Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

En neonatal bildemodell av gram-negativ bakteriell sepsis

Published: August 12, 2020 doi: 10.3791/61609
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 1, 1,2
1Department of Microbiology, Immunology, & Cell Biology, West Virginia University School of Medicine, 2Vaccine Development Center at West Virginia University Health Sciences Center
* These authors contributed equally

Summary

Infeksjon av neonatal mus med bioluminescerende E. coli O1:K1:H7 resulterer i en septisk infeksjon med betydelig lungebetennelse og lungepatologi. Her beskriver vi prosedyrer for å modellere og videre studere neonatal sepsis ved hjelp av langsgående intravital avbildning parallelt med opplisting av systemiske bakterielle byrder, inflammatorisk profilering og lunge histopatologi.

Abstract

Nyfødte har økt risiko for bakteriell sepsis på grunn av den unike immunprofilen de viser i de første månedene av livet. Vi har etablert en protokoll for å studere patogenesen av E. coli O1:K1:H7, en serotype som er ansvarlig for høy dødelighet hos nyfødte. Vår metode benytter intravital avbildning av neonatale valper på forskjellige tidspunkter under infeksjonsprogresjonen. Denne avbildningen, parallelt med måling av bakterier i blodet, inflammatorisk profilering og vev histopatologi, betyr en streng tilnærming til å forstå infeksjonsdynamikk under sepsis. I den nåværende rapporten modellerer vi to smittsomme inoculums for sammenligning av bakterielle byrder og alvorlighetsgraden av sykdommen. Vi finner at subscapular infeksjon fører til spredt infeksjon med 10 h etter infeksjon. Ved 24 timer var infeksjon av selvlysende E. coli rikelig i blod, lunger og annet perifert vev. Uttrykk for inflammatoriske cytokiner i lungene er signifikant ved 24 timer, og dette etterfølges av cellulær infiltrasjon og tegn på vevsskade som øker med smittsom dose. Intravital bildebehandling har noen begrensninger. Dette inkluderer en selvlysende signalterskel og noen komplikasjoner som kan oppstå med nyfødte under anestesi. Til tross for noen begrensninger finner vi at vår infeksjonsmodell gir et innblikk for å forstå langsgående infeksjonsdynamikk under neonatal murine sepsis, som ikke har blitt grundig undersøkt til dags dato. Vi forventer at denne modellen også kan tilpasses for å studere andre kritiske bakterielle infeksjoner tidlig i livet.

Introduction

Bakteriell sepsis er en betydelig bekymring for nyfødte som viser en unik immunprofil i de første dagene av livet som ikke gir tilstrekkelig beskyttelse mot infeksjon1. Neonatal sepsis fortsetter å være et betydelig amerikansk helseproblem som står for mer enn 75.000 tilfeller årlig i USA alene2. For å studere disse infeksjonene i dybden, er det nødvendig med nye dyremodeller som rekafulerer aspekter ved menneskelig sykdom. Vi har etablert en neonatal mus infeksjon modell ved hjelp av Escherichia coli, O1:K1:H73. E. coli er den nest ledende årsaken til neonatal sepsis i USA, men ansvarlig for flertallet av sepsis-assosiertdødelighet 4,5. Det er imidlertid den ledende årsaken når pre-term og svært lav fødselsvekt (VLBW) babyer anses uavhengig5. K1 serotypen er oftest forbundet med invasive blodbanen infeksjoner og meningitt i nyfødte6,7. For tiden er det ingen andre behandlingsalternativer utover antibiotika og støttende omsorg. I mellomtiden fortsetter forekomsten av antibiotikaresistens å stige for mange patogene bakterier, med noen stammer av E. coli som er resistente mot en rekke antibiotika som vanligvis brukes i behandling8. Dermed er det viktig at vi fortsetter å generere metoder for å studere mekanismene for sepsis og vertsresponsen i nyfødte. Disse resultatene kan bidra til å forbedre på dagens behandlinger og infeksjonsutfall.

Immuntilstanden til nyfødte er preget av både fenotypiske og funksjonelle forskjeller sammenlignet med voksne. For eksempel har forhøyede nivåer av antiinflammatoriske og regulatoriske cytokiner, som interleukin (IL) -10 og IL-27, vist seg å være produsert av ledningen blod-avledede makrofager og er til stede på større nivåer i serum av murine nyfødte9,10,11. Dette er i samsvar med lavere nivåer av IFN-α, IFN-ɣ, IL-12 og TNF-α som ofte rapporteres fra nyfødte celler sammenlignet med voksne kolleger10. I tillegg er det nyfødte immunsystemet skjevt mot en Th2 og regulatorisk T-cellerespons sammenlignet med voksne12. Forhøyede antall nøytrofiler, T-celler, B-celler, NK-celler og monocytter er også tilstede i nyfødte, men med betydelige funksjonsnedsettering. Dette inkluderer defekter i uttrykk for celleoverflatemarkører og antigenpresentasjon som tyder på umodenhet13,14,15. I tillegg er neonatale nøytrofiler betydelig mangelfulle i deres evne til å migrere til chemotaktiskefaktorer 16. Myeloid-avledede suppressorceller (MDSCer) finnes også ved forhøyede nivåer i nyfødte og nylig vist seg å være en kilde til IL-2711. MDSCer er svært undertrykkende mot T-celler17. Samlet viser disse dataene begrensninger i neonatal immunitet som gir økt mottakelighet for infeksjon.

For å studere utviklingen av bakteriell byrde og dissekere beskyttende verts immunresponser under neonatal sepsis, har vi utviklet en ny infeksjonsmodell. Neonatal mus på dager 3-4 av livet er vanskelig å injisere i intraperitoneal plass eller halevene. I vår modell administreres dag 3 eller 4 valper bakterieinkulum eller PBS subkutant inn i scapular-regionen. En systemisk infeksjon utvikler seg og bruker selvlysende E. coli O1:K1:H7, vi kan langsgående bilde individuelle neonatal mus for å følge den spredte bakterielle byrden i perifert vev. Dette er den første rapporterte modellen som bruker intravital avbildning for å forstå kinetikken til spredning av bakterier under sepsis hos murine nyfødte3.

Her beskriver vi en protokoll for å indusere septiske E. coli-infeksjoner hos neonatale mus3. Vi beskriver hvordan du forbereder bakteriell inokutum til injeksjon, og hvordan du høster vev for vurdering av patologi, måling av inflammatoriske markører ved genuttrykksanalyse og opplisting av bakteriebyrden. I tillegg er bruk av selvlysende E. coli for intravital avbildning av infiserte nyfødte og kvantifisering av bakteriell drap av neonatale immunceller også beskrevet. Disse protokollene kan også tilpasses for å studere andre viktige bakterielle infeksjoner i nyfødte. Dataene som presenteres her representerer en generell ny tilnærming til å forstå infeksjonsdynamikk i en oversettelig neonatal sepsismodell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle prosedyrer ble godkjent av West Virginia Institutional Animal Care and Use Committees og utført i samsvar med anbefalingene fra Guide for care and use of Laboratory Animals av National Research Council18.

1. Fremstilling av bakteriell inokus

  1. Strek en Tryptisk soy agar (TSA) plate med en inokulering sløyfe for isolering av en enkelt koloni fra en fryser lager av E. coli O1: K1: H7-lux som knivstakk uttrykker luciferase og bærer kanamycin motstand3. Inkuber over natten ved 37 °C.
  2. Dagen etter gjør det mulig for Luria kjøttkraft (LB) å komme til romtemperatur (25 °C) i et biosikkerhetsskap.
  3. Under en biosikkerhetskapshette, identifiser en enkelt koloni fra den stripete platen og inokuler den i 3 ml LB supplert med kanamycin (30 μg / ml). Inkuber over natten ved 37 °C med risting (220 o/min). Dette er startkulturen.
  4. Fortynn startkulturen 1:100 i en frisk 3 ml LB under en biosikkerhetskapshette og returner den til inkubatoren i 2-3 t ved 37 °C med risting (220 o/min). Dette er aksjekulturen.
  5. Les den optiske tettheten (OD) av både tom og lagerkultur på 600 nm ved hjelp av et spektrofotometer. Tilsett 100 μL LB (som ikke inneholder bakterier) i en brønn av en 96 godt flat bunnanalyseplate; dette er det tomme. Tilsett deretter 100 μL fra aksjekulturen til en egen brønn. Gjenta for to ekstra repliker. Absorbansen leses ved hjelp av en plateleser.
  6. Trekk den tomme absorbansen fra aksjekulturabsorbansverdien (OD-verdien) og sammenlign med en tidligere generert og validert vekstkurve for å bestemme en tilnærming av bakteriell tetthet i aksjekulturen for fremstilling av smittsom dose.
  7. Generer målinokuler avhengig av forskningsspørsmålet. Målinokus på 2 x 106 (lav) og 7 x 106 (høy) kolonidannende enheter (CFUer) per mus (/mus) ble brukt til denne studien.
    1. Del måldosen per mus (DoseT) etter den estimerte konsentrasjonen av bakterier i lagerkulturen (Lager) for å få volumet av bakterier som trengs fra bestandsrøret (VS).
    2. Multipliser VS med antall mus (NM) som må smittes sammen med nok til 5-10 statister for den totale mengden bakterier som kreves for infeksjonen pluss 5-10 ekstra doser. Fjern dette volumet fra lagerrøret og legg det til et nytt sentrifugerør.
    3. Bruk formelen nedenfor:
      DoseT/Stock = VS x NM = totalt volum (VT) av bakterier som skal fjernes fra bestandsrøret.
  1. Sentrifuger bakteriene ved 2000 x g i 5 min ved 4 °C og gjenoppuspend bakteriepelleten i 50 μL PBS (pH 7,2-7,6) per mus som skal smittes (f.eks. for 10 doser på 2 x 106 bakterier hver dose, vil pellet av 2 x10 7 bakterier bli gjenbrukt i 500 μL PBS). Igjen anbefales det å forberede mer inokus enn nødvendig. Forbered et likt volum pbs bare for kontroll inokulasjoner. Opprettholde den smittsomme inoculum og PBS kontroll på is til infeksjon.
  2. Utfør syv ti ganger seriefortynninger i PBS i en 96 brønns plastbunnsfortynningsplate, og plate 25 μL av fortynningene i duplikat på kvadrant TSA-plater supplert med kanamycin (30 μg/ml) for å liste opp den faktiske mengden bakterier som administreres. Inkuber ved 37 °C over natten for kolonidannelse før opplisting.

2. Identifikasjon av dyr

  1. Ordne et tilstrekkelig antall avlspar slik at kull kan synkroniseres for alderstilpassede valper. Aldersvariabilitet på ± 1 dag er akseptabelt.
  2. Identifiser en gravid C57BL/6 kvinnelig mus og monitor for fødselen av kullet i forkant av det planlagte eksperimentet for å nøyaktig bestemme alder.
  3. For å skille mellom kontroll og infiserte 3- eller 4-dagers gamle valper, bruk et par små, fintippede irissaks til å klippe endene av halene til kontrollvalpene bare. De infiserte valpene mottar ikke haleklipp. Før du kutter halen, desinfiserer huden med en bomullsdott doused i 70% etanol. Påfør trykk på enden av halen med en bomullsdott eller gasbind etter behov.
    MERK: Denne prosedyren utføres under en biosikkerhetskapshette. Et haleklipp på ca. 1/8 av en tomme er tilstrekkelig.
  4. For å identifisere valper innenfor kontroll- og infiserte grupper, bruk en 1 ml insulinsprøyte med en 28 G x 1/2'' permanent nål for å tatovere halene til valpene. Før tatovering, desinfisere huden med en bomullsdott doused i 70% etanol. Denne prosedyren utføres under en biosikkerhetskapshette.
  5. For å tatovere halen, bruk dyr tatovering blekk på spissen av nålen. Deretter begrenser du valpen forsiktig med den ene hånden, med halen fullt eksponert. Sett forsiktig nålen under huden, samtidig som du opprettholder et overfladisk dybdenivå, og flytt nålen parallelt med huden noen få millimeter til en liten merking, eller prikk, er opprettet. Vent noen sekunder før du sakte fjerner nålen fra under huden, for å unngå at overflødig blekk slippes ut fra under huden.
  6. Påfør trykk på såret med en bomullsdott eller gasbind etter behov. Fjern overflødig tatovering blekk på overflaten av huden med 70% etanol.
  7. Gjenta denne prosessen med påfølgende mus i de infiserte og kontrollgruppene, mens du legger til en ekstra prikk med hver påfølgende valp tatovert (f.eks. pup 1 vil ha 1 prikk på halen, pup 2 vil ha to prikker på halen, etc.).
    MERK: For et ekstra lag med identifikasjon anbefales det å bruke separate farger av dyretatoveringsblekk for kontroll og infiserte grupper.

3. Subcapular inokulasjon

MERK: For denne studien ble 2 eksperimenter utført med en lavdose og høydosegruppe utpekt for hvert eksperiment. I det første forsøket fikk 7 unger lavdoseinokus (4 valper ble brukt som kontroller), og 5 unger fra et eget kull fikk høy dose (3 valper ble brukt som kontroller). Valpene fra eksperiment 1 ga data for bare 24 t-tidspunktet. I det andre forsøket fikk 8 unger lavdoseinokulum (2 valper ble brukt som kontroller), og 6 unger fikk høydoseinokulum (2 valper ble brukt som kontroller). Valper fra eksperiment 2 ga data for 0, 10 og 24 t timepoints.

  1. Alder match valper ≤ 1 dag. Tilordne hvert kull som enten en lav dose eller et høydosekull. Innenfor et kull tilfeldig tildele valper som en kontroll eller infisert valp.
  2. På dag 3 eller 4 postnatal, registrere vekter av alle valper før inokulasjon med E. coli-lux eller PBS kontroll. Skill demningen fra valpene i løpet av denne tiden for å sikre at de ikke flyttes under infeksjonen.
  3. I et biosikkerhetsskap ved hjelp av en insulinnål, aspirer enten PBS eller E. coli-lux inoculum. For dette arbeidet ble inokuler på 2 x 106 og 7 x 106 CFUer per mus brukt. Oppbevar både inokulum og PBS på is til administrering via subscapular injeksjon.
  4. Plasser nyfødte på en ren overflate i biosikkerhetskapshetten og hev huden i nakken som om å scruff valpen.
  5. I rommet som nå er opprettet mellom huden og dyrets muskel, sett inn nålen, skråkant opp, like under huden og injiser 50 μL PBS eller E. coli-lux. Slipp samtidig den klemte delen av huden for å forhindre tilbakestrømning av injeksjonen.
  6. Fjern nålen langsomt og forsiktig. Plasser valper tilbake med dammer etter injeksjoner er ferdig.
    MERK: På grunn av deres anatomiske stadium i utviklingen, er det teknisk utfordrende å administrere en halevene eller intraperitoneal injeksjon til neonatale valper på dag 3-4. Dermed ble subscapular infeksjonsruten valgt for denne studien på grunn av enkel utførelse.

4. Evaluering av sykdoms- og endepunktkriterier

  1. Overvåk valpene to ganger daglig gjennom infeksjonens varighet. Legg merke til eventuelle abnormiteter i utseende.
  2. Registrer vekter som en objektiv måling av sykelighet.
  3. I tillegg til vektendringer, test valpenes evne til å rette seg ved å plassere nyfødte på dorsalsiden. Syke dyr vil ikke kunne vende seg til ventral side og på føttene eller vil fullføre denne handlingen med vanskeligheter.
  4. Kontroller følgende for å markere dyrene nær endepunktkriterier: mindre enn 85% av normal kroppsvekt; redusert bevegelse og manglende evne til å rette seg selv; misfarging av huden og et mer grått eller gjennomsiktig utseende i motsetning til rosa; følelse av kjølig å ta på, noe som indikerer redusert kroppstemperatur og hemorragiske blåmerker langs sidene, også indikerer forhåndssykdom.
    MERK: Hvis nyfødte ikke har gått opp i vekt over to dager og passer til noen av beskrivelsene i trinn 4.4, har de oppfylt endepunktkriteriene. Valper som får høy dose oppfyller ofte endepunktkriteriene med 24 timer. Kontrollvalper innenfor lav- og høydosekullene vil bli eutanisert samtidig for å tillate komparativ analyse mellom kontroll og eksperimentelle grupper. Fortsett til etanasiseksjonen nedenfor.

5. In vivo avbildning av bakteriell byrde

  1. Bruk en microCT imager og programvare for bildebehandling og påfølgende analyse.
    MERK: Pup hudfarge påvirker ikke bildekvaliteten.
  2. Plasser buret med E. coli-lux-infiserteneonatale mus og demning i en BSL-2 nivå laminær strømningshette. Fjern mus som skal avbildes, og legg i et gjennomsiktig isoflurankammer i panseret. Det anbefales å starte med uinfiserte kontroller for å måle mengden isofluran som trengs.
  3. Åpne programvaren på datamaskinen som er koblet til microCT. Initialiser systemet og vent til CCD-temperaturen låses ved -90 °C.
  4. Slå på isofluranfordamperen og juster skiven til 5 % isofluranstrømning. Hold mus i kammeret med denne isofluranblandingen i 20-30 s til de slutter å bevege seg; lengre eller kortere anestesieksponeringstider kan være nødvendig for noen mus. Når musene slutter å bevege seg, blir de tilstrekkelig bedøvet, og kan avbildes.
  5. Flytt mus inn i mikroCT bildekammeret og plasser dem på bildeboksen i utsatt stilling, med neser vendt vinkelrett på nesekjegler. Bruk tannvoks til å forsiktig begrense føttene på bildeboksen for å begrense enhver bevegelse. Opptil 4 neonatale mus kan avbildes om gangen.
  6. Vri isofluranfordamperen ned til 2-4% strømning for å holde musene bedøvet under bildebehandling. Lukk mikroCT bildekammerdøren. Sjekk på musene noen sekunder senere. Hvis de begynner å bevege seg, douse en bomullsdott i isofluran og hold den til nesen på dyret beveger seg i 5 sekunder for å bedøve. Hold bomullsdotten i nærheten av dyrene under avbildning. Vær forsiktig så du ikke bedøver og avslutter musene.
  7. Bruk programvaren til å velge alternativet Selvlysende for bildebehandling. Bruk et eksitasjonsfilter satt til Blokk og utslippsfilteret satt til Åpne,500 nm, 520 nm, 560 nm, 580 nm, 600 nm og 620 nm. Det vil være syv totale utslippsfiltre satt for luminescens.
  8. Bilde musene på hvert tidspunkt (0, 10 og 24 h etterinfeksjon [hpi]) og lagre alle bilder i en mappe for hvert tidspunkt. Returner valpene til buret med demningen og kontroller at alle valper har kommet seg fra anestesi.
  9. Hvis du vil analysere 2D-bilder, åpner du bilder i programvaren. Endre enheter til Utstråling (fotoner); dette vil bli til Total Flux (fotoner / sekund).
  10. Analyser bare ett bildesett med flere utslippsfiltre om gangen. Fra hvert bildesett noterer du deg minimums- og maksimumsutstrålingsverdiene nederst til høyre i hvert bilde (f.eks. hvis det er 7 utslippsfiltre, vil det være 7 bilder og 7 minimums- og maksimumsverdier). Gjenta for hvert bildesett som skal sammenlignes.
  11. Hvis du vil bestemme en skala som vil omfatte verdiene og lysstyrken for alle bilder, finner du den laveste minimumsverdien og den høyeste maksimumsverdien for hvert bildesett. For denne studien ble åpne filterbilder brukt som representative.
    1. Uthev og åpne det du vil bruke bildet for å endre skalaen. Klikk kategorien Bildejustering ikategorien Verktøypalett, og endre fargeskalaen til de laveste minimums- og høyeste maksimumsverdiene som tidligere er identifisert. Lagre hvert bildesett som en TIFF. Analyser individuelt hvert gang punkt på denne måten for å sikre at riktig skala vises.
  12. Hvis du vil kvantifisere den totale fluksen (mengden selvlysende signal per mus) for hver enkelt mus, åpner du et bilde som tidligere beskrevet i trinn 5.9-5.10. Åpne kategorien Roi-verktøy på verktøypaletten, og velg sirkelverktøyet. Velg 1 sirkel hvis du analyserer ett område med luminescence.
  13. Flytt avkastningen til overlegg på luminescenceområdet. Juster størrelsen på avkastningen om nødvendig.
    MERK: Hvis justering er nødvendig, justerer du ROIer i andre bilder som er sammenlignbare for å opprettholde konsistensen. Velg Mål ROIer. Vinduet ROI-målinger åpnes med Total Flux (p/s), Gjennomsnittlig utstråling (p/s/cm2/sr), Standardavvik for utstråling, minimum utstråling og maksimal utstråling.
  14. Registrer totale fluksmålinger for hvert bildesett. Dette nummeret er den kvantifiserte mengden luminescence i musen i 2D-bilder.
  15. Hvis du vil lage 3D-rekonstruerte microCT-bilder, åpner du DLIT 3D-rekonstruksjonspanelet på verktøypaletten og kontrollerer alle bølgelengder som skal inkluderes under Analyser-fanen.

6. Eutanasi

  1. Forbered og etikett rør for vev / organer av interesse for necropsy og passende nedstrøms applikasjoner.
  2. Skill nyfødte fra demningen i et biosikkerhetsskap.
  3. Bløtlegg en bomullsdott i veterinær-grade isofluran og legg innsiden av et gjennomsiktig inneslutningskammer.
  4. Hvis du samler blod, lag en P200 mikropipette med spiss og ha et 1,5 ml rør med 10 μL på 5 mM EDTA som antikoagulant. Det forventes et volum på 50-200 μL blod.
  5. Plasser en nyfødte i kammeret og overvåk valpen til den blir ubevegelig.
  6. Raskt, fjern neonate og halshugge med saks. Hvis det får lov til å puste frisk luft i en lengre periode, kan valpen gjenvinne bevisstheten. Nyfødte har redusert lungekapasitet i forhold til voksne mus, og derfor puster ikke dypt nok for eutanasi ved isofluran alene.
  7. Samle blod fra stammen ved foten av hodet ved hjelp av en P200 mikropipette. For å maksimere mengden blod som samles inn, utfør dette trinnet så raskt som mulig etter halshugging. Nummerer bakterier i blodet ved seriefortynning og standard platetelling som beskrevet i trinn 1.9.
  8. Steriliser hele nyfødte med 70% etanol før eksisjon av vevsprøver.

7. Vev høsting

  1. I et biosikkerhetsskap, bruk nyfødte med 70% etanol for å forhindre forurensning. Legg dyret på høyre side.
  2. Bruk tang, ta tak i huden på et punkt mellom magen og bakre venstre ben og gjør et snitt med fin-tipped kirurgisk saks. Fortsett å skjære bort huden og bevege seg oppover mot baksiden. Fremdrift til hele milten er utsatt.
  3. Bruk tangen til å gripe milten og fjerne den fra magen, ved hjelp av saks for å koble bindevevet. Plasser milten i løsningen som passer for nedstrøms applikasjonen.
  4. For å få lungene, skrell tilbake brystets hud helt.
  5. Inn ved foten av brystbenet med saks holdt vertikalt, kutt oppover til ribbeburet er delt.
  6. Bruk tang til å gripe høyre og venstre lunger individuelt og fjerne dem fra thoraxhulen. Fjern hjertet fra lungevevet ved å kutte med saks.
  7. Plasser lungen i løsningen som passer for nedstrøms bruk. For RNA-isolasjon, bruk 500 μL guanidinthiocyanat/fenol (GTCP). For histopatologi, bruk 5 ml 10% nøytralbufret formalin.

8. RNA-isolasjon fra lungevev for genuttrykk

  1. Forkjøl mikrocentrifuge til 4 °C.
  2. Hakke lungevevet i GTCP med saks. Deretter homogenisere vevet med en batteridrevet homogenisator. Fortsett til løsningen er så ensartet som mulig. Inkuber ved romtemperatur i 3-5 min.
  3. Bruk filtrerte pipettespisser til å tilsette 100 μL kloroform. Inverter røret i 15 s og inkuber 3-5 min ved romtemperatur.
  4. Sentrifuge i 15 min ved 12.000 x g.
  5. Under spinnet, forberede 1,5 ml rør med 500 μL på 70% etanol. Sett sammen og merk kolonnene og oppsamlingsrørene fra RNA-isolasjonssettet.
  6. Fjern forsiktig det øverste, vandige laget uten å forstyrre det interfase laget som dannes under sentrifugering. Legg det vandige laget i rørene som inneholder 70% etanol.
  7. Flytt etanol og lysate blanding til kolonnen i oppsamlingsrøret.
  8. Fra nå av følger du RNA-isolasjonssettets kommersielle produktprotokoll til den endelige elitasjonen av RNA.
  9. Analyser RNA for renhet og antall. Bruk umiddelbart eller oppbevares ved -80 °C til videre bruk.

9. cDNA syntese

  1. Merk PCR-rør og sett til side.
  2. Tilsett 1 μg RNA til cDNA reaksjonsblandingen for hver prøve.
  3. Legg til reagensene og malen i PCR-røret som beskrevet i cDNA-protokollen. Tilsett enzymet til blandingen sist.
  4. Plasser PCR-rørene i en termocycler med følgende kjøreinnstillinger: 5 min ved 25 °C, 40 min ved 42 °C, 15 min ved 85 °C og 4 °C siste hold.
  5. Fjern PCR-rørene fra termocycler og bruk umiddelbart eller oppbevar ved -20 °C til videre bruk.

10. Kvantitativ PCR-syklus (qPCR) i sanntid

  1. Forbered en reaksjonsblandingscocktail for hvert av genene som skal analyseres. Hver 15 μL PCR-reaksjon krever 7,5 μL 2x reagensblanding, 0,75 μL 20X 5'-FAM-merket genspesifikk primer/sonde og 3,75 μL kjernefritt vann. Amplicons vanligvis varierer fra 60-120 bp.
  2. Tilsett 3 μL cDNA-mal for hver eksperimentelle gruppe til de aktuelle brønnene.
  3. Tilsett 12 μL av den genspesifikke reaksjonsblandingscocktailen til de aktuelle brønnene.
  4. Dekk platen med optisk klebefilm og sentrifuge i 1 min ved 1000 x g for å fjerne eventuelle bobler som kan ha dannet seg i brønnene.
  5. Plasser PCR-platen i en PCR-termocycler i sanntid.
  6. Still inn løpemetoden slik: 3 min ved 95 °C, 40 sykluser på 95 °C i 15 s etterfulgt av 60 °C i 1 min.
  7. Analyser data ved å normalisere genet av interesse til en intern kontroll og uttrykke data fra infiserte prøver i forhold til uinfiserte kontrollprøver ved hjelp av2-ΔΔCt-formelen og enlogg 2-transformasjon av tallene.

11. Lunge histopatologi

  1. Fjern lungene fra neonatalvalpen som beskrevet ovenfor.
  2. Plasser vevet i et volum på 10% nøytralbufret formalin slik at forholdet mellom løsning og vev er ca. 20:1 i 3-7 dager.
  3. Koordiner med en passende histologitjeneste for parafininnbygging, snitting og hematoksylin og eosin (H&E) farging. For dette arbeidet ble West Virginia University Histopathology Core benyttet. Du kan også følge tidligere beskrevne protokoller19.

12. In vitro bakteriell drapsanalyse

  1. Fjern milten fra den uinfiserte neonatale valpen som beskrevet ovenfor, og legg den i en 40 μm nylonkurv i en steril 60 mm petriskål. Gjenta dette og bassenget milter i ett rør som skal høstes og homogeniseres sammen.
  2. Tilsett 5 ml PBS supplert med 10% FBS.
  3. Desingreger vevet ved hjelp av et sterilt 3 ml sprøytestempel til en enkelt celle suspensjon er opprettet.
  4. Samle encellede suspensjon utenfor nylonkurven, overfør til en 15 ml sentrifuge rør, og pellet celler på 350 x g for 5 min.
  5. Suspender cellene i røde blodlegemer lysis buffer (2 ml for opptil 7-8 milt) og la den stå i 5 min ved romtemperatur for å eliminere erytrocytter.
  6. Vask miltytter med PBS og pellet som ovenfor.
  7. Suspender miltytter i 0,25 ml PBS supplert med 0,5% BSA og 2 mM EDTA i henhold til forventet celleutbytte.
  8. Tell miltytter ved hjelp av et hemocytometer eller et annet passende bruksområde.
  9. Isoler Ly6B.2+ (myeloid populasjon av granulocytter /inflammatoriske monocytter) celler med immunomagnetiske perler i henhold til produsentens protokoll.
  10. Seed Ly6B.2+ celler med en tetthet på 1 x 10 5 celler perbrønn i en svart eller hvit 96-brønnsplate i et volum på 0,1 ml DMEM som inneholder 10% FBS, 2 mM glutamin og 25 mM HEPES (komplett medium).
  11. Nummerer bioluminescerende E. coli som beskrevet i avsnitt 1 og forberede bakteriell inokuleum ved ønsket infeksjonsmengde (MOI) i et endelig volum på 0,1 ml. Dette gjøres best ved å gjøre det som er nødvendig for alle brønner på en felles MOI i batch.
  12. Tilsett 0,1 ml bakteriell inokuleum eller komplett medium alene som en kontroll. Inkuber multibrønnplaten ved 37 °C og 5 % CO2 i 1 time.
  13. Bytt ut mediene med 0,2 ml friskt komplett medium som inneholder gentamicin (100 μg/ml) ved å forsiktig fjerne medier med en pipette og legge til friske medier med en ny pipettetspiss. Returner kulturen til inkubasjon i ytterligere 2 timer.
  14. Ved 3 t etterinfeksjon, måle luminescence i hver brønn av lokket kultur plate fra bunnen ved hjelp av en plateleser og deretter returnere kulturen til inkubasjon.
  15. Gjenta målinger av luminescence på andre ønskede tidspunkter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokollen induserte bakteriell sepsis hos neonatale mus, og vi brukte langsgående intravital avbildning, opplisting av bakterier i blodet, histologiske vurderinger av patologi og inflammatoriske cytokinuttrykkprofiler for å studere sykdomsforløpet. Tegn på sykelighet ble observert hos nyfødte unger infisert med både lave (~ 2 x 106 CFUer) og høye (~ 7 x 106 CFUer) inokuler av E.coli over tid. Valper som fikk større inokuler viste mer fremtredende tegn på nød som inkluderte redusert mobilitet, manglende evne til å korrigere sin holdning og nedsatt evne til å opprettholde en oppreist stilling med 24 h etterinfeksjon (hpi). Det var imidlertid en rekke sykelighet som noen valper dukket verre enn andre. Umiddelbart etter infeksjon døde ett lavdosedyr på grunn av isofluraneksponering under en bildebehandlingsøkt for å etablere baseline. Ved 24 hk bukket to av seks høydose dyr under for den systemiske infeksjonen (33,3 % dødelighet). Infiserte valper som fikk enten en høy eller lav dose inoculum veide betydelig mindre enn deres kontrollkull ved 24 hpi (figur 1A, B). Alle valpene som fikk høyere inokus oppfylte endepunktskriteriene ved 24 hki. Som sådan ble alle de infiserte valpene i denne gruppen eutanisert etter avbildning. Bakterier i blodet ble nummerert for en undergruppe av mus som fikk lavere inokus, og for alle dyr som fikk høyere inokutum siden de alle ble eutanisert. Resultatene fra to eksperimenter utført på samme måte indikerer at mens de fleste dyr hadde høye nivåer av bakterier i blodet (CfUer / ml) ved 24 hpi, hadde noen dyr ikke påviselige bakterier i blodet (figur 1C). Sistnevnte antyder at de ryddet infeksjonen på dette tidspunktet. Som forventet hadde unger som fikk høyere inokuleum nesten tre størrelsesordener flere CfUer/ml ved 24 hki i forhold til unger som fikk lavdoseinokus (figur 1C).

Levende dyreavbildning av selvlysende bakterier bekreftet ytterligere spredning av bakterier og økning i vekst i nyfødte valper over tid ved 10 og 24 hki (figur 2 og figur 3). I tillegg, ved hjelp av intravital avbildning med microCT, var vi i stand til å identifisere infeksjonsfoci, inkludert hjernen (figur 2B), lunger (figur 2B, figur 3A, B)og andre perifere vev (figur 2B). Lungene til noen svært infiserte mus viste ugjennomsiktige regioner i samsvar med inflammatorisk konsolidering som sam-lokalisert til selvlysende bakteriell signal (figur 3A). Disse områdene av antatt inflammatorisk ekssudat finnes ikke i uinfiserte kontrolllunger (figur 3A). Ytterligere bevis på en uttalt inflammatorisk cytokin respons i lungene til infiserte valper er demonstrert ved genuttrykkanalyse av IL-1β, IL-6 og TNF-α. En signifikant økning i uttrykk i forhold til kontroller ble observert for alle tre cytokiner i både lav og høy inoculum grupper (Figur 4A). Histopatologien i lungene ble også undersøkt ved 24 hki i kontroll og infiserte valper. Til tross for lignende inflammatoriske cytokinprofiler, ble en progressiv økning i patologi ofte observert fra nedre til høyere inokulum. Sammenlignet med vev fra uinfiserte kontroller viste lungene til infiserte valper bemerkelsesverdige inflammatoriske endringer, fortykning av alveolveggen, økt alveolær blødning og inflammatorisk infiltrasjon (figur 4B). I de alvorligste infeksjonene bidro lungeoverbelastningen og blødningsområdene til en massiv reduksjon i friluftsrommet (figur 4B). Samlet viser disse resultatene at i vår modell av tidlig utbruddet neonatal sepsis kan spredning av selvlysende bakterier følges over tid fra et subscapular inokulasjonssted til viktige infeksjonsfokus og forårsake betydelig betennelse og patologi hos alvorlig infiserte dyr.

For å studere vertsfaktorer som bidrar til bakteriell drap ved medfødte immunceller som monocytter, makrofager og nøytrofiler, utviklet vi en sensitiv in vitro-analyse for å måle bakteriell clearance. Ly6B.2+ celler isolert fra miltene til neonatale mus ble smittet med bioluminescerende E. coli i en rekke MOIer i 1 time og deretter behandlet med gentamicin for å drepe ekstracellulære bakterier. Ved 3, 6, 20 og 48 hk ble intracellulær luminescence målt med en multimodeleser. Som forventet, med økende MOI, ble det registrert mer selvlysende signal ved 3 timer (figur 5). Gradvis gikk dette signalet tapt, noe som indikerer bakteriell clearance (figur 5). Denne analysen er mottagelig for supplerte cytokiner, nøytralisering av utskilte effektorer, og tilsetning av farmakologiske hemmere av cellulære veier for å studere intervensjoner som kan fremme bakteriell clearance og tjene til å forbedre resultatene i neonatal sepsis modell beskrevet her.

Figure 1
Figur 1: Endringer i kroppsvekt og bakteriell replikering hos septiske neonatale mus.
(A, B) Individuelle musevekter i en gruppe (lav og høy) uttrykt som en prosentandel av gjennomsnittsvekten til kullmate kontrollvalper. Data presenteres som gjennomsnittlig prosentandel ± SEM. Individuelle t-tester ved hvert tidspunkt etter infeksjon viser signifikante forskjeller ved 24 timer mellom kontrollvalper og unger som fikk lav inokulum (p<0,0001) (A), eller mellom kontrollvalper og unger som fikk høy inokulum (p=0,0031) (B). (C) CFU / ml i blodet ved 24 hpi ble logg forvandlet og presentert som gjennomsnittet ± SEM. Mann-Whitney test avslører en trend mot betydning mellom lav og høy dose inoculums (p= 0,0882). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Intravital bildebehandling viser spredning av bakterier hos nyfødte mus over tid.
(A) En representativ neonatal mus (#1) infisert med et inokutum på ~ 2 x 106 CFUer vises på tidspunktet 0, 10 og 24 hpi. En kolorimetrisk skala med minimums- og maksimumsstrålingsverdier per tidspunkt vises for hvert tidspunkt. Mus ved 0 og 10 timer vises både på tidspunktskalaen og 24-timerskalaen for å demonstrere endringer i bakteriell vekst over tid. (B) Representative 3D rekonstruerte microCT bilder av samme neonatal mus på 10 og 24 hpi vises. Hvert gang punkt har bilder på overhead, transaxial, og koronar perspektiver. I transaksialbildet på 24 hk har flyet beveget seg mot musens periferi for å bedre vise infeksjonsfokus i perifert vev. Hvite piler indikerer hjernen og nyrene ved 10 hki og nyre og lunge ved 24 hki. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Lungene er et sted for større infeksjon under bakteriell sepsis hos nyfødte.
(A) Representative 3D rekonstruerte microCT bilder av en neonatal mus (#5) infisert med en inoculum på ~ 7 x 106 CFUer vises på 24 hpi sammenlignet med en uinfisert kontroll. Begge musene vises i transaksial perspektiv og lungene er indikert av hvite piler. Den infiserte musen ble plassert på to utstrålingsvekter (fotoner/sek). Skala #1 inkluderer alle 6 bølgelengder (500, 520, 560, 580, 600, 620 nm) og skala #2 inkluderer bare 500, 520 og 560 nm bølgelengder. Denne andre skalaen tillot oss å visualisere et økt signal i bakterier i lungene fordi lavere bølgelengder absorberes mer av vev og gir sterkere signal. (B) Representative 3D rekonstruerte microCT bilder av en neonatal mus (#4) infisert med en inokuler på ~ 7 x 106 CFUer vises på 24 hpi. Denne gangen har bilder på overhead, sagittal, transaksial, og koronale perspektiver. Hvite piler indikerer infeksjonsfoci i lungene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Betennelse og tilhørende histopatologiske funn i lungene til septik nyfødte.
Ved 24 hk ble lungene høstet fra valper som fikk ~2 x 106 eller 7 x 106 CfUer eller uinfiserte kontroller. (A) RNA ble isolert og uttrykket for IL-1β, IL-6 eller TNF-α som fastslått i forhold til uinfiserte kontroller ved kvantitativ sanntids-PCR ved hjelp av formelen 2-ΔΔCt. Dataene vises som den gjennomsnittlige logg2 forvandlet endring i uttrykk ± SEM for hvert inoculum som angitt. Statistisk signifikans ble bestemt ved bruk av uavsluttede t-tester av ΔCt-verdier mellom individuelle cytokingener og internkontrollen i konfidensintervallet på 95 %. Stjerner indikerer p<0,01. -Jeg har ikke noe å si. Histopathologic deler av H & E farget lungevev (20x, interesseområde konstruert i klippemaske og forstørret for klarhet) er vist. Lungevev fra en representativ uinfisert kontroll (B) eller infisert nyfødte ved lav (C) eller høy (D) inoculum er vist. Gule piler indikerer alveolr fortykning (C) eller blødning (D). Vektstangen = 500 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: En in vitro-analyse for bakteriell clearance.
Ly6B.2+ celler ble isolert fra miltene av uinfiserte kontroll nyfødte. Cellene ble seeded i 96-brønnplater og infisert med luciferase-uttrykkende E. coli O1:K1:H7 ved et mangfold av infeksjon (MOI) på 10, 50 eller 250 som angitt. Etter 1 t ble mediet erstattet med friskt som inneholdt gentamicin (100 μg/ml). Gjennomsnittlig relative lysenheter (RLU) ± SE for et individuelt eksperiment representant for flere vises. Statistisk signifikans i konfidensintervallet på 95 % ble bestemt ved hjelp av uavvikede t-tester med Welchs korreksjon; stjerner indikerer p<0,05. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vår subscapular infeksjon modell for å indusere bakteriell sepsis i neonatal mus er en ny metode for å studere langsgående spredning av bakterielle patogener i sanntid. Intravital bildebehandling gir mulighet til å utforske bakteriell formidling i sanntid i nyfødte. Dette er avgjørende for å forstå kinetikken til bakteriell formidling og å studere vertsresponsen og skaden i riktig sykdomsfase. Musevalper administreres en subkutan, subscapular injeksjon av bakteriell inoculum. Denne injeksjonsteknikken er enklere enn andre vanlige alternativer, som halevenen og intraperitoneale infeksjoner, da det krever mindre presisjon på et injeksjonssted. Dette er viktig gitt den lille størrelsen på valpene. Den intravitale avbildningen muliggjør en langsgående vurdering av bakteriell spredning og spredning i perifert vev og sentralnervesystemet over tid uten å måtte ofre dyret. Lignende imaging tilnærminger og teknologier har blitt brukt for studiet av kreftbiologi og metastase20,21. Videre, mens en annen studie har sitert bruk av bioluminescerende avbildning under en E. coli-infeksjon hos neonatale rotter22, her har vi brukt tilnærmingen til neonatale mus, hvor vår metodikk tillater evaluering av bakteriell kinetikk under murin sepsis. Visualisering av bakteriene er basert på utslipp av bioluminescerende lys ved ulike bølgelengder fra bakterier (f.eks. bakteriell luciferaseaktivitet) i dyret. Bioluminescens visualiseres deretter gjennom et avkjølt ladet koblede enhetskamera (CCD). Den resulterende visualiserte bioluminescensen kan deretter rekonstrueres til et 3D-bilde som viser både romlige og temporale effekter av bakterier i et dyr. For et ekstra, mer nyansert lag med datainnsamling, gir vellykket dyreidentifikasjon gjennom haletatovering en gjentatt tiltaksvurdering av individuelle valper over tid og identifisering av mulige outliers i en gitt eksperimentell gruppe.

Den mest vellykkede anvendelsen av den beskrevne modellen krever nøyaktighet i utarbeidelsen av bakteriell inokulum. Her beskriver vi en optimalisert metode for bakteriell forberedelse ved hjelp av en forhåndsetablert og validert E. coli vekstkurve som reduserer variasjonen mellom målet og faktisk inoculum. Dette tillater eksperimentell reproduserbarhet på et tiltenkt inoculum. Inkluderingen av to inokuler i vår modell viste doseavhengige resultater i blod-CFUer, dødelighet og lungepatologi. Noen aspekter av sykdomsbanen var imidlertid ikke doseavhengige. Manglende vektøkning hos infiserte dyr var ikke avhengig av inokulumet ved 24 hki. I tillegg ble lignende nivåer av inflammatorisk cytokinuttrykk observert i lungene som respons på infeksjon med begge inoculums. Hvorvidt dette mønsteret ville bli replikert i alle vev hvor bakterier ble observert, som nyre, lever, milt og hjerne, gjenstår å bli bestemt. I tillegg til sepsis er E. coli O1:K1:H7 forbundet med meningitt i den nyfødte befolkningen23. Denne hjerneinfeksjonen oppstår når bakterier fra periferien invaderer og trenger inn i blodhjernsbarrieren. Fremtidige studier vil utforske dette aspektet av modellen gjennom analyse av endringer i tett kobling protein uttrykk, samt teste ulike områder av bakterielle inoculums. En ekstra modifikasjon under intravital avbildning inkluderer tilsetning av en entall bomullsdott, doused i isofluran, som er plassert ca 2-3 inches unna musene under avbildning. Som svar på tidligere eksperimenter hvor neonatalvalpene har gjenvunnet bevisstheten under bildeøkten, og forhindrer nøyaktig bildeoppkjøp, plasserer vi nå bomullsballen nær nok til musene for å holde dem kontinuerlig bedøvet under bildebehandling. Det er imidlertid viktig at dette ikke gjøres så nær at de ikke klarer å komme seg fra anestesi.

Selv om den er fleksibel og lett tilpasningsdyktig for studiet av kinetikken til forskjellige bakterier i ulike dyre- og sykdomsmodeller, har vår protokoll noen begrensninger å vurdere. Den første begrensningen å vurdere er at den subscapular infeksjonsveien ikke speiler en naturlig overføringsmåte. Et hovedmål i utviklingen av vår modell fra begynnelsen var imidlertid å etablere en lett reproduserbar leveringsmåte som kunne brukes til å etablere en systemisk infeksjon som replikerer aspekter ved menneskelig sykdom. Derfor, i denne rapporten, beskriver vi en modell av humant tidlig sepsis sykdomssyndrom, ikke en modell for naturlig overføring. Det er en etablert modell for oral levering hos nyfødte rotter som replikerer noen aspekter av vanlig menneskelig overføring, for eksempel innledende kolonisering av E. coli-infeksjon i fordøyelseskanalen og påfølgende spredning til blodet og perifert vev, inkludert hjernen22. Modellen etablert av Witcomb og kolleger inkorporerer også bioluminescerende E. coli og intravital avbildning. Videre er det avgjørende å minimere isofluraneksponering, samt injisere, haletatovering og håndtere valper så raskt som mulig uten å gå på akkord med nøyaktigheten og presisjonen til teknikkene i et forsøk på å redusere stressnivået for både nyfødte og dammer. I noen tilfeller, hvis valpene opplever forbedrede menneskeinduserte og / eller eksperimentelle manipulasjoner, kan demningene stoppe sykepleie og omsorg for valpene, noe som resulterer i redusert overlevelse som ikke er relatert til infeksjonen. På samme måte har valper som er utsatt for isofluran i lengre perioder utover de omtrentlige 10 minuttene av en bildebehandling økt økt økt risiko for død; Dermed er det avgjørende å levere akkurat nok isofluran til å bedøve musene tilstrekkelig, men ikke nok til å eutanisere dem. Et siste vurderingspunkt er følsomhetsgrensen. Vev der mindre enn 104 CFUer/ml E. coli ble nummerert selvlysende signalet registrert faller på den lave enden av det påvisbare området, i henhold til skaleringsmetoden som brukes i bildeprogramvaren3. Dermed kan noen vev koloniseres med lave nivåer av bakterier, men vises uten synlig bioluminescens.

For tiden benytter de fleste studier voksne metoder for bakteriell formidling, som intraperitoneal (i.p.) og haleveneinjeksjoner for nyfødte. Pluschke og Pelkonen analyserte effekten av E. coli K1 på neonatale mus gjennom i.p., halevenen og orale infeksjoner24. Denne studien viste at ulike genotyper av mus med immuneffektivitet er mer utsatt for K1-stammen; Imidlertid er mange aspekter av verten immunrespons mot infeksjon samt mekanismene for bakteriell spredning uadressert. Deshmukh og kolleger smittet neonatal mus intraperitoneally med E. coli K1 eller K. pneumoniae og målte CFUer i milten og leveren ved 72 hpi25. Denne studien analyserte også noen aspekter ved vertsrespons på infeksjon basert på pre-eksponering av mus for antibiotika. Grundig undersøkelse av bakteriell spredning av perifert vev og blod over tid parallelt med inflammatorisk profilering i samme vev (annet enn granulocytose) ble imidlertid ikke adressert. Andre studier av neonatal sepsis hos mus med Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis,Gruppe B Streptococcusog E. coli utforsker varierende aspekter av verts immunsystemet som svar på infeksjon. Imidlertid bruker ingen av disse studiene intravital bildebehandling for å utforske kinetikken til bakteriell formidling eller lokalisering av infeksjonsfoci23,25,26,27. Vår metode for infeksjon og intravital avbildning, kombinert med bakteriell byrdevurdering og inflammatorisk profilering av perifert vev, gjør at vi kan undersøke aspekter av både verten og patogenet under infeksjon, noe som gir en mer presis forståelse av vertspatogene samspill under sepsis.

Vi har til hensikt å bruke denne infeksjonen og bildemodellen for å fremme vår forståelse av tidlig neonatal sepsis ved hjelp av en rekke patogene bakterier som vanligvis er ansvarlige for sepsis hos nyfødte, inkludert gruppe B streptokokker, K. pneuomoniaeog Listeria monocytogenes. Denne infeksjonsmodellen vil tillate oss å langsgående sammenligne spredning av forskjellige bakterielle patogener parallelt med vertsresponsen hos nyfødte. I tillegg er denne modellen tilpasningsdyktig til adoptivoverføring av spesifikke (fluorescerende konjugerte) immuncelletyper for å studere deres migrasjon til infeksjonssteder og påfølgende påvirkning på vertsrespons og kontroll av bakterier. Dette gir mulighet til å bedre forstå vertspatogeninteraksjonene som oppstår under sepsis tidlig i livet på måter som ikke tidligere har blitt demonstrert.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av institusjonelle midler til .M.R.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL Insulin Syringe Coviden 1188128012 Inoculum or PBS injection
10% Neutral Buffered Formalin VWR 89370-094 Histopathology
ACK Lysis Buffer Gibco LSA1049201 Bacterial clearance assay
Animal Tattoo Ink Paste Ketchum KI1482039 Animal identification
Animal Tattoo Ink Green Paste Ketchum KI1471039 Animal identification
Anti-Ly-6B.2 Microbeads Miltenyi Biotec 130-100-781 Cell isolation
Escherichia coli O1:K1:H7 ATCC 11775
Escherichia coli O1:K1:H7-lux (expresses luciferase) N/A N/A Constructed in-house at WVU
E.Z.N.A. HP Total Extraction RNA Kit Omega Bio-tek R6812 RNA extration
DPBS, 1X Corning 21-031-CV
Difco Tryptic Soy Agar Becton, Dickinson and Company 236950 Bacterial growth
IL-1 beta Primer/Probe (Mm00434228) Thermo Fisher Scientific 4331182 Cytokine expression qPCR
IL-6 Primer/Probe (Mm00446190) Thermo Fisher Scientific 4331182 Cytokine expression qPCR
iQ Supermix Bio-Rad 1708860 Real-time quantitative PCR
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708891 cDNA synthesis
Isolation Buffer Miltenyi Biotec N/A Bacterial clearance assay
IVIS Spectrum CT and Living Image 4.5 Software Perkin Elmer N/A Intravital imaging
LB Broth, Lennox Fisher BioReagents BP1427-500 Bacterial growth
EASYstrainer (Nylon Basket) Greiner Bio-one 542 040 Cell strainer
SpectraMax iD3 Molecular Devices N/A Plate reader
Pellet Pestle Motor Grainger 6HAZ6 Tissue homogenization
Polypropylene Pellet Pestles Grainger 6HAY5 Tissue homogenization
Prime Thermal Cycler Techne 3PRIMEBASE/02 cDNA synthesis
TNF-alpha Primer/Probe (Mm00443258) Thermo Fisher Scientific 4331182 Cytokine expression qPCR
TriReagent (GTCP) Molecular Research Center TR 118 RNA extration

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Qazi, S. A., Stoll, B. J. Neonatal sepsis: a major global public health challenge. Pediatr Infect Dis J. 28, 1-2 (2009).
  2. Simonsen, K. A., Anderson-Berry, A. L., Delair, S. F., Davies, H. D. Early-onset neonatal sepsis. Clinical Microbiology Reviews. 27 (1), 21-47 (2014).
  3. Seman, B. G., et al. Elevated levels of interleukin-27 in early life compromise protective immunity in a mouse model of Gram-negative neonatal sepsis. Infections and Immunity. , (2019).
  4. Schrag, S. J., et al. Epidemiology of Invasive Early-Onset Neonatal Sepsis, 2005 to 2014. Pediatrics. 138 (6), 20162013 (2016).
  5. Stoll, B. J., et al. Early onset neonatal sepsis: the burden of group B Streptococcal and E. coli disease continues. Pediatrics. 127 (5), 817-826 (2011).
  6. Weston, E. J., et al. The burden of invasive early-onset neonatal sepsis in the United States, 2005-2008. Pediatrics and Infectious Disease Journal. 30 (11), 937-941 (2011).
  7. Hornik, C. P., et al. Early and late onset sepsis in very-low-birth-weight infants from a large group of neonatal intensive care units. Early Human Development. , Suppl 2 69 (2012).
  8. Vergnano, S., Sharland, M., Kazembe, P., Mwansambo, C., Heath, P. T. Neonatal sepsis: an international perspective. Archives of Disease in Childhood: Fetal and Neonatal Edition. 90 (3), 220-224 (2005).
  9. Kraft, J. D., et al. Neonatal macrophages express elevated levels of interleukin-27 that oppose immune responses. Immunology. 139 (4), 484-493 (2013).
  10. Basha, S., Surendran, N., Pichichero, M. Immune responses in neonates. Expert Reviews of Clinical Immunology. 10 (9), 1171-1184 (2014).
  11. Gleave Parson, M., et al. Murine myeloid-derived suppressor cells are a source of elevated levels of interleukin-27 in early life and compromise control of bacterial infection. Immunology and Cell Biology. 97 (5), 445-446 (2018).
  12. Adkins, B., Leclerc, C., Marshall-Clarke, S. Neonatal adaptive immunity comes of age. Nature Reviews Immunology. 4 (7), 553-564 (2004).
  13. Kim, S. K., Keeney, S. E., Alpard, S. K., Schmalstieg, F. C. Comparison of L-selectin and CD11b on neutrophils of adults and neonates during the first month of life. Pediatrics Research. 53 (1), 132-136 (2003).
  14. Velilla, P. A., Rugeles, M. T., Chougnet, C. A. Defective antigen-presenting cell function in human neonates. Clinical Immunology. 121 (3), 251-259 (2006).
  15. Le Garff-Tavernier, M., et al. Human NK cells display major phenotypic and functional changes over the life span. Aging Cell. 9 (4), 527-535 (2010).
  16. Weinberger, B., et al. Mechanisms underlying reduced responsiveness of neonatal neutrophils to distinct chemoattractants. Journal of Leukocyte Biology. 70 (6), 969-976 (2001).
  17. Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system. Nature Reviewss Immunology. 9 (3), 162-174 (2009).
  18. National Research Council. Guide for the care and use of laboratory animals, 8th ed. , National Academies Press. Washington, DC. (2011).
  19. Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification. Journal of Visualized Experiments. (125), e55796 (2017).
  20. Bayarmagnai, B., Perrin, L., Esmaeili Pourfarhangi, K., Gligorijevic, B. Intravital Imaging of Tumor Cell Motility in the Tumor Microenvironment Context. Methods in Molecular Biology. 1749, 175-193 (2018).
  21. Beerling, E., Ritsma, L., Vrisekoop, N., Derksen, P. W., van Rheenen, J. Intravital microscopy: new insights into metastasis of tumors. Journal of Cell Science. 124, Pt 3 299-310 (2011).
  22. Witcomb, L. A., Collins, J. W., McCarthy, A. J., Frankel, G., Taylor, P. W. Bioluminescent Imaging Reveals Novel Patterns of Colonization and Invasion in Systemic Escherichia coli K1 Experimental Infection in the Neonatal Rat. Infection and Immunity. 83 (12), 4528 (2015).
  23. Singh, K., et al. Inter-alpha inhibitor protein administration improves survival from neonatal sepsis in mice. Pediatric Research. 68 (3), 242-247 (2010).
  24. Pluschke, G., Pelkonen, S. Host factors in the resistance of newborn mice to K1 Escherichia coli infection. Microb. Patho. , 93-102 (1988).
  25. Mancuso, G., et al. Role of interleukin 12 in experimental neonatal sepsis caused by group B streptococci. Infections and Immunity. 65 (9), 3731-3735 (1997).
  26. Thammavongsa, V., Rauch, S., Kim, H. K., Missiakas, D. M., Schneewind, O. Protein A-neutralizing monoclonal antibody protects neonatal mice against Staphylococcus aureus. Vaccine. 33 (4), 523-526 (2015).
  27. Andrade, E. B., et al. TLR2-induced IL-10 production impairs neutrophil recruitment to infected tissues during neonatal bacterial sepsis. Journal of Immunology. 191 (9), 4759-4768 (2013).

Tags

Immunologi og infeksjon utgave 162 bioluminescens intravital bildebehandling E. coli subkapulær inokulasjon nyfødte sepsis betennelse cytokiner
En neonatal bildemodell av gram-negativ bakteriell sepsis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Seman, B. G., Povroznik, J. M.,… More

Seman, B. G., Povroznik, J. M., Vance, J. K., Rawson, T. W., Robinson, C. M. A Neonatal Imaging Model of Gram-Negative Bacterial Sepsis. J. Vis. Exp. (162), e61609, doi:10.3791/61609 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter