Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

En neonatal Imaging Model af Gram-Negative bakteriel sepsis

Published: August 12, 2020 doi: 10.3791/61609
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 1, 1,2
1Department of Microbiology, Immunology, & Cell Biology, West Virginia University School of Medicine, 2Vaccine Development Center at West Virginia University Health Sciences Center
* These authors contributed equally

Summary

Infektion af neonatal mus med bioluminescerende E. coli O1:K1:H7 resulterer i en septisk infektion med betydelig lungebetændelse og lungepatologi. Her beskriver vi procedurer til model og yderligere undersøgelse neonatal sepsis ved hjælp af langsgående intravital billeddannelse parallelt med optælling af systemiske bakterielle byrder, inflammatorisk profilering, og lunge histopatologi.

Abstract

Nyfødte har en øget risiko for bakteriel sepsis på grund af den unikke immunprofil, de viser i de første levemåneder. Vi har etableret en protokol for undersøgelse af patogenesen af E. coli O1:K1:H7, en serotype, der er ansvarlig for høj dødelighed hos nyfødte. Vores metode udnytter intravital billeddannelse af neonatal hvalpe på forskellige tidspunkter under udviklingen af infektion. Denne billeddannelse, parallelt med måling af bakterier i blodet, inflammatorisk profilering, og væv histopatologi, betyder en streng tilgang til at forstå infektion dynamik under sepsis. I den aktuelle rapport modellerer vi to infektiøse inokulums til sammenligning af bakterielle byrder og sygdommens sværhedsgrad. Vi finder, at subscapular infektion fører til dissemineret infektion med 10 h post-infektion. Ved 24 timer, infektion af selvlysende E. coli var rigeligt i blodet, lungerne, og andre perifere væv. Ekspression af inflammatoriske cytokiner i lungerne er signifikant ved 24 timer, og dette efterfølges af cellulær infiltration og tegn på vævsskader, der stiger med infektiøs dosis. Intravital billeddannelse har nogle begrænsninger. Dette omfatter en selvlysende signal tærskel og nogle komplikationer, der kan opstå med nyfødte under anæstesi. På trods af nogle begrænsninger, finder vi, at vores infektion model giver et indblik for at forstå langsgående infektion dynamik under neonatal murine sepsis, der ikke er blevet grundigt undersøgt til dato. Vi forventer, at denne model også kan tilpasses til at studere andre kritiske bakterielle infektioner i det tidlige liv.

Introduction

Bakteriel sepsis er en betydelig bekymring for nyfødte, der udviser en unik immunprofil i de første dage af livet, der ikke giver tilstrækkelig beskyttelse mod infektion1. Neonatal sepsis fortsætter med at være en betydelig amerikansk sundhedspleje problem tegner sig for mere end 75.000 tilfælde årligt i USA alene2. At studere disse infektioner i dybden, nye dyremodeller, der opsummerer aspekter af menneskers sygdom er påkrævet. Vi har etableret en neonatal mus infektion model ved hjælp af Escherichia coli, O1: K1: H73. E. coli er den næststørste årsag til neonatal sepsis i USA, men ansvarlig for størstedelen af sepsis-associeret dødelighed4,5. Men det er den hyppigste årsag, når præ-sigt og meget lav fødselsvægt (VLBW) babyer betragtes uafhængigt5. K1 serotypen er hyppigst forbundet med invasive infektioner i blodbanen og meningitis hos nyfødte6,7. I øjeblikket er der ingen andre behandlingsmuligheder ud over antibiotika og understøttende behandling. I mellemtiden, satser for antibiotikaresistens fortsætter med at stige for mange patogene bakterier, med nogle stammer af E. coli resistente over for et væld af antibiotika, der almindeligvis anvendes i behandling8. Det er derfor bydende nødvendigt, at vi fortsætter med at generere metoder til at undersøge mekanismerne i sepsis og værtsresponsen hos nyfødte. Disse resultater kan bidrage til at forbedre de nuværende behandlinger og infektion resultater.

Nyfødtes immuntilstand er karakteriseret ved både fænoypiske og funktionelle forskelle sammenlignet med voksne. For eksempel, forhøjede niveauer af anti-inflammatoriske og regulerende cytokiner, såsom interleukin (IL)-10 og IL-27, har vist sig at være produceret af navlestrengsblod-afledte makrofager og er til stede på større niveauer i serum af murine nyfødte9,10,11. Dette er i overensstemmelse med lavere niveauer af IFN-α, IFN-ɣ, IL-12 og TNF-α, der ofte rapporteres fra neonatal celler sammenlignet med voksnemodstykker 10. Derudover er det neonatale immunsystem skævt mod en Th2 og regulerende T-celle respons i forhold til voksne12. Forhøjede antal neutrofiler, T-celler, B-celler, NK-celler og monocytter er også til stede i nyfødte, men med betydelige funktionelle funktionsnedsættelser. Dette omfatter defekter i ekspression af celleoverflademarkører og antigenpræsentation, der tyder på umodenhed13,14,15. Derudover, neonatal neutrofiler er betydeligt mangelfuld i deres evne til at migrere til chemotactic faktorer16. Myeloid-afledte suppressor celler (MDSCs) findes også på forhøjede niveauer i nyfødte og for nylig vist sig at være en kilde til IL-2711. MDSCs er meget undertrykkende mod T-celler17. Kollektivt, disse data viser begrænsninger i neonatal immunitet, der giver til øget modtagelighed for infektion.

At studere udviklingen af den bakterielle byrde og dissekere beskyttende vært immunrespons under neonatal sepsis, har vi udviklet en ny infektion model. Neonatal mus på dag 3-4 i livet er vanskelige at injicere i det intraperitoneale rum eller hale vene. I vores model administreres dag 3 eller 4 unger den bakterielle inokulum eller PBS subkutende ind i skulderk regionen. En systemisk infektion udvikler og ved hjælp af selvlysende E. coli O1:K1:H7, kan vi i længderetningen billede enkelte neonatal mus til at følge den disse formidlede bakterielle byrde i perifere væv. Dette er den første rapporterede model til at udnytte intravital billeddannelse til at forstå kinetik af spredning af bakterier under sepsis i murine nyfødte3.

Her beskriver vi en protokol til at fremkalde septiske E. coli infektioner i neonatal mus3. Vi beskriver, hvordan man forbereder den bakterielle inoculum til injektion, og hvordan man høster væv til vurdering af patologi, måling af inflammatoriske markører ved genekspressionsanalyse og optælling af bakteriebyrden. Desuden beskrives også brugen af selvlysende E. coli til intravital billeddannelse af inficerede nyfødte og kvantificering af bakteriedrab med neonatale immunceller. Disse protokoller kan også tilpasses til at studere andre vigtige bakterielle infektioner hos nyfødte. De data, der præsenteres her repræsenterer en samlet ny tilgang til forståelse infektion dynamik i en oversættelig neonatal sepsis model.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedurer blev godkendt af West Virginia Institutional Animal Care and Use udvalg og gennemført i overensstemmelse med anbefalingerne fra vejledningen om pleje og brug af laboratoriedyr af National Research Council18.

1. Præparat af bakteriel inoculum

  1. Streak en tryptisk soy agar (TSA) plade med en podning løkke til isolering af en enkelt koloni fra en fryser lager af E. coli O1: K1:H7-lux, der stabilt udtrykker luciferase og bærer kanamycin modstand3. Inkuber natten over ved 37 °C.
  2. Den følgende dag tillader Luria bouillon (LB) at komme til stuetemperatur (25 °C) i et biosikkerhedsskab.
  3. Under en biosikkerhedsskabshætte identificeres en enkelt koloni fra den stribede plade, og den inokuleres i 3 ml LB suppleret med kanamycin (30 μg/ml). Inkuberes natten over ved 37 °C med omrystning (220 omdr./min.). Dette er starterkulturen.
  4. Fortynd startkulturen 1:100 i en frisk 3 ml LB under en biosikkerhedsskabhætte og tilbagelever den til inkubatoren i 2-3 timer ved 37 °C med omrystning (220 omdr./min.). Det er aktiekulturen.
  5. Den optiske massetæthed (OD) af både blindprøven og bestandskulturen ved 600 nm ved hjælp af et spektrofotometer. Der tilsættes 100 μL LB (der indeholder ingen bakterier) i en brønd af en 96 brønd flad bundanalyseplade; Dette er tom. Derefter tilsættes 100 μL fra bestandskulturen til en separat brønd. Gentag for yderligere to replikater. Absorbansen aflæses ved hjælp af en pladelæser.
  6. Træk den tomme absorbans fra bestanden kultur absorbans værdi (OD-værdien) og sammenligne med en tidligere genereret og valideret vækstkurve til at bestemme en tilnærmelse af bakteriel tæthed i bestanden kultur til fremstilling af infektiøs dosis.
  7. Generer målinoculums afhængigt af forskningsspørgsmål. Målinoculum på 2 x 106 (lav) og 7 x 106 (høj) kolonidannende enheder (CFUs) pr. mus (/mus) blev anvendt til denne undersøgelse.
    1. Divider måldosis pr. mus (DosisT)med den anslåede koncentration af bakterier i lagerkulturen (Stock) for at få den mængde bakterier, der er behov for fra lagerrøret (VS).
    2. MultiplicerV S med antallet af mus (NM),der skal inficeres sammen med nok til 5-10 ekstramateriale for den samlede mængde bakterier, der kræves til infektionen plus 5-10 ekstra doser. Fjern dette volumen fra lagerrøret og tilsæt det til et nyt centrifugerør.
    3. Brug ligningen nedenfor:
      DosisT/Stock = VS x NM = samlet volumen (VT)af bakterier, der skal fjernes fra lagerrøret.
  1. Centrifuge bakterier ved 2.000 x g i 5 min ved 4 °C og opsaltning af bakteriepellet i 50 μL PBS (pH 7,2-7,6) pr. mus, der skal inficeres (f.eks. for 10 doser på 2 x 106 bakterier hver dosis, pellet af 2 x 107 bakterier ville blive resuspended i 500 μL PBS). Igen anbefales det at forberede mere inoculum end nødvendigt. Forbered kun en tilsvarende mængde PBS til kontrolookuulationer. Den smitsomme inokulum- og PBS-kontrol på is opretholdes indtil infektionen.
  2. Udfør syv ti gange serielle fortyndinger i PBS i en 96 brønd plastbundfortyndingsplade, og plade 25 μL af fortyndingerne i duplikeret på kvadrant-TSA-plader suppleret med kanamycin (30 μg/ml) for at opregne den faktiske mængde bakterier, der administreres. Inkuberes ved 37 °C natten over for kolonidannelse før optælling.

2. Identifikation af dyr

  1. Arranger et tilstrækkeligt antal ynglende par, således at kuld kan synkroniseres for aldersmatchede hvalpe. Aldersvariation af ± 1 dag er acceptabel.
  2. Identificer en gravid C57BL/6 kvindelig mus og monitor til fødsel af kuldet forud for det planlagte eksperiment for præcist at bestemme alder.
  3. At skelne mellem kontrol og inficerede 3- eller 4-dages gamle hvalpe, bruge et par små, fint tippet, iris saks til klip enderne af haler af kontrol hvalpe kun. De inficerede hvalpe modtager ikke haleklip. Før du skærer halen, desinficere huden med en vatkugle overhældt i 70% ethanol. Tryk på enden af halen med en vatkugle eller gaze efter behov.
    BEMÆRK: Denne procedure udføres under en biosikkerhedsskabhætte. En hale klip på ca 1 / 8 af en tomme er tilstrækkelig.
  4. For at identificere hvalpe i kontrol- og inficerede grupper skal du bruge en 1 ml insulinsprøjte med en 28 G x 1/2'' permanent nål til at tatovere hvalpenes haler. Før tatovering, desinficere huden med en vat overhældt i 70% ethanol. Denne procedure udføres under en biosikkerhedsskabhætte.
  5. At tatovering halen, anvende dyr tatovering blæk til spidsen af nålen. Dernæst forsigtigt begrænse hvalpen med den ene hånd, med deres hale fuldt eksponeret. Forsigtigt indsætte nålen under huden, samtidig med at en overfladisk niveau af dybde, og flytte nålen parallelt med huden et par millimeter, indtil en lille mærkning, eller prik, er blevet oprettet. Vent et par sekunder, før du langsomt fjerner nålen under huden for at undgå, at overskydende blæk slipper ud under huden.
  6. Tryk på såret med en vatkugle eller gaze efter behov. Fjern overskydende tatovering blæk på overfladen af huden med 70% ethanol.
  7. Gentag denne proces med efterfølgende mus i de inficerede og kontrolgrupper, samtidig med at tilføje en ekstra prik med hver efterfølgende hvalp tatoveret (f.eks hvalp 1 vil have 1 prik på halen, hvalp 2 vil have to prikker på halen, osv.).
    BEMÆRK: For et ekstra lag af identifikation, anbefales det at bruge separate farver af dyr tatovering blæk til kontrol og inficerede grupper.

3. Subscapular inokulering

BEMÆRK: Til denne undersøgelse blev der udført 2 forsøg med en lavdosis- og højdosisgruppe, der var udpeget til hvert eksperiment. I det første forsøg fik 7 unger den lave dosis inoculum (4 unger blev anvendt som kontrol), og 5 unger fra et separat kuld fik den høje dosis (3 unger blev anvendt som kontroller). Hvalpene fra eksperiment 1 fremlagde kun data for 24 h-tidspunktet. I det andet eksperiment fik 8 unger den lave dosis inoculum (2 unger blev anvendt som kontrol), og 6 unger fik den høje dosis inoculum (2 unger blev anvendt som kontroller). Hvalpe fra eksperiment 2 leverede data for 0, 10 og 24 h timepoint.

  1. Alder match hvalpe ≤ 1 dag. Tildel hvert kuld som enten en lav dosis eller en høj dosis kuld. Inden for et kuld tilfældigt tildele hvalpe som en kontrol eller inficeret hvalp.
  2. På dag 3 eller 4 postnatal registreres vægtene af alle unger før inokulering med E. coli-lux eller PBS-kontrollen. Adskære dæmningen fra hvalpene i løbet af denne tid for at sikre, at de ikke flyttes under infektionen.
  3. Inden for et biosikkerhedsskab ved hjælp af en insulinnål skal du aspirere enten PBS eller E. coli-lux inoculum. Til dette arbejde blev der anvendt inoculums på 2 x 106 og 7 x 106 CFUs pr. mus. Hold både infektiøs inokulum og PBS på is, indtil det er blevet indgift via subscapular injektion.
  4. Placer nyfødte på en ren overflade i biosikkerhed kabinet hætte og hæve huden på nakken, som om at scruff hvalpen.
  5. I rummet nu skabt mellem huden og musklen af dyret, indsætte nålen, facet op, lige under huden og injicere 50 μL AF PBS eller E. coli-lux. Slip samtidig den klemte del af huden for at forhindre tilbageløb af injektioner.
  6. Fjern nålen langsomt og med omhu. Placer hvalpe tilbage med dæmninger efter injektioner er færdige.
    BEMÆRK: På grund af deres anatomiske fase i udviklingen, er det teknisk udfordrende at administrere en hale vene eller intraperitoneal injektion til neonatal hvalpe på dag 3-4. Således, den subscapular infektion rute blev valgt til denne undersøgelse på grund af den lette udførelse.

4. Vurdering af sygdoms- og endepunktskriterier

  1. Overvåge hvalpene to gange dagligt i løbet af infektionens varighed. Bemærk eventuelle abnormiteter i udseende.
  2. Optag vægte som en objektiv måling af sygelighed.
  3. Ud over vægtændringer, teste evne til hvalpene til at rette sig selv ved at placere den nyfødte på dorsale side. Syge dyr vil være i stand til at vende sig til ventrale side og på fødderne eller vil fuldføre denne handling med besvær.
  4. Kontroller, om følgende skal mærke dyrene tæt på endepunktskriterierne: mindre end 85 % af den normale kropsvægt; nedsat bevægelse og manglende evne til at rette sig selv; misfarvning af huden og et mere gråt eller gennemsigtigt udseende i modsætning til pink; følelse cool at røre ved, hvilket indikerer nedsat kropstemperatur og hæmoragiske blå mærker langs siderne, også tegn på forudgående sygdom.
    BEMÆRK: Hvis nyfødte ikke har taget på i vægt over to dage og passer til nogen af beskrivelserne i trin 4.4, har de opfyldt slutpunktskriterierne. Hvalpe, der modtager den høje dosis ofte opfylder endpoint kriterier ved 24 timer. Kontrolunger i lav- og højdosisgred vil blive aflivet samtidig for at muliggøre en sammenlignende analyse mellem kontrolgrupperne og forsøgsgrupperne. Fortsæt til afsnittet om aktiv dødshjælp nedenfor.

5. In vivo imaging af bakteriel byrde

  1. Brug en microCT-billedenhed og software til billedbehandling og efterfølgende analyse.
    BEMÆRK: Pup hudfarve påvirker ikke billedkvalitet.
  2. Placer buret med E. coli-lux-inficeredeneonatal mus og dæmningen i en BSL-2 niveau laminar flow hætte. Fjern mus, der skal afbildes, og sted i et gennemsigtigt isoflurankammer i emhætten. Det anbefales at starte med uinficerede kontroller for at måle mængden af isofluran nødvendig.
  3. Åbn softwaren på den computer, der er tilsluttet mikroCT'en. Initialiser systemet, og vent på, at CCD-temperaturen låses ved -90 °C.
  4. Tænd isoflurane vaporizer på og justere skiven til 5% isofluran flow. Hold mus i kammeret med denne isofluranblanding i 20-30 s, indtil de holder op med at bevæge sig; længere eller kortere anæstesieksponeringstider kan være nødvendige for nogle mus. Når mus holder op med at bevæge sig, er de tilstrækkeligt bedøvet, og kan afbildes.
  5. Flyt mus ind i mikroCT-billeddannelseskammeret, og placer dem på billedboksen i den udsatte position med næser, der vender vinkelret på næsekekopper. Brug dental voks til forsigtigt at begrænse fødderne på billedbehandling boksen for at begrænse enhver bevægelse. Op til 4 neonatal mus kan afbildes ad gangen.
  6. Drej isoflurandamperen ned til 2-4% flow for at holde mus bedøvet under billeddannelse. Luk mikroCT-billedkammerdøren. Tjek musene et par sekunder senere. Hvis de begynder at bevæge sig, douse en vat i isofluran og holde den til næsen af dyret bevæger sig i 5 sekunder for at bedøve. Hold vat i nærheden af dyrene under billeddannelse. Pas på ikke at over bedøvelse og afslutte musene.
  7. Brug af softwaren til at vælge indstillingen Luminescent til billedbehandling. Brug et excitationsfilter indstillet til Blok og det emissionsfilter, der er indstillettil Åben , 500 nm, 520 nm, 560 nm, 580 nm, 600 nm og 620 nm. Der vil være syv samlede emissionsfiltre indstillet til luminescens.
  8. Billede musene på hvert tidspunkt (0, 10 og 24 timer efter infektion [hpi]) og gem alle billeder i en mappe for hvert tidspunkt. Returner hvalpene til buret med dæmningen og kontrollere, at alle hvalpe er kommet sig efter anæstesi.
  9. Hvis du vil analysere 2D-billeder, skal du åbne billeder i softwaren. Skift enheder til Radiance (fotoner); dette vil blive til Total Flux (fotoner / sekund).
  10. Analyser kun ét billedesæt med flere emissionsfiltre ad gangen. Fra hvert billedsæt skal du notere minimum- og maksimumudstrålingsværdierne i nederste højre hjørne af hvert billede (f.eks. hvis der er 7 emissionsfiltre, vil der være 7 billeder og 7 minimums- og maksimumværdier). Gentag for hvert billedsæt, der skal sammenlignes.
  11. Hvis du vil bestemme en skala, der omfatter værdierne og lysstyrken for alle billeder, skal du finde den laveste minimumsværdi og den højeste maksimale værdi for hvert billedsæt. Til denne undersøgelse blev Open-filterbillederne brugt som repræsentative.
    1. Fremhæv og åbn billedet af valg for at ændre skalaen. Klik på fanen Billedjustering påværktøjspaletten , og skift farveskalaen til de laveste minimum- og højeste maksimumværdier, der tidligere er identificeret. Gem hvert billedsæt som en TIFF. Analysere hver tidspunkt individuelt på denne måde for at sikre, at den korrekte skala vises.
  12. Hvis du vil kvantificere den samlede flux (mængden af selvlysende signal pr. mus) for hver enkelt mus, skal du åbne et billede som tidligere beskrevet i trin 5.9-5.10. Åbn fanen ROI-værktøjer på værktøjspaletten, og vælg cirkelværktøjet. Vælg 1 cirkel, hvis du analyserer et område af luminescens.
  13. Flyt investeringsafkastet til Overlejring på området for luminescens. Juster størrelsen på investeringsafkastet, hvis det er nødvendigt.
    BEMÆRK: Hvis justering er nødvendig, skal du justere ROI'er i andre billeder sammenligneligt for at bevare konsistensen. Vælg Målafrafkast. Vinduet ROI-målinger åbnes med totalfedt (p/s), gennemsnitlig radiance (p/s/cm2/sr), standardafvigelse for radiance, minimumudstråling og maksimal radiance.
  14. Optag totalfedtmålinger for hvert billedsæt. Dette tal er den kvantificerede mængde luminescens i musen i 2D-billeder.
  15. Hvis du vil lave 3D-rekonstruerede mikroCT-billeder, skal du åbne DLIT 3D-rekonstruktionspanelet på værktøjspaletten og kontrollere alle bølgelængder, der skal medtages under fanen Analysér. Vælg Rekonstruktion .

6.

  1. Klargør og etikettere rør til væv/organer af interesse for obduktion og passende downstream-anvendelser.
  2. Adskaf nyfødte fra dæmningen i et biosikkerhedsskab.
  3. Sættetid en vat i veterinær-grade isofluran og sted inde i en gennemsigtig indeslutning kammer.
  4. Hvis der indsamles blod, skal der forberedes en P200-mikropipette med en spids og har et 1,5 ml rør med 10 μL 5 mM EDTA som antikoagulerende middel. Der forventes et volumen på 50-200 μL blod.
  5. Placer en nyfødte i kammeret og overvåge hvalpen, indtil det bliver ubevægelig.
  6. Fjern hurtigt nyfødte og halshugge med en saks. Hvis lov til at indånde frisk luft i en længere periode, kan hvalpen genvinde bevidstheden. Nyfødte har nedsat lungekapacitet i forhold til voksne mus, og derfor ikke trække vejret dybt nok til eutanasi ved isofluran alene.
  7. Indsamle blod fra stammen i bunden af hovedet ved hjælp af en P200 mikropipette. For at maksimere mængden af blod indsamlet, udføre dette trin så hurtigt som muligt efter halshugning. Optælle bakterier i blodet ved serielle fortynding og standard pladetælling som beskrevet i trin 1.9.
  8. Steriliser hele nyfødte med 70% ethanol før excision af vævsprøver.

7. Vævshøst

  1. Inden for et biosikkerhedsskab skal nyfødte douse med 70% ethanol for at forhindre kontaminering. Læg dyret på sin højre side.
  2. Brug af spån, forstå huden på et punkt mellem maven og bageste venstre ben og foretage et snit med fint tippet kirurgisk saks. Fortsæt med at skære huden væk bevæger sig opad mod bagsiden. Fremskridt, indtil hele milten er udsat.
  3. Brug de vicess til at gribe milten og fjerne det fra maven, ved hjælp af en saks til at afbryde bindevævet. Anstæns i den opløsning, der passer til dens downstream-anvendelse.
  4. For at få lungerne, skræl tilbage huden af brystet helt.
  5. Indtastning i bunden af brystbenet med en saks holdes lodret, skåret opad, indtil brystkassen er delt.
  6. Brug snævle til at gribe højre og venstre lunger individuelt og fjerne dem fra brysthulen. Fjern hjertet fra lungevævet ved at skære med en saks.
  7. Anst samme lunge i den opløsning, der passer til dens downstream-anvendelse. Ved RNA-isolering anvendes 500 μL guanidin thiocyanat/phenol (GTCP). For histopatologisk, brug 5 ml 10% neutral-buffered formalin.

8. RNA-isolering fra lungevæv til genekspression

  1. Forkøl mikrocentrifugen til 4 °C.
  2. Hakke lungevævet i GTCP med en saks. Derefter homogeniseres vævet med en batteridrevet homogenisator. Fortsæt, indtil opløsningen er så ensartet som muligt. Inkubere ved stuetemperatur i 3-5 min.
  3. Ved hjælp af filtrerede pipettespidser tilsættes 100 μL chloroform. Inverter røret i 15 s og inkubere 3-5 min ved stuetemperatur.
  4. Centrifuge i 15 min ved 12.000 x g.
  5. Under spin, forberede 1,5 ml rør med 500 μL af 70% ethanol. Saml og mærf kolonnerne og samlingsrørene fra RNA-isolationssættet.
  6. Fjern forsigtigt det øverste, vandige lag uden at forstyrre det interfaselag, der dannes under centrifugering. Læg det vandige lag i rørene, der indeholder 70% ethanol.
  7. Flyt ethanol- og lysatblandingen til kolonnen i opsamlingsrøret.
  8. Fra dette punkt skal du følge RNA isolationskit kommercielle produktprotokol indtil den endelige elution af RNA.
  9. Analysér RNA'et for renhed og mængde. Anvendes straks eller opbevares ved -80 °C indtil videre brug.

9. cDNA syntese

  1. Mærke PCR rør og der er afsat.
  2. Der tilsættes 1 μg RNA til cDNA-reaktionsblandingen for hver prøve.
  3. Tilsæt reagenserne og skabelonen til PCR-røret som beskrevet i cDNA-protokollen. Tilsæt enzymet til blandingen sidste.
  4. PCR-rør anbringes i en termocykstyring med følgende køreindstillinger: 5 min ved 25 °C, 40 min ved 42 °C, 15 min ved 85 °C og 4 °C endeligt hold.
  5. Fjern PCR-rør fra termocykator og brug straks eller opbevar ved -20 °C indtil videre brug.

10. Kvantitativ PCR-cyklus (qPCR) i realtid

  1. Forbered en reaktion mix cocktail for hver af de gener, der skal analyseres. Hver 15 μL PCR-reaktion kræver 7,5 μL 2x reagensblanding, 0,75 μL 20X 5'-FAM-mærket genspecifik primer/sonde og 3,75 μL nukleosfrit vand. Amplicons typisk spænder fra 60-120 bp.
  2. Der tilsættes 3 μL cDNA-skabelon for hver forsøgsgruppe til de relevante brønde.
  3. Der tilsættes 12 μL af den genspecifikke reaktionsblandingscocktail til de relevante brønde.
  4. Dæk pladen med optisk klæbefilm og centrifuge i 1 min ved 1.000 x g for at fjerne eventuelle bobler, der kan have dannet i brøndene.
  5. Placer PCR-pladen i en PCR-termocyr i realtid.
  6. Løbemetoden angives således: 3 min ved 95 °C, 40 cyklusser på 95 °C i 15 s efterfulgt af 60 °C i 1 min.
  7. Analysere data ved at normalisere genet af interesse for en intern kontrol og ekspresdata fra inficerede prøver i forhold til ikke-inficerede kontrolprøver ved hjælp af 2-ΔΔCt-formlen og en log2-omdannelse af tallene.

11. Lunge histopatologi

  1. Fjern lungerne fra neonatal hvalp som beskrevet ovenfor.
  2. Vævet sættes i et volumen på 10% neutral buffered formalin, således at forholdet mellem opløsning til væv er ca. 20:1 i 3-7 dage.
  3. Koordinere med en passende histologi service for paraffin indlejring, sektion, og hæmaxylin og eosin (H & E) farvning. Til dette arbejde blev West Virginia University Histopathology Core udnyttet. Du kan også følge tidligere beskrevne protokoller19.

12. In vitro bakteriel drab analyse

  1. Fjern milten fra den ikke-inficerede neonatal hvalp som beskrevet ovenfor og læg den i en 40 μm nylonkurv i en steril 60 mm petriskål. Gentag dette og pool milt i et rør, der skal høstes og homogeniseres sammen.
  2. Tilsæt 5 ml PBS suppleret med 10% FBS.
  3. Nedsiv vævet med et sterilt 3 ml sprøjtestempel, indtil der oprettes en enkelt cellesuspension.
  4. Encelledefjedringen opsamres uden for nylonkurven, overføres til et 15 ml centrifugerør, og pelletcellerne skal være 350 x g i 5 min.
  5. Suspendere cellerne i røde blodlegemer lysis buffer (2 ml i op til 7-8 milt) og lad det stå i 5 min ved stuetemperatur for at fjerne erythrocytter.
  6. Splenocytter vaskes med PBS og pellet som ovenfor.
  7. Miltcytterne suspenderes i 0,25 ml PBS suppleret med 0,5 % BSA og 2 mM EDTA i henhold til det forventede celleudbytte.
  8. Tæl miltytterne ved hjælp af et hæmocytometer eller et andet passende program.
  9. Isoler Ly6B.2+ (myeloid population af granulocytter/inflammatoriske monocytter) celler med immunmagnetiske perler i henhold til producentens protokol.
  10. Seed Ly6B.2+ celler ved en massefylde på 1 x 105 celler pr. brønd i en sort eller hvid 96-brøndplade i et volumen på 0,1 ml DMEM, der indeholder 10% FBS, 2 mM glutamin og 25 mM HEPES (komplet medium).
  11. Optælle bioluminescerende E. coli som beskrevet i afsnit 1 og klargør bakterieinoculum ved den ønskede mangfoldighed af infektion (MOI) i et endeligt volumen på 0,1 ml. Dette gøres bedst ved at gøre, hvad der er nødvendigt for alle brønde på en fælles MOI i parti.
  12. Tilsæt 0,1 ml bakteriel inokulum eller komplet medium alene som en kontrol. Der inkuberes multi-brøndpladen ved 37 °C og 5% CO2 i 1 time.
  13. Udskift mediet med 0,2 ml frisk komplet medie, der indeholder gentamicin (100 μg/ml) ved forsigtigt at fjerne medier med en pipette og tilføje friske medier med en ny pipettespids. Returner kulturen til inkubation i yderligere 2 timer.
  14. Ved 3 timers post-infektion, måle luminescens i hver brønd af låg kultur plade fra bunden ved hjælp af en pladelæser og derefter returnere kulturen til inkubation.
  15. Gentag målinger af luminescens ved andre ønskede tidspunkter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokol induceret bakteriel sepsis i neonatal mus, og vi brugte langsgående intravital billeddannelse, optælling af bakterier i blodet, histologiske vurderinger af patologi, og inflammatoriskcytokin udtryk profiler til at studere sygdomsforløbet. Der blev observeret tegn på sygelighed hos neonatal unger inficeret med både lave (~2 x 106 CFUs) og høje (~7 x 106 CFUs) inoculums af E.coli over tid. Hvalpe, der fik større inoculum viste mere fremtrædende tegn på angst, der omfattede nedsat mobilitet, manglende evne til at korrigere deres kropsholdning, og nedsat evne til at opretholde en oprejst position ved 24 h post-infektion (hpi). Der var dog en række sygelighed som nogle hvalpe syntes værre end andre. Umiddelbart efter infektion, en lav-dosis dyr døde på grund af isofluran eksponering under en billeddannelse session at etablere baseline. Ved 24 hpi bukkede to ud af seks højdosisdyr under for den systemiske infektion (33,3 % dødelighed). Inficerede hvalpe, der fik enten en høj eller lav dosis inoculum vejede betydeligt mindre end deres kontrol littermates på 24 hpi (Figur 1A, B). Alle de unger, der fik den højere inoculum opfyldt endepunkt kriterier på 24 hpi. Som sådan, alle de inficerede hvalpe i denne gruppe blev aflivet efter billeddannelse. Bakterier i blodet blev opregnet for en delmængde af mus, der modtog den nederste inoculum, og for alle dyr, der modtog den højere inokulum, da de alle blev aflivet. Resultaterne fra to udførte forsøg viser på samme måde, at mens de fleste dyr havde høje niveauer af bakterier i blodet (CFUs/ml) ved 24 hpi, havde nogle dyr ikke påviselige bakterier i blodet (Figur 1C). Sidstnævnte tyder på, at de ryddet infektionen på dette tidspunkt. Som forventet, hvalpe, der fik den højere inoculum havde næsten tre størrelsesordener mere CFUs/ml på 24 hpi i forhold til hvalpe, der modtog den lave dosis inoculum (Figur 1C).

Levende dyrebilleddannelse af selvlysende bakterier bekræftede yderligere spredningen af bakterier og stigningen i væksten hos nyfødte unger over tid ved 10 og 24 hpi (Figur 2 og Figur 3). Ved hjælp af intravital billeddannelse med mikroCT var vi desuden i stand til at identificere infektionsfoci, herunder hjernen (figur 2B), lunger (Figur 2B, Figur 3A,B) og andre perifere væv (Figur 2B). Lungerne af nogle stærkt inficerede mus viste uigennemsigtige områder i overensstemmelse med inflammatorisk konsolidering, der co-lokaliseret til selvlysende bakteriel signal (Figur 3A). Disse områder af formodet inflammatorisk ekssudat findes ikke i ikke-inficerede kontrollunger (Figur 3A). Yderligere tegn på en udtalt inflammatorisk cytokin respons i lungerne af inficerede hvalpe er påvist ved genekspression analyse af IL-1β, IL-6, og TNF-α. Der blev observeret en betydelig stigning i udtrykket i forhold til kontrollerne for alle tre cytokiner i både lav- og højinokulumsgrupper (figur 4A). Histopatologi af lungerne blev også undersøgt på 24 hpi i kontrol og inficerede hvalpe. På trods af lignende inflammatoriske cytokin profiler, en progressiv stigning i patologi blev almindeligt observeret fra den nederste til den højere inokulum. Sammenlignet med væv fra ikke-inficerede kontroller, lungerne af inficerede unger viste bemærkelsesværdige inflammatoriske ændringer, fortykkelse af alveolær væggen, øget alveolær blødning, og inflammatorisk infiltration (Figur 4B). I de alvorligste infektioner bidrog lungepropper og blødningsområder til en massiv reduktion af det åbne luftrum (figur 4B). Kollektivt, disse resultater viser, at i vores model af tidlig debut neonatal sepsis, formidling af selvlysende bakterier kan følges over tid fra en subscapular inokulering site til vigtige infektion foci og forårsage betydelig inflammation og patologi i alvorligt inficerede dyr.

At studere vært faktorer, der bidrager til bakteriel drab af medfødte immunceller såsom monocytter, makrofager, og neutrofiler, vi udviklet en følsom in vitro assay at måle bakteriel clearance. Ly6B.2+ celler isoleret fra milten af neonatal mus blev inficeret med bioluminescerende E. coli ved en række MOPI'er i 1 time og derefter behandlet med gentamicin at dræbe ekstracellulære bakterier. Ved 3, 6, 20 og 48 hpi blev intracellulær luminescens målt med en flermodelæser. Som forventet blev der med stigende MOI registreret mere selvlysende signal ved 3 timer (Figur 5). Gradvist, dette signal gik tabt, hvilket indikerer bakteriel clearance (Figur 5). Denne analyse er modtagelig for suppleret cytokiner, neutralisering af udskilles effektorer, og tilsætning af farmakologiske hæmmere af cellulære veje til at studere interventioner, der kan fremme bakteriel clearance og tjene til at forbedre resultaterne i neonatal sepsis model beskrevet her.

Figure 1
Figur 1: Ændringer i kropsvægt og bakteriel replikation i septiske neonatale mus.
(A,B) Individuelle musevægte i en gruppe (lav og høj) udtrykt i procent af den gennemsnitlige vægt af littermate kontrolunger. Data præsenteres som middelprocent ± SEM. Individuelle t-test på hvert tidspunkt efter infektionen afslører signifikante forskelle ved 24 timer mellem kontrolunger og unger, der fik den lave inokulum (p<0,0001) (A) eller mellem kontrolunger og unger, der modtog den høje inokulum (p=0,0031) (B). (C)CFU/ml i blodet ved 24 hpi blev log omdannet og præsenteret som middelværdi ± SEM. Mann-Whitney test afslører en tendens til betydning mellem lav og høj dosis inoculums (p= 0,0882). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Intravital billeddannelse viser spredning af bakterier i neonatal mus over tid.
(A) En repræsentativ neonatal mus (#1) inficeret med et inoculum på ~ 2 x 106 CFUs vises på tidspunktet 0, 10 og 24 hpi. Der vises en kolotrimetrisk skala med minimum- og maksimumudstrålingsværdier pr. tidspunkt for hvert tidspunkt. Mus ved 0 og 10 timer vises på både deres tidspunktsskala og 24-timers skalaen for at påvise ændringer i bakterievækst over tid. b) Repræsentative 3D-rekonstruerede mikroCT-billeder af samme neonatale mus ved 10 og 24 hpi vises. Hvert tidspunktspunkt har billeder ved overhead-, transaksiale og koronale perspektiver. I transaksiale billede på 24 hpi, har flyet bevæget sig mod periferien af musen til bedre at vise infektion foci i det perifere væv. Hvide pile angiver hjernen og nyrerne ved 10 hpi og nyre og lunge ved 24 hpi. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Lunger er et sted for større infektion under bakteriel sepsis hos nyfødte.
(A) Repræsentative 3D rekonstruerede mikroCT-billeder af en neonatal mus (#5) inficeret med et inokulum på ~ 7 x 106 CFUs vises ved 24 hpi sammenlignet med en ikke-inficeret kontrol. Begge mus vises i transaksial perspektiv og lunger er angivet med hvide pile. Den inficerede mus blev placeret på to udstråling (fotoner / sek) skalaer. Skala #1 omfatter alle 6 bølgelængder (500, 520, 560, 580, 600, 620 nm) og skala #2 omfatter kun 500, 520 og 560 nm bølgelængder. Denne anden skala tillod os at visualisere et øget signal i bakterier i lungerne, fordi lavere bølgelængder er mere stærkt absorberet af væv og producere stærkere signal. (B) Repræsentative 3D rekonstruerede mikroCT-billeder af en neonatal mus (#4) inficeret med et inokulum på ~ 7 x 106 CFUs vises ved 24 hpi. Dette tidspunkt har billeder på overhead, sagittal, transaksial, og koronale perspektiver. Hvide pile indikerer infektion foci i lungerne. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Betændelse og tilhørende histopatologiske fund i lungerne af septiske nyfødte.
Ved 24 hpi blev lungerne høstet fra unger, der fik ~2 x 106 eller 7 x 106 CFUs eller ikke-inficerede kontroller. a) RNA blev isoleret, og udtrykket IL-1β, IL-6 eller TNF-α blev bestemt i forhold til ikke-inficerede kontroller ved kvantitative pcr i realtid ved hjælp af formlen 2-ΔΔCt. Dataene vises som den gennemsnitlige log2 transformeret ændring i udtrykket ± SEM for hvert inoculum som angivet. Statistisk signifikans blev bestemt ved hjælp af uertalte t-test af ΔCt-værdier mellem individuelle cytokingener og den interne kontrol i konfidensintervallet på 95 %. Stjerner angiver p<0,01. (B-D) Histopatologiske dele af H&E farvede lungevæv (20x, interesseområde konstrueret i udsnitsmaske og udvidet for klarhed) er vist. Lungevæv fra en repræsentativ ikke-inficeret kontrol (B) eller inficeret nyfødte ved den lave (C) eller høje(D)inokulum er vist. Gule pile angiver alveolær fortykkelse (C) eller blødning (D). Skalabar = 500 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: En in vitro-analyse til bakteriel frihøjde.
Ly6B.2+ celler blev isoleret fra milt af ikke-inficerede kontrol nyfødte. Cellerne var seedet i 96-brøndsplader og inficeret med luciferase-ekspresserende E. coli O1:K1:H7 ved en mangfoldighed af infektion (MOI) på 10, 50 eller 250 som angivet. Efter 1 time blev mediet erstattet med frisk, der indeholdt gentamicin (100 μg/ml). Gennemsnitlige relative lysenheder (RLU), ± SE for et individuelt eksperiment, der er repræsentativt for flere, vises. Statistisk signifikans i konfidensintervallet på 95 % blev fastlagt ved hjælp af uerte t-test med Welchs korrektion; stjerner angiver p<0,05. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vores subscapular infektion model for at fremkalde bakteriel sepsis i neonatal mus er en ny metode til at studere langsgående spredning af bakterielle patogener i realtid. Intravital billeddannelse giver mulighed for at udforske bakteriel formidling i realtid hos nyfødte. Dette er afgørende for at forstå kinetik af bakteriel formidling og til yderligere at studere værtens respons og skader på den relevante fase af sygdommen. Mus hvalpe administreres en subkutan, subscapular injektion af bakteriel inoculum. Denne injektion teknik er enklere end andre almindeligt anvendte alternativer, såsom hale vene og intraperitoneal infektioner, da det kræver mindre præcision inden for et injektionssted. Dette er vigtigt i betragtning af den lille størrelse af hvalpene. Den intravital billeddannelse giver mulighed for en langsgående vurdering af bakteriel spredning og spredning i perifere væv og centralnervesystemet over tid uden at det er nødvendigt at ofre dyret. Lignende billeddannelsesmetoder og -teknologier er blevet anvendt til undersøgelse af kræftbiologi og metastase20,21. Endvidere, mens en anden undersøgelse har nævnt brugen af bioluminescerende billeddannelse under en E. coli infektion i neonatal rotter22, her, vi har anvendt tilgang til neonatal mus, hvor vores metode tillader evaluering af bakterielle kinetik under murine sepsis. Visualisering af bakterierne er baseret på emission af bioluminescerende lys ved forskellige bølgelængder fra bakterier (f.eks. bakteriel luciferaseaktivitet) i dyret. Bioluminescens visualiseres derefter gennem et afkølet opladet koblet enhed (CCD) kamera. Den resulterende visualiserede bioluminescens kan derefter rekonstrueres til et 3D-billede, der viser både rumlige og tidsmæssige-afhængige virkninger af bakterier i et dyr. For en tilføjet, mere nuanceret lag af dataindsamling, vellykket dyreidentifikation gennem hale tatovering giver mulighed for en gentagen foranstaltninger vurdering af de enkelte unger over tid og identifikation af mulige outliers inden for en given eksperimentel gruppe.

Den mest vellykkede anvendelse af den beskrevne model kræver nøjagtighed i forberedelsen af den bakterielle inoculum. Her beskriver vi en optimeret metode til bakteriel præparat ved hjælp af en foruddefineret og valideret E. coli vækstkurve, der reducerer variationen mellem målet og det faktiske inokulum. Dette giver mulighed for eksperimentel reproducerbarhed på et tilsigtet inokulum. Inddragelsen af to inoculums i vores model viste dosisafhængige resultater i blod-CFUs, dødelighed og lungepatologi. Nogle aspekter af sygdomsforløbet var dog ikke dosisafhængige. Den manglende vægt på at tage på i de inficerede dyr var ikke afhængig af inokulum ved 24 hpi. Derudover blev der observeret tilsvarende niveauer af inflammatorisk cytokinekspression i lungerne som reaktion på infektion med begge inokulum. Hvorvidt dette mønster ville blive gentaget i alle væv, hvor bakterier blev observeret, såsom nyre, lever, milt og hjerne, er endnu ikke fastlagt. Ud over sepsis, E. coli O1:K1:H7 er forbundet med meningitis i neonatal population23. Denne hjerneinfektion opstår, når bakterier fra periferien invadere og trænge ind i blod-hjerne barrieren. Fremtidige undersøgelser vil undersøge dette aspekt af modellen gennem analyse af ændringer i stramme kryds protein udtryk, samt teste forskellige intervaller af bakterielle inokulum. En yderligere ændring under intravital billeddannelse omfatter tilsætning af en ental vat, overhældt i isofluran, som er placeret ca 2-3 inches væk fra musene under billeddannelse. Som svar på tidligere eksperimenter, hvor neonatal hvalpe har genvundet bevidstheden under billeddannelse session, forhindrer nøjagtig billedopkøb, vi nu placere vat tæt nok til musene til at holde dem løbende bedøvet under billeddannelse. Men det er vigtigt, at dette ikke sker så tæt, at de undlader at komme sig efter anæstesi.

Selv om fleksibel og let kan tilpasses til undersøgelse af kinetik af forskellige bakterier i forskellige dyre- og sygdomsmodeller, har vores protokol nogle begrænsninger at overveje. Den første begrænsning at overveje er, at den subscapular rute infektion ikke afspejler en naturlig vej til transmission. Men et primært mål i udviklingen af vores model fra starten var at etablere en let reproducerbar leveringsmåde, der kunne bruges til at etablere en systemisk infektion, der replikerer aspekter af sygdomme hos mennesker. Derfor beskriver vi i denne betænkning en model af humant tidligt indsættende sepsissygdomsyndrom, ikke en model for naturlig overførsel. Der er en etableret model for oral levering i neonatal rotter, der replikerer nogle aspekter af fælles overførsel af mennesker, såsom indledende kolonisering af E. coli infektion i fordøjelseskanalen og efterfølgende formidling til blodbanen og perifere væv, herunder hjernen22. Modellen etableret af Witcomb og kolleger inkorporerer også bioluminescerende E. coli og intravital billeddannelse. Desuden er det afgørende at minimere isofluran eksponering, samt injicere, hale tatovering, og håndtere hvalpe så hurtigt som muligt uden at gå på kompromis nøjagtighed og præcision af de teknikker i et forsøg på at afbøde stressniveauer for både nyfødte og dæmninger. I nogle tilfælde, hvis hvalpene oplever forbedret menneske-induceret og / eller eksperimentelle manipulationer, dæmningerne kan stoppe sygepleje og omsorg for hvalpene, hvilket resulterer i nedsat overlevelse relateret til infektionen. Tilsvarende, hvalpe, der er udsat for isofluran i længere perioder ud over de ca. 10 minutter af en billedbehandling session har en øget risiko for død; derfor er det afgørende at levere lige nok isofluran til tilstrækkeligt bedøve musene, men ikke nok til at aflive dem. Et sidste punkt, hvor man overvejer, er følsomhedsgrænsen. Væv, hvor mindre end 104 CFUs/ml E. coli blev opregnet det optagede selvlysende signal falder i den lave ende af det påviselige område, i henhold til den skaleringsmetode, der anvendes i billedbehandlingssoftwaren3. Således kan nogle væv koloniseres med lave niveauer af bakterier, men vises uden synlig bioluminescens.

I øjeblikket, de fleste undersøgelser udnytte voksne metoder til bakteriel formidling, såsom intraperitoneal (ip) og hale vene injektioner for nyfødte. Pluschke og Pelkonen analyserede effekten af E. coli K1 på neonatal mus gennem i.p., hale vene, og orale infektioner24. Denne undersøgelse viste, at forskellige genotyper af mus med immundefekter er mere modtagelige for K1-stammen; men mange aspekter af værten immunrespons på infektion samt mekanismerne for bakteriel spredning er overladt adresseløse. Deshmukh og kolleger inficerede neonatal mus intraperitoneally med E. coli K1 eller K. pneumoniae og målte CFUs i milten og leveren ved 72 hpi25. Denne undersøgelse analyserede også nogle aspekter af værtens reaktion på infektion baseret på præ-eksponering af mus til antibiotika. Der blev imidlertid ikke taget fat på en grundig undersøgelse af bakteriel spredning til perifert væv og blod over tid parallelt med inflammatorisk profilering i samme væv (bortset fra granulocytose). Andre undersøgelser af neonatal sepsis hos mus med Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Gruppe B Streptococcus, og E. coli udforske varierende aspekter af værtens immunsystem som reaktion på infektion. Men, ingen af disse undersøgelser udnytte intravital billeddannelse at udforske kinetik af bakteriel formidling eller lokalisering af infektion foci23,25,26,27. Vores metode til infektion og intravital billeddannelse, kombineret med bakteriel byrde vurdering og inflammatorisk profilering af perifere væv, giver os mulighed for omfattende undersøge aspekter af både vært og patogen under infektion, hvilket giver en mere præcis forståelse af vært-patogen samspil under sepsis.

Vi agter at udnytte denne infektion og billeddannelse model til at fremme vores forståelse af tidlig debut neonatal sepsis ved hjælp af en række patogene bakterier, der almindeligvis er ansvarlige for sepsis i nyfødte, herunder gruppe B streptococci, K. pneuomoniae, og Listeria monocytogenes. Denne infektion model vil give os mulighed for at langsgående sammenligne formidling af forskellige bakterielle patogener parallelt med værten svar i nyfødte. Desuden kan denne model tilpasses den adoptivoverførsel af specifikke (fluorescerende konjugerede) immuncelletyper for at studere deres migration til infektionssteder og efterfølgende indflydelse på værtens respons og kontrol af bakterier. Dette giver mulighed for bedre at forstå vært-patogen interaktioner, der opstår under sepsis i det tidlige liv på måder, der ikke tidligere er blevet påvist.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af institutionelle midler til .M.R.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL Insulin Syringe Coviden 1188128012 Inoculum or PBS injection
10% Neutral Buffered Formalin VWR 89370-094 Histopathology
ACK Lysis Buffer Gibco LSA1049201 Bacterial clearance assay
Animal Tattoo Ink Paste Ketchum KI1482039 Animal identification
Animal Tattoo Ink Green Paste Ketchum KI1471039 Animal identification
Anti-Ly-6B.2 Microbeads Miltenyi Biotec 130-100-781 Cell isolation
Escherichia coli O1:K1:H7 ATCC 11775
Escherichia coli O1:K1:H7-lux (expresses luciferase) N/A N/A Constructed in-house at WVU
E.Z.N.A. HP Total Extraction RNA Kit Omega Bio-tek R6812 RNA extration
DPBS, 1X Corning 21-031-CV
Difco Tryptic Soy Agar Becton, Dickinson and Company 236950 Bacterial growth
IL-1 beta Primer/Probe (Mm00434228) Thermo Fisher Scientific 4331182 Cytokine expression qPCR
IL-6 Primer/Probe (Mm00446190) Thermo Fisher Scientific 4331182 Cytokine expression qPCR
iQ Supermix Bio-Rad 1708860 Real-time quantitative PCR
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708891 cDNA synthesis
Isolation Buffer Miltenyi Biotec N/A Bacterial clearance assay
IVIS Spectrum CT and Living Image 4.5 Software Perkin Elmer N/A Intravital imaging
LB Broth, Lennox Fisher BioReagents BP1427-500 Bacterial growth
EASYstrainer (Nylon Basket) Greiner Bio-one 542 040 Cell strainer
SpectraMax iD3 Molecular Devices N/A Plate reader
Pellet Pestle Motor Grainger 6HAZ6 Tissue homogenization
Polypropylene Pellet Pestles Grainger 6HAY5 Tissue homogenization
Prime Thermal Cycler Techne 3PRIMEBASE/02 cDNA synthesis
TNF-alpha Primer/Probe (Mm00443258) Thermo Fisher Scientific 4331182 Cytokine expression qPCR
TriReagent (GTCP) Molecular Research Center TR 118 RNA extration

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Qazi, S. A., Stoll, B. J. Neonatal sepsis: a major global public health challenge. Pediatr Infect Dis J. 28, 1-2 (2009).
  2. Simonsen, K. A., Anderson-Berry, A. L., Delair, S. F., Davies, H. D. Early-onset neonatal sepsis. Clinical Microbiology Reviews. 27 (1), 21-47 (2014).
  3. Seman, B. G., et al. Elevated levels of interleukin-27 in early life compromise protective immunity in a mouse model of Gram-negative neonatal sepsis. Infections and Immunity. , (2019).
  4. Schrag, S. J., et al. Epidemiology of Invasive Early-Onset Neonatal Sepsis, 2005 to 2014. Pediatrics. 138 (6), 20162013 (2016).
  5. Stoll, B. J., et al. Early onset neonatal sepsis: the burden of group B Streptococcal and E. coli disease continues. Pediatrics. 127 (5), 817-826 (2011).
  6. Weston, E. J., et al. The burden of invasive early-onset neonatal sepsis in the United States, 2005-2008. Pediatrics and Infectious Disease Journal. 30 (11), 937-941 (2011).
  7. Hornik, C. P., et al. Early and late onset sepsis in very-low-birth-weight infants from a large group of neonatal intensive care units. Early Human Development. , Suppl 2 69 (2012).
  8. Vergnano, S., Sharland, M., Kazembe, P., Mwansambo, C., Heath, P. T. Neonatal sepsis: an international perspective. Archives of Disease in Childhood: Fetal and Neonatal Edition. 90 (3), 220-224 (2005).
  9. Kraft, J. D., et al. Neonatal macrophages express elevated levels of interleukin-27 that oppose immune responses. Immunology. 139 (4), 484-493 (2013).
  10. Basha, S., Surendran, N., Pichichero, M. Immune responses in neonates. Expert Reviews of Clinical Immunology. 10 (9), 1171-1184 (2014).
  11. Gleave Parson, M., et al. Murine myeloid-derived suppressor cells are a source of elevated levels of interleukin-27 in early life and compromise control of bacterial infection. Immunology and Cell Biology. 97 (5), 445-446 (2018).
  12. Adkins, B., Leclerc, C., Marshall-Clarke, S. Neonatal adaptive immunity comes of age. Nature Reviews Immunology. 4 (7), 553-564 (2004).
  13. Kim, S. K., Keeney, S. E., Alpard, S. K., Schmalstieg, F. C. Comparison of L-selectin and CD11b on neutrophils of adults and neonates during the first month of life. Pediatrics Research. 53 (1), 132-136 (2003).
  14. Velilla, P. A., Rugeles, M. T., Chougnet, C. A. Defective antigen-presenting cell function in human neonates. Clinical Immunology. 121 (3), 251-259 (2006).
  15. Le Garff-Tavernier, M., et al. Human NK cells display major phenotypic and functional changes over the life span. Aging Cell. 9 (4), 527-535 (2010).
  16. Weinberger, B., et al. Mechanisms underlying reduced responsiveness of neonatal neutrophils to distinct chemoattractants. Journal of Leukocyte Biology. 70 (6), 969-976 (2001).
  17. Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system. Nature Reviewss Immunology. 9 (3), 162-174 (2009).
  18. National Research Council. Guide for the care and use of laboratory animals, 8th ed. , National Academies Press. Washington, DC. (2011).
  19. Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification. Journal of Visualized Experiments. (125), e55796 (2017).
  20. Bayarmagnai, B., Perrin, L., Esmaeili Pourfarhangi, K., Gligorijevic, B. Intravital Imaging of Tumor Cell Motility in the Tumor Microenvironment Context. Methods in Molecular Biology. 1749, 175-193 (2018).
  21. Beerling, E., Ritsma, L., Vrisekoop, N., Derksen, P. W., van Rheenen, J. Intravital microscopy: new insights into metastasis of tumors. Journal of Cell Science. 124, Pt 3 299-310 (2011).
  22. Witcomb, L. A., Collins, J. W., McCarthy, A. J., Frankel, G., Taylor, P. W. Bioluminescent Imaging Reveals Novel Patterns of Colonization and Invasion in Systemic Escherichia coli K1 Experimental Infection in the Neonatal Rat. Infection and Immunity. 83 (12), 4528 (2015).
  23. Singh, K., et al. Inter-alpha inhibitor protein administration improves survival from neonatal sepsis in mice. Pediatric Research. 68 (3), 242-247 (2010).
  24. Pluschke, G., Pelkonen, S. Host factors in the resistance of newborn mice to K1 Escherichia coli infection. Microb. Patho. , 93-102 (1988).
  25. Mancuso, G., et al. Role of interleukin 12 in experimental neonatal sepsis caused by group B streptococci. Infections and Immunity. 65 (9), 3731-3735 (1997).
  26. Thammavongsa, V., Rauch, S., Kim, H. K., Missiakas, D. M., Schneewind, O. Protein A-neutralizing monoclonal antibody protects neonatal mice against Staphylococcus aureus. Vaccine. 33 (4), 523-526 (2015).
  27. Andrade, E. B., et al. TLR2-induced IL-10 production impairs neutrophil recruitment to infected tissues during neonatal bacterial sepsis. Journal of Immunology. 191 (9), 4759-4768 (2013).

Tags

Immunologi og infektion Problem 162 bioluminescens intravital billeddannelse E. coli subscapular inokulering nyfødte sepsis inflammation cytokiner
En neonatal Imaging Model af Gram-Negative bakteriel sepsis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Seman, B. G., Povroznik, J. M.,… More

Seman, B. G., Povroznik, J. M., Vance, J. K., Rawson, T. W., Robinson, C. M. A Neonatal Imaging Model of Gram-Negative Bacterial Sepsis. J. Vis. Exp. (162), e61609, doi:10.3791/61609 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter