Summary
Här beskriver vi en S. pneumoniae serotyp 1-stam 519/43 som kan modifieras genetiskt genom att använda dess förmåga att naturligt förvärva DNA och en självmordsplasmid. Som bevis på principen gjordes en isogen mutant i pneumolysin (skikt) genen.
Abstract
Streptococcus pneumoniae serotyp 1 är fortfarande ett stort problem i låg- och medelinkomstländer, särskilt i Afrika söder om Sahara. Trots dess betydelse har studier i denna serotyp hindrats av bristen på genetiska verktyg för att modifiera den. I denna studie beskriver vi en metod för att genetiskt modifiera ett kliniskt isolat av serotyp 1 (stam 519/43). Intressant nog uppnåddes detta genom att utnyttja Pneumokockernas förmåga att naturligt förvärva DNA. Men till skillnad från de flesta pneumokocker var användningen av linjärt DNA inte framgångsrik; För att mutera denna viktiga stam måste en självmordsplasmid användas. Denna metod har gett medel för en djupare förståelse av denna svårfångade serotyp, både när det gäller dess biologi och patogenicitet. För att validera metoden muterades det viktigaste kända pneumokocktoxinet, pneumolysin, eftersom det har en välkänd och lätt att följa fenotyp. Vi visade att mutanten, som förväntat, förlorade sin förmåga att lysera röda blodkroppar. Genom att kunna mutera en viktig gen i den aktuella serotypen kunde vi observera olika fenotyper för förlust av funktionsmutanter vid intraperitoneala och intranasala infektioner än de som observerats för andra serotyper. Sammanfattningsvis visar denna studie att stam 519/43 (serotyp 1) kan modifieras genetiskt.
Introduction
Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae, pneumokockerna) är en av de främsta orsakerna till sjuklighet och dödlighet globalt. Fram till nyligen har nära 100 serotyper av S. pneumoniae upptäckts 1,2,3,4,5,6,7. Årligen kräver invasiv pneumokocksjukdom (IPD) cirka 700 000 dödsfall av barn yngre än 5 år8. S. pneumoniae är den främsta orsaken till bakteriell lunginflammation, otitis media, hjärnhinneinflammation och septikemi över hela världen9.
I det afrikanska meningitbältet är serotyp 1 ansvarig för utbrott av hjärnhinneinflammation, där sekvenstyp (ST) ST217, en extremt virulent sekvenstyp, är dominerande 10,11,12,13,14,15. Dess betydelse i meningitpatologi har liknats vid Neisseria meningitidis i det afrikanska meningitbältet16. Serotyp 1 är ofta den främsta orsaken till IPD; Det finns dock mycket sällan i vagn. Faktum är att i Gambia är denna serotyp ansvarig för 20% av all invasiv sjukdom, men den hittades bara i 0,5% av friska bärare14,17,18,19. Genetiskt utbyte och rekombination hos kompetenta pneumokocker sker i allmänhet i transport snarare än vid invasiv sjukdom20. Dessutom har serotyp 1 visat sig ha en av de kortaste transportfrekvenserna som beskrivs bland pneumokocker (endast 9 dagar). Därför har det föreslagits att denna serotyp kan ha en mycket lägre rekombinationsfrekvens än andra21.
Fördjupade studier är nödvändiga för att förstå orsaken bakom serotyp 1-stammarnas låga transporthastighet och dess betydelse för invasiv sjukdom i Afrika söder om Sahara.
Här rapporterar vi ett protokoll som tillåter genomomfattande mutagenes av en viss serotyp 1-stam, 519/43. Denna stam kan enkelt förvärva och rekombinera nytt DNA i dess genom. Denna metod är ännu inte inter-strain, men den är mycket effektiv när den görs i 519/43 bakgrund (andra mål har muterats, manuskript under utarbetande). Genom att helt enkelt använda 519/43-stammen och utnyttja dess naturliga kompetens, samt ersätta det sätt som det exogena DNA tillhandahålls, kunde vi mutera pneumolysingenen (skikt) i denna serotyp 1-stam. Denna metod representerar en förbättring av den som presenterades av Harvey et al.22 eftersom den görs i ett steg utan att behöva passera DNA genom en annan serotyp. Ändå, och på grund av variabilitet mellan stammar, har ingen metod standardiserats för alla stammar. Förmågan att mutera specifika gener och observera dess effekter kommer att möjliggöra en djup förståelse av stammar av serotyp 1 S. pneumoniae och det kommer att ge svar på rollen av dessa stammar i hjärnhinneinflammation i Afrika söder om Sahara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generering av den muterande amplikonen med SOE-PCR23 och amplifiering av spektinomycinkassetten
- Börja med att utföra PCR för amplifiering av homologiarmarna (skikt 5' (488 bp) respektive skikt3' (715 bp) av de flankerande regionerna av skiktgenen från stam 519/43. Använd primers plyFw1_NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG), ply5'R1_BamHI (CGAAATATAGACCAAAGGACGC GGATCC AGAACCAAACTTGACCTTGA), ply3'F1_BamHI (TCAAGGTCAAGTTTGGTTCTGGATCC GCGTCCTTTGGTCTATATTTCG) och plyRv2_NotI (TTTGCGGCCGCCATTTTTTCTACCTTCTCTCTACC).
- Använd följande PCR-villkor för skikt5': denaturering vid 94 °C i 60 sekunder, steg 2: denaturering vid 94 °C i 30 sekunder, steg 3: glödgning vid 58 °C i 30 sekunder, steg 4: förlängning vid 72 °C i 30 sekunder, steg 5: gå tillbaka till steg 2 och upprepa i 35 cykler, steg 6: slutlig förlängning vid 72 °C i 30 sekunder.
- Använd samma PCR-villkor för skikt3' med undantag för förlängningstiden i steg 4 och steg 6 där den ska vara 60 s.
- Analysera PCR-produkterna med gelelektrofores och punktbeskatta amplikonen från gelén.
- Rena PCR-amplikonerna enligt protokollet som beskrivs i tillverkarens instruktioner (Materialförteckning).
- Använd ekvimolära mängder av båda homologiarmarna som mallar i SOE-PCR. Smält samman de två amplikonerna med primers plyFw1_ NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG) och plyRv2_NotI (TTTGCGGCCGCCATTTTTTCTACCTTCCTCTACC).
- Använd följande SOE-PCR-villkor (steg 1: denaturering vid 94 °C i 2 minuter, steg 2: denaturering vid 94 °C i 30 sekunder, steg 3: glödgning av 58 °C i 30 sekunder, steg 4: förlängning vid 68 °C i 60 sekunder, steg 5: gå tillbaka till steg 2 och upprepa i 25 cykler, steg 6: slutlig förlängning vid 68 °C i 90 sekunder).
- Analysera SOE-PCR-produkten med gelelektrofores. Punktskatta det från gelén med hjälp av ett gelextraktionssats och följ instruktionerna.
- Förstärk spektinomycinkassetten från plasmiden pR412 under följande PCR-betingelser: Steg 1: Denaturering vid 94 °C i 60 sekunder. Steg 2: Denaturering vid 94 °C i 30 sekunder. Steg 3: glödgning vid 55 °C i 30 sekunder. Steg 4: förlängning vid 68 °C i 60 sekunder. Steg 5: Gå tillbaka till steg 2 och upprepa i 25 cykler. Steg 6: Slutlig förlängning vid 68 °C i 60 sekunder.
- Använd primers BamHI_SP2F2 (GGATCC CTA GAA CTA GTG GAT CCC CC) och BamHI_SP2R2 (GGATCC AAT TCT GCA GAT TTT AC ATG ATC). Plasmid pR412 förvärvades från Dr Marc PrudHomme (CNRS-Université Paul Sabatier, Toulouse, Frankrike).
- Analysera PCR-amplikonerna med gelelektrofores. Punktbeskatta och rena den resulterande PCR-ampliconen enligt beskrivningen ovan.
2. Generering av plasmid pSD1 och kemisk omvandling av E. coli Dh5α
- Utför en ligering enligt pGEMT-easy system I tillverkarens instruktioner (Table of Materials). Tillsätt 5 μL 2x ligeringsbuffert, 1 μL pGEMTeasy, 2 μL ply_SOE produkt, 1 μL T4 DNA-ligas och vatten i ett mikrocentrifugrör. Inkubera över natten vid 4 °C. Detta genererar plasmid pSD1.
- Omvandla kemiskt kompetent E. coli Dh5α med pSD1. Börja med att inkubera 50 μL kemiskt kompetent E. coli Dh5α med 3 μL pSD1-ligeringsreaktion i 15 minuter på is. Fortsätt sedan genom att utsätta cellerna för termisk chock (42 °C, 30 s). Lägg cellerna på is i 2 minuter.
- Ta bort cellerna från is och tillsätt 350 μL S.O.C-media. Inkubera kulturen i 2 timmar vid 37 °C, 120 rpm.
- Platta transformationen på Luria Bertani Agar (LBA) kompletterad med 0,4 mM IPTG, 0,24 mg/ml X-Gal för blå/vitt urval och 100 μg/ml ampicillin för att säkerställa att alla kolonier som växer i plattan har plasmidryggraden. Vita kolonier innehåller pSD1.
- Välj tre vita kolonier och sätt upp tillväxt över natten i 10 ml LB, kompletterat med 100 μg / ml ampicillin. Inkubera kulturerna över natten vid 37 °C med skakning.
- Nästa dag centrifugerar kulturerna vid 3,082 x g och använd pelleten för plasmidextraktion.
3. Plasmid DNA-extraktion, restriktionssmältning av pSD1 och spektinomycingen och sammansättning av pSD2
- Extrahera plasmid-DNA enligt instruktionerna som medföljer det kommersiella kitet (Table of Materials).
- Ställ in en BamHI-restriktionsdigestion för både pSD1-plasmid och spektinomycinkassetten som tidigare amplifierats och renats. Använd följande villkor och kvantiteter som beskrivs i tabell 1.
- Inkubera restriktionsreaktionerna vid digestion och kontroller vid 37 °C i 3 timmar.
- Analysera begränsningssmältningen genom elektrofores, punktskatta bandet och rena enligt instruktionerna som medföljer det kommersiella kitet (materialförteckning).
- Förbered sedan en ligeringsreaktion enligt tillverkarens instruktioner (Table of Materials) med användning av BamHI-smält pSD1 och spektinomycin (från steg 3.2). Tillsätt följande reaktionskomponenter i ett mikrocentrifugrör: 5 μL 2x ligeringsbuffert, 2 μL pSD1, 2 μL spektinomycinkassett, 1 μL T4 DNA-ligas och inkubera över natten vid 4 °C. Detta genererar plasmid pSD2.
- Omvandla plasmid pSD2 till kemiskt kompetent E. coli Dh5α enligt beskrivningen i steg 2.2.
- Välj de transformanter som bär plasmid pSD2 baserat på deras förmåga att växa i LBA kompletterat med 100 μg/ml spektinomycin och ampicillin.
- Utför en plasmid-DNA-extraktion (pSD2) enligt beskrivningen ovan och följ tillverkarens instruktioner (μL).
4. Omvandling av S. pneumoniae-stammen 519/43
- Förbered en nattkultur av S. pneumoniae 519/43 i BHI och låt den växa statiskt vid 37 °C, 5% CO2.
- Följande dag späd kulturerna 1:50 och 1:100 i 10 ml färsk BHI-buljong. Inkubera kulturerna statiskt vid 37 °C tills OD595nm är mellan 0,05 och 0,1 (optimalt DNA-inhämtande närmare 0,1 OD).
- När en OD på 0,1 har uppnåtts, ta 860 μL och överför till ett mikrocentrifugrör. I samma mikrocentrifugrör adderas: 100 μL 100 mM NaOH, 10 μL 20% (w/v) BSA, 10 μL 100 mM CaCl 2,2 μL 50 ng/ml CSP124 och 500 ng pSD2.
- Inkubera reaktionen statiskt vid 37 °C i 3 timmar.
- Platta 330 μL på 5% blodagarplattor (BA) kompletterat med 100 μg/ml spektinomycin, varje timme under de 3 inkubationstimmarna.
- Inkubera plattorna över natten vid 37 °C, 5 %CO2. Patcha spektinomycinresistenta kolonier på en annan BA-platta kompletterad med 100 μg/ml spektinomycin samt på BA-plattor kompletterade med 100 μg/ml ampicillin. Inkubera båda uppsättningarna plattor över natten under de förhållanden som anges ovan. Ampicillinplattorna ska testa för närvaron av plasmidryggraden.
- Bekräfta närvaron av spektinomycinkassetten med PCR med hjälp av primrar plyFw1_ NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG) och SPEC_REV (TAATTCCTCTAAGTCATAATTTCCG). Bekräfta mutationen med PCR med hjälp av primrarna plySCN1 (CCAATGGAAATCGCTAGGCAAGAGATAA) och plySCN2 (ATTACTTAGTCCAACCACGGCTGAT) som fäster utanför det muterade området.
- Bekräfta integrationen i rätt plats för genomet genom sekvensering med hjälp av primers plySCN1 (CCAATGGAAATCGCTAGGCAAGAGAGATAA), plySCN2 (ATTACTTAGTCCAACCACGGCTGAT), samt primers med deras bindningsställe i spektinomycinkassetten sqr1 (CCTGATCCAAACATGTAAGTACC) sqf2 (CGTAGTTATCTTGGAGAGAATA) spec_sqf1 (GGTACTTACATGTTTGGATCAGG ) och spec_sqr2 TATTCTCTCCAAGATAACTACG.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollet som beskrivs här börjar med att använda PCR för att förstärka vänster och höger homologiarm, samtidigt som 191 bp raderas från den mellersta regionen av skiktgenen . Under PCR introduceras en BamHI-plats vid 3' på vänster homologiarm och vid 5'-änden av höger homologiarm (figur 1A). Detta följs av PCR-SOE där vänster och höger homologiarmar smälts samman till en amplikon (figur 1B). Denna SOE-PCR-amplikon klonas sedan till pGEMTeasy med TA-kloning för att generera plasmid pSD1 (figur 1C). Framgångsrik omvandling kommer att ge vita kolonier som är resistenta mot ampicillin. Alla blå kolonier kommer att vara transformanter som innehåller en tom pGEMTeasy plasmid. pSD1 kommer sedan att spjälkas på BamHI-stället som introducerades vid tidpunkten för SOE-PCR (figur 1D) och ligeras till en spektinomycinkassett (även BamHI spjälkat för kompatibla ändamål). Den nya plasmiden kallas pSD2 (figur 1E). Korrekt montering av pSD2 bekräftas genom restriktionsuppslutning (figur 2A). pSD2, som fungerar som en självmordsplasmid eftersom den inte innehåller ett grampositivt kompatibelt replikationsursprung, användes för att transformera 519/43WT (tidigare beredd att vara kompetent). Positiva transformanter är kolonier som växer på 100 μg/ml spektinomycin efter en inkubation över natten. Alla kolonier lappas på nyligen färska blodagarbasplattor kompletterade med 100 μg/ml spektinomycin samt blodagarbas kompletterad med 100 μg/ml ampicillin. Eventuella kolonier som växer på de andra nattplattorna kompletterade med spektinomycin är möjliga positiva. Alla kolonier som växer på ampicillinplattor kommer att beteckna integration av hela plasmiden eller rekombinationen av ampicillinkassetten någon annanstans i genomet. Hittills och med stam 519/43 har inga kolonier vuxit på plattorna kompletterade med ampicillin. Alla bisamhällen som är positiva med PCR måste bekräftas genom sekvensering (figur 2C) för att bedöma och bekräfta platsen för insättningen. För detta ändamål måste primers ha sitt bindningsställe utanför homologiregionen (figur 2C). Det valda målet har en mycket markerad fenotyp (hemolys av röda blodkroppar (RBC)), och därför kan mutationen också bekräftas fenotypiskt (figur 2B). Mutanten förlorade sin förmåga att lysera RBC: er.
| Komponenter | Reaktion (μL) | Styrning (μL) | Reaktion (μL) | Styrning (μL) |
| Buffert | 2 | 2 | 2 | 2 |
| pSD1 | 4 | 4 | - | |
| Spektinomycin kassett | - | - | 6 | 6 |
| BamHI-HF | 1 | - | 1 | - |
| Vatten | 13 | 14 | 11 | 12 |
| Total volym | 20 | 20 | 20 | 20 |
Tabell 1: Restriktionsreaktionskomponenter för pSD1 och spektinomycinkassett.
Figur 1: Översikt över mutagenesstrategin. a) Förstärkning av homologiarmar (Ply3' och Ply5' (banorna 2 till 5); och skarvning genom överlappande förlängning PCR (banorna 6 och 7). L- hyperladder I (Bioline), bana 1- negativ kontroll för reaktionen, bana 2 och 3- skikt5' (488 bp) och ply3' (715 bp) homologiarmar förstärkta från D39 gDNA, banorna 4 och 5- skikt5' (488 bp) och ply3' (715 bp) homologiarmar förstärkta från 519/43 gDNA. Höger sidofält 6- D39 SOE PCR-produkt, körfält 7- 519/43 SOE PCR-produkt (1235 bp). B) Schematisk bild av den slutliga SOE-PCR-konstruktionen som erhållits (ply_SOE); Indikerade med pilar är de primers som används för att erhålla homologiregionen mellan båda homologiarmarna såväl som den valda restriktionssmältningen. C) Plasmid pSD1, som visar kloning av ply_SOE; D) Restriktionsuppslutning av pSD1 och spektinomycinkassett. E) Slutkonstruktion pSD2 som sedan används som en självmordsplasmid för att transformera S. pneumoniae. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: A) Bekräftelse av närvaron av spektinomycinkassetten i pSD2. L- hyperladder 1kb (Bioline); 1- pSD1 smält med BamHI; 2-pSD2 smält med BamHI; L hyperladder 1 kb (Bioline); 3- Spektinomycinkassett förstärkt från pR412, 4- Spektinomycinkassett smält med BamHI; B) Fenotypisk bekräftelse av pneumolysinmutationen genom bestämning av hemolytisk aktivitet för D39, 519/43WT och mutant 519/43Δply. Detta jämfördes med hemolys av röda blodkroppar med 0,5 % saponin. Saponin-härledd hemolys anses vara 100% och hastigheterna för 519/43Wt och 519/43Δply beräknades mot den. Varje datapunkt är medelvärdet av 5 tekniska och 3 biologiska replikat. C) Sekvenseringsdata mappade till det muterade genomområdet där pneumolysin avbröts. Primers anges som pilar och med namn. PLYSCN1 och PLYSCN2 binder utanför homologiarmarna. Sekvensering erhållen från primers PLYSCN1 och 2 visade att det fanns oavbruten sekvens från de närliggande regionerna utanför homologiområdet tills spektinomycinkassetten, vilket demonstrerade införandet i genomet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Streptococcus pneumoniae, särskilt serotyp 1, fortsätter att vara ett globalt hot som orsakar invasiv pneumokocksjukdom och hjärnhinneinflammation. Trots införandet av olika vacciner som bör skydda mot serotyp 1, i Afrika, kan denna serotyp fortfarande orsaka utbrott som leder till hög sjuklighet och dödlighet13. Förmågan att genetiskt manipulera denna serotyp är av avgörande betydelse på grund av dess kliniska relevans. Metoden som beskrivs i denna studie möjliggör genetisk manipulation av en representativ stam inom denna serotyp. En invasiv stam 519/43 (ST5316), ett kliniskt isolat från en hjärnhinneinflammationspatient i Danmark25.
Metoden som presenteras här var framgångsrik främst på grund av den valda stammen eftersom den kan förvärva exogent DNA, men också på grund av ändringar som gjorts i de traditionella protokollen som används för S. pneumoniae-transformation , är en typisk framgångsgrad för vårt transformationsprotokoll cirka 70%.
Med denna metodik är det av största vikt att använda en självmordsplasmid istället för det vanliga linjära DNA. Konventionellt skulle linjärt DNA26,27,28 ha använts; emellertid misslyckades alla försök att använda det exogena DNA i denna form. Dessutom lyckades inte försöken att utnyttja den naturliga kompetensen hos S. pneumoniae 519/43 vid lägre absorbans. Felsökning visade att den naturliga kompetensen för stam 519/43 var högre när OD595 var 0,1, vilket skiljer sig från de data som observerats för andra serotyper av S. pneumoniae där den högsta naturliga kompetensen observerades vid mycket låg OD24.
För att validera metoden konstruerades en pneumolysinmutant eftersom den uppvisar en lätt att följa fenotyp; Men för att bevisa att metoden kan tillämpas på vilken gen som helst inom denna stam har andra gener framgångsrikt riktats (manuskript under utarbetande). En sådan metod, som använder en självmordsvektor som inte har något grampositivt kompatibelt ursprung, skulle också kunna användas för kromosomal komplementering, överuttryck av gener av intresse, samt införande av rapportsystem, allt genom att använda de närliggande generna som homologiregioner.
Utvidgningen av genetiska verktyg till S. pneumoniae serotyp 1, stam 519/43 är viktig eftersom vi nu genetiskt kan manipulera representativa stammar direkt. Stam 519/43 är av intresse eftersom den är genetiskt smidig, är patogen eftersom den isolerades från en hjärnhinneinflammationspatient, och dess manipulation kommer att ge ledtrådar för att bättre förstå utvecklingen och etableringen av hjärnhinneinflammation. Tidigare gjordes förståelsen av vissa determinanter inom arten genom att sätta in genen i fråga i en av de mycket väl karakteriserade stammarna av S. pneumoniae, såsom D39 (serotyp 2). Ett sådant tillvägagångssätt användes av Paton et al. på grund av svårigheter med mutagenesen på serotyp 129. Resultaten som rapporterats av dem på D39 som bär en mindre hemolytisk allel av serotyp 1 skikt i jämförelse med 519/43 ∆skikt skiljer sig från de som presenteras av oss30 , vilket belyser vikten av att kunna mutera en gen inom den ursprungliga stambakgrunden. Senare kunde samma grupp mutera en icke-härstamning A serotyp 1 stam22. Intressant nog skiljer sig deras protokoll ganska mycket från vårt, eftersom det är en tvåstegsmetod som kräver att mutationen görs först i serotyp 2-stammar och detta används sedan som en mall för att omvandlas i deras serotyp 1-stam.
För närvarande finns det en begränsning i den presenterade metoden. För närvarande fungerar denna metod endast för den representativa stammen 519/43. Samma exakta protokoll prövades i andra stammar, nämligen kliniska isolat från ST3081 och ST303 och det lyckades inte. Vidare försökte elektroporering som en metod för leverans av exogent DNA till cellen också på alla tre sekvenstyperna, med positiva resultat observerade endast för 519/43. Att utöka och standardisera metodiken till alla serotyp 1-stammar är av största vikt eftersom det finns en enorm variation i hela gruppen. Studier pågår för närvarande för att utöka metodens tillämpbarhet till alla stammar inom serotyp 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka Meningitis Trust och MRC för att ha tillhandahållit finansiering för detta arbete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AccuPrime Pfx DNA polymerase | Invitrogen | 12344024 | Used for amplification of the fragments |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A9518 | Used for bacterial selection on stage 1(pSD1) |
| Blood Agar Base | Oxoid | CM0055 | Used to plate S. pneumoniae transformants |
| Bovine Serum Albumine | sigma | 55470 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Brain Heart Infusion | Oxoid | CM1135 | used to grow S. pneumoniae cells |
| Calcium Chloride Cacl2 | Sigma | 449709 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Competence stimulating peptide 1 | AnaSpec | AS-63779 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Luria Broth Agar | Gibco | 22700025 | used for plating and selection of pSD1 and pSD2 |
| Luria Broth Base (Miller's formulation) | Gibco | 12795027 | used for plating and selection of pSD1 and pSD2 |
| Monarch Gel Extraction Kit | NEB | T1020S | Used to extract the bands from the DNA gel |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | NEB | T1010S | Used to extract plasmid from the cells |
| pGEM T-easy | Promega | A1360 | used as suicide plasmid |
| S.O.C. | Invitrogen | 15544034 | used for recovery of cells after transformation |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma | S0899 | used for S.pneumoniae Transformation |
| Spectinomycin Hydrochloride | SigmaAldrich | PHR1426 | Used for bacterial selection |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Invitrogen | 18265017 | used for the creation of pSD1 and pSD2 |
References
- Bentley, S. D., et al. Genetic Analysis of the Capsular Biosynthetic Locus from All 90 Pneumococcal Serotypes. PLoS Genetics. 2 (3), 31 (2006).
- Calix, J. J., Nahm, M. H. A new pneumococcal serotype, 11E, has a variably inactivated wcjE gene. The Journal of Infectious Diseases. 202 (1), 29-38 (2010).
- Park, I. H., Pritchard, D. G., Cartee, R., Brandao, A., Brandileone, M. C. C., Nahm, M. H. Discovery of a New Capsular Serotype (6C) within Serogroup 6 of Streptococcus pneumoniae. Journal of Clinical Microbiology. 45 (4), 1225-1233 (2007).
- Jin, P., et al. First Report of Putative Streptococcus pneumoniae Serotype 6D among Nasopharyngeal Isolates from Fijian Children. The Journal of Infectious Diseases. 200 (9), 1375-1380 (2009).
- Oliver, M. B., vander Linden, M. P. G., Küntzel, S. A., Saad, J. S., Nahm, M. H. Discovery of Streptococcus pneumoniae Serotype 6 Variants with Glycosyltransferases Synthesizing Two Differing Repeating Units. Journal of Biological Chemistry. 288 (36), 25976-25985 (2013).
- Calix, J. J., et al. Serological Characterization of Two Capsule Subtypes among Streptococcus pneumoniae Serotype 20 Strains. Journal of Biological Chemistry. 287 (33), 27885-27894 (2012).
- Park, I. H., et al. and Serological Characterization of a New Pneumococcal Serotype, 6H, and Generation of a Pneumococcal Strain Producing Three Different Capsular Repeat Units. Clinical and Vaccine Immunology. 22 (3), 313-318 (2015).
- O'Brien, K. L., et al. Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates. The Lancet. 374 (9693), 893-902 (2009).
- Henriques-Normark, B., Tuomanen, E. I. The Pneumococcus: Epidemiology, Microbiology, and Pathogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 3 (7), 010215 (2013).
- Leimkugel, J., et al. An Outbreak of Serotype 1 Streptococcus pneumoniae Meningitis in Northern Ghana with Features That Are Characteristic of Neisseria meningitidis Meningitis Epidemics. The Journal of Infectious Diseases. 192 (2), 192-199 (2005).
- Yaro, S., et al. Epidemiological and Molecular Characteristics of a Highly Lethal Pneumococcal Meningitis Epidemic in Burkina Faso. Clinical Infectious Diseases. 43 (6), 693-700 (2006).
- Antonio, M., et al. Molecular epidemiology of pneumococci obtained from Gambian children aged 2-29 months with invasive pneumococcal disease during a trial of a 9-valent pneumococcal conjugate vaccine. BMC Infectious Diseases. 8 (1), 81 (2008).
- Kwambana-Adams, B. A., et al. An outbreak of pneumococcal meningitis among older children (≥5 years) and adults after the implementation of an infant vaccination programme with the 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in Ghana. BMC Infectious Diseases. 16 (1), 575 (2016).
- Antonio, M., et al. Seasonality and outbreak of a predominant Streptococcus pneumoniae serotype 1 clone from The Gambia: Expansion of ST217 hypervirulent clonal complex in West Africa. BMC Microbiology. 8 (1), 198 (2008).
- Staples, M., et al. Molecular characterization of an Australian serotype 1 Streptococcus pneumoniae outbreak. Epidemiology and Infection. 143 (2), 325-333 (2015).
- Gessner, B. D., Mueller, J. E., Yaro, S. African meningitis belt pneumococcal disease epidemiology indicates a need for an effective serotype 1 containing vaccine, including for older children and adults. BMC Infectious Diseases. 10 (1), 22 (2010).
- Hill, P. C., et al. Nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae in Gambian infants: a longitudinal study. Clinical Infectious Diseases. 46 (6), 807-814 (2008).
- Ebruke, C., et al. Temporal changes in nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae serotype 1 genotypes in healthy Gambians before and after the 7-valent pneumococcal conjugate vaccine. PeerJ. 3, 90 (2015).
- Adegbola, R. A., et al. Serotype and antimicrobial susceptibility patterns of isolates of Streptococcus pneumoniae causing invasive disease in The Gambia 1996-2003. Tropical Medicine and International Health. 11 (7), 1128-1135 (2006).
- Marks, L. R., Reddinger, R. M., Hakansson, A. P. High Levels of Genetic Recombination during Nasopharyngeal Carriage and Biofilm Formation in Streptococcus pneumoniae. mBio. 3 (5), (2012).
- Ritchie, N. D., Mitchell, T. J., Evans, T. J. What is different about serotype 1 pneumococci. Future Microbiology. 7 (1), 33-46 (2012).
- Harvey, R. M., et al. The variable region of pneumococcal pathogenicity island 1 is responsible for unusually high virulence of a serotype 1 isolate. Infection and Immunity. 84 (3), 822-832 (2016).
- Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. BioTechniques. 8 (5), 528-535 (1990).
- Alioing, G., Granadel, C., Morrison, D. A., Claverys, J. P. Competence pheromone, oligopeptide permease, and induction of competence in Streptococcus pneumoniae. Molecular Microbiology. 21 (3), 471-478 (1996).
- Lund, E. Enumeration and description of the strains belonging to the State Serum Institute, Copenhagen Denmark. , (1951).
- Barany, F., Tomasz, A. Genetic transformation of Streptococcus pneumoniae by heterologous plasmid deoxyribonucleic acid. Journal of Bacteriology. 144 (2), 698-709 (1980).
- Terra, V. S., Homer, K. A., Rao, S. G., Andrew, P. W., Yesilkaya, H. Characterization of novel β-galactosidase activity that contributes to glycoprotein degradation and virulence in Streptococcus pneumoniae. Infection and Immunity. 78 (1), (2010).
- Terra, V. S., Zhi, X., Kahya, H. F., Andrew, P. W., Yesilkaya, H. Pneumococcal 6-phospho-β-glucosidase (BglA3) is involved in virulence and nutrient metabolism. Infection and Immunity. 84 (1), (2015).
- Harvey, R. M., Ogunniyi, A. D., Chen, A. Y., Paton, J. C. Pneumolysin with Low Hemolytic Activity Confers an Early Growth Advantage to Streptococcus pneumoniae in the Blood. Infection and Immunity. 79 (10), 4122 (2011).
- Terra, V. S., Plumptre, C. D., Wall, E. C., Brown, J. S., Wren, B. W. Construction of a pneumolysin deficient mutant in Streptococcus pneumoniae serotype 1 strain 519/43 and phenotypic characterisation. Microbial Pathogenesis. 141, 103999 (2020).
