Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

نموذج تصوير حديثي الولادة من تعفن الدم البكتيري السلبي للجرام

Published: August 12, 2020 doi: 10.3791/61609
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 1, 1,2
1Department of Microbiology, Immunology, & Cell Biology, West Virginia University School of Medicine, 2Vaccine Development Center at West Virginia University Health Sciences Center
* These authors contributed equally

Summary

عدوى الفئران حديثي الولادة مع الإنارة الحيوية E. القولونية O1:K1:H7 يؤدي إلى عدوى الصرف الصحي مع التهاب رئوي كبير وأمراض الرئة. هنا، نحن وصف إجراءات لنموذج ومواصلة دراسة الإنتان الوليد باستخدام التصوير داخل الرحم الطولي بالتوازي مع تعداد الأعباء البكتيرية النظامية، التنميط الالتهابي، وعلم الأنسجة الرئوية.

Abstract

يتعرض الولدان لخطر متزايد للإصابة بالإنتان البكتيري بسبب الملامح المناعية الفريدة التي يعرضونها في الأشهر الأولى من الحياة. لقد أنشأنا بروتوكولا لدراسة التسبب في الإمراض من E. القولونية O1:K1:H7، وهو نوع المصلي المسؤول عن ارتفاع معدلات الوفيات لدى الأطفال حديثي الولادة. تستخدم طريقتنا التصوير داخل الرحم للجراء الوليدية في نقاط زمنية مختلفة أثناء تطور العدوى. هذا التصوير، بالتوازي مع قياس البكتيريا في الدم، التنميط الالتهابي، وعلم الأنسجة الأنسجة، يدل على نهج صارم لفهم ديناميات العدوى أثناء الإنتان. في هذا التقرير، نحن نموذج اثنين من inoculums المعدية للمقارنة بين الأعباء البكتيرية وشدة المرض. نجد أن العدوى تحت الكتف تؤدي إلى العدوى التي تنتشر من قبل 10 ح بعد العدوى. بواسطة 24 ساعة، عدوى الإشريكية القولونية الإنارة كانت وفيرة في الدم والرئتين والأنسجة الطرفية الأخرى. التعبير عن السيتوكينات الالتهابية في الرئتين مهم في 24 ساعة ، ويتبع ذلك تسلل خلوي ودليل على تلف الأنسجة يزيد مع الجرعة المعدية. التصوير داخل الرحم لديه بعض القيود. وهذا يشمل عتبة إشارة الإنارة وبعض المضاعفات التي يمكن أن تنشأ مع حديثي الولادة أثناء التخدير. على الرغم من بعض القيود، نجد أن نموذج العدوى لدينا يقدم نظرة ثاقبة لفهم ديناميات العدوى الطولية خلال تعفن الرحم الوليد، التي لم يتم فحصها بدقة حتى الآن. ونتوقع أيضا أن يتم تكييف هذا النموذج لدراسة الالتهابات البكتيرية الحرجة الأخرى خلال الحياة المبكرة.

Introduction

تعفن الدم البكتيري هو مصدر قلق كبير لحديثي الولادة التي تظهر صورة مناعية فريدة في الأيام الأولى من الحياة التي لا توفر الحماية الكافية من العدوى1. لا يزال الإنتان الوليدي مشكلة كبيرة في الرعاية الصحية في الولايات المتحدة تمثل أكبر من 75,000 حالة سنويًا في الولايات المتحدة وحدها2. لدراسة هذه العدوى في العمق، هناك حاجة إلى نماذج حيوانية جديدة تُكاب في أشكال من أمراض الإنسان. لقد أنشأنا نموذج عدوى الماوس الوليدية باستخدام Escherichia القولونية، O1:K1:H73. الإشريكية القولونية هي السبب الرئيسي الثاني لتعفن الدم الوليدي في الولايات المتحدة، ولكنها مسؤولة عن غالبية الوفيات المرتبطة بالإنتان4،5. ومع ذلك، هو السبب الرئيسي عندما قبل المدى وانخفاض جدا الوزن عند الولادة (VLBW) تعتبر الأطفال بشكل مستقل5. ويرتبط النمط المصلي K1 في كثير من الأحيان مع التهابات مجرى الدم الغازية والتهاب السحايا في الأطفال حديثي الولادة6,7. ولا توجد حالياً خيارات علاجية أخرى تتجاوز المضادات الحيوية والرعاية الداعمة. وفي الوقت نفسه، معدلات مقاومة المضادات الحيوية لا تزال ترتفع بالنسبة للعديد من البكتيريا المسببة للأمراض، مع بعض سلالات الإشريكية مقاومة للعديد من المضادات الحيوية المستخدمة عادة في العلاج8. وبالتالي، من الضروري أن نستمر في توليد طرق لدراسة آليات الإنتان واستجابة المضيف في حديثي الولادة. يمكن أن تساعد هذه النتائج على تحسين العلاجات الحالية ونتائج العدوى.

تتميز الحالة المناعية لحديثي الولادة باختلافات ظاهرية ووظيفية مقارنةً بالبالغين. على سبيل المثال، وقد ثبت أن مستويات مرتفعة من مضادة للالتهابات والسيكوكاينات، مثل interleukin (IL)-10 و IL-27، التي تنتجها الضامة المستمدة من دم الحبل السري، وهي موجودة في مستويات أكبر في مصل حديثي الولادة مورين9،10،11. وهذا يتسق مع انخفاض مستويات IFN-α، IFN-ɣ، IL-12، و TNF-α التي يتم الإبلاغ عنها بشكل متكرر من خلايا حديثي الولادة مقارنة مع نظرائهم البالغين10. بالإضافة إلى ذلك، فإن الجهاز المناعي الوليدي منحرف نحو استجابة الخلايا التائية Th2 والتنظيمية مقارنةً بـبالغين12. كما توجد أعداد مرتفعة من العدلات والخلايا التائية والخلايا ب وخلايا NK والخلايا أحادية الخلايا في المواليد الجدد، ولكن مع إعاقات وظيفية كبيرة. وهذا يشمل عيوب في التعبير عن علامات سطح الخلية وعرض المستضد التي تشير إلى عدم النضج13،14،15. بالإضافة إلى ذلك، العدلات الوليدية تعاني من نقص كبير في قدرتها على الهجرة إلى العوامل الكيميائية16. كما تم العثور على خلايا القامع النخاعية المشتقة (MDSCs) في مستويات مرتفعة في حديثي الولادة وتبين مؤخرا أن يكون مصدرا لل IL-2711. MDSCs هي قمع شديد تجاه الخلايا T17. وبشكل جماعي، تُظهر هذه البيانات أوجه قصور في مناعة الولدان التي تزيد من قابلية الإصابة بالعدوى.

لدراسة تطور العبء البكتيري وتشريح الاستجابات المناعية المضيفة الواقية أثناء الإنتان الوليدي ، قمنا بتطوير نموذج عدوى جديد. الفئران الوليدية في الأيام 3-4 من الحياة من الصعب حقن في الفضاء داخل الصفاق أو الوريد الذيل. في نموذجنا ، يتم إعطاء اليوم 3 أو 4 الجراء في البكتيريا inoculum أو PBS تحت الجلد في المنطقة الكتف. تطور العدوى الجهازية واستخدام الإنارة الإشريكية القولونية O1:K1:H7، يمكننا تصوير فئران حديثي الولادة الفردية بشكل طولي لمتابعة العبء البكتيري المنشور في الأنسجة الطرفية. هذا هو أول نموذج يتم الإبلاغ عنه للاستفادة من التصوير داخل الرحم لفهم حركية انتشار البكتيريا أثناء الإنتان في المواليد3المورين .

هنا، نحن وصف بروتوكول للحث على التهابات الإشريكية القولونية في الفئران حديثي الولادة3. نحن نُصف كيفية تحضير الحقن البكتيري للحقن، وكيفية حصاد الأنسجة لتقييم علم الأمراض، وقياس العلامات الالتهابية عن طريق تحليل التعبير الجيني، و تعداد العبء البكتيري. بالإضافة إلى ذلك، يتم وصف استخدام الإشريكية الإشريكية الإشريكية (E. coli) للتصوير داخل الرحم للمواليد المصابين وتحديد كمية القتل البكتيري من قبل الخلايا المناعية الوليدية. ويمكن أيضاً تكييف هذه البروتوكولات لدراسة التهابات بكتيرية مهمة أخرى لدى الولدان. تمثل البيانات المعروضة هنا منهجًا جديدًا عامًا لفهم ديناميكيات العدوى في نموذج الإنتان الوليدي القابل للترجمة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل اللجان المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في ولاية فرجينيا الغربية والتي أجريت وفقا لتوصيات من دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية من قبل المجلس الوطني للبحوث18.

1. إعداد Inoculum البكتيرية

  1. Streak a Tryptic soy agar (TSA) لوحة مع حلقة تلقيح لعزل مستعمرة واحدة من مخزون الفريزر من E. القولونية O1:K1:H7-لوكس التي تعبر بشكل ثابت luciferase ويحمل kanamycinالمقاومة 3. احتضان ليلة وضحاها في 37 درجة مئوية.
  2. في اليوم التالي تسمح مرق لوريا (LB) أن تأتي إلى درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية) في مجلس الوزراء السلامة الأحيائية.
  3. تحت غطاء مجلس الوزراء السلامة الأحيائية، وتحديد مستعمرة واحدة من لوحة streaked وتطعيم في 3 مل من LB تكملها kanamycin (30 ميكروغرام / مل). احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع اهتزاز (220 دورة في الدقيقة). هذه هي ثقافة البداية.
  4. تمييع ثقافة بداية 1:100 في 3 مل جديدة من LB تحت غطاء مجلس الوزراء السلامة الحيوية وإعادته إلى الحاضنة لمدة 2-3 ح في 37 درجة مئوية مع اهتزاز (220 دورة في الدقيقة). هذه هي ثقافة الأسهم.
  5. اقرأ الكثافة البصرية (OD) لكل من ثقافة الأسهم الفارغة و الأسهم في 600 نانومتر باستخدام مقياس الطيف. إضافة 100 ميكرولتر من LB (لا تحتوي على البكتيريا) في بئر واحد من 96 بئرا مسطحة أسفل لوحة المقايسة; هذا هو الفراغ. ثم إضافة 100 μL من ثقافة الأسهم إلى بئر منفصلة. كرر النسخ المتماثل إضافية اثنين. يتم قراءة امتصاص باستخدام قارئ لوحة.
  6. طرح الامتصاص فارغة من قيمة امتصاص ثقافة الأسهم (قيمة OD) ومقارنتها إلى منحنى النمو ولدت سابقا والتحقق من صحة لتحديد تقريب الكثافة البكتيرية في ثقافة الأسهم لإعداد الجرعة المعدية.
  7. إنشاء inoculums الهدف اعتمادا على سؤال البحث. تم استخدام الهدف من inoculum 2 × 106 (منخفضة) و 7 × 106 (ارتفاع) وحدات تشكيل مستعمرة (CFUs) لكل فأر (/ فأر) لهذه الدراسة.
    1. تقسيم الجرعة المستهدفة لكل ماوس (الجرعةT)حسب التركيز المقدر للبكتيريا في ثقافة الأسهم (المخزون) للحصول على حجم البكتيريا اللازمة من أنبوب الأسهم (VS).
    2. ضرب VS من قبل عدد الفئران (NM) التي تحتاج إلى أن تكون مصابة جنبا إلى جنب مع ما يكفي ل 5-10 إضافات لمجموع كمية البكتيريا اللازمة للعدوى بالإضافة إلى جرعات إضافية 5-10. إزالة هذا الحجم من أنبوب المخزون وإضافته إلى أنبوب جديد للطرد المركزي.
    3. استخدم المعادلة أدناه:
      الجرعةT/ الأسهم = VS x NM = إجمالي حجم (VT)من البكتيريا التي سيتم إزالتها من أنبوب المخزون.
  1. الطرد المركزي البكتيريا في 2000 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية و resuspend بيليه البكتيرية في 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني (درجة الحرارة 7.2-7.6) لكل فأرة للإصابة (على سبيل المثال، ل 10 جرعات من 2 × 106 البكتيريا كل جرعة، فإن بيليه من 2 × 107 البكتيريا resuspended في 500 ميكرولتر PBS). مرة أخرى، فمن المستحسن إعداد أكثر inoculum مما هو مطلوب. إعداد حجم متساو من برنامج تلفزيوني فقط للطعيمات السيطرة. الحفاظ على inoculum المعدية وPBS السيطرة على الجليد حتى العدوى.
  2. أداء سبعة عشرة أضعاف التخفيفات التسلسلية في برنامج تلفزيوني في 96 جيدا البلاستيك أسفل لوحة التخفيف، ولوحة 25 ميكرولتر من المخففات في مكررة على لوحات TSA رباعية تكملها kanamycin (30 ميكروغرام / مل) لتعداد الكمية الفعلية من البكتيريا تدار. احتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها لتشكيل مستعمرة قبل التعداد.

2. هوية الحيوان

  1. ترتيب عدد كاف من أزواج التربية بحيث يمكن مزامنة القمامة للجراء مطابقة للعمر. التغير العمري ± 1 يوم مقبول.
  2. تحديد الحوامل C57BL/6 أنثى الماوس ورصد لولادة القمامة قبل التجربة المخطط لها لتحديد العمر بدقة.
  3. للتمييز بين السيطرة والمصابة 3- أو 4 أيام الجراء القديمة، واستخدام زوج من الصغيرة، غرامة يميل، مقص القزحية لقصاص نهايات ذيول الجراء السيطرة فقط. الجراء المصابة لا تتلقى قصاصات الذيل. قبل قطع الذيل، وتطهير الجلد مع كرة القطن مُزموسة في الإيثانول 70٪. تطبيق الضغط على نهاية الذيل مع كرة القطن أو الشاش حسب الحاجة.
    ملاحظة: يتم تنفيذ هذا الإجراء تحت غطاء خزانة السلامة الحيوية. قصاصة ذيل من حوالي 1/8 من بوصة كافية.
  4. لتحديد الجراء داخل السيطرة والمجموعات المصابة، استخدم حقنة الأنسولين 1 مل مع إبرة دائمة 28 G x 1/2'' الوشم ذيول الجراء. قبل الوشم، وتطهير الجلد مع كرة القطن اُمْسَن في الإيثانول 70٪ . يتم تنفيذ هذا الإجراء تحت غطاء خزانة السلامة الحيوية.
  5. وشم الذيل، وتطبيق الحبر الوشم الحيوان على طرف الإبرة. المقبل، بعناية تقييد الجرو بيد واحدة، مع ذيلها مكشوفة تماما. أدخل الإبرة بلطف تحت الجلد، مع الحفاظ على مستوى سطحي من العمق، وتحريك الإبرة بالتوازي مع الجلد بضعة ملليمترات حتى تم إنشاء علامة صغيرة، أو نقطة. انتظر بضع ثوان قبل إزالة الإبرة ببطء من تحت الجلد، لتجنب الحبر الزائد الافراج من تحت الجلد.
  6. تطبيق الضغط على الجرح مع كرة القطن أو الشاش حسب الحاجة. إزالة الحبر الوشم الزائد على سطح الجلد مع 70٪ الإيثانول.
  7. كرر هذه العملية مع الفئران اللاحقة في مجموعات المصابة والسيطرة، في حين إضافة نقطة إضافية مع كل الجرو المتعاقبة وشم (على سبيل المثال، الجرو 1 سيكون لها نقطة 1 على ذيلهم، الجرو 2 سيكون لها نقطتين على ذيلها، الخ).
    ملاحظة: بالنسبة لطبقة إضافية من تعريف، فمن المستحسن استخدام ألوان منفصلة من حبر الوشم الحيوان للسيطرة والمجموعات المصابة.

3- التلقيح تحت الكتف

ملاحظة: بالنسبة لهذه الدراسة، أجريت تجربتان مع مجموعة جرعة منخفضة وجرعات عالية تم تعيينها لكل تجربة. في التجربة الأولى، أعطيت 7 الجراء جرعة منخفضة inoculum (4 الجراء واستخدمت كضوابط)، وأعطيت 5 الجراء من القمامة منفصلة جرعة عالية (3 الجراء واستخدمت كضوابط). الجراء من التجربة 1 قدمت بيانات فقط عن نقطة زمنية 24 ساعة. وفي التجربة الثانية، أعطيت 8 جراء جرعة منخفضة من حقن الـ (تم استخدام جراءين كضوابط)، وأعطيت 6 جراء جرعة عالية من التلقيح (استخدم جراءان كضوابط). الجراء من التجربة 2 قدمت بيانات عن نقاط زمنية 0 و 10 و 24 ساعة.

  1. العمر مطابقة الجراء ≤ 1 يوم. تعيين كل القمامة إما جرعة منخفضة أو القمامة جرعة عالية. داخل القمامة تعيين الجراء عشوائيا كمكافحة أو الجرو المصابة.
  2. في اليوم الثالث أو الرابع بعد الولادة، تسجل الأوزان القياسية لجميع الجراء قبل التلقيح مع E. التشولي-لوكس أو التحكم PBS. فصل السد من الجراء خلال هذا الوقت لضمان عدم نقلها أثناء العدوى.
  3. داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية باستخدام إبرة الأنسولين، يتبخر إما برنامج تلفزيوني أو e. coli-lux inoculum. لهذا العمل، تم استخدام inoculums من 2 × 106 و 7 × 106 CFUs لكل ماوس. الحفاظ على كل من inoculum المعدية وبرنامج تلفزيوني على الجليد حتى الإدارة عن طريق الحقن تحت غطاء.
  4. وضع الوليد على سطح نظيف في غطاء مجلس الوزراء السلامة الأحيائية ورفع الجلد في مؤخر الرقبة كما لو أن scruff الجرو.
  5. في الفضاء التي تم إنشاؤها الآن بين الجلد والعضلات من الحيوان، وإدراج إبرة، شطبة، فقط تحت الجلد وحقن 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني أو E. القولونية لوكس. في وقت واحد الإفراج عن جزء مقروص من الجلد لمنع الحقن مرة أخرى.
  6. إزالة الإبرة ببطء وبعناية. وضع الجراء مرة أخرى مع السدود بعد الانتهاء من الحقن.
    ملاحظة: بسبب مرحلتهم التشريحية في التنمية، فإنه من الصعب تقنيا لإدارة الوريد الذيل أو الحقن داخل الصفاق للجراء حديثي الولادة في اليوم 3-4. وهكذا ، تم اختيار طريق العدوى تحت الكتف لهذه الدراسة بسبب سهولة التنفيذ.

4- تقييم معايير المرض ونقطة النهاية

  1. مراقبة الجراء مرتين يوميا طوال مدة العدوى. لاحظ أي شذوذ في المظهر.
  2. تسجيل الأوزان كمقياس موضوعي للاعتلال.
  3. بالإضافة إلى تغيرات الوزن، اختبر قدرة الجراء على تحديد مواقعها من خلال وضع الوليد على الجانب الظهري. الحيوانات المريضة لن تكون قادرة على تسليم إلى الجانب البطني وعلى القدمين أو سوف تكمل هذا العمل مع صعوبة.
  4. تحقق من التالي لوضع علامة على الحيوانات بالقرب من معايير نقطة النهاية: أقل من 85٪ من وزن الجسم الطبيعي؛ انخفاض الحركة وعدم القدرة على حق أنفسهم؛ تلون الجلد ومظهر أكثر رمادية أو شفافة بدلا من الوردي. شعور بارد لمسة، مما يدل على انخفاض درجة حرارة الجسم وكدمات النزفية على طول الجانبين، كما يدل على المرض المسبق.
    ملاحظة: إذا فشل الولدان في زيادة الوزن على مدى يومين وتناسب أي من الأوصاف في الخطوات 4.4، فقد استوفوا معايير نقطة النهاية. الجراء التي تتلقى جرعة عالية في كثير من الأحيان تلبية معايير نقطة النهاية من قبل 24 ساعة. وسيتم قتل الجراء السيطرة داخل القمامة جرعة منخفضة وعالية في نفس الوقت للسماح للتحليل المقارن بين المجموعات الخاضعة للمراقبة والتجريبية. انتقل إلى قسم القتل الرحيم أدناه.

5. في التصوير الجسم الحي من عبء بكتيرية

  1. استخدم صورة ميكروكات وبرامج للتصوير والتحليل اللاحق.
    ملاحظة: لون بشرة الجرو لا يؤثر على جودة التصوير.
  2. وضع القفص مع E. القولونية-لوكسالفئران الوليدية المصابة وسد في غطاء تدفق لاريم ما بين BSL-2 مستوى. إزالة الفئران إلى أن تكون صورة، ومكان في غرفة isoflurane شفافة داخل غطاء محرك السيارة. من المستحسن أن تبدأ مع الضوابط غير المصابة لقياس كمية isoflurane اللازمة.
  3. افتح البرنامج على الكمبيوتر المرفق بالمجهر. تهيئة النظام وانتظر درجة حرارة CCD لقفل في -90 درجة مئوية.
  4. بدوره على مرذاذ isoflurane وضبط الطلب على تدفق isoflurane 5٪. إبقاء الفئران في الغرفة مع هذا خليط isoflurane لمدة 20-30 s حتى أنها تتوقف عن التحرك؛ قد تكون هناك حاجة إلى أوقات تعرض للتخدير لفترة أطول أو أقصر لبعض الفئران. مرة واحدة الفئران تتوقف عن التحرك، يتم تخديرها بما فيه الكفاية، ويمكن تصويرها.
  5. حرّك الفئران إلى غرفة التصوير المجهرية وضعه على مربع التصوير في الوضع المعرض، مع أنوف تواجه عمودياً على مخاريط الأنف. استخدم شمع الأسنان لثني القدمين على مربع التصوير بلطف للحد من أي حركة. يمكن تصوير ما يصل إلى 4 فئران حديثي الولادة في كل مرة.
  6. قم بتبخير الأيزوفلوران إلى تدفق 2-4٪ للحفاظ على تخدير الفئران أثناء التصوير. أغلق باب غرفة التصوير المجهري. تحقق من الفئران بعد بضع ثوان. إذا بدأت في التحرك ، وغمر كرة القطن في ايزوفلوران وعقده على أنف الحيوان تتحرك لمدة 5 ثوان ل التخدير. الحفاظ على الكرة القطنية بالقرب من الحيوانات أثناء التصوير. يجب الحرص على عدم أكثر من تخدير وإنهاء الفئران.
  7. باستخدام البرنامج، اختر خيار Luminescent للتصوير. استخدام مرشح الإثارة تعيين إلى كتلة ومرشح الانبعاثات تعيين لفتح، 500 نانومتر ، 520 نانومتر ، 560 نانومتر ، 580 نانومتر ، 600 نانومتر ، و 620 نانومتر. سيكون هناك سبعة مرشحات الانبعاثات الإجمالية تعيين للإنارة.
  8. صورة الفئران في كل نقطة زمنية (0 و 10 و 24 ح بعد العدوى [hpi]) وحفظ جميع الصور إلى مجلد لكل نقطة وقت. إعادة الجراء إلى القفص مع السد والتحقق من أن جميع الجراء قد تعافى من التخدير.
  9. لتحليل الصور 2D، افتح الصور في البرنامج. تغيير وحدات إلى الشعاع (الفوتونات)؛ وهذا سوف يتحول إلى تدفق الإجمالي (الفوتونات / الثانية).
  10. تحليل صورة واحدة فقط مع مجموعة مرشحات الانبعاثات متعددة في وقت واحد. من كل مجموعة صور، يحيط علماً بقيم التألق الدنيا والقصوى الموجودة في الزاوية اليمنى السفلى من كل صورة (على سبيل المثال، إذا كان هناك 7 فلاتر انبعاث، سيكون هناك 7 صور، و7 قيم دنيا وأقصى). كرر كل مجموعة صور يتم مقارنتها.
  11. لتحديد مقياس يشمل القيم والإنارة لكافة الصور، حدد أدنى قيمة دنيا وأعلى قيمة قصوى لكل مجموعة صور. لهذه الدراسة، تم استخدام صور المرشح المفتوح كممثل.
    1. تمييز الصورة التي تختارها وتغيير المقياس وفتحها. على لوحة الأدوات، انقر فوق علامة التبويب "ضبط الصورة" ثم قم بتغيير مقياس اللون إلى أدنى القيم القصوى والحد الأقصى الأعلى التي تم تحديدها مسبقًا. حفظ كل مجموعة صور كـ TIFF. تحليل كل نقطة زمنية بشكل فردي بهذه الطريقة لضمان عرض المقياس الصحيح.
  12. لقياس التدفق الكلي (مقدار إشارة الإنارة لكل ماوس) لكل فأرة، افتح صورة كما سبق وصفها في الخطوة 5.9-5.10. افتح علامة التبويب أدوات العائد على الاستثمار على لوحة الأدوات وحدد أداة الدائرة. اختر دائرة واحدة إذا تم تحليل منطقة واحدة من الإنارة.
  13. نقل عائد الاستثمار إلى تراكب على منطقة التاهب. اضبط حجم عائد الاستثمار إذا لزم الأمر.
    ملاحظة: إذا كان التعديل ضروريًا، قم بضبط ROIs في صور أخرى بشكلٍ مقارن للحفاظ على التناسق. اختر قياس ROIs. سوف تفتح نافذة "قياسات عائد الاستثمار" عرض إجمالي التدفق (p/s) ومتوسط الإشراق (p/s/cm2/sr) والانحراف المعياري للإشراقوالحد الأدنى من التألق والحد الأقصى من التألق.
  14. تسجيل قياسات التدفق الكلي لكل مجموعة صور. هذا الرقم هو كمية كمية من الإنارة في الماوس في الصور 2D.
  15. لجعل صور microCT ثلاثية الأبعاد، افتح لوحة إعادة الإعمار ثلاثية الأبعاد DLIT على لوحة الأدوات وتحقق من جميع الأطوال الموجية التي سيتم تضمينها تحت علامة التبويب تحليل.

6- القتل الرحيم

  1. إعداد وتسمية أنابيب للأنسجة / الأجهزة ذات الأهمية للتطبيقات المصب necropsy المناسبة.
  2. فصل الولدان عن السد في خزانة السلامة البيولوجية.
  3. نقع كرة القطن في isoflurane البيطرية الصف ومكان داخل غرفة احتواء شفافة.
  4. إذا جمع الدم, إعداد P200 ميكروبيبيت مع طرف ولها أنبوب 1.5 مل مع 10 ميكرولتر من 5 mM EDTA كما anticoulant. ومن المتوقع أن يكون حجم الدم 50-200 ميكرولتر.
  5. ضع الولدان في الغرفة واراقب الجرو حتى يصبح بلا حراك.
  6. بسرعة، إزالة حديثي الولادة وقطع الرأس مع مقص. إذا سمح للتنفس الهواء النقي لفترة طويلة، يمكن الجرو استعادة وعيه. وقد انخفض لحديثي الولادة قدرة الرئة نسبة إلى الفئران البالغة، وبالتالي، لا تتنفس بعمق بما فيه الكفاية للقتل الرحيم عن طريق ايزوفلوران وحدها.
  7. جمع الدم من الجذع في قاعدة الرأس باستخدام P200 ميكروبليت. لتحقيق أقصى قدر من الدم الذي تم جمعه، قم بتنفيذ هذه الخطوة بأسرع وقت ممكن بعد قطع الرأس. تعداد البكتيريا في الدم عن طريق التخفيف التسلسلي وعد الصفائح القياسية كما هو موضح في الخطوة 1.9.
  8. تعقيم كامل الوليد مع 70٪ الإيثانول قبل ختان عينات الأنسجة.

7. حصاد الأنسجة

  1. داخل مجلس الوزراء السلامة الأحيائية، إخماد الوليد مع 70٪ الإيثانول لمنع التلوث. وضع الحيوان على جانبها الأيمن.
  2. باستخدام ملقط، فهم الجلد في نقطة بين البطن والقدم اليسرى الخلفية وجعل شق مع مقص جراحي ناعم. الاستمرار في قطع الجلد بعيدا تتحرك صعودا نحو الظهر. تقدم حتى يتم كشف الطحال بأكمله.
  3. استخدم ملقط لفهم الطحال وإزالته من البطن، وذلك باستخدام مقص لفصل النسيج الضام. وضع الطحال في الحل المناسب لتطبيقها المصب.
  4. للحصول على الرئتين، قشر مرة أخرى جلد الصدر تماما.
  5. دخول في قاعدة القص مع مقص عقد عموديا، وقطع صعودا حتى يتم تقسيم القفص الصدري.
  6. استخدم ملقطًا لفهم الرئتين الأيمن والأيسر بشكل فردي وإزالتها من تجويف الصدر. إزالة القلب من أنسجة الرئة عن طريق قطع مع مقص.
  7. ضع الرئة في الحل المناسب لتطبيقها المصب. بالنسبة لعزلة الحمض النووي الريبي، استخدم 500 ميكرولتر من الـ ثياسيانات الجوانيدين/الفينول (GTCP). لـ الهيستوباتولوجيا، استخدم 5 مل من 10٪ 10-buffered محايد.

8. RNA العزل من أنسجة الرئة للتعبير الجيني

  1. قبل تبريد microcentrifuge إلى 4 درجة مئوية.
  2. اِنُمَ أنسجة الرئة في GTCP مع المقص. بعد ذلك، التجانس الأنسجة مع التجانس التي تعمل بالبطارية. استمر حتى يصبح الحل موحدًا قدر الإمكان. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 3-5 دقيقة.
  3. باستخدام نصائح الماصات المصفاة، إضافة 100 ميكرولتر من الكلوروفورم. عكس أنبوب لمدة 15 ق واحتضان 3-5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. جهاز طرد مركزي لمدة 15 دقيقة عند 12000 x g.
  5. أثناء الدوران، قم بإعداد 1.5 مل أنابيب مع 500 ميكرولتر من 70٪ الإيثانول. تجميع وتسمية الأعمدة وأنابيب الجمع من عدة العزلة RNA.
  6. إزالة بعناية الطبقة العليا، مائي دون إزعاج طبقة interphase التي تشكلت أثناء الطرد المركزي. وضع طبقة مائي في الأنابيب التي تحتوي على 70٪ الإيثانول.
  7. نقل الإيثانول وخليط lysate إلى العمود في أنبوب جمع.
  8. من هذه النقطة فصاعدا، اتبع RNA عزل عدة بروتوكول المنتجات التجارية حتى elution النهائي من رنا.
  9. تحليل الجيش الملكي النيبالي للنقاء والكمية. استخدم على الفور أو تخزينها عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام الإضافي.

9. التوليف cDNA

  1. تسمية أنابيب PCR وتوضع جانبا.
  2. إضافة 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي إلى خليط التفاعل cDNA لكل عينة.
  3. إضافة الكواشف والقوالب إلى أنبوب PCR كما هو موضح في بروتوكول cDNA. إضافة إنزيم إلى الخليط الأخير.
  4. ضع أنابيب PCR في ثيرموسيفير مع إعدادات التشغيل التالية: 5 دقائق عند 25 درجة مئوية، 40 دقيقة عند 42 درجة مئوية، 15 دقيقة عند 85 درجة مئوية و4 درجات مئوية.
  5. إزالة أنابيب PCR من ثيرموسيفير واستخدامها على الفور أو تخزينها في -20 درجة مئوية حتى مزيد من الاستخدام.

10. في الوقت الحقيقي الكمية PCR (qPCR) دورة

  1. إعداد مزيج التفاعل مزيج لكل من الجينات التي سيتم تحليلها. كل 15 μL PCR التفاعل يتطلب 7.5 ميكرولتر من 2x مزيج الكاشف، 0.75 ميكرولتر من 20X 5'-FAM المسمى جين محدد التمهيدي / التحقيق، و 3.75 ميكرولتر من المياه الخالية من النوى. أمبليكون عادة ما تتراوح بين 60-120 نقطة بريتيش بتروليوم.
  2. إضافة 3 ميكرولتر من قالب cDNA لكل مجموعة تجريبية إلى الآبار المناسبة.
  3. أضف 12 ميكرولتر من مزيج مزيج التفاعلات الخاصة بالجينات إلى الآبار المناسبة.
  4. غطي اللوحة بطبق لاصق بصري وطرد مركزي لمدة دقيقة عند 1000 x ز لإزالة أي فقاعات قد تكون تشكلت في الآبار.
  5. ضع لوحة PCR في ثيرسيكلوسير PCR في الوقت الحقيقي.
  6. تعيين طريقة تشغيل كما يلي: 3 دقيقة في 95 درجة مئوية، 40 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 15 s متبوعاً بـ 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
  7. تحليل البيانات عن طريق تطبيع الجين ذات الأهمية لمراقبة داخلية والبيانات من العينات المصابة نسبة إلى عينات التحكم غير المصابة باستخدام صيغة 2-ΔCt وتحويل سجل2 من الأرقام.

11. أمراض الرئة

  1. إزالة الرئتين من الجرو الوليدي كما هو موضح أعلاه.
  2. وضع الأنسجة في حجم 10٪ formalin محايدة المخزنة بحيث نسبة المحلل إلى الأنسجة هو حوالي 20:1 لمدة 3-7 أيام.
  3. تنسيق مع خدمة علم الأنسجة المناسبة لتضمين البارافين، والقطع، والهماتروسيلين و eosin (H & E) تلطيخ. لهذا العمل، تم استخدام جامعة فرجينيا الغربية هيستوباتشيكولوجي الأساسية. وبدلاً من ذلك، اتبع البروتوكولات19الموصوفة سابقاً .

12. في المختبر جرثومي قتل المقايسة

  1. إزالة الطحال من الجرو الوليدي غير المصاب كما هو موضح أعلاه ووضعها في سلة نايلون 40 ميكرومتر داخل طبق بيتري معقمة 60 ملم. كرر هذا وتجمع الطحال في أنبوب واحد ليتم حصادها ومتجانسة معا.
  2. إضافة 5 مل من برنامج تلفزيوني تكملها 10٪ FBS.
  3. تجزئة الأنسجة باستخدام مغمس حقنة 3 مل معقمة حتى يتم إنشاء تعليق خلية واحدة.
  4. جمع تعليق وحيد الخلية خارج سلة النايلون، ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل، وخلايا بيليه في 350 × ز لمدة 5 دقائق.
  5. تعليق الخلايا في الدم الأحمر تحلل الخلايا العازلة (2 مل لمدة تصل إلى 7-8 الطحالات) والسماح لها الوقوف لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة للقضاء على كريات الدم الحمراء.
  6. غسل الطحال مع برنامج تلفزيوني وبيليه على النحو الوارد أعلاه.
  7. تعليق الطحال في 0.25 مل من برنامج تلفزيوني تكملها مع 0.5٪ BSA و 2 mM EDTA وفقا لغلة الخلايا المتوقعة.
  8. عد الطحال باستخدام مقياس الهيموسيت أو أي تطبيق آخر مناسب.
  9. عزل Ly6B.2+ (السكان النخاعي من المحببة / monocytes الالتهابية) الخلايا مع الخرز المثبطة للمناعة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  10. بذور Ly6B.2+ الخلايا في كثافة 1 × 105 خلايا في بئر في صفيحة 96-well بالأبيض والأسود في حجم 0.1 مل من DMEM التي تحتوي على 10٪ FBS، 2 mM الجلوتامين، و 25 mM HEPES (متوسطة كاملة).
  11. عدّد الإنارة الحيوية الإشريكية القولونية كما هو موضح في القسم 1، واحضر الزبومي الجرثومي عند التعدد المرغوب للعدوى (MOI) في حجم نهائي 0.1 مل. ويتم ذلك على أفضل نحو من خلال جعل ما هو ضروري لجميع الآبار في وزارة الداخلية المشتركة دفعة.
  12. إضافة 0.1 مل من inoculum البكتيرية أو المتوسطة كاملة وحدها كتحكم. احتضان لوحة متعددة جيدا في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 ل 1 ساعة.
  13. استبدل الوسائط بـ 0.2 مل من الوسائط الكاملة الطازجة التي تحتوي على جينتاميسين (100 ميكروغرام/مل) عن طريق إزالة الوسائط بلطف باستخدام ماصة وإضافة وسائط جديدة مع طرف ماص جديد. العودة إلى الثقافة للاحتضان لمدة 2 ساعة إضافية.
  14. في 3 ح بعد العدوى، وقياس الإنارة في كل بئر من لوحة الثقافة غطاء من أسفل باستخدام قارئ لوحة ومن ثم العودة الثقافة إلى الحضانة.
  15. كرر قياسات التامعة في نقاط الوقت الأخرى المطلوبة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

هذا البروتوكول تسبب في الإنتان البكتيري في الفئران حديثي الولادة، واستخدمنا التصوير داخل الرحم الطولي، تعداد البكتيريا في الدم، والتقييمات النسيجية لعلم الأمراض، وملامح التعبير السيتوكينية الالتهابية لدراسة مسار المرض. وقد لوحظت علامات المراضة في الجراء الوليدية المصابة بكل من منخفضة (~ 2 × 106 CFUs) وعالية (~ 7 × 106 CFUs) أُنكوس من الإشريكية القولونية مع مرور الوقت. الجراء التي تلقت أكبر inoculum عرض علامات أكثر بروزا من الضيق التي شملت انخفاض الحركة، وعدم القدرة على تصحيح موقفهم، وضعف القدرة على الحفاظ على وضع مستقيم من قبل 24 ح بعد العدوى (hpi). ومع ذلك، كانت هناك مجموعة من المراضة لأن بعض الجراء تبدو أسوأ من غيرها. بعد العدوى مباشرة، توفي واحد بجرعة منخفضة بسبب التعرض للآيزوفلوران خلال جلسة تصوير لتحديد خط الأساس. من قبل 24 إتش بي، اثنين من ستة الحيوانات جرعة عالية استسلمت للعدوى الجهازية (33.3٪ الوفيات). الجراء المصابة التي تلقت إما جرعة عالية أو منخفضة inoculum وزنها أقل بكثير من الزملاء في السيطرة على 24 حصان(الشكل 1A, B). جميع الجراء التي تلقت أعلى inoculum تلبية معايير نقطة النهاية في 24 حصانا. على هذا النحو ، تم قتل جميع الجراء المصابة في هذه المجموعة بعد التصوير. تم تعداد البكتيريا في الدم لمجموعة فرعية من الفئران التي تلقت أقل inoculum، ولجميع الحيوانات التي تلقت أعلى inoculum منذ كانوا جميعا القتل الرحيم. وتشير نتائج تجربتين أجريتا بالمثل إلى أنه في حين أن معظم الحيوانات لديها مستويات عالية من البكتيريا في الدم (CFUs/mL) عند 24 حصاناً، فإن بعض الحيوانات لم يكن لديها بكتيريا قابلة للكشف في الدم(الشكل 1C). هذا الأخير يشير إلى أنها مسح العدوى في هذه النقطة الزمنية. كما هو متوقع، الجراء التي تلقت أعلى inoculum كان ما يقرب من ثلاثة أوامر من حجم أكثر CFUs / مل في 24 إتش بي نسبة إلى الجراء التي تلقت جرعة منخفضة inoculum(الشكل 1C).

وأكد التصوير الحي للحيوانات من البكتيريا الإنارة كذلك نشر البكتيريا وزيادة في النمو في الجراء حديثي الولادة مع مرور الوقت في 10 و 24 إتش بي (الشكل 2 والشكل 3). بالإضافة إلى ذلك، باستخدام التصوير داخل الرحم مع الميكروتشيك، تمكنا من تحديد بؤر العدوى، بما في ذلك الدماغ (الشكل 2B) ، الرئتين (الشكل 2B، الشكل 3A، B) ، والأنسجة الطرفية الأخرى ( الشكل2B). أظهرت رئة بعض الفئران المصابة بشدة مناطق مبهمة تتفق مع الدمج الالتهابي الذي شارك في ترجمة الإشارة البكتيرية المُضاءة(الشكل 3A). لم يتم العثور على هذه المناطق من نضح التهاب المفترض في الرئتين السيطرة غير المصابة (الشكل 3A). ويتضح مزيد من الأدلة على استجابة السيتوكين الالتهابية وضوحا داخل الرئتين من الجراء المصابة من خلال تحليل التعبير الجيني من IL-1β, IL-6, و TNF-α. ولوحظت زيادة كبيرة في التعبير نسبة إلى الضوابط لجميع السيتوكينات الثلاثة في كل من مجموعات inoculum منخفضة وعالية(الشكل 4A). كما تم فحص أمراض الأنسجة للرئة في 24 حصان في السيطرة والجراء المصابة. على الرغم من ملامح السيتوكين الالتهابية المماثلة ، لوحظت زيادة تدريجية في علم الأمراض بشكل شائع من الأسفل إلى أعلى inoculum. بالمقارنة مع الأنسجة من الضوابط غير المصابة، وأظهرت الرئتين من الجراء المصابة تغيرات التهابية ملحوظة، وسماكة جدار السنخي، وزيادة نزيف السنخي، والتسلل الالتهابي(الشكل 4B). في أشد الالتهابات، والاحتقان الرئوي ومناطق النزيف ساهمت في انخفاض هائل في الفضاء في الهواء الطلق (الشكل 4B). بشكل جماعي، تثبت هذه النتائج أنه في نموذجنا للتعفن الوليدي المبكر، يمكن اتباع انتشار البكتيريا الإنارة بمرور الوقت من موقع تلقيح تحت الرأس إلى بؤر العدوى الهامة وتسبب التهابًا كبيرًا وأمراض في الحيوانات المصابة بشدة.

لدراسة العوامل المضيفة التي تسهم في القتل البكتيري بواسطة الخلايا المناعية الفطرية مثل أحاديات الدم، الضامة، والعدلات، وضعنا فحصًا حساسًا في المختبر لقياس إزالة البكتيريا. Ly6B.2+ الخلايا المعزولة من طحال الفئران حديثي الولادة كانت مصابة بـ E. coli الإنارة الحيوية في مجموعة من MOIs لمدة 1 ساعة ثم تم علاجها بالجنتاميسين لقتل البكتيريا خارج الخلية. في 3 و 6 و 20 و 48 حصانا، تم قياس الإنارة داخل الخلايا مع قارئ متعدد الأنماط. كما هو متوقع، مع زيادة وزارة الداخلية، تم تسجيل إشارة أكثر إنارة في 3 ساعة(الشكل 5). تدريجيا، فقدت هذه الإشارة، مما يدل على إزالة البكتيرية (الشكل 5). هذا الفحص قابل للسيتوكينات المكملة، وتحييد المُفعلات المُفَرَّعة، وإضافة مثبطات دوائية من المسارات الخلوية لدراسة التدخلات التي قد تعزز إزالة البكتيريا وتعمل على تحسين النتائج في نموذج الإنتان الوليدي الموصوف هنا.

Figure 1
الشكل 1: التغيرات في وزن الجسم والتكرار البكتيري في الفئران الوليدية المتعفنة.
(أ، ب) الأوزان الماوس الفردية داخل مجموعة (منخفضة وعالية) وأعرب عن كنسبة مئوية من متوسط وزن الجراء السيطرة littermate. يتم عرض البيانات على أنها متوسط النسبة المئوية ± SEM. تكشف اختبارات t الفردية في كل نقطة زمنية بعد العدوى عن اختلافات كبيرة عند 24 ساعة بين الجراء والجراء المسيطرة التي تلقت نسبة منخفضة من التلقين(p<0.0001)(A)، أو بين الجراء و الجراء التي تلقت نسبة عالية من التلقيح (p= 0.0031) (B). (C) CFU / مل في الدم في 24 تم تحويل سجل hpi وقدم على أنه متوسط ± SEM. يكشف اختبار مان-ويتني عن اتجاه نحو الأهمية بين الحقنة الوريدية منخفضة وعالية الجرعة (p= 0.0882). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: التصوير داخل الرحم يوضح انتشار البكتيريا في الفئران الوليدية مع مرور الوقت.
(أ) يظهر ماوس حديث (#1) مصاب بـ 2 × 106 CFUs في الوقت 0 و 10 و 24 حصان. يتم عرض مقياس قياس الألوان مع الحد الأدنى والحد الأقصى لقيم الإشراق لكل نقطة زمنية لكل نقطة زمنية. يتم عرض الفئران في 0 و 10 ح على حد سواء مقياس نقطة الوقت ومقياس 24 ح لإثبات التغيرات في نمو البكتيريا مع مرور الوقت. (B) ممثل 3D إعادة إنشاء صور microCT لنفس الماوس الوليد في 10 و 24 يتم عرض hpi. كل نقطة زمنية لديها صور في النفقات العامة، عبرaxial، ووجهات النظر التاجية. في الصورة عبرaxial في 24 حصان، وقد تحركت الطائرة نحو أطراف الماوس لعرض أفضل بؤر العدوى في الأنسجة الطرفية. تشير الأسهم البيضاء إلى الدماغ والكلى عند 10 هباءً والكلى والرئة عند 24 حصاناً. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: الرئتين هي موقع العدوى الرئيسية خلال تعفن البكتيريا في حديثي الولادة.
(أ)ممثل 3D إعادة إنشاء صور microCT من ماوس حديثي الولادة (#5) المصابة بinoculum من ~ 7 × 106 يتم عرض وحدات CFUs في 24 إتش بي مقارنة مع السيطرة غير المصابة. يتم عرض كلا الفئران في منظور transaxial ويشار إلى الرئتين من السهام البيضاء. تم وضع الماوس المصاب على مقياسين إشعاع (فوتون/ثانية). يشمل مقياس #1 جميع الأطوال الموجية 6 (500 و520 و560 و580 و600 و620 نانومتر) ويشمل مقياس #2 500 و520 و560 نانومتر فقط. سمح لنا هذا المقياس الثاني بتصور إشارة متزايدة في البكتيريا في الرئتين لأن الأطوال الموجية السفلية أكثر امتصاصًا لالأنسجة وتنتج إشارة أقوى. (B) ممثل 3D إعادة إنشاء صور microCT من ماوس حديثي الولادة (#4) المصابة بـ 7 × 106 يتم عرض وحدات CFUs في 24 hpi. هذه النقطة الزمنية لديها صور في النفقات العامة، القوس، transaxial، والاكلية. الأسهم البيضاء تشير إلى بؤر العدوى في الرئتين. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: الالتهاب والنتائج الهستوولوجية المرتبطة بها في رئتي حديثي الولادة المتعفنين.
في 24 hpi تم حصاد الرئتين من الجراء التي تلقت ~ 2 × 106 أو 7 × 106 CFUs أو الضوابط غير المصابة. (أ) تم عزل الجيش الملكي النيبالي والتعبير عن IL-1β، IL-6، أو TNF-α كما تحدد نسبة إلى الضوابط غير المصابة بواسطة PCR في الوقت الحقيقي الكمية باستخدام الصيغة 2-ΔCt. يتم عرض البيانات كتغيّر متوسط السجل2 تحول في التعبير ± SEM لكل inoculum كما هو مبين. تم تحديد الأهمية الإحصائية باستخدام اختبارات t-غير مُزَدّة لقيم ΔCt بين جينات السيتوكين الفردية والرقابة الداخلية في فاصل الثقة 95٪. تشير العلامات النجمية إلى p<0.01. (B-D) تظهر أقسام الهستوبواثية من أنسجة الرئة الملطخة H & E (20x، منطقة الاهتمام التي شيدت في قناع القطع وتضخم للوضوح). تظهر أنسجة الرئة من السيطرة غير المصابة ممثل (B) أو الوليد المصاب في أدنى (C) أو عالية (D) inoculum. تشير الأسهم الصفراء إلى سماكة السنخية (C) أو نزيف (D). شريط مقياس = 500 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: مقايسة في المختبر لإزالة البكتيريا.
تم عزل Ly6B.2+ الخلايا من طحال الوليد السيطرة غير المصابة. كانت الخلايا مبذرة في 96-صحن وإصابة مع luciferase التعبير عن الإشريكية القولونية O1:K1:H7 في تعدد العدوى (وزارة الداخلية) من 10، 50، أو 250 كما هو مبين. بعد 1 ساعة، تم استبدال المتوسطة مع الطازجة التي تحتوي على جنتاميسين (100 ميكروغرام / مل). يتم عرض متوسط وحدات الضوء النسبي (RLU) ± SE لممثل تجربة فردية متعددة. تم تحديد الأهمية الإحصائية في الفاصل الثقة 95٪ باستخدام اختبارات t غير المدفوعة مع تصحيح ويلش؛ تشير العلامات النجمية إلى p<0.05. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

نموذج العدوى تحت كابيكال لدينا لتحفيز تعفن البكتيريا في الفئران حديثي الولادة هو طريقة جديدة لدراسة الانتشار الطولي للمسببات البكتيرية في الوقت الحقيقي. يوفر التصوير داخل الرحم الفرصة لاستكشاف الانتشار البكتيري في الوقت الحقيقي في حديثي الولادة. وهذا أمر بالغ الأهمية لفهم حركية الانتشار البكتيري ومواصلة دراسة استجابة المضيف وتلفه في المرحلة المناسبة من المرض. الجراء الماوس تدار تحت الجلد، حقن تحت الكتف من inoculum البكتيرية. تقنية الحقن هذه أبسط من البدائل الأخرى الشائعة الاستخدام، مثل وريد الذيل والالتهابات داخل الصفاق، لأنها تتطلب دقة أقل داخل موقع الحقن. وهذا أمر مهم نظرا لصغر حجم الجراء. التصوير داخل في مدينة تسمح لتقييم طولي من انتشار البكتيريا ونشرها في الأنسجة الطرفية والجهاز العصبي المركزي مع مرور الوقت دون الحاجة إلى التضحية بالحيوان. وقد استخدمت أساليب التصوير المماثلة والتقنيات لدراسة علم الأحياء السرطاني و الانبثاث20,21. وعلاوة على ذلك، في حين أن دراسة أخرى قد استشهد استخدام التصوير الإنارة الحيوية خلال عدوى القولونية E. في الفئران حديثي الولادة22، هنا، قمنا بتطبيق النهج على الفئران حديثي الولادة، حيث يسمح منهجيتنا تقييم الحركية البكتيرية خلال تعفن الرحم. ويستند التصور من البكتيريا على انبعاث الضوء الإنارة الحيوية في أطوال موجية مختلفة من البكتيريا (مثل، نشاط لوسيفيراز البكتيرية) داخل الحيوان. ثم يتم تصور Bioluminescence من خلال جهاز مبرد مشحونة إلى جانب (CCD) الكاميرا. ويمكن بعد ذلك إعادة بناء الإضاءة البيولوجية المتخيلة الناتجة في صورة ثلاثية الأبعاد تظهر الآثار المكانية والزمانية للبكتيريا داخل الحيوان. للحصول على طبقة إضافية أكثر دقة من اكتساب البيانات ، يسمح تحديد هوية الحيوان الناجح من خلال وشم الذيل بإجراء تقييم متكرر لمقاييس الجراء الفردية عبر الزمن وتحديد القيم المتطرفة المحتملة داخل مجموعة تجريبية معينة.

يتطلب التطبيق الأكثر نجاحًا للنموذج الموصوف الدقة في إعداد التلقيح البكتيري. هنا، نحن وصف الطريقة الأمثل لإعداد البكتيرية باستخدام منحنى النمو القولونية E- محددة مسبقا والتحقق من صحتها أن يقلل من التباين بين الهدف والإحقولي الفعلي. وهذا يسمح القابلية للتكرار التجريبية في أينوكولوم المقصود. وقد أظهر إدراج اثنين من المُلقنين في نموذجنا نتائج تعتمد على الجرعة في دم الوفيات وأمراض الرئة. ومع ذلك، لم تكن بعض جوانب مسار المرض تعتمد على الجرعة. ولم يكن الفشل في زيادة الوزن في الحيوانات المصابة يعتمد على inoculum في 24 حصان. بالإضافة إلى ذلك، لوحظت مستويات مماثلة من التعبير السيتوكيني الالتهابي في الرئة استجابة للعدوى مع كل من inoculums. ما إذا كان أو لم يكن سيتم تكرار هذا النمط في جميع الأنسجة حيث لوحظت البكتيريا, مثل الكلى, الكبد, الطحال والدماغ, يبقى أن يحدد. بالإضافة إلى الإنتان، الإشريكية القولونية O1:K1:H7 يرتبط بالتهاب السحايا في السكان حديثي الولادة23. تحدث هذه العدوى الدماغية عندما تغزو البكتيريا من المحيط الحاجز الدماغي في الدم وتخترقه. وسوف تستكشف الدراسات المستقبلية هذا الجانب من النموذج من خلال تحليل التغيرات في التعبير البروتيني الضيق، وكذلك اختبار نطاقات مختلفة من التلقيحات البكتيرية. تعديل إضافي أثناء التصوير داخل وفيما يلي إضافة كرة القطن المفرد، التي لديها في ايزوفلوران، والتي وضعت ما يقرب من 2-3 بوصة بعيدا عن الفئران أثناء التصوير. استجابة للتجارب السابقة حيث الجراء حديثي الولادة قد استعادت الوعي خلال جلسة التصوير، ومنع الحصول على صورة دقيقة، ونحن الآن وضع الكرة القطن قريبة بما فيه الكفاية للفئران للحفاظ عليها تخدير مستمر أثناء التصوير. ومع ذلك ، من المهم أن هذا لا يتم قريبًا جدًا لدرجة أنها تفشل في التعافي من التخدير.

على الرغم من مرونة وسهولة التكيف لدراسة حركية البكتيريا المختلفة في مختلف نماذج الحيوانات والمرض، بروتوكول لدينا بعض القيود للنظر. القيد الأول هو أن النظر في أن الطريق دون كابي للعدوى لا يعكس مسار طبيعي لانتقال العدوى. ومع ذلك، كان أحد الأهداف الرئيسية في تطوير نموذجنا منذ البداية هو إنشاء طريقة سهلة التكاثر للتسليم يمكن استخدامها لإنشاء عدوى نظامية تتكاثر جوانب الأمراض البشرية. ولذلك، في هذا التقرير، نحن وصف نموذج من متلازمة مرض الإنتان في وقت مبكر من الإنسان، وليس نموذجا للانتقال الطبيعي. هناك نموذج راسخ للتسليم عن طريق الفم في فئران حديثي الولادة يكرر بعض جوانب انتقال العدوى البشرية الشائعة، مثل الاستعمار الأولي للعدوى القولونية في القناة الغذائية وما يتبع ذلك من نشر في مجرى الدم والأنسجة الطرفية، بما في ذلك الدماغ22. النموذج الذي أنشأته Witcomb وزملاؤه يتضمن أيضا الإنارة الحيوية الإشريكية القولونية والتصوير داخلي. وعلاوة على ذلك، من المهم الحد من التعرض لـ isoflurane، وكذلك حقن، وشم الذيل، والتعامل مع الجراء في أسرع وقت ممكن دون المساس بدقة ودقة التقنيات في محاولة لتخفيف مستويات التوتر لكل من حديثي الولادة والسدود. وفي بعض الحالات، إذا كانت الجراء تواجه تلاعبا معززا من صنع الإنسان و/أو تجريبيا، يمكن للسدود أن تتوقف عن إرضاع الجراء ورعاية هذه الجراء، مما يؤدي إلى انخفاض البقاء على قيد الحياة الذي لا علاقة له بالعدوى. وبالمثل، فإن الجراء التي تتعرض لـ isoflurane لفترات طويلة تتجاوز الدقائق العشر تقريبًا من جلسة التصوير يكون لها خطر متزايد للوفاة؛ لذلك هو حاسمة أن يزوفلوران فقط بما فيه الكفاية أن يُجرّد بما فيه الكفاية الفئران، لكن ليس بما فيه الكفاية للقتل الرحيم لهم. والنقطة الأخيرة من النظر هي حد الحساسية. تم تعداد الأنسجة التي أقل من10 4 CFUs / mL E. القولونية إشارة مضيئة سجلت يقع في نهاية منخفضة من النطاق القابل للكشف، وفقا لطريقة التحجيم المستخدمة في برنامج التصوير3. وهكذا، قد تكون مستعمرة بعض الأنسجة مع مستويات منخفضة من البكتيريا ولكن تظهر دون الإضاءة الحيوية مرئية.

تستخدم معظم الدراسات حاليًا طرق البالغين في الانتشار البكتيري، مثل الحقن الوريدي الوريدي (i.p.) وريدي الذيل لحديثي الولادة. بلوشكي وبيلكونن حلل تأثير E. القولونية K1 على الفئران حديثي الولادة من خلال i.p., الوريد الذيل, والتهابات الفم24. أظهرت هذه الدراسة أن الأنماط الجينية المختلفة للفئران ذات العوز المناعي هي أكثر عرضة لسلالة K1؛ ومع ذلك، يتم ترك العديد من جوانب الاستجابة المناعية المضيف للعدوى، فضلا عن آليات انتشار البكتيريا دون معالجة. Deshmukh وزملاؤه أصاب الفئران الوليدية intraperitoneally مع E. القولونية K1 أو K. الالتهاب الرئوي وقياس CFUs في الطحال والكبد في 72 إتش بي25. كما حللت هذه الدراسة بعض جوانب استجابة المضيف للعدوى على أساس التعرض المسبق للفئران للمضادات الحيوية. ومع ذلك، لم يتم تناول دراسة شاملة لنشر البكتيريا في الأنسجة الطرفية والدم مع مرور الوقت بالتوازي مع التنميط الالتهابي في نفس الأنسجة (بخلاف الحبيبية). دراسات أخرى من الإنتان الوليدي في الفئران مع المكورات العنقودية aureus, البشرة المكورات العنقودية العنقودية, المجموعة B المكورات العقدية, و E. القولونية استكشاف جوانب مختلفة من الجهاز المناعي المضيف استجابة للعدوى. ومع ذلك ، لا تستخدم أي من هذه الدراسات التصوير داخل مدينة استكشاف حركية من نشر البكتيريا أو توطين بؤر العدوى23،25،26،27. إن طريقتنا في العدوى والتصوير داخل الرحم، إلى جانب تقييم العبء البكتيري والتنميط الالتهابي للأنسجة الطرفية، تسمح لنا بفحص شامل لجوانب كل من المضيف والمسبب للمرض أثناء العدوى، مما يوفر فهمًا أكثر دقة للتفاعل بين المضيفين والعوامل الممرضة أثناء تعفن الدم.

ونحن نعتزم الاستفادة من هذا النموذج العدوى والتصوير لتعزيز فهمنا للتعفن الوليدي في وقت مبكر من بداية باستخدام مجموعة متنوعة من البكتيريا المسببة للأمراض المسؤولة عادة عن الإنتان في حديثي الولادة, بما في ذلك المجموعة B streptococci, K. pneuomoniae, و monocytogenes الليستيريا. سيسمح لنا نموذج العدوى هذا بمقارنة انتشار مسببات الأمراض البكتيرية المختلفة بشكل طولي بالتوازي مع استجابة المضيف في حديثي الولادة. وبالإضافة إلى ذلك، هذا النموذج قابل للتكيف مع النقل بالتبني لأنواع محددة من الخلايا المناعية (مترافقة بالفلورسنت) لدراسة هجرتهم إلى مواقع العدوى والتأثير اللاحق على استجابة المضيف والسيطرة على البكتيريا. وهذا يمنح الفرصة لفهم أفضل للتفاعلات المضيفة المسببة للأمراض التي تحدث أثناء الإنتان في وقت مبكر من الحياة بطرق لم يتم إثباتها من قبل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يوجد لدى أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgments

وقد دعم هذا العمل من قبل صناديق مؤسسية إلى C.M.R.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL Insulin Syringe Coviden 1188128012 Inoculum or PBS injection
10% Neutral Buffered Formalin VWR 89370-094 Histopathology
ACK Lysis Buffer Gibco LSA1049201 Bacterial clearance assay
Animal Tattoo Ink Paste Ketchum KI1482039 Animal identification
Animal Tattoo Ink Green Paste Ketchum KI1471039 Animal identification
Anti-Ly-6B.2 Microbeads Miltenyi Biotec 130-100-781 Cell isolation
Escherichia coli O1:K1:H7 ATCC 11775
Escherichia coli O1:K1:H7-lux (expresses luciferase) N/A N/A Constructed in-house at WVU
E.Z.N.A. HP Total Extraction RNA Kit Omega Bio-tek R6812 RNA extration
DPBS, 1X Corning 21-031-CV
Difco Tryptic Soy Agar Becton, Dickinson and Company 236950 Bacterial growth
IL-1 beta Primer/Probe (Mm00434228) Thermo Fisher Scientific 4331182 Cytokine expression qPCR
IL-6 Primer/Probe (Mm00446190) Thermo Fisher Scientific 4331182 Cytokine expression qPCR
iQ Supermix Bio-Rad 1708860 Real-time quantitative PCR
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708891 cDNA synthesis
Isolation Buffer Miltenyi Biotec N/A Bacterial clearance assay
IVIS Spectrum CT and Living Image 4.5 Software Perkin Elmer N/A Intravital imaging
LB Broth, Lennox Fisher BioReagents BP1427-500 Bacterial growth
EASYstrainer (Nylon Basket) Greiner Bio-one 542 040 Cell strainer
SpectraMax iD3 Molecular Devices N/A Plate reader
Pellet Pestle Motor Grainger 6HAZ6 Tissue homogenization
Polypropylene Pellet Pestles Grainger 6HAY5 Tissue homogenization
Prime Thermal Cycler Techne 3PRIMEBASE/02 cDNA synthesis
TNF-alpha Primer/Probe (Mm00443258) Thermo Fisher Scientific 4331182 Cytokine expression qPCR
TriReagent (GTCP) Molecular Research Center TR 118 RNA extration

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Qazi, S. A., Stoll, B. J. Neonatal sepsis: a major global public health challenge. Pediatr Infect Dis J. 28, 1-2 (2009).
  2. Simonsen, K. A., Anderson-Berry, A. L., Delair, S. F., Davies, H. D. Early-onset neonatal sepsis. Clinical Microbiology Reviews. 27 (1), 21-47 (2014).
  3. Seman, B. G., et al. Elevated levels of interleukin-27 in early life compromise protective immunity in a mouse model of Gram-negative neonatal sepsis. Infections and Immunity. , (2019).
  4. Schrag, S. J., et al. Epidemiology of Invasive Early-Onset Neonatal Sepsis, 2005 to 2014. Pediatrics. 138 (6), 20162013 (2016).
  5. Stoll, B. J., et al. Early onset neonatal sepsis: the burden of group B Streptococcal and E. coli disease continues. Pediatrics. 127 (5), 817-826 (2011).
  6. Weston, E. J., et al. The burden of invasive early-onset neonatal sepsis in the United States, 2005-2008. Pediatrics and Infectious Disease Journal. 30 (11), 937-941 (2011).
  7. Hornik, C. P., et al. Early and late onset sepsis in very-low-birth-weight infants from a large group of neonatal intensive care units. Early Human Development. , Suppl 2 69 (2012).
  8. Vergnano, S., Sharland, M., Kazembe, P., Mwansambo, C., Heath, P. T. Neonatal sepsis: an international perspective. Archives of Disease in Childhood: Fetal and Neonatal Edition. 90 (3), 220-224 (2005).
  9. Kraft, J. D., et al. Neonatal macrophages express elevated levels of interleukin-27 that oppose immune responses. Immunology. 139 (4), 484-493 (2013).
  10. Basha, S., Surendran, N., Pichichero, M. Immune responses in neonates. Expert Reviews of Clinical Immunology. 10 (9), 1171-1184 (2014).
  11. Gleave Parson, M., et al. Murine myeloid-derived suppressor cells are a source of elevated levels of interleukin-27 in early life and compromise control of bacterial infection. Immunology and Cell Biology. 97 (5), 445-446 (2018).
  12. Adkins, B., Leclerc, C., Marshall-Clarke, S. Neonatal adaptive immunity comes of age. Nature Reviews Immunology. 4 (7), 553-564 (2004).
  13. Kim, S. K., Keeney, S. E., Alpard, S. K., Schmalstieg, F. C. Comparison of L-selectin and CD11b on neutrophils of adults and neonates during the first month of life. Pediatrics Research. 53 (1), 132-136 (2003).
  14. Velilla, P. A., Rugeles, M. T., Chougnet, C. A. Defective antigen-presenting cell function in human neonates. Clinical Immunology. 121 (3), 251-259 (2006).
  15. Le Garff-Tavernier, M., et al. Human NK cells display major phenotypic and functional changes over the life span. Aging Cell. 9 (4), 527-535 (2010).
  16. Weinberger, B., et al. Mechanisms underlying reduced responsiveness of neonatal neutrophils to distinct chemoattractants. Journal of Leukocyte Biology. 70 (6), 969-976 (2001).
  17. Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system. Nature Reviewss Immunology. 9 (3), 162-174 (2009).
  18. National Research Council. Guide for the care and use of laboratory animals, 8th ed. , National Academies Press. Washington, DC. (2011).
  19. Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification. Journal of Visualized Experiments. (125), e55796 (2017).
  20. Bayarmagnai, B., Perrin, L., Esmaeili Pourfarhangi, K., Gligorijevic, B. Intravital Imaging of Tumor Cell Motility in the Tumor Microenvironment Context. Methods in Molecular Biology. 1749, 175-193 (2018).
  21. Beerling, E., Ritsma, L., Vrisekoop, N., Derksen, P. W., van Rheenen, J. Intravital microscopy: new insights into metastasis of tumors. Journal of Cell Science. 124, Pt 3 299-310 (2011).
  22. Witcomb, L. A., Collins, J. W., McCarthy, A. J., Frankel, G., Taylor, P. W. Bioluminescent Imaging Reveals Novel Patterns of Colonization and Invasion in Systemic Escherichia coli K1 Experimental Infection in the Neonatal Rat. Infection and Immunity. 83 (12), 4528 (2015).
  23. Singh, K., et al. Inter-alpha inhibitor protein administration improves survival from neonatal sepsis in mice. Pediatric Research. 68 (3), 242-247 (2010).
  24. Pluschke, G., Pelkonen, S. Host factors in the resistance of newborn mice to K1 Escherichia coli infection. Microb. Patho. , 93-102 (1988).
  25. Mancuso, G., et al. Role of interleukin 12 in experimental neonatal sepsis caused by group B streptococci. Infections and Immunity. 65 (9), 3731-3735 (1997).
  26. Thammavongsa, V., Rauch, S., Kim, H. K., Missiakas, D. M., Schneewind, O. Protein A-neutralizing monoclonal antibody protects neonatal mice against Staphylococcus aureus. Vaccine. 33 (4), 523-526 (2015).
  27. Andrade, E. B., et al. TLR2-induced IL-10 production impairs neutrophil recruitment to infected tissues during neonatal bacterial sepsis. Journal of Immunology. 191 (9), 4759-4768 (2013).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 162، الاضاءة الحيوية، التصوير داخل الرحم، الإشريكية القولونية،التلقيح تحت الكتف، حديثي الولادة، الإنتان، الالتهاب، السيتوكينات
نموذج تصوير حديثي الولادة من تعفن الدم البكتيري السلبي للجرام
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Seman, B. G., Povroznik, J. M.,… More

Seman, B. G., Povroznik, J. M., Vance, J. K., Rawson, T. W., Robinson, C. M. A Neonatal Imaging Model of Gram-Negative Bacterial Sepsis. J. Vis. Exp. (162), e61609, doi:10.3791/61609 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter