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Immunology and Infection

ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरियल सेप्सिस का एक नवजात इमेजिंग मॉडल

Published: August 12, 2020 doi: 10.3791/61609
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 1, 1,2
1Department of Microbiology, Immunology, & Cell Biology, West Virginia University School of Medicine, 2Vaccine Development Center at West Virginia University Health Sciences Center
* These authors contributed equally

Summary

बायोल्यूमिनेसेंट ई. कोलाई O1: K1: H7 के साथ नवजात चूहों का संक्रमण महत्वपूर्ण फेफड़े की सूजन और फेफड़ों की विकृति के साथ एक सेप्टिक संक्रमण में परिणाम है। यहां, हम प्रणालीगत जीवाणु बोझ, भड़काऊ प्रोफाइलिंग, और फेफड़ों के हिस्टोपैथोलॉजी की गणना के साथ समानांतर में अनुदैर्ध्य इंट्राविटल इमेजिंग का उपयोग करके नवजात सेप्सिस को मॉडल और आगे अध्ययन करने के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन करते हैं।

Abstract

नवजातों को जीवन के पहले महीनों में प्रदर्शित अद्वितीय प्रतिरक्षा प्रोफ़ाइल के कारण बैक्टीरियल सेप्सिस का खतरा बढ़ जाता है। हमने ई. कोलाई O1:K1:H7 के रोगजननों का अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल स्थापित किया है, जो नवजात शिशुओं में उच्च मृत्यु दर के लिए जिम्मेदार एक सेरोटाइप है। हमारी विधि संक्रमण की प्रगति के दौरान विभिन्न समय बिंदुओं पर नवजात पिल्ले की इंट्राविटल इमेजिंग का उपयोग करती है। यह इमेजिंग, रक्त में बैक्टीरिया की माप, भड़काऊ प्रोफाइलिंग, और ऊतक हिस्टोपैथोलॉजी द्वारा समानांतर, सेप्सिस के दौरान संक्रमण गतिशीलता को समझने के लिए एक कठोर दृष्टिकोण का प्रतीक है। वर्तमान रिपोर्ट में, हम बैक्टीरियल बोझ और रोग की गंभीरता की तुलना के लिए दो संक्रामक inoculums मॉडल । हम पाते हैं कि उप-मध्य संक्रमण संक्रमण के बाद 10 घंटे तक प्रसारित संक्रमण होता है। 24 घंटे तक, ल्यूमिनेसेंट ई कोलाई का संक्रमण रक्त, फेफड़ों और अन्य परिधीय ऊतकों में प्रचुर मात्रा में था। फेफड़ों में भड़काऊ साइटोकिन्स की अभिव्यक्ति 24 घंटे में महत्वपूर्ण है, और इसके बाद सेलुलर घुसपैठ और ऊतक क्षति के सबूत होते हैं जो संक्रामक खुराक के साथ बढ़ जाता है। इंट्राविटल इमेजिंग की कुछ सीमाएं हैं। इसमें एक ल्यूमिनेसेंट सिग्नल सीमा और कुछ जटिलताएं शामिल हैं जो संज्ञाहरण के दौरान नवजात शिशुओं के साथ उत्पन्न हो सकती हैं। कुछ सीमाओं के बावजूद, हम पाते हैं कि हमारा संक्रमण मॉडल नवजात मुरीन सेप्सिस के दौरान देशांतर संक्रमण गतिशीलता को समझने के लिए एक अंतर्दृष्टि प्रदान करता है, जिसकी आज तक अच्छी तरह से जांच नहीं की गई है। हम उम्मीद करते हैं कि इस मॉडल को प्रारंभिक जीवन के दौरान अन्य महत्वपूर्ण जीवाणु संक्रमणों का अध्ययन करने के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है।

Introduction

बैक्टीरियल सेप्सिस उन नवजातों के लिए एक महत्वपूर्ण चिंता का विषय है जो जीवन के पहले दिनों में एक अद्वितीय प्रतिरक्षा प्रोफ़ाइल प्रदर्शित करते हैं जो संक्रमण से पर्याप्त सुरक्षा प्रदान नहीं करता है1. नवजात सेप्सिस एक महत्वपूर्ण अमेरिकी स्वास्थ्य देखभाल समस्या अकेले अमेरिका में सालाना ७५,००० से अधिक मामलों के लिए लेखांकन जारी है2। इन संक्रमणों का गहराई से अध्ययन करने के लिए, मानव रोग के पहलुओं को फिर से बदलने वाले उपन्यास पशु मॉडल की आवश्यकता होती है। हमने ईशेरिचिया कोलाई,O1:K1:H7 3 का उपयोग करके एक नवजात माउस संक्रमण मॉडलस्थापितकिया है। ई. कोलाई अमेरिका में नवजात सेप्सिस का दूसरा प्रमुख कारण है, लेकिन सेप्सिस से जुड़े मृत्यु दर4,5केबहुमतके लिए जिम्मेदार है। हालांकि, यह प्रमुख कारण है जब पूर्व अवधि और बहुत कम जन्म-वजन (VLBW) शिशुओं को स्वतंत्र रूप से 5 मानाजाताहै। के1 सीरोटाइप सबसे अधिक बार नवजात शिशुओं में इनवेसिव ब्लडस्ट्रीम संक्रमण और दिमागी बुखार से जुड़ा होता है6,7. वर्तमान में, एंटीबायोटिक दवाओं और सहायक देखभाल से परे कोई अन्य उपचार विकल्प नहीं हैं। इस बीच, एंटीबायोटिक प्रतिरोध की दरों में कई रोगजनक बैक्टीरिया के लिए वृद्धि जारी है, ई. कोलाई के कुछ उपभेदों के साथ आमतौर पर उपचार में इस्तेमाल एंटीबायोटिक दवाओं की एक भीड़ के लिए प्रतिरोधी8। इस प्रकार, यह जरूरी है कि हम सेप्सिस के तंत्र और नवजातों में मेजबान प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के तरीके उत्पन्न करना जारी रखें। इन परिणामों को वर्तमान उपचार और संक्रमण के परिणामों पर सुधार करने में मदद कर सकते हैं ।

नवजात शिशुओं की प्रतिरक्षा स्थिति वयस्कों की तुलना में फेनोटाइपिक और कार्यात्मक दोनों अंतरों की विशेषता है। उदाहरण के लिए, इंटरल्यूकिन (आईएल) -10 और आईएल-27 जैसे एंटी-भड़काऊ और नियामक साइटोकिन्स के ऊंचा स्तर को कॉर्ड रक्त-व्युत्पन्न मैक्रोफेज द्वारा उत्पादित दिखाया गया है और मुरीन नवजात शिशुओं के सीरम में अधिक स्तर पर मौजूद हैं9,10,11। यह आईएफएन-α, आईएफएन-ɣ, आईएल-12 और टीएनएफ-α के निचले स्तरों के अनुरूप है जो वयस्क समकक्षों की तुलना में अक्सर नवजात कोशिकाओं से रिपोर्ट किए जाते हैं10। इसके अतिरिक्त, नवजात प्रतिरक्षा प्रणाली12वयस्कों की तुलना में एक Th2 और नियामक टी सेल प्रतिक्रिया की ओर विषम है । नवजातों में न्यूट्रोफिल, टी कोशिकाओं, बी कोशिकाओं, एनके कोशिकाओं और मोनोसाइट्स की ऊंचा संख्या भी मौजूद है, लेकिन महत्वपूर्ण कार्यात्मक हानि के साथ। इसमें कोशिका सतह के मार्कर और एंटीजन प्रस्तुति की अभिव्यक्ति में दोष शामिल हैं जो अपरिपक्वता13,14,15को सुझाते हैं । इसके अतिरिक्त, नवजात न्यूट्रोफिल में रसायनीय कारकों में स्थानांतरित करने की उनकी क्षमता में काफी कमी होती है16. माइलॉयड-व्युत्पन्न दमन कोशिकाएं (एमडीएससी) भी नवजातों में ऊंचा स्तर पर पाई जाती हैं और हाल ही में आईएल-2711का स्रोत दिखाया गया है। एमडीएससी टी कोशिकाओं17की ओर अत्यधिक दमनकारी हैं । सामूहिक रूप से, ये डेटा नवजात प्रतिरक्षा में सीमाओं को प्रदर्शित करता है जो संक्रमण के प्रति संवेदनशीलता को बढ़ाता है।

नवजात सेप्सिस के दौरान बैक्टीरियल बोझ की प्रगति का अध्ययन करने और सुरक्षात्मक मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को विच्छेदन करने के लिए, हमने एक उपन्यास संक्रमण मॉडल विकसित किया है। जीवन के 3-4 दिनों में नवजात चूहों को इंट्रापेरिटोनियल स्पेस या पूंछ नस में इंजेक्ट करना मुश्किल होता है। हमारे मॉडल में, दिन 3 या 4 पिल्ले को बैक्टीरियल इनोकुलम या पीबीएस को स्कैपुलर क्षेत्र में चमड़े के साथ प्रशासित किया जाता है। एक प्रणालीगत संक्रमण विकसित होता है और ल्यूमिनेसेंट ई. कोलाई O1: K1:H7 का उपयोग कर, हम परिधीय ऊतकों में प्रसारित जीवाणु बोझ का पालन करने के लिए व्यक्तिगत नवजात चूहों की छवि कर सकते हैं। मुरीन नवजातों में सेप्सिस केदौरानबैक्टीरिया के प्रसार के काइनेटिक्स को समझने के लिए इंट्राविटल इमेजिंग का उपयोग करने वाला यह पहला मॉडल है ।

यहां, हम नवजात चूहों3में सेप्टिक ई. कोलाई संक्रमण को प्रेरित करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। हम इंजेक्शन के लिए बैक्टीरियल इनोकुलम कैसे तैयार करें, और पैथोलॉजी के मूल्यांकन के लिए ऊतकों को कैसे फसल करें, जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण द्वारा भड़काऊ मार्कर की माप, और बैक्टीरियल बोझ की गणना का वर्णन करते हैं। इसके अलावा संक्रमित नवजातों की इंट्राविटल इमेजिंग के लिए ल्यूमिनेसेंट ई कोलाई का इस्तेमाल और नवजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा बैक्टीरियल किलिंग की मात्रा का भी वर्णन किया गया है । नवजात शिशुओं में अन्य महत्वपूर्ण जीवाणु संक्रमणों का अध्ययन करने के लिए इन प्रोटोकॉलों को भी अनुकूलित किया जा सकता है। यहां प्रस्तुत डेटा एक अनुवाद योग्य नवजात सेप्सिस मॉडल में संक्रमण की गतिशीलता को समझने के लिए एक समग्र उपन्यास दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है ।

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Protocol

सभी प्रक्रियाओं को पश्चिम वर्जीनिया इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर एंड यूज कमेटियों द्वारा अनुमोदित किया गया था और राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद द्वारा प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड की सिफारिशों के अनुसार आयोजित कियागयाथा ।

1. बैक्टीरियल इनोकुलम की तैयारी

  1. लकीर एक Triptic सोया आगर (TSA) ई. कोलाई O1 के एक फ्रीजर स्टॉक से एक कॉलोनी के अलगाव के लिए एक inoculating पाश के साथ थाली: K1: H7-लक्स कि stably लूसिफ़ेरेस व्यक्त करता है और kanamycin प्रतिरोध 3 किया जाताहै । रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया।
  2. अगले दिन लुरिया शोरबा (एलबी) को बायोसेफ्टी कैबिनेट में कमरे के तापमान (25 डिग्री सेल्सियस) में आने की अनुमति देता है।
  3. एक जैवसेफ्टी कैबिनेट हुड के तहत, लकीर की प्लेट से एक ही कॉलोनी की पहचान करें और इसे एलबी के 3 एमएल में टीका लगाएं जो कानमाइसिन (30 माइक्रोग्राम/एमएल) के साथ पूरक है। मिलाते हुए (220 आरपीएम) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट। यह स्टार्टर कल्चर है।
  4. स्टार्टर संस्कृति 1:100 को एक जैवसेफ्टी कैबिनेट हुड के तहत एलबी के एक ताजा 3 एमसीएल में पतला करें और इसे मिलाते हुए (220 आरपीएम) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 2-3 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में वापस करें। यह स्टॉक कल्चर है।
  5. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके 600 एनएम पर ब्लैंक और स्टॉक कल्चर दोनों की ऑप्टिकल डेंसिटी (ओडी) पढ़ें। एक ९६ अच्छी तरह से फ्लैट नीचे परख प्लेट के एक अच्छी तरह से पौंड (कोई बैक्टीरिया युक्त) के १०० μL जोड़ें; यह खाली है। फिर स्टॉक कल्चर से 100 माइक्रोन को अलग कुआं में जोड़ें। दो अतिरिक्त प्रतिकृति के लिए दोहराएं। अवशोषण एक प्लेट रीडर का उपयोग कर पढ़ा जाता है।
  6. स्टॉक संस्कृति अवशोषण मूल्य (ओडी मूल्य) से खाली अवशोषण घटाना और संक्रामक खुराक की तैयारी के लिए स्टॉक संस्कृति में बैक्टीरियल घनत्व के सन्निकटन का निर्धारण करने के लिए पहले से उत्पन्न और मान्य विकास वक्र की तुलना करें।
  7. शोध प्रश्न के आधार पर लक्ष्य इनोकुलम उत्पन्न करें। इस अध्ययन के लिए 2 x 106 (कम) और 7 x 106 (उच्च) कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) प्रति माउस (/माउस) के लक्ष्य इनोकुलम का उपयोग किया गया था ।
    1. स्टॉक ट्यूब (वीएस)से आवश्यक बैक्टीरिया की मात्रा प्राप्त करने के लिए स्टॉक संस्कृति (स्टॉक) में बैक्टीरिया की अनुमानित एकाग्रता द्वारा प्रति माउस (खुराकटी)लक्ष्य खुराक को विभाजित करें।
    2. चूहों (एनएम)की संख्या से वीएस गुणा करें जिन्हें संक्रमण के साथ-साथ 5-10 अतिरिक्त खुराक के लिए आवश्यक बैक्टीरिया की कुल मात्रा के लिए 5-10 एक्स्ट्रा कलाकार के लिए पर्याप्त के साथ संक्रमित होने की आवश्यकता होती है। इस वॉल्यूम को स्टॉक ट्यूब से निकाल कर एक नई सेंट्रलाइज ट्यूब में डालें।
    3. नीचे दिए गए समीकरण का उपयोग करें:
      डोजटी/स्टॉक= वीएस एक्स एनएम = स्टॉक ट्यूब से निकाले जाने वाले बैक्टीरिया की कुल मात्रा (वीटी)।
  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 2,000 x ग्राम पर बैक्टीरिया को सेंट्रलाइज करें और संक्रमित होने वाले माउस प्रति माउस (पीएच 7.2-7.6) के 50 माइक्रोन में बैक्टीरियल गोली को फिर से खर्च करें (उदाहरण के लिए, प्रत्येक खुराक में 2 x 10 6 बैक्टीरिया की10 खुराक के लिए, 2 x 107 बैक्टीरिया के गोली को 500 माइक्रोल पीबीएस में फिर से निलंबित किया जाएगा।) फिर, आवश्यकता से अधिक इनोकुलम तैयार करने की सिफारिश की जाती है। केवल नियंत्रण टीका के लिए पीबीएस की बराबर मात्रा तैयार करें। संक्रमण तक बर्फ पर संक्रामक इनोकुलम और पीबीएस नियंत्रण बनाए रखें।
  2. एक ९६ अच्छी तरह से प्लास्टिक के नीचे कमजोर पड़ने की थाली में PBS में सात दस गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने प्रदर्शन, और मंदक TSA प्लेटों पर डुप्लिकेट में कमजोर पड़ने की थाली 25 μL kanamycin (30 μg/mL) के साथ पूरक बैक्टीरिया की वास्तविक मात्रा की गणना करने के लिए प्रशासित । गणना से पहले कॉलोनी गठन के लिए रात 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।

2. पशु पहचान

  1. पर्याप्त संख्या में प्रजनन जोड़े की व्यवस्था करें जैसे कि उम्र से मेल खाने वाले पिल्ले के लिए कूड़े को सिंक्रोनाइज्ड किया जा सकता है। 1 दिन ± की आयु परिवर्तनशीलता स्वीकार्य है।
  2. एक गर्भवती C57BL/6 महिला माउस की पहचान करें और सही उम्र निर्धारित करने के लिए नियोजित प्रयोग के अग्रिम में कूड़े के जन्म के लिए निगरानी करें ।
  3. नियंत्रण और संक्रमित 3-या 4 दिन पुराने पिल्ले के बीच अंतर करने के लिए, केवल नियंत्रण पिल्ले की पूंछ के सिरों को स्निप करने के लिए छोटे, ठीक-इत्तला, आईरिस कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करें। संक्रमित पिल्ले पूंछ स्निप्स प्राप्त नहीं करते हैं। पूंछ काटने से पहले, 70% इथेनॉल में एक कपास की गेंद के साथ त्वचा को कीटाणुरहित करें। जरूरत के अनुसार कपास की गेंद या धुंध के साथ पूंछ के अंत में दबाव लागू करें।
    नोट: यह प्रक्रिया जैवसेफ्टी कैबिनेट हुड के तहत की जाती है। एक इंच के लगभग 1/8 की पूंछ स्निप पर्याप्त है।
  4. नियंत्रण और संक्रमित समूहों के भीतर पिल्ले की पहचान करने के लिए, पिल्ले की पूंछ टैटू के लिए एक 28 जी x 1/2 ' स्थाई सुई के साथ एक 1 मिलीएल इंसुलिन सिरिंज का उपयोग करें । गोदना से पहले, 70% इथेनॉल में एक कपास की गेंद के साथ त्वचा को कीटाणुरहित करें। यह प्रक्रिया जैवसेफ्टी कैबिनेट हुड के तहत की जाती है।
  5. पूंछ टैटू के लिए, सुई की नोक पर पशु टैटू स्याही लागू होते हैं। इसके बाद, ध्यान से एक हाथ से पिल्ला को नियंत्रित करें, उनकी पूंछ पूरी तरह से उजागर हो। धीरे-धीरे त्वचा के नीचे सुई डालें, जबकि गहराई के सतही स्तर को बनाए रखते हुए, और सुई को त्वचा के साथ कुछ मिलीमीटर तक स्थानांतरित करें जब तक कि एक छोटा अंकन, या डॉट बनाया गया हो। त्वचा के नीचे से अतिरिक्त स्याही से बचने के लिए, त्वचा के नीचे से सुई को धीरे-धीरे हटाने से पहले कुछ सेकंड प्रतीक्षा करें।
  6. जरूरत के अनुसार कपास की गेंद या धुंध के साथ घाव पर दबाव लागू करें। 70% इथेनॉल के साथ त्वचा की सतह पर अतिरिक्त टैटू स्याही निकालें।
  7. संक्रमित और नियंत्रण समूहों में बाद के चूहों के साथ इस प्रक्रिया को दोहराएं, जबकि प्रत्येक लगातार पिल्ला टैटू के साथ एक अतिरिक्त डॉट जोड़ते हैं (उदाहरण के लिए, पिल्ला 1 में उनकी पूंछ पर 1 डॉट होगा, पिल्ला 2 में उनकी पूंछ पर दो डॉट होंगे, आदि)।
    नोट: पहचान की एक अतिरिक्त परत के लिए, नियंत्रण और संक्रमित समूहों के लिए पशु टैटू स्याही के अलग रंगों का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।

3. उप-capular टीका

नोट: इस अध्ययन के लिए, प्रत्येक प्रयोग के लिए नामित कम खुराक और उच्च खुराक समूह के साथ 2 प्रयोग किए गए थे। पहले प्रयोग में, 7 पिल्ले को कम खुराक इनोकुलम दिया गया था (4 पिल्ले नियंत्रण के रूप में उपयोग किए जाते थे), और एक अलग कूड़े से 5 पिल्ले उच्च खुराक दिए गए थे (3 पिल्ले नियंत्रण के रूप में उपयोग किए जाते थे)। प्रयोग 1 से पिल्ले केवल 24 घंटे के समय बिंदु के लिए डेटा प्रदान की है । दूसरे प्रयोग में, 8 पिल्ले को कम खुराक इनोकुलम दिया गया था (2 पिल्ले को नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था), और 6 पिल्ले को उच्च खुराक इनोकुलम दिया गया था (2 पिल्ले नियंत्रण के रूप में उपयोग किए गए थे)। प्रयोग 2 से पिल्ले 0, 10, और 24 घंटे के समय बिंदुओं के लिए डेटा प्रदान की है ।

  1. आयु मैच पिल्ले 1 दिन ≤। प्रत्येक कूड़े को कम खुराक या उच्च खुराक कूड़े के रूप में असाइन करें। कूड़े के भीतर बेतरतीब ढंग से एक नियंत्रण या संक्रमित पिल्ला के रूप में पिल्ले आवंटित।
  2. दिन 3 या 4 प्रसवोत्तर पर, ई. कोलाई-लक्स या पीबीएस नियंत्रण के साथ टीका लगाने से पहले सभी पिल्ले के रिकॉर्ड वजन । इस समय के दौरान पिल्ले से बांध को अलग करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि संक्रमण के दौरान उन्हें स्थानांतरित नहीं किया जाता है।
  3. इंसुलिन सुई का उपयोग करके जैवसेफ्टी कैबिनेट के भीतर, पीबीएस या ई कोलाई-लक्स इनोकुलम को या तो एस्पिरेट करें। इस काम के लिए प्रति माउस 2 x 10 6 और7 x 106 सीएफयू के इनोकुलम्स का इस्तेमाल किया गया। सब्सकैपुलर इंजेक्शन के माध्यम से प्रशासन तक बर्फ पर दोनों संक्रामक इनोकुलम और पीबीएस रखें।
  4. बायोसेफ्टी कैबिनेट हुड में एक साफ सतह पर नवजात रखें और गर्दन के नैप पर त्वचा को उठाएं जैसे कि पिल्ला को स्क्रफ करना।
  5. अब जानवर की त्वचा और मांसपेशियों के बीच बनाई गई जगह में, सुई डालें, त्वचा के ठीक नीचे बेवेल करें और पीबीएस या ई कोलाई-लक्सके 50 माइक्रोन इंजेक्ट करें। इसके साथ ही इंजेक्शन बैकफ्लो को रोकने के लिए त्वचा के चुटकी वाले हिस्से को जारी करें।
  6. धीरे-धीरे और देखभाल के साथ सुई निकालें। इंजेक्शन समाप्त होने के बाद पिल्ले को बांधों के साथ वापस रखें।
    नोट: विकास में उनके शारीरिक चरण के कारण, 3-4 दिन में नवजात पिल्ले को पूंछ नस या इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन प्रशासन करना तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है। इस प्रकार, निष्पादन में आसानी के कारण इस अध्ययन के लिए उप-capुलर संक्रमण मार्ग चुना गया था।

4. रोग और अंत बिंदु मानदंडों का मूल्यांकन

  1. संक्रमण की अवधि के दौरान रोजाना दो बार पिल्ले की निगरानी करें। दिखने में किसी भी असामान्यताएं ध्यान दें।
  2. रुग्णता के उद्देश्य माप के रूप में रिकॉर्ड वजन।
  3. वजन में बदलाव के अलावा, पृष्ठीय पक्ष पर नवजात को स्थिति बनाकर पिल्ले की क्षमता को सही करने के लिए खुद को परीक्षण करें। बीमार जानवर वेंट्रल साइड और पैरों पर चालू करने में असमर्थ होंगे या कठिनाई के साथ इस कार्रवाई को पूरा करेंगे।
  4. एंडपॉइंट मानदंडों के करीब जानवरों को चिह्नित करने के लिए निम्नलिखित की जांच करें: सामान्य शरीर के वजन का 85% से कम; आंदोलन में कमी आई और खुद को सही करने में असमर्थता; त्वचा का मलिनकिरण और गुलाबी के विपरीत अधिक ग्रे या पारदर्शी उपस्थिति; स्पर्श करने के लिए शांत महसूस करना, शरीर के तापमान में कमी और पक्षों के साथ रक्तस्रावी चोट का संकेत, अग्रिम बीमारी का भी संकेत है।
    नोट: यदि नवजात दो दिनों में वजन बढ़ाने में विफल रहे हैं और चरण 4.4 में किसी भी विवरण को फिट करते हैं, तो वे एंडपॉइंट मानदंडों को पूरा कर चुके हैं। उच्च खुराक प्राप्त करने वाले पिल्ले अक्सर 24 घंटे तक एंडपॉइंट मानदंडों को पूरा करते हैं। नियंत्रण और प्रयोगात्मक समूहों के बीच तुलनात्मक विश्लेषण के लिए अनुमति देने के लिए कम और उच्च खुराक कूड़े के भीतर नियंत्रण पिल्ले को एक ही समय में इच्छामृत्यु दी जाएगी। नीचे इच्छामृत्यु अनुभाग के लिए आगे बढ़ें ।

5. बैक्टीरियल बोझ के वीवो इमेजिंग में

  1. इमेजिंग और बाद के विश्लेषण के लिए माइक्रोसीटी इमेजर और सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।
    नोट: पिल्ला त्वचा का रंग इमेजिंग गुणवत्ता को प्रभावित नहीं करता है।
  2. ई. कोलाई-लक्स-संक्रमितनवजात चूहों और बांध के साथ पिंजरे को बीएसएल-2 स्तर के लैमिनार प्रवाह हुड में रखें। चूहों को चित्रित करने के लिए निकालें, और हुड के भीतर एक पारदर्शी आइसोफ्लुन कक्ष में रखें। इसकी आवश्यकता आइसोफ्लारेन की मात्रा को मापने के लिए असंक्रमित नियंत्रणों से शुरू करने की सिफारिश की जाती है।
  3. माइक्रोसीटी से जुड़े कंप्यूटर पर सॉफ्टवेयर खोलें। सिस्टम को शुरू करें और सीसीडी तापमान -90 डिग्री सेल्सियस पर लॉक होने का इंतजार करें।
  4. आइसोफ्लुएंज वाष्पीकरण को चालू करें और डायल को 5% आइसोफ्लारेन प्रवाह में समायोजित करें। चूहों को 20-30 एस के लिए इस आइसोफ्लुन मिश्रण के साथ कक्ष में रखें जब तक कि वे आगे बढ़ना बंद न कर दें; कुछ चूहों के लिए लंबे या छोटे संज्ञाहरण जोखिम समय की आवश्यकता हो सकती है। एक बार चूहों को आगे बढ़ने से रोक दें, वे पर्याप्त रूप से एनेस्थेटाइज्ड होते हैं, और इमेज किए जा सकते हैं।
  5. चूहों को माइक्रोसीटी इमेजिंग कक्ष में ले जाएं और उन्हें प्रवण स्थिति में इमेजिंग बॉक्स पर रखें, नाक शंकु के लंबवत का सामना कर रही नाक के साथ। किसी भी आंदोलन को सीमित करने के लिए इमेजिंग बॉक्स पर पैरों को धीरे से नियंत्रित करने के लिए दंत मोम का उपयोग करें। एक बार में 4 नवजात चूहों को इमेज किया जा सकता है।
  6. इमेजिंग के दौरान चूहों को एनेस्थेटाइज्ड रखने के लिए आइसोफ्लुएंजर वाष्पीकरण को 2-4% प्रवाह तक नीचे करें। माइक्रोसीटी इमेजिंग चैंबर का दरवाजा बंद करें। कुछ सेकंड बाद चूहों पर जांच करें। यदि वे स्थानांतरित करना शुरू करते हैं, तो आइसोफ्लाणे में एक कपास की गेंद को खंगालें और इसे एनेस्थेटाइज करने के लिए 5 सेकंड तक चलने वाले जानवर की नाक पर पकड़ें। इमेजिंग के दौरान कॉटन बॉल को जानवरों के पास रखें। चूहों को एनेस्थेटाइज और समाप्त करने के लिए सावधान रहें।
  7. सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, इमेजिंग के लिए ल्यूमिनेसेंट विकल्प चुनें। ब्लॉक करने के लिए एक एक्सटिटेशन फिल्टर सेट का उपयोग करें और उत्सर्जन फिल्टर खोलनेके लिए सेट, 500 एनएम, 520 एनएम, 560 एनएम, 580 एनएम, 600 एनएम, और 620 एनएम। ल्यूमिनेसेंस के लिए सात कुल उत्सर्जन फिल्टर सेट होंगे ।
  8. हर समय बिंदु पर चूहों छवि (0, 10, और 24 घंटे के बाद संक्रमण [hpi]) और हर समय बिंदु के लिए एक फ़ोल्डर के लिए सभी छवियों को बचाने के लिए । पिल्ले को बांध के साथ पिंजरे में लौटाएं और जांच करें कि सभी पिल्ले संज्ञाहरण से बरामद हुए हैं।
  9. 2D छवियों का विश्लेषण करने के लिए, सॉफ्टवेयर में छवियों को खोलें। चमक (फोटॉन)के लिए इकाइयों को बदलें; यह कुल प्रवाह (फोटॉन/सेकंड)में बदल जाएगा ।
  10. केवल एक समय में अपने कई उत्सर्जन फिल्टर के साथ सेट एक छवि का विश्लेषण करें। प्रत्येक छवि सेट से, प्रत्येक छवि के नीचे दाएं कोने में स्थित न्यूनतम और अधिकतम चमक मानों पर ध्यान दें (उदाहरण के लिए, यदि 7 उत्सर्जन फ़िल्टर हैं, तो 7 छवियां होंगी, और 7 न्यूनतम और अधिकतम मूल्य)। प्रत्येक छवि सेट के लिए दोहराएं जिसकी तुलना की जानी है।
  11. एक पैमाने का निर्धारण करने के लिए जो सभी छवियों के लिए मूल्यों और ल्यूमिनेसेंस को शामिल करेगा, सबसे कम न्यूनतम मूल्य और प्रत्येक छवि सेट के लिए उच्चतम अधिकतम मूल्य का पता लगाएगा। इस अध्ययन के लिए, ओपन फिल्टर छवियों को प्रतिनिधि के रूप में इस्तेमाल किया गया था।
    1. हाइलाइट करें और पैमाने को बदलने के लिए पसंद की छवि खोलें। टूल पैलेटपर, इमेज एडजस्ट टैब पर क्लिक करें और कलर स्केल को पहले से पहचाने गए सबसे कम न्यूनतम और उच्चतम अधिकतम मानों में बदल दें। झगड़ा के रूप में सेट प्रत्येक छवि को सहेजें। सही पैमाने को प्रदर्शित करने के लिए व्यक्तिगत रूप से इस तरीके से हर बार बिंदु का विश्लेषण करें।
  12. प्रत्येक व्यक्ति माउस के लिए कुल प्रवाह (प्रति माउस ल्यूमिनेसेंट सिग्नल की मात्रा) की मात्रा निर्धारित करने के लिए, एक छवि खोलें जैसा कि पहले चरण 5.9-5.10 में वर्णित है। टूल पैलेट पर आरओआई टूल टैब खोलें और सर्कल टूल का चयन करें। यदि ल्यूमिनेसेंस के एक क्षेत्र का विश्लेषण करते हैं तो 1 सर्कल चुनें।
  13. ल्यूमिनेसेंस के क्षेत्र पर आरओआई को ओवरले में ले जाएं। यदि आवश्यक हो तो आरओआई के आकार को समायोजित करें।
    नोट: यदि समायोजन आवश्यक है, तो निरंतरता बनाए रखने के लिए तुलनात्मक रूप से अन्य छवियों में आरओआई को समायोजित करें। उपाय आरओआईचुनें। आरओआई मापन खिड़की टोटल फ्लक्स (पी/एस), औसत फ्लक्स (पी/सेमी 2/एसआर), रेडिएशन का मानक विचलन, न्यूनतम चमक और अधिकतम चमकप्रदर्शित करेगी ।
  14. प्रत्येक छवि सेट के लिए कुल प्रवाह माप रिकॉर्ड करें। यह संख्या 2D छवियों में माउस में ल्यूमिनेसेंस की मात्रा निर्धारित राशि है।
  15. 3डी खंगाला माइक्रोसीटी इमेज बनाने के लिए टूल पैलेट पर डीलिट 3डी रिकंस्ट्रक्शन पैनल खोलें और एनालिसिस टैब के तहत शामिल होने वाले सभी तरंगदैर्ध्य की जांच करें। पुनर्निर्माणका चयन करें।

6. इच्छामृत्यु

  1. नेक्रॉप्सी और उपयुक्त डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए ब्याज के ऊतकों/अंगों के लिए ट्यूब तैयार और लेबल करें।
  2. नवजातों को बायोसेफ्टी कैबिनेट में बांध से अलग करें ।
  3. पशु चिकित्सा ग्रेड आइसोफ्लुरेन में एक कपास की गेंद को भिगोएं और एक पारदर्शी रोकथाम कक्ष के अंदर रखें।
  4. यदि रक्त एकत्र कर रहे हैं, तो एक टिप के साथ एक P200 माइक्रोपिपेट तैयार करें और एंटीकोगुलैंट के रूप में 5 एमएम ईडीटीए के 10 माइक्रोन के साथ 1.5 एमएल ट्यूब लें। रक्त की 50-200 माइक्रोन की मात्रा की उम्मीद है।
  5. एक नवजात को कक्ष में रखें और पिल्ला की निगरानी करें जब तक कि यह स्थिर न हो जाए।
  6. जल्दी से नवजात को निकालें और कैंची से डेपुटेशन करें। यदि लंबे समय तक ताजी हवा में सांस लेने की अनुमति दी जाती है, तो पिल्ला चेतना हासिल कर सकता है। नवजात शिशुओं ने वयस्क चूहों के सापेक्ष फेफड़ों की क्षमता को कम कर दिया है, और इसलिए, अकेले आइसोफ्लुने द्वारा इच्छामृत्यु के लिए पर्याप्त गहरी सांस नहीं लेते हैं।
  7. एक P200 माइक्रोपिपेट का उपयोग कर सिर के आधार पर ट्रंक से रक्त ले लीजिए। एकत्र किए गए रक्त की मात्रा को अधिकतम करने के लिए, इस चरण को जितनी जल्दी हो सके डेपुटेशन के बाद करें। धारावाहिक कमजोर पड़ने और मानक प्लेट गिनती के रूप में कदम १.९ में वर्णित द्वारा रक्त में बैक्टीरिया की गणना ।
  8. ऊतक के नमूनों के उत्तेजन से पहले 70% इथेनॉल के साथ पूरे नवजात को स्टरलाइज करें।

7. ऊतक फसल

  1. एक जैव बचाव कैबिनेट के भीतर, संदूषण को रोकने के लिए 70% इथेनॉल के साथ नवजात को बुझाना। जानवर को उसके दाईं ओर रखना।
  2. संदंश का उपयोग करना, पेट और पीछे बाएं पैर के बीच एक बिंदु पर त्वचा को समझें और ठीक इत्तला दी सर्जिकल कैंची के साथ एक चीरा करें। त्वचा को पीठ की ओर ऊपर की ओर ले जाते हुए दूर काटते रहें। जब तक पूरी तिल्ली उजागर नहीं हो जाती तब तक प्रगति करें।
  3. प्लीहा को समझने और इसे पेट से हटाने के लिए संदंश का उपयोग करें, कनेक्टिव ऊतक को डिस्कनेक्ट करने के लिए कैंची का उपयोग करें। इसके डाउनस्ट्रीम आवेदन के लिए उपयुक्त समाधान में तिल्ली रखें।
  4. फेफड़ों को प्राप्त करने के लिए, छाती की त्वचा को पूरी तरह से छील लें।
  5. लंबवत आयोजित कैंची के साथ उरोस्थि के आधार पर प्रवेश, रिब पिंजरे विभाजित है जब तक ऊपर की ओर कटौती।
  6. दाएं और बाएं फेफड़ों को व्यक्तिगत रूप से समझने और उन्हें वक्ष गुहा से हटाने के लिए संदंश का उपयोग करें। कैंची से काटकर फेफड़ों के टिश्यू से दिल निकालें।
  7. फेफड़ों को इसके डाउनस्ट्रीम एप्लिकेशन के लिए उपयुक्त समाधान में रखें। आरएनए अलगाव के लिए, ग्वानाइनाइन थिओसाइनेट/फिनोल (जीटीसीपी) के ५०० माइक्रोन का उपयोग करें । हिस्टोपैथोलॉजी के लिए, 10% तटस्थ-बफर फॉर्मेलिन के 5 एमएल का उपयोग करें।

8. जीन अभिव्यक्ति के लिए फेफड़ों के ऊतकों से आरएनए अलगाव

  1. माइक्रोसेंट्रफ्यूज को 4 डिग्री सेल्सियस तक प्री-कूल करें।
  2. कैंची के साथ जीटीसीपी में फेफड़ों के ऊतकों कीमा। इसके बाद, बैटरी चालित होमोजेनाइजर के साथ ऊतक को समरूप करें। तब तक जारी रखें जब तक कि समाधान यथासंभव एक समान न हो जाए। 3-5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।
  3. फ़िल्टर किए गए पिपेट टिप्स का उपयोग करके, क्लोरोफॉर्म के 100 माइक्रोल जोड़ें। 15 एस के लिए ट्यूब उलटा और कमरे के तापमान पर 3-5 मिनट इनक्यूबेट ।
  4. 12,000 x ग्रामपर 15 मिनट के लिए सेंट्रलाइज।
  5. स्पिन के दौरान, 70% इथेनॉल के 500 माइक्रोन के साथ 1.5 एमएल ट्यूब तैयार करें। आरएनए आइसोलेशन किट से कॉलम और कलेक्शन ट्यूब को इकट्ठा करें और लेबल करें।
  6. अपकेंद्री के दौरान बनने वाली इंटरफेज परत को परेशान किए बिना शीर्ष, जलीय परत को ध्यान से हटा दें। जलीय परत को 70% इथेनॉल वाली ट्यूबों में रखें।
  7. संग्रह ट्यूब में कॉलम में इथेनॉल और lysate मिश्रण ले जाएँ।
  8. इस बिंदु से, आरएनए के अंतिम समापन तक आरएनए आइसोलेशन किट वाणिज्यिक उत्पाद प्रोटोकॉल का पालन करें।
  9. शुद्धता और मात्रा के लिए आरएनए का विश्लेषण करें। आगे का उपयोग होने तक तुरंत उपयोग करें या -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

9. सीडीएनए संश्लेषण

  1. लेबल पीसीआर ट्यूब और अलग सेट।
  2. प्रत्येक नमूने के लिए सीडीएनए प्रतिक्रिया मिश्रण में आरएनए का 1 माइक्रोग्राम जोड़ें।
  3. सीडीएनए प्रोटोकॉल में वर्णित पीसीआर ट्यूब में रिएजेंट्स और टेम्पलेट जोड़ें। पिछले मिश्रण में एंजाइम जोड़ें।
  4. निम्नलिखित रन सेटिंग्स के साथ एक थर्मोसाइकिलर में पीसीआर ट्यूब रखें: 25 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट, 42 डिग्री सेल्सियस पर 40 मिनट, 85 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस अंतिम पकड़।
  5. थर्मोसाइकिलर से पीसीआर ट्यूब निकालें और तुरंत उपयोग करें या आगे के उपयोग तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

10. वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर (क्यूपीसीआर) चक्र

  1. प्रत्येक जीन का विश्लेषण करने के लिए एक प्रतिक्रिया मिश्रण कॉकटेल तैयार करें। प्रत्येक 15 माइक्रोन पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए 2x रीएजेंट मिक्स के 7.5 माइक्रोन, 20X 5'-एफएएम-लेबल वाले जीन-विशिष्ट प्राइमर/प्रोब के 0.75 माइक्रोन और नाभिक मुक्त पानी के 3.75 माइक्रोन की आवश्यकता होती है। एम्प्लिकॉन आमतौर पर 60-120 बीपी से होते हैं।
  2. उपयुक्त कुओं में प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह के लिए सीडीएनए टेम्पलेट के 3 माइक्रोन जोड़ें।
  3. उपयुक्त कुओं में जीन-विशिष्ट प्रतिक्रिया मिश्रण कॉकटेल के 12 माइक्रोन जोड़ें।
  4. कुओं में बनने वाले किसी भी बुलबुले को हटाने के लिए 1,000 x ग्राम पर 1 मिनट के लिए ऑप्टिकल चिपकने वाली फिल्म और अपकेंद्रित्र के साथ प्लेट को कवर करें।
  5. पीसीआर प्लेट को रियल टाइम पीसीआर थर्मोसाइकिलर में रखें।
  6. रन विधि को इस प्रकार निर्धारित करें: 95 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट, 15 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 40 चक्र और 1 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस के बाद।
  7. एक आंतरिक नियंत्रण के लिए ब्याज के जीन को सामान्य बनाने और 2-ΤCt फार्मूला और संख्या के एक लॉग2 परिवर्तन का उपयोग कर असंक्रमित नियंत्रण नमूनों के सापेक्ष संक्रमित नमूनों से डेटा व्यक्त करके डेटा का विश्लेषण करें ।

11. फेफड़ों के हिस्टोपैथोलॉजी

  1. ऊपर वर्णित नवजात पिल्ला से फेफड़ों को हटा दें।
  2. ऊतक को 10% तटस्थ-बफर फॉर्मेलिन की मात्रा में रखें ताकि ऊतक के समाधान का अनुपात 3-7 दिनों के लिए लगभग 20:1 हो।
  3. पैराफिन एम्बेडिंग, सेक्शनिंग, और हेमटॉक्सीलिन और ियोसिन (एच एंड ई) धुंधला करने के लिए एक उपयुक्त हिस्टोलॉजी सेवा के साथ समन्वय करें। इस काम के लिए वेस्ट वर्जीनिया यूनिवर्सिटी हिस्टोपैथोलॉजी कोर का इस्तेमाल किया गया। वैकल्पिक रूप से, पहले वर्णित प्रोटोकॉल19का पालन करें ।

12. इन विट्रो बैक्टीरियल हत्या परख

  1. ऊपर वर्णित असंक्रमित नवजात पिल्ला से तिल्ली निकालें और इसे बाँझ 60 मिमी पेट्री डिश के भीतर 40 माइक्रोन नायलॉन बास्केट में रखें। इसे दोहराएं और पूल तिल्ली को एक ट्यूब में काटा और एक साथ समरूप बनाया जाए।
  2. 10% एफबीएस के साथ पूरक पीबीएस के 5 मिलीएल जोड़ें।
  3. एक एकल सेल निलंबन बनाने तक बाँझ 3 एमएल सिरिंज प्लंजर का उपयोग करके ऊतक को अलग करें।
  4. नायलॉन बास्केट के बाहर एकल-सेल निलंबन ले लीजिए, 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें, और 5 मिनट के लिए 350 x ग्राम पर पैलेट सेल।
  5. लाल रक्त कोशिका लाइसिस बफर (7-8 तिल्ली तक के लिए 2 एमएल) में कोशिकाओं को निलंबित करें और एरिथ्रोसाइट्स को खत्म करने के लिए इसे कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए खड़े होने दें।
  6. ऊपर की तरह पीबीएस और पैलेट के साथ स्प्लेनोसाइट्स धोएं।
  7. अपेक्षित सेल यील्ड के अनुसार 0.5% बीएसए और 2 एमएम ईडीटीए के साथ पूरक पीबीएस के 0.25 मिलीलन में स्प्लेनोसाइट्स को निलंबित करें।
  8. हीमोसाइटोमीटर या अन्य उपयुक्त अनुप्रयोग का उपयोग करके स्प्लेनोसाइट्स की गणना करें।
  9. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार इम्यूनोमैग्नेटिक मोतियों के साथ Ly6B.2+ (ग्रेनुलोसाइट्स/भड़काऊ मोनोसाइट्स की माइलॉयड आबादी) कोशिकाओं को अलग करें।
  10. सीड Ly6B.2+ कोशिकाओं को एक काले या सफेद 96-अच्छी तरह से प्लेट में 1 x 105 कोशिकाओं के घनत्व पर डीएमईएम के 0.1 मिलील की मात्रा में जिसमें 10% एफबीएस, 2 एमएम ग्लूटामाइन और 25 एमएम एचईपी (पूर्ण माध्यम) शामिल हैं।
  11. धारा 1 में वर्णित बायोल्यूमिनेसेंट ई कोलाई की गणना करें और 0.1 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा में संक्रमण की वांछित बहुलता (एमओआई) पर बैक्टीरियल इनोकुलम तैयार करें। यह सबसे अच्छा बैच में एक आम एमओआई में सभी कुओं के लिए आवश्यक है बनाने के द्वारा किया जाता है ।
  12. एक नियंत्रण के रूप में अकेले बैक्टीरियल इनोकुलम या पूर्ण माध्यम के 0.1 मिलील जोड़ें। मल्टी वेल प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 को1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  13. मीडिया को 0.2 एमएल ताजा पूर्ण मीडिया के साथ बदलें जिसमें एक पिपेट के साथ मीडिया को धीरे से हटाकर और एक नए पिपेट टिप के साथ ताजा मीडिया जोड़कर जेंटामिसिन (100 μg/l) शामिल है। संस्कृति को एक अतिरिक्त 2 घंटे के लिए इनक्यूबेशन पर लौटें।
  14. 3 घंटे के बाद संक्रमण पर, एक प्लेट रीडर का उपयोग कर नीचे से lidded संस्कृति प्लेट के प्रत्येक कुएं में चिकनाई उपाय और फिर इनक्यूबेशन करने के लिए संस्कृति वापस ।
  15. अन्य वांछित समय बिंदुओं पर ल्यूमिनेसेंस के माप दोहराएं।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल ने नवजात चूहों में बैक्टीरियल सेप्सिस को प्रेरित किया, और हमने रोग के पाठ्यक्रम का अध्ययन करने के लिए देशांतर इंट्राविटल इमेजिंग, रक्त में बैक्टीरिया की गणना, पैथोलॉजी के हिस्टोलॉजिकल आकलन और भड़काऊ साइटोकिन अभिव्यक्ति प्रोफाइल का उपयोग किया। समय के साथ ई.कोलाई के उच्च (~ 7 x 106 सीएफयू) दोनों से संक्रमित नवजात पिल्ले में रुग्णता के लक्षण देखे गए। पिल्ले कि अधिक से अधिक inoculum प्राप्त संकट के अधिक प्रमुख संकेत है कि कम गतिशीलता, उनकी मुद्रा को सही करने में असमर्थता, और बिगड़ा 24 घंटे के बाद संक्रमण (hpi) द्वारा एक ईमानदार स्थिति को बनाए रखने की क्षमता शामिल प्रदर्शित । हालांकि, कुछ पिल्ले दूसरों की तुलना में बदतर दिखाई देने के रूप में रुग्णता की एक श्रृंखला थी । संक्रमण के तुरंत बाद, बेसलाइन स्थापित करने के लिए इमेजिंग सत्र के दौरान आइसोफलुरेन एक्सपोजर के कारण एक कम खुराक वाले जानवर की मृत्यु हो गई। 24 एचपीआई तक, छह उच्च खुराक वाले दो जानवर प्रणालीगत संक्रमण (33.3% मृत्यु दर) का शिकार हो गए। संक्रमित पिल्ले जो या तो उच्च या कम खुराक वाले इनोकुलम प्राप्त करते थे, उनका वजन 24 एचपीआई(चित्रा 1ए, बी)पर उनके नियंत्रण लिटरमेट्स से काफी कम था। उच्च इनोकुलम प्राप्त करने वाले सभी पिल्ले 24 एचपीआई पर एंडपॉइंट मानदंडों को पूरा करते हैं। जैसे, इस समूह में सभी संक्रमित पिल्ले इमेजिंग के बाद इच्छामृत्यु थे । रक्त में बैक्टीरिया चूहों के एक सबसेट के लिए गणना की गई थी जो कम इनोकुलम प्राप्त करते थे, और उन सभी जानवरों के लिए जो उच्च इनोकुलम प्राप्त करते थे क्योंकि वे सभी इच्छामृत्यु थे। इसी तरह किए गए दो प्रयोगों के परिणामों से पता चलता है कि जहां अधिकांश जानवरों में 24 एचपीआई में रक्त (सीएफयू/एमएल) में बैक्टीरिया का उच्च स्तर था, वहीं कुछ जानवरों के रक्त में पता लगाने योग्य बैक्टीरिया(चित्रा 1C)नहीं था । बाद का सुझाव है कि वे इस समय बिंदु से संक्रमण को मंजूरी दे दी । जैसा कि अपेक्षा थी, पिल्ले कि उच्च इनोकुलम प्राप्त करने के लिए पिल्ले के सापेक्ष 24 एचपीआई पर परिमाण अधिक CFUs/एमएल के लगभग तीन आदेश थे जो कम खुराक इनोकुलम(चित्रा 1C) प्राप्त करते थे।

ल्यूमिनेसेंट बैक्टीरिया की लाइव एनिमल इमेजिंग ने बैक्टीरिया के प्रसार और 10 और 24 एचपीआई(चित्रा 2 और चित्रा 3)में समय के साथ नवजात पिल्ले में वृद्धि की पुष्टि की । इसके अतिरिक्त, माइक्रोसीटी के साथ इंट्राविटल इमेजिंग का उपयोग करके, हम मस्तिष्क(चित्रा 2 बी), फेफड़े (चित्रा 2बी, चित्र 3ए, बी)और अन्य परिधीय ऊतकों (चित्रा 2बी)सहित संक्रमण फोसी की पहचान करने में सक्षम थे। कुछ अत्यधिक संक्रमित चूहों के फेफड़ों ने भड़काऊ समेकन के अनुरूप अपारदर्शी क्षेत्रों का प्रदर्शन किया जो ल्यूमिनेसेंट बैक्टीरियल सिग्नल(चित्रा 3 ए)के सह-स्थानीयकृत हैं। माना भड़काऊ exudate के इन क्षेत्रों असंक्रमित नियंत्रण फेफड़ों(चित्रा 3A)में नहीं पाए जाते हैं । संक्रमित पिल्ले के फेफड़ों के भीतर एक स्पष्ट भड़काऊ साइटोकिन प्रतिक्रिया के आगे सबूत आईएल-1, आईएल-6, और टीएनएफ-α के जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण द्वारा प्रदर्शित किया जाता है। निम्न और उच्च इनोकुलम समूहों(चित्रा 4 ए)दोनों में सभी तीन साइटोकिन्स के लिए नियंत्रण के सापेक्ष अभिव्यक्ति में उल्लेखनीय वृद्धि देखी गई। फेफड़ों के हिस्टोपैथोलॉजी को भी नियंत्रण और संक्रमित पिल्ले में 24 एचपीआई पर जांच की गई । इसी तरह के भड़काऊ साइटोकिन प्रोफाइल के बावजूद, पैथोलॉजी में एक प्रगतिशील वृद्धि आमतौर पर निचले से उच्च इनोकुलम तक देखी गई थी। असंक्रमित नियंत्रणों से ऊतक के साथ तुलना में, संक्रमित पिल्ले के फेफड़ों में उल्लेखनीय भड़काऊ परिवर्तन, अल्वियोलर दीवार का मोटा होना, अल्वेलर रक्तस्राव में वृद्धि और भड़काऊ घुसपैठ(चित्रा 4B) दिखाया गया। सबसे गंभीर संक्रमणों में, फेफड़े की भीड़ और नकसीर के क्षेत्रों ने खुली हवा के अंतरिक्ष(चित्रा 4B)में भारी कमी लाने में योगदान दिया। सामूहिक रूप से, इन परिणामों से पता चलता है कि जल्दी शुरुआत नवजात सेप्सिस के हमारे मॉडल में, ल्यूमिनेसेंट बैक्टीरिया के प्रसार के लिए एक उपकप्तान टीका साइट से महत्वपूर्ण संक्रमण foci के लिए समय के साथ पीछा किया जा सकता है और गंभीर रूप से संक्रमित जानवरों में महत्वपूर्ण सूजन और विकृति का कारण ।

मोनोसाइट्स, मैक्रोफेज और न्यूट्रोफिल जैसी जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा बैक्टीरियल किलिंग में योगदान देने वाले मेजबान कारकों का अध्ययन करने के लिए, हमने बैक्टीरियल क्लीयरेंस को मापने के लिए विट्रो परख में एक संवेदनशील विकसित किया। नवजात चूहों की तिल्ली से अलग Ly6B.2+ कोशिकाओं को 1 घंटे के लिए एमओआई की एक श्रृंखला में बायोल्यूमिनेसेंट ई. कोलाई से संक्रमित किया गया था और फिर एक्सट्रासेलुलर बैक्टीरिया को मारने के लिए जेंटामिसिन के साथ इलाज किया गया था। 3, 6, 20, और 48 एचपीआई पर, इंट्रासेल्युलर ल्यूमिनेसेंस को मल्टीमोड रीडर के साथ मापा गया था। जैसा कि उम्मीद थी, बढ़ते एमओआई के साथ, अधिक ल्यूमिनेसेंट सिग्नल 3 एच(चित्रा 5)पर दर्ज किया गया था। धीरे-धीरे, यह संकेत खो गया था, बैक्टीरियल क्लीयरेंस(चित्रा 5) कासंकेत है। यह परख पूरक साइटोकिन्स, स्रावित प्रभावकों को बेअसर करने और सेलुलर रास्तों के औषधीय अवरोधकों के अलावा हस्तक्षेपों का अध्ययन करने के लिए उत्तरदायी है जो बैक्टीरियल क्लीयरेंस को बढ़ावा दे सकते हैं और यहां वर्णित नवजात सेप्सिस मॉडल में परिणामों में सुधार करने की सेवा करते हैं।

Figure 1
चित्र 1: सेप्टिक नवजात चूहों में शरीर के वजन और बैक्टीरियल प्रतिकृति में परिवर्तन।
(A,B) एक समूह के भीतर व्यक्तिगत माउस वजन (कम और उच्च) लिटरमेट नियंत्रण पिल्ले के मतलब वजन के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया। डेटा को प्रत्येक पोस्ट-इंफेक्शन टाइम पॉइंट पर मतलब प्रतिशत ± रूप में प्रस्तुत किया जाता है। संक्रमण के बाद के समय बिंदु पर व्यक्तिगत टी-परीक्षण नियंत्रण पिल्ले और पिल्ले के बीच 24 घंटे में महत्वपूर्ण अंतर प्रकट करते हैं जो कम इनोकुलम(पीएंड एलटी;0.0001)(ए)या नियंत्रण पिल्ले और पिल्ले के बीच प्राप्त होते हैं जो उच्च इनोकुलम(पी=0.0031)(बी)प्राप्त करते हैं। (ग)24 एचपीआई में रक्त में सीएलयू/एमएल को लॉग इन किया गया और एसईएम के ± मतलब के रूप में प्रस्तुत किया गया । मान-व्हिटनी परीक्षण कम और उच्च खुराक inoculums(पी= ०.०८८२) के बीच महत्व की ओर एक प्रवृत्ति का पता चलता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: इंट्राविटल इमेजिंग समय के साथ नवजात चूहों में बैक्टीरिया के प्रसार को दर्शाता है।
(A)~ 2 x 106 सीएफयू के इनोकुलम से संक्रमित एक प्रतिनिधि नवजात माउस (#1) को समय 0, 10 और 24 एचपीआई में दिखाया गया है। प्रत्येक समय बिंदु के लिए न्यूनतम और अधिकतम चमक मूल्यों के साथ एक रंगीन पैमाने प्रदर्शित किए जाते हैं। 0 और 10 घंटे पर चूहों को समय के साथ बैक्टीरियल विकास में परिवर्तन प्रदर्शित करने के लिए उनके समय बिंदु पैमाने और 24 एच पैमाने पर प्रदर्शित किया जाता है। (ख)प्रतिनिधि 3डी 10 और 24 एचपीआई पर एक ही नवजात माउस की माइक्रोसीटी छवियों को खंगाला जाता है। हर बार बिंदु उपरि, ट्रांसेक्सियल, और कोरोनल दृष्टिकोण पर छवियों है । 24 एचपीआई में ट्रांसएक्सियल इमेज में, विमान परिधीय ऊतकों में संक्रमण फोसी को बेहतर तरह प्रदर्शित करने के लिए माउस की परिधि की ओर बढ़ गया है। सफेद तीर 10 एचपीआई पर मस्तिष्क और गुर्दे और 24 एचपीआई पर गुर्दे और फेफड़े का संकेत देते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: फेफड़े नवजात शिशुओं में बैक्टीरियल सेप्सिस के दौरान प्रमुख संक्रमण की एक साइट हैं।
(A)प्रतिनिधि 3डी ने असंक्रमित नियंत्रण की तुलना में ~7 x 106 सीएफयू के इनोकुलम से संक्रमित नवजात माउस (#5) की माइक्रोसीटी छवियों को 24 एचपीआई पर दिखाया गया है । दोनों चूहों को ट्रांसेक्सियल परिप्रेक्ष्य में प्रदर्शित किया जाता है और फेफड़ों को सफेद तीरों द्वारा इंगित किया जाता है। संक्रमित माउस को दो चमक (फोटॉन/सेकंड) तराजू पर रखा गया था । स्केल #1 में सभी 6 तरंगदैर्ध्य (500, 520, 560, 580, 600, 620 एनएम) शामिल हैं और स्केल #2 में केवल 500, 520 और 560 एनएम तरंगदैर्ध्य शामिल हैं। इस दूसरे पैमाने ने हमें फेफड़ों में बैक्टीरिया में वृद्धि के संकेत की कल्पना करने की अनुमति दी क्योंकि कम तरंगदैर्ध्य ऊतक द्वारा अधिक उच्च अवशोषित होते हैं और मजबूत संकेत पैदा करते हैं। (ख)प्रतिनिधि 3डी ने ~7 x 106 सीएफयू के इनोकुलम से संक्रमित नवजात माउस (#4) की माइक्रोसीटी छवियों को 24 एचपीआई में दिखाया गया है । इस बार बिंदु में ओवरहेड, सगिटल, ट्रांसेक्सियल और कोरोनल दृष्टिकोण पर छवियां हैं। सफेद तीर फेफड़ों में संक्रमण फोसी का संकेत देते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4: सेप्टिक नवजात शिशुओं के फेफड़ों में सूजन और संबद्ध हिस्टोपैथोलॉजिकल निष्कर्ष।
24 एचपीआई में फेफड़ों को पिल्ले से काटा गया था जो ~ 2 x 106 या 7 x 106 सीएफयू या असंक्रमित नियंत्रण प्राप्त करते थे। (A)आरएनए को अलग-थलग कर दिया गया था और आईएल-1, आईएल-6, या टीएनएफ-α की अभिव्यक्ति के रूप में मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर द्वारा असंक्रमित नियंत्रण के सापेक्ष निर्धारित फार्मूला2-Τ ΟCtका उपयोग कर । डेटा को प्रत्येक इनोकुलम के लिए एक्सप्रेशन ± एसईएम में औसत लॉग2 रूपांतरित परिवर्तन के रूप में दिखाया गया है जैसा कि संकेत दिया गया है। सांख्यिकीय महत्व व्यक्तिगत साइटोकिन जीन और 95% विश्वास अंतराल में आंतरिक नियंत्रण के बीच ΤCT मूल्यों के अकर्षित टी-परीक्षणों का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। तारांकन पीऔर लेफ्टिनेंट; 0.01 का संकेत देते हैं। (बी-डी) एच एंड ई दाग फेफड़ों के ऊतकों (20x, कतरन मुखौटा में निर्मित ब्याज के क्षेत्र और स्पष्टता के लिए बढ़े हुए) के हिस्टोपैथोलोजिक वर्गों को दिखाया गया है। एक प्रतिनिधि असंक्रमित नियंत्रण(बी)या संक्रमित नवजात से कम(सी)या उच्च(डी)इनोकुलम से फेफड़ों के ऊतकों को दिखाया जाता है। पीले तीर अल्वेलर मोटा(सी)या रक्तस्राव(डी)का संकेत देते हैं। स्केल बार = 500 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: बैक्टीरियल क्लीयरेंस के लिए एक इन विट्रो परख।
Ly6B.2+ कोशिकाओं को असंक्रमित नियंत्रण नवजातों की तिल्ली से अलग किया गया । कोशिकाओं को ९६-अच्छी प्लेटों में वरीयता प्राप्त किया गया था और लूसिफ़ेरेस-व्यक्त ई. कोलाई O1: K1: H7 संक्रमण की बहुलता पर 10, ५०, या २५० के रूप में संकेत के रूप में संक्रमित थे । 1 घंटे के बाद, माध्यम को ताजा के साथ प्रतिस्थापित किया गया जिसमें जेंटामिसिन (100 μg/mL) निहित था। मतलब सापेक्ष प्रकाश इकाइयों (आरएलयू) ± एसई एक अलग प्रयोग के लिए कई दिखाया जाता है । 95% आत्मविश्वास अंतराल में सांख्यिकीय महत्व वेल्च के सुधार के साथ अकर्पित टी परीक्षणों का उपयोग करके निर्धारित किया गया था; तारांकन पीऔर लेफ्टिनेंट; 0.05 का संकेत देते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

नवजात चूहों में बैक्टीरियल सेप्सिस को प्रेरित करने के लिए हमारा उप-capular संक्रमण मॉडल वास्तविक समय में जीवाणु रोगजनकों के देशांतर प्रसार का अध्ययन करने के लिए एक उपन्यास विधि है। इंट्राविटल इमेजिंग नवजातों में वास्तविक समय में बैक्टीरियल प्रसार का पता लगाने का अवसर प्रदान करता है। यह बैक्टीरियल प्रसार के गतिज को समझने और बीमारी के उचित चरण में मेजबान प्रतिक्रिया और क्षति का आगे अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है। माउस पिल्ले को बैक्टीरियल इनोकुलम का एक चमड़े के नीचे, उप-capular इंजेक्शन प्रशासित किया जाता है। यह इंजेक्शन तकनीक अन्य आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले विकल्पों की तुलना में सरल है, जैसे पूंछ नस और इंट्रापेरिटोनियल संक्रमण, क्योंकि इसके लिए इंजेक्शन साइट के भीतर कम सटीकता की आवश्यकता होती है। पिल्ले के छोटे आकार को देखते हुए यह महत्वपूर्ण है। इंट्राविटल इमेजिंग जानवर का बलिदान करने की आवश्यकता के बिना समय के साथ परिधीय ऊतकों और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में जीवाणु प्रसार और प्रसार के देशांतर मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है। कैंसर जीव विज्ञान और मेटास्टेसिस20 , 21के अध्ययन के लिए इसी तरह के इमेजिंग दृष्टिकोण और प्रौद्योगिकियों का उपयोग किया गया है । इसके अलावा, जबकि एक अन्य अध्ययन में नवजात चूहों में ई कोलाई संक्रमण के दौरान बायोल्यूमिनेसेंट इमेजिंग के उपयोग का हवाला दिया गया है, यहां, हमने नवजात चूहों के दृष्टिकोण को लागू किया है, जिसमें हमारी पद्धति मुरीन सेप्सिस केदौरानबैक्टीरियल काइनेटिक्स के मूल्यांकन की अनुमति देती है। बैक्टीरिया का दृश्य जानवर के भीतर बैक्टीरिया (जैसे, बैक्टीरियल लूसिफ़ेरेस गतिविधि) से विभिन्न तरंगदैर्ध्य पर बायोल्यूमिनेसेंट प्रकाश के उत्सर्जन पर आधारित है। इसके बाद बायोल्यूमिनेसेंस को कूल्ड चार्ज्ड युग्मित डिवाइस (सीसीडी) कैमरे के माध्यम से कल्पना की जाती है। परिणामस्वरूप कल्पना बायोल्यूमिनेसेंस को 3 डी छवि में खंगाला जा सकता है जो जानवर के भीतर बैक्टीरिया के स्थानिक और लौकिक-निर्भर दोनों प्रभावों को दर्शाता है। एक जोड़ा के लिए, डेटा अधिग्रहण की अधिक सूक्ष्म परत, पूंछ टैटू के माध्यम से सफल पशु पहचान समय भर में व्यक्तिगत पिल्ले के एक दोहराया उपायों के आकलन और एक दिए गए प्रयोगात्मक समूह के भीतर संभव outliers की पहचान के लिए अनुमति देता है ।

वर्णित मॉडल के सबसे सफल अनुप्रयोग बैक्टीरियल इनोकुलम की तैयारी में सटीकता की आवश्यकता होती है। यहां, हम पूर्व-स्थापित और मान्य ई. कोलाई विकास वक्र का उपयोग करके बैक्टीरियल तैयारी के लिए एक अनुकूलित विधि का वर्णन करते हैं जो लक्ष्य और वास्तविक इनोकुलम के बीच भिन्नता को कम करता है। यह एक इच्छित इनोकुलम पर प्रयोगात्मक प्रजनन की अनुमति देता है। हमारे मॉडल में दो inoculums के शामिल किए जाने रक्त CFUs, मृत्यु दर, और फेफड़ों की विकृति में खुराक पर निर्भर परिणामों का प्रदर्शन किया । हालांकि, रोग प्रक्षेपवक्र के कुछ पहलू खुराक निर्भर नहीं थे। संक्रमित पशुओं में वजन बढ़ने में विफलता 24 एचपीआई पर इनोकुलम पर निर्भर नहीं थी। इसके अतिरिक्त, दोनों इनोकुलम के साथ संक्रमण के जवाब में फेफड़ों में भड़काऊ साइटोकिन अभिव्यक्ति के समान स्तर देखे गए। चाहे या नहीं इस पैटर्न सभी ऊतकों में दोहराया जाएगा, जहां बैक्टीरिया देखा गया, जैसे गुर्दे, जिगर, तिल्ली और मस्तिष्क के रूप में, निर्धारित किया जाना बाकी है । सेप्सिस के अलावा, ई. कोलाई O1: K1: H7 नवजात आबादी23में दिमागी बुखार के साथ जुड़ा हुआ है । यह मस्तिष्क संक्रमण तब होता है जब परिधि से बैक्टीरिया आक्रमण करते हैं और रक्त मस्तिष्क बाधा में प्रवेश करते हैं। भविष्य के अध्ययन तंग जंक्शन प्रोटीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन के विश्लेषण के माध्यम से मॉडल के इस पहलू का पता लगाने के साथ ही बैक्टीरियल इनोकुलम की विभिन्न श्रेणियों का परीक्षण करेंगे । इंट्राविटल इमेजिंग के दौरान एक अतिरिक्त संशोधन में एक विलक्षण कपास की गेंद का जोड़ शामिल है, जो आइसोफ्लाणे में इस प्रकार है, जिसे इमेजिंग के दौरान चूहों से लगभग 2-3 इंच दूर रखा जाता है। पिछले प्रयोगों के जवाब में जिसमें नवजात पिल्ले इमेजिंग सत्र के दौरान चेतना वापस आ गए हैं, सटीक छवि अधिग्रहण को रोकने, अब हम कपास की गेंद को चूहों के लिए काफी करीब रखते हैं ताकि उन्हें इमेजिंग के दौरान लगातार एनेस्थेटाइज्ड रखा जा सके। हालांकि, यह महत्वपूर्ण है कि यह इतना करीब नहीं किया जाता है कि वे संज्ञाहरण से उबरने में विफल रहे हैं।

यद्यपि विभिन्न पशु और रोग मॉडलों में विभिन्न बैक्टीरिया के काइनेटिक्स के अध्ययन के लिए लचीला और आसानी से अनुकूलनीय, हमारे प्रोटोकॉल पर विचार करने के लिए कुछ सीमाएं हैं। विचार करने के लिए पहली सीमा यह है कि संक्रमण का उप-capुलर मार्ग संचरण के प्राकृतिक मार्ग को प्रतिबिंबित नहीं करता है। हालांकि, शुरू से ही हमारे मॉडल के विकास में एक प्राथमिक उद्देश्य प्रसव का एक आसानी से प्रजनन मोड स्थापित करना था जिसका उपयोग एक प्रणालीगत संक्रमण स्थापित करने के लिए किया जा सकता है जो मानव रोग के पहलुओं को दोहराता है। इसलिए, इस रिपोर्ट में, हम मानव जल्दी शुरुआत सेप्सिस रोग सिंड्रोम के एक मॉडल का वर्णन, प्राकृतिक संचरण का एक मॉडल नहीं है । नवजात चूहों में मौखिक प्रसव का एक स्थापित मॉडल है जो आम मानव संचरण के कुछ पहलुओं को दोहराता है, जैसे आहार नहर में ई कोलाई संक्रमण का प्रारंभिक उपनिवेशीकरण और मस्तिष्क सहित रक्तप्रवाह और परिधीय ऊतकों के बाद प्रसार22। विटकॉम्ब और सहयोगियों द्वारा स्थापित मॉडल में बायोल्यूमिनेसेंट ई कोलाई और इंट्राविटल इमेजिंग को भी शामिल किया गया है। इसके अलावा, यह आइसोफलुरेन जोखिम को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है, साथ ही इंजेक्शन, पूंछ टैटू, और दोनों नवजात और बांधों के लिए तनाव के स्तर को कम करने के प्रयास में सटीकता और तकनीकों की परिशुद्धता समझौता किए बिना जितनी जल्दी हो सके पिल्ले संभाल । कुछ मामलों में, यदि पिल्ले मानव प्रेरित और/या प्रयोगात्मक जोड़तोड़ का अनुभव करते हैं, तो बांध नर्सिंग और पिल्ले की देखभाल करना बंद कर सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप संक्रमण से असंबंधित अस्तित्व में कमी आई है । इसी तरह, पिल्ले जो इमेजिंग सत्र के लगभग 10 मिनट से परे लंबे समय तक आइसोफ्लारेन के संपर्क में आते हैं, उनमें मृत्यु का खतरा बढ़ जाता है; इस प्रकार चूहों को पर्याप्त रूप से एनेस्थेटाइज करने के लिए पर्याप्त आइसोफ्लुन की आपूर्ति करना महत्वपूर्ण है, लेकिन उन्हें इच्छामृत्यु देने के लिए पर्याप्त नहीं है। विचार का अंतिम बिंदु संवेदनशीलता की सीमा है । इमेजिंग सॉफ्टवेयर3में इस्तेमाल होने वाले स्केलिंग विधि के अनुसार, जिन ऊतकों में १०४ CFUs/एमएल ई कोलाई से कम की गणना की गई थी, वह पता लगाने योग्य रेंज के कम अंत में दर्ज ल्यूमिनेसेंट सिग्नल की गणना की गई थी । इस प्रकार, कुछ ऊतकों को बैक्टीरिया के निम्न स्तर के साथ उपनिवेश किया जा सकता है लेकिन दिखाई देने वाले बायोल्यूमिनेसेंस के बिना दिखाई देते हैं।

वर्तमान में, अधिकांश अध्ययन बैक्टीरियल प्रसार के वयस्क तरीकों का उपयोग करते हैं, जैसे कि इंट्रापेरिटोनियल (आईपी) और नवजातों के लिए पूंछ नस इंजेक्शन। प्लस्चके और पेल्कोनेन ने 24 यानी पूंछ नस और मौखिक संक्रमण के माध्यम से नवजात चूहों पर ई कोलाई के1के प्रभाव का विश्लेषण किया। इस अध्ययन से पता चला है कि इम्यूनोडेफिसिएनियों वाले चूहों के विभिन्न जीनोटाइप K1 तनाव के लिए अधिक संवेदनशील हैं; हालांकि, संक्रमण के लिए मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के कई पहलुओं के साथ-साथ बैक्टीरियल प्रसार के लिए तंत्र को अनछुए छोड़ दिया जाता है। देशमुख और उनके सहयोगियों ने नवजात चूहों को ई. कोलाई के1 या के निमोनिया से संक्रमित किया और तिल्ली और यकृत में 72 एचपीआई25पर सीएफयू मापा । इस अध्ययन में एंटीबायोटिक दवाओं के लिए चूहों के पूर्व जोखिम के आधार पर संक्रमण के लिए मेजबान प्रतिक्रिया के कुछ पहलुओं का भी विश्लेषण किया गया । हालांकि, एक ही ऊतक (ग्रैनुलोसिटोसिस के अलावा) में भड़काऊ प्रोफाइलिंग के साथ समानांतर समय के साथ परिधीय ऊतकों और रक्त के लिए जीवाणु प्रसार की पूरी जांच को संबोधित नहीं किया गया था। स्टेफिलोकोकस ऑरियस, स्टेफिलोकोकस एपिडर्मिडिस,ग्रुप बी स्ट्रेप्टोकोकसऔर ई कोलाई के साथ चूहों में नवजात सेप्सिस के अन्य अध्ययन संक्रमण के जवाब में मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली के विभिन्न पहलुओं का पता लगाते हैं। हालांकि , इनमें से कोई भी अध्ययन बैक्टीरियल प्रसार या संक्रमण के स्थानीयकरण के काइनेटिक्स का पता लगाने के लिए इंट्राविटल इमेजिंग का उपयोग नहीं करता है23,25 ,26,27. संक्रमण और इंट्राविटल इमेजिंग की हमारी विधि, बैक्टीरियल बोझ मूल्यांकन और परिधीय ऊतकों की भड़काऊ प्रोफाइलिंग के साथ संयुक्त, हमें संक्रमण के दौरान मेजबान और रोगजनक दोनों के पहलुओं की व्यापक जांच करने की अनुमति देती है, जो सेप्सिस के दौरान मेजबान-रोगजनक परस्पर क्रिया की अधिक सटीक समझ प्रदान करती है।

हम इस संक्रमण और इमेजिंग मॉडल का उपयोग करने के लिए प्रारंभिक शुरुआत नवजात सेप्सिस की हमारी समझ को आगे बढ़ाने का इरादा है, जो आमतौर पर नवजातों में सेप्सिस के लिए जिम्मेदार विभिन्न रोगजनक बैक्टीरिया का उपयोग करते हैं, जिसमें ग्रुप बी स्ट्रेप्टोकोसी, के न्यूओमोनियाईऔर लिस्टेरिया मोनोसाइटोजीनशामिल हैं। यह संक्रमण मॉडल हमें नवजात शिशुओं में मेजबान प्रतिक्रिया के समानांतर विभिन्न जीवाणु रोगजनकों के प्रसार की तुलना करने की अनुमति देगा। इसके अलावा, यह मॉडल विशिष्ट (फ्लोरोसेंटली संयुग्मित) प्रतिरक्षा कोशिका प्रकारों के दत्तक हस्तांतरण के लिए अनुकूलनीय है ताकि संक्रमण की साइटों पर उनके प्रवास और बैक्टीरिया के नियंत्रण पर बाद में प्रभाव का अध्ययन किया जा सके। यह उन तरीकों से शुरुआती जीवन में सेप्सिस के दौरान होने वाली मेजबान-रोगजनक इंटरैक्शन को बेहतर ढंग से समझने का अवसर देता है जो पहले प्रदर्शित नहीं किए गए हैं।

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

इस कार्य को संस्थागत निधियों द्वारा सी.M आर को समर्थन दिया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL Insulin Syringe Coviden 1188128012 Inoculum or PBS injection
10% Neutral Buffered Formalin VWR 89370-094 Histopathology
ACK Lysis Buffer Gibco LSA1049201 Bacterial clearance assay
Animal Tattoo Ink Paste Ketchum KI1482039 Animal identification
Animal Tattoo Ink Green Paste Ketchum KI1471039 Animal identification
Anti-Ly-6B.2 Microbeads Miltenyi Biotec 130-100-781 Cell isolation
Escherichia coli O1:K1:H7 ATCC 11775
Escherichia coli O1:K1:H7-lux (expresses luciferase) N/A N/A Constructed in-house at WVU
E.Z.N.A. HP Total Extraction RNA Kit Omega Bio-tek R6812 RNA extration
DPBS, 1X Corning 21-031-CV
Difco Tryptic Soy Agar Becton, Dickinson and Company 236950 Bacterial growth
IL-1 beta Primer/Probe (Mm00434228) Thermo Fisher Scientific 4331182 Cytokine expression qPCR
IL-6 Primer/Probe (Mm00446190) Thermo Fisher Scientific 4331182 Cytokine expression qPCR
iQ Supermix Bio-Rad 1708860 Real-time quantitative PCR
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708891 cDNA synthesis
Isolation Buffer Miltenyi Biotec N/A Bacterial clearance assay
IVIS Spectrum CT and Living Image 4.5 Software Perkin Elmer N/A Intravital imaging
LB Broth, Lennox Fisher BioReagents BP1427-500 Bacterial growth
EASYstrainer (Nylon Basket) Greiner Bio-one 542 040 Cell strainer
SpectraMax iD3 Molecular Devices N/A Plate reader
Pellet Pestle Motor Grainger 6HAZ6 Tissue homogenization
Polypropylene Pellet Pestles Grainger 6HAY5 Tissue homogenization
Prime Thermal Cycler Techne 3PRIMEBASE/02 cDNA synthesis
TNF-alpha Primer/Probe (Mm00443258) Thermo Fisher Scientific 4331182 Cytokine expression qPCR
TriReagent (GTCP) Molecular Research Center TR 118 RNA extration

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 162 बायोल्यूमिनेसेंस इंट्राविटल इमेजिंग ई. कोलाई,सब्सकैपुलर टीका नवजात सेप्सिस सूजन साइटोकिन्स
ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरियल सेप्सिस का एक नवजात इमेजिंग मॉडल
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Seman, B. G., Povroznik, J. M.,… More

Seman, B. G., Povroznik, J. M., Vance, J. K., Rawson, T. W., Robinson, C. M. A Neonatal Imaging Model of Gram-Negative Bacterial Sepsis. J. Vis. Exp. (162), e61609, doi:10.3791/61609 (2020).

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