirá en el sitio de BamHI que se introdujo en el momento de la SOE-PCR (Figura 1D) y se ligará a un casete de espectinomicina (también BamHI digerido para fines compatibles). El nuevo plásmido se denomina pSD2 (Figura 1E). El ensamblaje correcto de pSD2 se confirma mediante digestión restringida (Figura 2A). pSD2, que funciona como un plásmido suicida ya que no contiene un origen de replicación compatible Gram-positivo, se utilizó para transformar 519/43WT (previamente preparado para ser competente). Los transformadores positivos son colonias que crecen con 100 μg/ml de espectinomicina después de una incubación nocturna. Todas las colonias se parchean en placas base de agar sangre recién frescas suplementadas con 100 μg / ml de espectinomicina, así como en base de agar sangre suplementada con 100 μg / ml de ampicilina. Cualquier colonia que crezca en las segundas placas durante la noche suplementadas con espectinomicina son posibles positivos. Cualquier colonia que crezca en placas de ampicilina denotará la integración del plásmido completo o la recombinación del casete de ampicilina en otra parte del genoma. Hasta el momento y utilizando la cepa 519/43 no han crecido colonias en las placas suplementadas con ampicilina. Todas las colonias positivas por PCR deben ser confirmadas por secuenciación (Figura 2C) para evaluar y confirmar la localización de la inserción. Con este fin, los cebadores deben tener su sitio de unión fuera de la región de homología (Figura 2C). La diana elegida tiene un fenotipo muy marcado (hemólisis de glóbulos rojos [RBC]), por lo que la mutación también puede confirmarse fenotípicamente (Figura 2B). El mutante perdió su capacidad de lisar RBC.
| Componentes | Reacción (μL) | Control (μL) | Reacción (μL) | Control (μL) |
| Búfer | 2 | 2 | 2 | 2 |
| pSD1 | 4 | 4 | - | |
| Casete de espectinomicina | - | - | 6 | 6 |
| BamHI-HF | 1 | - | 1 | - |
| Agua | 13 | 14 | 11 | 12 |
| Volumen total | 20 | 20 | 20 | 20 |
Tabla 1: Componentes de la reacción de digestión de restricción para pSD1 y casete de espectinomicina.
Figura 1: Visión general de la estrategia de mutagénesis. A) Amplificación de brazos homólogos (Ply3' y Ply5' (carriles 2 a 5); y Empalme por PCR de Extensión Superpuesta (Carriles 6 y 7). L- hiperescalera I (Bioline), carril 1- control negativo para la reacción, carril 2 y 3- ply5' (488 pp) y ply3' (715 pb) brazos de homología amplificados a partir de D39 gDNA, carriles 4 y 5- ply5' (488 pp) y ply3' (715 pb) brazos de homología amplificados a partir de 519/43 gDNA. Carril lateral derecho 6- Producto D39 SOE PCR, carril 7- 519/43 SOE PCR producto (1235 pb). B) Esquema que representa la construcción final de SOE-PCR obtenida (ply_SOE); Indicados por flechas son los cebadores utilizados para obtener la región de homología entre ambos brazos de homología, así como la digestión de restricción elegida. C) Plásmido pSD1, que representa la clonación de ply_SOE; D) Digestión restringida de pSD1 y casete de espectinomicina. E) Construcción final pSD2 que luego se utiliza como plásmido suicida para transformar S. pneumoniae. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: A) Confirmación de la presencia del casete de espectinomicina en pSD2. L- hiperescalera 1kb (Bioline); 1- pSD1 digerido con BamHI; 2-pSD2 digerido con BamHI; L hiperescalera 1 kb (Bioline); 3- Cassette de espectinomicina amplificado a partir de pR412, 4- Cassette de espectinomicina digerido con BamHI; B) Confirmación fenotípica de la mutación de la neumolisina mediante la determinación de la actividad hemolítica para D39, 519/43WT y el mutante 519/43Δply. Esto se comparó con la hemólisis de los glóbulos rojos por saponina al 0,5%. La hemólisis derivada de saponina se considera del 100% y las tasas para 519/43Wt y 519/43Δply se calcularon contra ella. Cada punto de datos es la media de 5 réplicas técnicas y 3 biológicas. C) Datos de secuenciación mapeados a la región del genoma mutante donde se interrumpió la neumolisina. Los cebadores se indican como flechas y por nombre. PLYSCN1 y PLYSCN2 se unen fuera de los brazos de homología. La secuenciación obtenida a partir de cebadores PLYSCN1 y 2 mostró que había una secuencia ininterrumpida desde las regiones vecinas fuera del área de homología hasta el casete de espectinomicina, demostrando la inserción en el genoma. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Streptococcus pneumoniae, en particular el serotipo 1, sigue siendo una amenaza mundial que causa enfermedad neumocócica invasiva y meningitis. A pesar de la introducción de varias vacunas que deberían ser protectoras contra el serotipo 1, en África, este serotipo todavía es capaz de causar brotes que conducen a una alta morbilidad y mortalidad13. La capacidad de manipular genéticamente este serotipo es de importancia crítica debido a su relevancia clínica. El método descrito en este estudio permite la manipulación genética de una cepa representativa dentro de este serotipo. Una cepa invasiva 519/43 (ST5316), un aislado clínico de un paciente con meningitis en Dinamarca25.
La metodología presentada aquí, fue exitosa principalmente debido a la cepa elegida, ya que puede adquirir ADN exógeno, pero también debido a los cambios realizados en los protocolos tradicionales utilizados para la transformación de S. pneumoniae , una tasa de éxito típica de nuestro protocolo de transformación es de aproximadamente el 70%.
Con esta metodología, es primordial utilizar un plásmido suicida en lugar del ADN lineal habitual. Convencionalmente, se habría utilizado ADN lineal26,27,28; sin embargo, todos los intentos de usar el ADN exógeno en esta forma no tuvieron éxito. Además, los intentos de explotar la competencia natural de S. pneumoniae 519/43 a menor absorbancia no tuvieron éxito. La resolución de problemas demostró que la competencia natural para la cepa 519/43 fue mayor cuando la OD595 fue de 0,1, que es diferente de los datos observados para otros serotipos de S. pneumoniae donde la mayor competencia natural se observó con una OD muy baja24.
Para validar el método, se construyó un mutante de neumolisina porque exhibe un fenotipo fácil de seguir; Sin embargo, para demostrar que el método se puede aplicar a cualquier gen dentro de esta cepa, otros genes han sido dirigidos con éxito (manuscritos en preparación). Tal método, utilizando un vector suicida que no tiene un origen compatible Gram-positivo, también podría usarse para la complementación cromosómica, la sobreexpresión de genes de interés, así como la introducción de sistemas reporteros, todo utilizando los genes vecinos como regiones de homología.
La expansión de las herramientas genéticas a S. pneumoniae serotipo 1, cepa 519/43 es importante porque ahora podemos manipular genéticamente cepas representativas directamente. La cepa 519/43 es de interés ya que es genéticamente flexible, es patógena ya que se aisló de un paciente con meningitis, y su manipulación proporcionará pistas para comprender mejor el desarrollo y el establecimiento de la meningitis. Anteriormente, la comprensión de ciertos determinantes dentro de la especie se realizaba insertando el gen en cuestión en una de las cepas muy bien caracterizadas de S. pneumoniae, como D39 (serotipo 2). Tal enfoque fue utilizado por Paton et al., debido a las dificultades con la mutagénesis en el serotipo 129. Los resultados reportados por ellos en D39 portadores de un alelo menos hemolítico de capa de serotipo 1 en comparación con 519/43 ∆ply difieren de los presentados por nosotros30 destacando la importancia de poder mutar un gen dentro del fondo original de la cepa. Más tarde, el mismo grupo fue capaz de mutar una cepa22 del serotipo 1 A no linaje. Curiosamente, su protocolo es bastante distinto al nuestro, ya que es un enfoque de dos pasos que requiere que la mutación se realice primero en cepas de serotipo 2 y luego se use como plantilla para transformarse en su cepa de serotipo 1.
Actualmente, hay una limitación en el método presentado. Por ahora, este método solo funciona para la cepa representativa 519/43. El mismo protocolo exacto se probó en otras cepas, a saber, aislados clínicos de ST3081 y ST303 y no tuvo éxito. Además, la electroporación como método de entrega de ADN exógeno a la célula también se intentó en los tres tipos de secuencias, con resultados positivos observados solo para 519/43. Ampliar y estandarizar la metodología a todas las cepas de serotipo 1 es de suma importancia, ya que existe una enorme variabilidad en todo el grupo. Actualmente se están realizando estudios para ampliar la aplicabilidad del método a todas las cepas dentro del serotipo 1.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer al Meningitis Trust y al MRC por proporcionar fondos para este trabajo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AccuPrime Pfx DNA polymerase | Invitrogen | 12344024 | Used for amplification of the fragments |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A9518 | Used for bacterial selection on stage 1(pSD1) |
| Blood Agar Base | Oxoid | CM0055 | Used to plate S. pneumoniae transformants |
| Bovine Serum Albumine | sigma | 55470 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Brain Heart Infusion | Oxoid | CM1135 | used to grow S. pneumoniae cells |
| Calcium Chloride Cacl2 | Sigma | 449709 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Competence stimulating peptide 1 | AnaSpec | AS-63779 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Luria Broth Agar | Gibco | 22700025 | used for plating and selection of pSD1 and pSD2 |
| Luria Broth Base (Miller's formulation) | Gibco | 12795027 | used for plating and selection of pSD1 and pSD2 |
| Monarch Gel Extraction Kit | NEB | T1020S | Used to extract the bands from the DNA gel |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | NEB | T1010S | Used to extract plasmid from the cells |
| pGEM T-easy | Promega | A1360 | used as suicide plasmid |
| S.O.C. | Invitrogen | 15544034 | used for recovery of cells after transformation |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma | S0899 | used for S.pneumoniae Transformation |
| Spectinomycin Hydrochloride | SigmaAldrich | PHR1426 | Used for bacterial selection |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Invitrogen | 18265017 | used for the creation of pSD1 and pSD2 |
References
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