Summary
Инфекция неонатальных мышей биолюминесцентной кишечной палочкой O1:K1:H7 приводит к септической инфекции со значительным воспалением легких и патологией легких. Здесь мы описываем процедуры моделирования и дальнейшего изучения неонатального сепсиса с использованием продольной интравитальной визуализации параллельно с перечислением системных бактериальных обременений, воспалительного профилирования и гистопатологии легких.
Abstract
Новорожденные находятся на повышенный риск бактериального сепсиса из-за уникального иммунного профиля они отображают в первые месяцы жизни. Мы установили протокол для изучения патогенеза E. coli O1:K1:H7, серотипа, ответственного за высокие показатели смертности у новорожденных. Наш метод использует интравитаную визуализацию неонатальных щенков в разные моменты времени во время прогрессирования инфекции. Эта визуализация, параллельно с измерением бактерий в крови, воспалительным профилированием и гистопатологией тканей, означает строгий подход к пониманию динамики инфекции во время сепсиса. В настоящем докладе мы моделем два инфекционных инокулума для сравнения бактериального бремени и тяжести заболевания. Мы находим, что подкапулярная инфекция приводит к распространению инфекции на 10 ч после заражения. К 24 ч инфекция люминесцентной кишечной палочки была в изобилии в крови, легких и других периферических тканях. Выражение воспалительных цитокинов в легких является значительным на 24 ч, и это сопровождается клеточной инфильтрации и доказательства повреждения тканей, что увеличивается с инфекционной дозы. Интравитальная визуализация имеет некоторые ограничения. Это включает в себя люминесцентный порог сигнала и некоторые осложнения, которые могут возникнуть с новорожденными во время анестезии. Несмотря на некоторые ограничения, мы находим, что наша модель инфекции предлагает понимание продольной динамики инфекции во время неонатального сепсиса мурина, который не был тщательно изучен до сих пор. Мы ожидаем, что эта модель также может быть адаптирована для изучения других критических бактериальных инфекций в раннем возрасте.
Introduction
Бактериальный сепсис является значительной проблемой для новорожденных, которые демонстрируют уникальный иммунный профиль в первые дни жизни, что не обеспечивает адекватной защиты отинфекции 1. Неонатальный сепсис по-прежнему является важной проблемой здравоохранения США, на которую приходится более 75 000 случаев заболевания в год только вСША 2. Для углубленного изучения этих инфекций необходимы новые модели животных, которые подысовывают аспекты болезней человека. Мы создали модель неонатальной мыши инфекции с использованием Escherichia coli, O1:K1:H73. E. coli является второй ведущей причиной неонатального сепсиса в США, но отвечает за большинство сепсиса связанныхсмертности 4,5. Тем не менее, это ведущая причина, когда досрочные и очень низкой массы тела при рождении (VLBW) дети считаютсясамостоятельно 5. Серотип К1 чаще всего ассоциируется с инвазивными инфекциями кровотока и менингитом у новорожденных6,7. В настоящее время нет других вариантов лечения, кроме антибиотиков и поддерживающей помощи. Между тем, темпы устойчивости к антибиотикам продолжают расти для многих патогенных бактерий, с некоторыми штаммами кишечной палочки устойчивы к множеству антибиотиков, обычно используемых влечении 8. Таким образом, крайне важно, чтобы мы продолжали генерировать методы для изучения механизмов сепсиса и принимающей реакции у новорожденных. Эти результаты могут помочь улучшить текущее лечение и результаты инфекции.
Иммунное состояние новорожденных характеризуется как фенотипическими, так и функциональными различиями по сравнению со взрослыми. Например, повышенные уровни противовоспалительных и нормативных цитокинов, таких как интерлеукин (IL)-10 и IL-27, как было показано, производятся макрофагами, полученными пуповинной кровью, и присутствуют на более высоких уровнях всыворотке крови муринных новорожденных 9,10,11. Это согласуется с более низкими уровнями IFN-α, IFN-ɣ, IL-12 и TNF-α, которые часто сообщаются из неонатальных клеток по сравнению со взрослымиколлегами 10. Кроме того, неонатальной иммунной системы перекос в сторону Th2 и нормативных Т-клеток ответ по сравнению совзрослыми 12. Повышенное количество нейтрофилов, Т-клеток, В-клеток, НК-клеток и моноцитов также присутствует у новорожденных, но со значительными функциональными нарушениями. Это включает в себя дефекты в выражении маркеров поверхности клеток и антиген презентации, которыепредлагают незрелость 13,14,15. Кроме того, неонатальные нейтрофилов значительно не хватает их способности мигрировать к химиотатическимфакторам 16. Клетки супрессора, полученные из миелоида (MDSCs), также находятся на повышенных уровнях у новорожденных и недавно показали, что источник il-2711. MDSCs являются весьма подавляющим к Т-клеток17. В совокупности эти данные демонстрируют ограничения в неонатальном иммунитете, которые придают повышенную восприимчивость к инфекции.
Для изучения прогрессирования бактериального бремени и вскрытия защитных иммунных реакций хозяина во время неонатального сепсиса, мы разработали новую модель инфекции. Неонатальным мышам в 3-4 дня жизни трудно вводить внутриперитонеашеическое пространство или хвостовую вену. В нашей модели, день 3 или 4 щенков вводят бактериальной инкулум или PBS подкожно в лопаткулярной области. Системная инфекция развивается и с использованием люминесцентной E. coli O1:K1:H7, мы можем продольно изображения отдельных неонатальных мышей следовать распространенной бактериальной нагрузки в периферических тканях. Это первая модель сообщили использовать интравитальной визуализации, чтобы понять кинетику распространения бактерий во время сепсиса в мурине новорожденных3.
Здесь мы описываем протокол, чтобы вызвать септические инфекции кишечной палочки у неонатальных мышей3. Мы описываем, как подготовить бактериальный инокулум к инъекциям, и как собрать ткани для оценки патологии, измерения воспалительных маркеров путем анализа экспрессии генов и перечисления бактериальной нагрузки. Кроме того, описано использование люминесцентной кишечной палочки для интравитальной визуализации инфицированных новорожденных и количественной оценки бактериальных убийств неонатальными иммунными клетками. Эти протоколы также могут быть адаптированы для изучения других важных бактериальных инфекций у новорожденных. Представленные здесь данные представляют собой общий новый подход к пониманию динамики инфекции в переводимой модели неонатального сепсиса.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры были одобрены Комитетами по уходу и использованию животных Западной Вирджинии и проведены в соответствии с рекомендациями Руководства по уходу и использованию лабораторных животных Национальным исследовательскимсоветом 18.
1. Подготовка бактериального инокулума
- Полоса триптического соевого агара (TSA) пластины с инокуляции петли для изоляции одной колонии из морозильной камеры фонда E. coli O1:K1:H7-люкс, который быстро выражает люцифераза и несет kanamycin сопротивление3. Инкубировать на ночь при 37 градусов по Цельсию.
- На следующий день позвольте бульону Luria (LB) прийти к комнатной температуре (25 градусов по Цельсию) в кабинете биобезопасности.
- Под капотом шкафа биобезопасности идентифицировать одну колонию из полосатой пластины и привить ее в 3 мл LB, дополненной канамицином (30 мкг/мл). Инкубировать на ночь при 37 градусов по Цельсию со тряской (220 об/мин). Это стартовая культура.
- Разбавить культуру стартера 1:100 в свежие 3 мл LB под капотом шкафа биобезопасности и вернуть его в инкубатор на 2-3 ч при 37 градусов по Цельсию со тряской (220 об/мин). Это фондовая культура.
- Прочитайте оптическую плотность (OD) как пустой, так и фондовой культуры на 600 нм с помощью спектрофотометра. Добавьте 100 л LB (не содержащий бактерий) в один колодец из 96 хорошо плоская нижняя анализная пластина; это пустой. Затем добавьте 100 мкл из биржевой культуры в отдельную колодец. Повторите еще две репликации. Абсорбанс читается с помощью считыватель пластин.
- Вычесть пустое поглощение из стоимости абсорбции культуры акций (значение OD) и сравнить с ранее сгенерированной и проверенной кривой роста, чтобы определить приближение бактериальной плотности в культуре запасов для подготовки инфекционной дозы.
- Создание целевых инокулумов в зависимости от исследовательского вопроса. Для этого исследования были использованы целевые инокулы 2х 10 6 (низкий)и 7 х 10 6 (высоких) колонийообразующих единиц (CFUs) на мышь (/мышь).
- Разделите целевую дозу на мышь (DoseT)на оценочную концентрацию бактерий в биржевой культуре (Stock), чтобы получить объем бактерий, необходимых из биржевой трубки (VS).
- Умножьте V S на количество мышей (NM), которые должны быть инфицированы вместе с достаточно для 5-10 дополнительных услуг для общего количества бактерий, необходимых для инфекции плюс 5-10 дополнительных доз. Удалите этот объем из стоковой трубки и добавьте его в новую центрифугу трубки.
- Используйте уравнение ниже:
ДозаT/Stock - VS x NM - общий объем (VT)бактерий, которые будут удалены из биржевой трубки.
- Центрифуга бактерий на 2000 х г в течение 5 мин при 4 градусов по Цельсию и повторно бактериальных гранул в 50 МКЛ PBS (рН 7,2-7,6) на мышь, чтобы быть инфицированы (например, для 10 доз 2 х 106 бактерий каждую дозу, гранулы 2 х10 7 бактерий будут повторно использованы в 500 йл PBS). Опять же, рекомендуется готовить больше инокулов, чем это необходимо. Подготовь равный объем PBS только для контрольных прививок. Поддержание инфекционного инокулума и PBS контроля на льду до инфекции.
- Выполните семь десятикратных серийных разбавлений в PBS в 96 хорошо пластиковых нижней разбавленной пластины, и пластины 25 йл разбавления в дублировать на квадрант TSA пластин, дополненных канамицин (30 мкг / мл), чтобы перечислить фактическое количество бактерий вводят. Инкубировать при 37 градусов по Цельсию на ночь для формирования колонии до перечисления.
2. Идентификация животных
- Упорядочить достаточное количество пар разведения, так что пометы могут быть синхронизированы для возрастных щенков. Вариабельность ± 1 день приемлема.
- Определите беременную мышь C57BL/6 и следите за рождением помета до запланированного эксперимента по точному определению возраста.
- Чтобы различать контроль и инфицированных 3- или 4-дневных щенков, используйте пару небольших, тонко наконечником, ножницы радужной оболочки глаза, чтобы резать концы хвостов контроля щенков только. Зараженные щенки не получают хвостовые ножницы. Перед резки хвоста, дезинфицировать кожу с ватным тампоном облили 70% этанола. При необходимости нанесите давление на конец хвоста ватным тампоном или марлей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура выполняется под капотом шкафа биобезопасности. Хвост фрагмент примерно 1 / 8 дюйма достаточно. - Чтобы определить щенков в пределах контроля и инфицированных групп, используйте 1 мл инсулина шприц с 28 G х 1 / 2 'постоянная игла татуировку хвосты щенков. Перед татуировкой, дезинфицировать кожу с ватным тампоном облили 70% этанола. Эта процедура выполняется под капотом шкафа биобезопасности.
- Чтобы татуировка хвост, применить животных чернила татуировки на кончике иглы. Далее, тщательно удерживайте щенка одной рукой, с их хвост полностью подвергается. Аккуратно вставьте иглу под кожу, сохраняя при этом поверхностный уровень глубины, и двигайте иглу параллельно коже несколько миллиметров, пока не будет создана небольшая маркировка, или точка. Подождите несколько секунд, прежде чем медленно удалить иглу из-под кожи, чтобы избежать избытка чернил, высвобождающих из-под кожи.
- При необходимости нанесите давление на рану ватным тампоном или марлей. Удалите избыток чернил татуировки на поверхности кожи с 70% этанола.
- Повторите этот процесс с последующими мышами в инфицированных и контрольных групп, добавляя дополнительную точку с каждым последующим щенком татуировку (например, щенок 1 будет иметь 1 точку на хвосте, щенок 2 будет иметь две точки на хвосте и т.д.).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для дополнительного уровня идентификации рекомендуется использовать отдельные цвета чернил татуировки животных для контроля и инфицированных групп.
3. Подкапулярная прививка
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого исследования, 2 эксперимента были проведены с низкой дозы и высоких доз группы, предназначенные для каждого эксперимента. В первом эксперименте, 7 щенков получили низкие дозы инокулума (4 щенков были использованы в качестве контроля), и 5 щенков из отдельного помета были даны высокие дозы (3 щенков были использованы в качестве контроля). Детеныши из эксперимента 1 предоставили данные только для 24 часов времени. Во втором эксперименте, 8 щенков получили низкую дозу инокулума (2 щенков были использованы в качестве контроля), и 6 щенков получили высокую дозу инокулума (2 щенков были использованы в качестве контроля). Щенки из эксперимента 2 предоставили данные для точек времени 0, 10 и 24 ч.
- Возраст матч щенков ≤ 1 день. Присвойте каждому помету либо низкую дозу, либо высокую дозу помета. В помете случайным образом назначить щенков в качестве контроля или инфицированных щенков.
- На 3 или 4 день послеродовой, рекордный вес всех щенков до прививки с E. coli-lux или PBS управления. Отделить плотину от щенков в течение этого времени, чтобы убедиться, что они не перемещаются во время инфекции.
- В кабинете биобезопасности с помощью инсулиновой иглы, аспират либо PBS или E. coli-lux inoculum. Для этой работы были использованы инокулумы 2 х10 6 и 7 х10 6 CFUs на мышь. Держите как инфекционные инокулум и PBS на льду до введения через подкапулярные инъекции.
- Поместите новорожденных на чистую поверхность в капюшоне шкафа биобезопасности и поднимите кожу на затылке, как бы потертого щенка.
- В пространстве, созданном между кожей и мышцей животного, вставьте иглу, скошенную вверх, прямо под кожей и ввись 50 МКЛ PBS или E. coli-lux. Одновременно отпустите ущипнул часть кожи, чтобы предотвратить инъекцию обратного потока.
- Удалите иглу медленно и с осторожностью. Поместите щенков обратно с плотинами после инъекций закончены.
ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за их анатомической стадии развития, это технически сложно управлять хвостовой вены или внутриперитонеальной инъекции неонатальных щенков в день 3-4. Таким образом, маршрут подкапулярной инфекции был выбран для этого исследования из-за простоты исполнения.
4. Оценка заболеваний и критериев конечных точек
- Мониторинг щенков два раза в день в течение всего срока инфекции. Обратите внимание на какие-либо отклонения во внешнем виде.
- Рекордные веса как объективное измерение заболеваемости.
- В дополнение к изменениям веса, проверить способность щенков, чтобы исправить себя, позиционирование новорожденного на спинной стороне. Больные животные не смогут перевернуться на вентраловую сторону и на ноги или с трудом заверят это действие.
- Проверьте следующие, чтобы отметить животных близко к конечной точки критериев: менее 85% от нормальной массы тела; снижение движения и неспособность исправить себя; обесцвечивание кожи и более серый или прозрачный внешний вид, в отличие от розового; чувство прохлады на ощупь, свидетельствует о снижении температуры тела и геморрагических синяков по бокам, также свидетельствует о заблаговременной болезни.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если новорожденные не смогли набрать вес в течение двух дней и соответствовать любому из описаний в шагах 4.4, они соответствовали критериям конечной точки. Детеныши, которые получают высокую дозу, часто отвечают критериям конечной точки на 24 ч. Контроль щенков в пределах низких и высоких доз пометов будет усыплен в то же время, чтобы обеспечить сравнительный анализ между контрольными и экспериментальными группами. Перейти к эвтаназии разделе ниже.
5. In vivo визуализации бактериального бремени
- Используйте микроКТ-изображение и программное обеспечение для визуализации и последующего анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Цвет кожи щенка не влияет на качество изображения. - Поместите клетку с E. coli-lux-инфицированныхнеонатальных мышей и плотины в BSL-2 уровне ламинарного потока капот. Удалите мышей, которые будут изображены, и поместите в прозрачную камеру изофлюрана внутри капота. Рекомендуется начать с неинфицированных элементов управления, чтобы оценить количество изофлюрана необходимо.
- Откройте программное обеспечение на компьютере, прикрепленном к microCT. Инициализировать систему и ждать, пока температура CCD зафиксировать при температуре -90 градусов по Цельсию.
- Включите испаритель изофлюрана и отрегулируйте циферблат до 5% потока изофлюрана. Держите мышей в камере с этой изофлюрановой смесью в течение 20-30 с, пока они не перестанут двигаться; более длиннее или более скоро времена выдержки анестезии могут быть необходимы для некоторых мышей. Как только мыши перестают двигаться, они достаточно анестезировано, и могут быть изображены.
- Переместите мышей в камеру визуализации microCT и поместите их на окно для визуализации в положении, подверженном риску, с носом, обращенным перпендикулярно носу конусов. Используйте зубной воск, чтобы мягко сдерживать ноги на коробке для визуализации, чтобы ограничить любое движение. Одновременно можно увидеть до 4 неонатальных мышей.
- Включите изофлюран испаритель до 2-4% потока держать мышей анестезии во время изображения. Закрой дверь камеры визуализации microCT. Проверьте на мышах несколько секунд спустя. Если они начинают двигаться, облить ватным тампоном в isoflurane и держать его к носу животного движущихся в течение 5 секунд, чтобы обезболить. Держите ватный шарик рядом с животными во время визуализации. Будьте осторожны, чтобы не более анестезировать и прекратить мышей.
- Используя программное обеспечение, выберите параметр Luminescent для визуализации. Используйте фильтр возбуждения, установленный для блока, и фильтр выбросов, установленный для Open,500 нм, 520 нм, 560 нм, 580 нм, 600 нм и 620 нм. Для люминесценции будет установлено семь фильтров общего объема выбросов.
- Изображение мышей в каждой точке времени (0, 10 и 24 ч после заражения) и сохранить все изображения в папку для каждой точки времени. Верните щенков в клетку с плотиной и убедитесь, что все щенки оправились от анестезии.
- Для анализа 2D-изображений, открытые изображения в программном обеспечении. Изменение единиц на Radiance (фотоны); это превратится в Total Flux (фотоны/секунды).
- Анализируйте только один набор изображений с его фильтрами множественного излучения одновременно. Из каждого набора изображений обратите внимание на минимальные и максимальные значения сияния, расположенные в правом нижнем углу каждого изображения (например, если есть 7 фильтров выбросов, будет 7 изображений, и 7 минимальных и максимальных значений). Повторите для каждого набора изображений, который должен быть сравнен.
- Чтобы определить шкалу, которая будет охватывать значения и люминесценцию для всех изображений, найдите наименьшее минимальное значение и максимальное значение для каждого набора изображений. Для этого исследования изображения открытого фильтра использовались в качестве репрезентативных.
- Выделите и откройте изображение выбора, чтобы изменить шкалу. На палитре инструментов нажмитена вкладку Корректировка изображения и измените цветовую шкалу до самых низких минимальных и самых высоких максимальных значений, ранее идентифицированных. Сохраните каждый набор изображений в качестве TIFF. Индивидуально проанализируйте каждую точку времени таким образом, чтобы обеспечить отображение правильной шкалы.
- Для количественной оценки общего потока (количество люминесцентного сигнала на мышь) для каждой отдельной мыши откройте изображение, описанное ранее в шаге 5.9-5.10. Откройте вкладку ROI Tools на палитре инструментов и выберите инструмент круга. Выберите 1 круг при анализе одной области люминесценции.
- Перемести roi на наложение на область люминесценции. При необходимости отрегулируйте размер рентабельности инвестиций.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если требуется корректировка, отрегулируйте ИИ в других изображениях сравнительно для поддержания согласованности. Выберите меру ROIs. Окно ROI Measurements откроется с отображением Total Flux (p/s), Average Radiance (p/s/cm2/sr), Стандартное отклонение радианса, минимальное сияние и максимальное сияние. - Запись общих измерений потока для каждого набора изображений. Это число является количественным количеством люминесценции мыши на 2D-изображениях.
- Чтобы сделать 3D реконструированные изображения microCT, откройте панель DLIT 3D Reconstruction на палитре инструментов и проверьте все длины волн, которые будут включены под вкладку Analyze. Select Reconstruct.
6. Эвтаназия
- Подготовка и маркировка труб для тканей / органов, представляющих интерес для некропсии и соответствующих приложений вниз по течению.
- Отделить новорожденных от плотины в шкафе биобезопасности.
- Замочите ватный шарик в изофлюране ветеринарного класса и поместите внутрь прозрачной камеры сдерживания.
- При сборе крови подготовьте микропипет P200 кончиком и иметь трубку 1,5 мл с 10 МЛ 5 мМ ЭДТА в качестве антикоагулянта. Ожидается объем 50-200 мкл крови.
- Поместите новорожденного в камеру и следите за щенком, пока он не станет неподвижным.
- Быстро удалите новорожденных и обезглавите ножницами. Если позволить дышать свежим воздухом в течение длительного периода, щенок может восстановить сознание. Новорожденные снизили емкость легких по сравнению со взрослыми мышами, и, следовательно, не дышат достаточно глубоко для эвтаназии изофлюраном в одиночку.
- Соберите кровь из ствола у основания головы с помощью микропипеда P200. Чтобы максимизировать количество собранной крови, выполните этот шаг как можно быстрее после обезглавливания. Перечислите бактерии в крови путем последовательного разбавления и стандартного подсчета пластин, как описано в шаге 1.9.
- Стерилизовать весь новорожденный с 70% этанола до иссечения образцов тканей.
7. Урожай тканей
- В биобезопасности шкаф, облить новорожденных с 70% этанола для предотвращения загрязнения. Положите животное на правую сторону.
- Используя типсы, схватить кожу в точке между животом и задней левой ногой и сделать разрез с тонкой наконечником хирургических ножниц. Продолжайте отрезать кожу, двигаясь вверх к спине. Прогресс до тех пор, пока вся селезенка подвергается воздействию.
- Используйте типсы, чтобы схватить селезенку и удалить ее из живота, используя ножницы, чтобы отключить соединительной ткани. Поместите селезенку в раствор, подходящий для ее применения ниже по течению.
- Чтобы получить легкие, очистить кожу грудной клетки полностью.
- Входя в основание грудины с ножницами, удерживаемыми вертикально, вырезать вверх, пока грудная клетка не будет разделена.
- Используйте типсы, чтобы схватить правые и левые легкие по отдельности и удалить их из грудной полости. Удалить сердце из легочной ткани, разрезая ножницами.
- Поместите легкое в раствор, подходящий для его применения ниже по течению. Для изоляции РНК используйте 500 л гуанидина тиоцианата/фенола (GTCP). Для гистопатологии используйте 5 мл 10% нейтрально-буферного формалина.
8. Изоляция РНК от легочной ткани для экспрессии генов
- Предварительно охладить микроцентрифуг до 4 градусов по Цельсию.
- Фарш легочной ткани в GTCP с ножницами. Далее гомогенизируйте ткани с помощью гомогенизатора, работающего от аккумулятора. Продолжайте до тех пор, пока решение не будет как можно более однородным. Инкубация при комнатной температуре 3-5 мин.
- Используя фильтрованные наконечники пипеток, добавьте 100 мкл хлороформа. Переверните трубку на 15 с и инкубировать 3-5 мин при комнатной температуре.
- Центрифуга в течение 15 мин при 12000 х г.
- Во время вращения приготовьте 1,5 мл трубок с 500 л 70% этанола. Соберите и обозначите столбцы и трубки сбора из комплекта изоляции РНК.
- Аккуратно удалите верхний, аковый слой, не нарушая межфазный слой, образовав его во время центрифугации. Поместите aqueous слой в трубах, содержащих 70% этанола.
- Переместите этанол и лисатную смесь на колонку в трубке сбора.
- С этого момента следуйте протоколу об изоляции РНК до окончательного элаутации РНК.
- Проанализируйте РНК на чистоту и количество. Используйте немедленно или храните при -80 градусов по Цельсию до дальнейшего использования.
9. синтез кДНК
- Этикетка ПЦР труб и отложите в сторону.
- Добавьте 1 мкг РНК в смесь реакции cDNA для каждого образца.
- Добавьте реагенты и шаблон в трубку PCR, как описано в протоколе cDNA. Добавить фермент в смесь в последнюю минуту.
- Поместите ПЦР трубки в термоциклер со следующими настройками пробега: 5 мин при 25 градусов по Цельсию, 40 мин при 42 градусов по Цельсию, 15 мин при 85 градусов по Цельсию и 4 градуса по Цельсию.
- Удалите ПЦР трубки из термоциклера и немедленно используйте или храните при -20 градусов по Цельсию до дальнейшего использования.
10. Количественный цикл ПЦР в реальном времени (qPCR)
- Подготовь коктейль смеси реакции для каждого из генов, которые будут проанализированы. Каждая 15-й реакции ПЦР требует 7,5 мкл смеси реагентов 2x, 0,75 МЛ 20X 5'-FAM-маркированы ген-специфические грунтовки / зонд, и 3,75 мл нуклеазы свободной воды. Ампликоны обычно варьируются от 60-120 bp.
- Добавьте 3 МКЛ шаблона cDNA для каждой экспериментальной группы к соответствующим скважинам.
- Добавьте 12 мкл генно-специфического коктейля для смеси реакции в соответствующие скважины.
- Обложка пластины с оптической клейкой пленкой и центрифугой в течение 1 мин при 1000 х г, чтобы удалить любые пузырьки, которые могут образоваться в скважинах.
- Поместите пластину ПЦР в термоциклер PCR в режиме реального времени.
- Установите метод запуска следующим образом: 3 мин при 95 градусов по Цельсию, 40 циклов по 95 градусов по Цельсию в течение 15 с, а затем 60 градусов по Цельсию в течение 1 мин.
- Анализируйте данные путем нормализации гена, представляющий интерес для внутреннего контроля, и экспресс-данные из зараженных образцов по сравнению с неинфицированными образцами управления с использованиемформулы 2 -КТ и преобразования чисел вжурнале 2.
11. Гистопатология легких
- Удалите легкие из неонатального щенка, как описано выше.
- Поместите ткань в объем 10% нейтрально-буферного формалина так, чтобы соотношение раствора к тканям было примерно 20:1 в течение 3-7 дней.
- Координировать с соответствующей гистологической службы для парафина встраивания, секции, и гематоксилин и эозин (Н И Е) окрашивания. Для этой работы, Западной Вирджинии университета гистопатологии ядро было использовано. Кроме того, следуйте ранее описаннымпротоколам 19.
12. Анализ бактериального убийства in vitro
- Удалите селезенку из неинфицированного неонатального щенка, как описано выше, и поместите его в 40 мкм нейлоновой корзины в стерильной 60 мм чашки Петри. Повторите это и бассейн селезенки в одну трубку, которые будут собраны и гомогенизированы вместе.
- Добавьте 5 мл PBS, дополненный 10% FBS.
- Дезагрегировать ткань с помощью стерильного 3 мл шприца поршень до тех пор, пока одна клеточная подвеска не будет создана.
- Соберите одноклеточную подвеску за пределами нейлоновой корзины, перенесите в центрифугу 15 мл и гранулированные клетки по 350 х г в течение 5 минут.
- Приостановить клетки в буфере лиза красных кровяных телец (2 мл до 7-8 селезенки) и дайте ему стоять в течение 5 минут при комнатной температуре для устранения эритроцитов.
- Вымойте сплайкоциты с PBS и гранулы, как указано выше.
- Приостановить спеноциты в 0,25 мл PBS дополняется 0,5% BSA и 2 мМ EDTA в соответствии с ожидаемой урожайностью клеток.
- Подсчитайте спланоциты с помощью гемоцитометра или другого соответствующего применения.
- Изолировать клетки Ly6B.2 (миелоидная популяция гранулоцитов/воспалительных моноцитов) с иммуномагнитными бусинами в соответствии с протоколом производителя.
- Семя Ly6B.2 -клетки при плотности 1 x 105 клеток на колодец в черной или белой пластине 96-колодец в объеме 0,1 мл DMEM, которая содержит 10% FBS, 2 мМ глутамина и 25 мМ HEPES (полная среда).
- Перечислите биолюминесцентную кишечную палочку, описанную в разделе 1, и подготовьте бактериальный инокулум при желаемом множественности инфекции (МВД) в итоговом объеме 0,1 мл. Это лучше всего сделать, сделав то, что необходимо для всех скважин на общий МВД в партии.
- Добавить 0,1 мл бактериальной инокулы или полной среды в одиночку в качестве контроля. Инкубировать многоясную пластину при 37 градусах Цельсия и 5% CO2 в течение 1 ч.
- Замените средства массовой информации на 0,2 мл свежих полных средств массовой информации, которые содержат гентамицин (100 мкг/мл), аккуратно удалив средства массовой информации с пипеткой и добавив свежие средства массовой информации с новым наконечником пипетки. Верните культуру инкубации еще на 2 ч.
- На 3 ч после инфекции, мера люминесценции в каждом хорошо крышкой пластины культуры снизу с помощью пластины читателя, а затем вернуть культуру инкубации.
- Повторите измерения люминесценции в других желаемых точках времени.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол индуцированных бактериального сепсиса у неонатальных мышей, и мы использовали продольные интравитальной визуализации, перечисление бактерий в крови, гистологические оценки патологии, и воспалительные профили экспрессии цитокинов для изучения хода заболевания. Признаки заболеваемости наблюдались у неонатальных щенков, инфицированных как низкими (No 2 х 106 CFUs), так и высокими (7 х10 6 CFUS) инокулумами E.coli с течением времени. У щенков, получивших больший инокулум, проявлялись более заметные признаки бедствия, которые включали снижение подвижности, неспособность исправить осанку и нарушение способности поддерживать вертикальное положение на 24 ч после инфицирования (hpi). Был, однако, диапазон заболеваемости, как некоторые щенки оказались хуже, чем другие. Сразу же после заражения, один низкодозное животное умерло из-за воздействия изофлюрана во время сеанса визуализации, чтобы установить базовый уровень. К 24 л.с. два из шести высокодозных животных умерли от системной инфекции (33,3% смертности). Инфицированные щенки, которые получили либо высокую или низкую дозу инокулума весил значительно меньше, чем их контроль littermates на 24 л.с.(рисунок 1A,B). Все щенки, получившие высший инокулум, соответствовали критериям конечной точки на уровне 24 л.с. Таким образом, все инфицированные щенки в этой группе были усыплены после визуализации. Бактерии в крови были перечислены для подмножества мышей, которые получили нижнюю инокулум, и для всех животных, которые получили более высокий инокулум, так как все они были усыпаны. Результаты двух экспериментов, выполненных аналогичным образом показывают, что в то время как большинство животных имели высокий уровень бактерий в крови (CFUs/mL) на 24 л.с., некоторые животные не имели обнаруживаемых бактерий в крови(рисунок 1C). Последние предполагают, что они очистили инфекцию к этому моменту. Как и ожидалось, щенки, которые получили более высокий инокулум было почти три порядка величины больше CFUs / МЛ на 24 hpi по отношению к щенкам, которые получили низкую дозу инокулума (Рисунок 1C).
Изображения люминесцентных бактерий в реальном времени еще раз подтвердили распространение бактерий и увеличение роста неонатальных щенков с течением времени на 10 и 24л.с. (рисунок 2 и рисунок 3). Кроме того, используя интравитальные изображения с microCT, мы смогли определить инфекции очагов, в том числе мозга(рисунок 2B), легкие(рисунок 2B, Рисунок 3A, B), и другие периферические ткани (Рисунок 2B). Легкие некоторых высоко инфицированных мышей продемонстрировали непрозрачные области, соответствующие воспалительной консолидации, которая ко локализовывается на люминесцентный бактериальныйсигнал (рисунок 3A). Эти области предполагаемого воспалительного экссудата не обнаружены в неинфицированных контрольных легких(рисунок 3A). Дополнительные доказательства выраженной воспалительной реакции цитокинов в легких инфицированных щенков демонстрируются анализом экспрессии генов IL-1, IL-6 и TNF-α. Значительное увеличение экспрессии по отношению к контролю наблюдалось для всех трех цитокинов как в низких, так и в высоких инокульных группах(рисунок 4A). Гистопатология легких также была обследована на 24 л.с. в контроле и инфицированных щенков. Несмотря на аналогичные воспалительные профили цитокинов, прогрессирующее увеличение патологии обычно наблюдалось от нижнего до высшего инокулума. По сравнению с тканями от неинфицированных контроля, легкие инфицированных щенков показали заметные воспалительные изменения, утолщение альвеолярной стенки, увеличение альвеолярного кровоизлияния, и воспалительное проникновение(рисунок 4B). В наиболее тяжелых инфекций, легочных заторов и областей кровоизлияния способствовали массовому сокращению открытого пространства воздуха(рисунок 4B). В совокупности эти результаты показывают, что в нашей модели раннего начала неонатального сепсиса, распространение люминесцентных бактерий может сопровождаться с течением времени от подкапулярной прививки до важных очагов инфекции и вызвать значительное воспаление и патологию у тяжело инфицированных животных.
Для изучения принимающих факторов, способствующих бактериальному убийству врожденными иммунными клетками, такими как моноциты, макрофаги и нейтрофилы, мы разработали чувствительный анализ in vitro для измерения бактериального просвета. Ly6B.2 -клетки, изолированные от селезенки неонатальных мышей, были заражены биолюминесцентной кишечной палочкой в диапазоне MOIs в течение 1 ч, а затем обработаны гентамицином для уничтожения внеклеточных бактерий. На 3, 6, 20 и 48 л.с., внутриклеточная люминесценция была измерена с мультимодным считывателем. Как и ожидалось, с увеличением МВД, более люминесцентный сигнал был зарегистрирован на 3 ч(рисунок 5). Постепенно этот сигнал был потерян, что свидетельствует о бактериальном просвете(рисунок 5). Этот анализ является податливым для дополнения цитокинов, нейтрализации секретных эффекторов, а также добавление фармакологических ингибиторов клеточных путей для изучения мероприятий, которые могут способствовать бактериальному освидетельствованию и служить для улучшения результатов в модели неонатального сепсиса, описанной здесь.
Рисунок 1: Изменения в массе тела и бактериальной репликации у септических неонатальных мышей.
(A,B) Индивидуальные веса мыши в группе (низкий и высокий) выражается в процентах от среднего веса littermate контроля щенков. Данные представлены в качестве среднего процента ± SEM. Индивидуальные t-тесты в каждой пост-инфекционной точке времени выявить значительные различия в 24 ч между контроль щенков и щенков, которые получили низкий инокулум (plt;0.0001)(A ), или между контроль щенков и щенков, которые получили высокий инокулум (р0,0031) (B). (C) CFU / МЛ в крови на 24 л.с. были преобразованы журнал и представлены в качестве среднего ± SEM. Манн-Уитни тест показывает тенденцию к значению между низкой и высокой дозы инокулумов (р0,0882). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Интравитальная визуализация демонстрирует распространение бактерий у неонатальных мышей с течением времени.
(A)Репрезентативная неонатальной мыши (#1) инфицированных инокулем 2 х 106 CFUs показано во время 0, 10 и 24 hpi. Для каждой точки времени отображается колоритная шкала с минимальными и максимальными значениями сияния на точку времени. Мыши на 0 и 10 ч отображаются как по шкале времени, так и по шкале 24 ч, чтобы продемонстрировать изменения в росте бактерий с течением времени. (B) Представитель 3D реконструированных микроКТ изображения той же неонатальной мыши на 10 и 24 л.с. показаны. Каждая точка времени имеет изображения накладных, трансаксиальных и корональных перспектив. На трансаксианом изображении на 24 л.с., самолет двинулся к периферии мыши, чтобы лучше отображать очаги инфекции в периферических тканях. Белые стрелки указывают на мозг и почки на 10 л.с., а почки и легкие на 24 л.с. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Легкие являются местом крупной инфекции во время бактериального сепсиса у новорожденных.
(A)Представитель 3D реконструированных микроКТ изображения неонатальной мыши (#5), инфицированных инокулем 7 х 106 CFUs показаны на 24 л.с. по сравнению с неинфицированных контроля. Обе мыши отображаются в трансаксиальной перспективе и легкие показаны белыми стрелками. Зараженная мышь была помещена на двух масштабах сияния (фотоны/сек). Масштаб #1 включает в себя все 6 длин волн (500, 520, 560, 580, 600, 620 нм) и масштаб #2 включает в себя только 500, 520 и 560 нм длин волн. Эта вторая шкала позволила нам визуализировать повышенный сигнал в бактериях в легких, потому что более низкие длины волн более высоко поглощаются тканью и производят более сильный сигнал. (B)Представитель 3D реконструированных микроКТ изображения неонатальной мыши (#4), инфицированных инокулем 7 х 106 CFUs показаны на 24 л.с. На этот раз точка имеет изображения на накладных, sagittal, трансаксиальных и корональных точек зрения. Белые стрелки указывают на инфекцию очагов в легких. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Воспаление и связанные с ним гистопатологические находки в легких септических новорожденных.
На 24 л.с. легкие были собраны из щенков, которые получили 2 х 106 или 7 х10 6 CFUs или неинфицированных элементов управления. (A) РНК была изолирована и выражение IL-1, IL-6, или TNF-α как определяется по отношению к неинфицированных элементов управления количественным ПЦР в режиме реального времени с использованием формулы 2- КТ. Данные отображаются как среднее преобразованиежурнала 2 в экспрессии и ± для каждого inoculum, как указано. Статистическая значимость была определена с помощью неоплаченных т-тестов значений КТ между отдельными генами цитокинов и внутренним контролем в 95% доверии. Звездочки указывают p lt;0.01. (B-D) Гистопатологические разделы H и E окрашенных тканей легких (20x, область интереса построен в обрезание маски и увеличены для ясности) показаны. Показаны ткани легких от представителя неинфицированного контроля(B)или инфицированного новорожденного на низком уровне(C)или высокой(D) inoculum. желтые стрелки указывают на альвеолярноеутолщение (C)или кровоизлияние (D). Масштабная планка 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Анализ в пробирке для бактериального клиренса.
Ly6B.2- клетки были изолированы от селезенки неинфицированных неинфицированных неонатов. Клетки были посеяны в 96-хорошо пластин и инфицированы люциферазы экспрессии E. coli O1:K1:H7 при множественности инфекции (MOI) 10, 50, или 250, как указано. Через 1 ч среда была заменена свежей, содержащей гентамицин (100 мкг/мл). Показаны средние относительные световые единицы (RLU) ± SE для индивидуального эксперимента представителя нескольких. Статистическая значимость в интервале доверия 95% была определена с помощью неспареных т-тестов с коррекцией Уэлча; звездочки указывают p lt;0.05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наша модель подкапулярной инфекции для индуцирования бактериального сепсиса у неонатальных мышей является новым методом для изучения продольного распространения бактериальных патогенов в режиме реального времени. Интравитальная визуализация дает возможность исследовать распространение бактерий в режиме реального времени у новорожденных. Это имеет решающее значение для понимания кинетики распространения бактерий и дальнейшего изучения реакции хозяина и повреждения на соответствующей стадии заболевания. Мыши щенков вводят подкожной, подкапулярной инъекции бактериального инокулума. Этот метод инъекций проще, чем другие широко используемые альтернативы, такие как хвостовая вена и внутриперитонеальные инфекции, так как он требует меньшей точности в месте инъекции. Это важно, учитывая небольшой размер щенков. Интравитальная визуализация позволяет продольную оценку бактериального распространения и распространения в периферических тканях и центральной нервной системе с течением времени без необходимости жертвовать животным. Аналогичные подходы и технологии визуализации были использованы для изучения биологии рака иметастазов 20,21. Кроме того, в то время как другое исследование цитируется использование биолюминесцентных изображений во время инфекции кишечной палочкиу неонатальных крыс 22, здесь, мы применили подход к неонатальных мышей, в котором наша методология позволяет оценки бактериальной кинетики во время мурин сепсиса. Визуализация бактерий основана на излучелении биолюминесцентного света на различных длинах волн от бактерий (например, бактериальной активности люциферазы) внутри животного. Биолюминесценция затем визуализируется с помощью охлаждено заряженной камеры соединенного устройства (CCD). Полученная визуализированная биолюминесценция может быть реконструирована в 3D-изображение, которое показывает как пространственно-, так и височно-зависимое воздействие бактерий внутри животного. Для дополнительного, более тонкого слоя сбора данных, успешная идентификация животных с помощью татуировки хвоста позволяет повторно оценить отдельных щенков во времени и выявление возможных выбросов в данной экспериментальной группе.
Наиболее успешное применение описанной модели требует точности в подготовке бактериального инокулума. Здесь мы описываем оптимизированный метод бактериальной подготовки с использованием заранее установленной и проверенной кривой роста кишечной палочки, которая уменьшает различия между целевым и фактическим инокулемом. Это позволяет экспериментальной воспроизводимости на предполагаемой инокулы. Включение двух инокулумов в нашу модель продемонстрировало доза-зависимые исходы в крови CFUs, смертности и патологии легких. Тем не менее, некоторые аспекты траектории заболевания не зависят от дозы. Неспособность набрать вес у инфицированных животных не зависела от инокулума в 24 л.с. Кроме того, аналогичные уровни воспалительного экспрессии цитокинов наблюдались в легких в ответ на инфекцию обоих инокулем. Будет ли эта модель реплицироваться во всех тканях, где наблюдались бактерии, такие как почки, печень, селезенка и мозг, еще предстоит определить. В дополнение к сепсису, E. coli O1:K1:H7 связан с менингитом в неонатальной популяции23. Эта инфекция мозга возникает, когда бактерии с периферии вторгаются и проникают в геммокомммивный барьер. Будущие исследования будут изучать этот аспект модели путем анализа изменений в жесткой экспрессии белка соединения, а также проверить различные диапазоны бактериальных инокулумов. Дополнительная модификация во время интравитальной визуализации включает в себя добавление единственного ватного шарика, обливаемого изофлюраном, который помещается примерно в 2-3 дюйма от мышей во время визуализации. В ответ на предыдущие эксперименты, в которых неонатальные щенки пришли в сознание во время сеанса визуализации, предотвращая точное получение изображения, мы теперь поставить ватный шарик достаточно близко к мышам, чтобы держать их непрерывно анестезии во время визуализации. Тем не менее, важно, что это не делается так близко, что они не могут оправиться от анестезии.
Хотя гибкий и легко адаптируемый для изучения кинетики различных бактерий в различных животных и болезней моделей, наш протокол имеет некоторые ограничения для рассмотрения. Первое ограничение, которое следует учитывать, заключается в том, что подкапулярный маршрут инфекции не отражает естественный путь передачи инфекции. Однако основная цель разработки нашей модели с самого начала заключалась в создании легко воспроизводимого способа доставки, который можно было бы использовать для установления системной инфекции, которая воспроизводит аспекты болезней человека. Поэтому в настоящем докладе мы описываем модель синдрома сепсиса раннего начала заболевания человека, а не модель естественной передачи. Существует установленная модель устных родов у неонатальных крыс, которая воспроизводит некоторые аспекты общей передачи человека, такие как первоначальная колонизация инфекции кишечной палочки в алиментном канале и последующее распространение в кровоток и периферические ткани, в том числемозг 22. Модель, созданная Witcomb и его коллегами, также включает биолюминесцентную кишечную палочку и интравитаную визуализацию. Кроме того, крайне важно свести к минимуму воздействие изофлюрана, а также вводить, хвост татуировки, и обрабатывать щенков как можно быстрее без ущерба для точности и точности методов в попытке смягчить уровень стресса как для новорожденных и плотин. В некоторых случаях, если щенки испытывают усиленные индуцированные человеком и/или экспериментальные манипуляции, плотины могут прекратить уход и уход за щенками, что приводит к снижению выживаемости, не связанной с инфекцией. Аналогичным образом, щенки, подвергаемые воздействию изофлюрана в течение длительных периодов времени, выходящих за пределы приблизительно 10 минут сеанса визуализации, имеют повышенный риск смерти; таким образом, крайне важно поставить достаточно isoflurane достаточно анестезировать мышей, но не достаточно, чтобы усыплять их. Последней точкой рассмотрения является предел чувствительности. Ткани, в которых менее 104 CFUs/mL E. coli были перечислены люминесцентный сигнал, зарегистрированный падает на низком конце обнаруживаемого диапазона, в соответствии с методом масштабирования, используемым в программном обеспеченииизображения 3. Таким образом, некоторые ткани могут быть колонизированы с низким уровнем бактерий, но появляются без видимой биолюминесценции.
В настоящее время в большинстве исследований используются взрослые методы распространения бактерий, такие как внутриперитонеальный (i.p.) и инъекции вен хвоста для новорожденных. Плющке и Пелконен проанализировали влияние кишечной палочки K1 на неонатальных мышей через i.p., хвостовую вену и устныеинфекции 24. Это исследование показало, что различные генотипы мышей с иммунодефицитом более восприимчивы к штамму К1; однако многие аспекты иммунного ответа хозяина на инфекцию, а также механизмы распространения бактерий остаются без внимания. Дешмух и его коллеги заразили неонатальных мышей инфраперитонеально кишечной палочкой K1 или K. pneumoniae и измерили CFUs в селезенке и печени при 72л.с. 25. В этом исследовании также проанализированы некоторые аспекты принимающей ответ на инфекцию на основе предварительного воздействия мышей на антибиотики. Однако тщательное исследование распространения бактерий в периферических тканях и крови с течением времени параллельно с воспалительным профилированием в той же ткани (кроме гранулоцитоза) не было решено. Другие исследования неонатального сепсиса у мышей с золотистым стафилококком, стафилококк эпидермидис, группа B стрептококк, и кишечной палочки изучить различные аспекты иммунной системы хозяина в ответ на инфекцию. Тем не менее, ни одно из этих исследований использовать интравитальной визуализации для изучения кинетики бактериального распространенияили локализации инфекцииfoci 23,25,26,27. Наш метод инфекционной и интравитальной визуализации в сочетании с оценкой бактериального бремени и воспалительным профилированием периферических тканей позволяет всесторонне изучить аспекты как хозяина, так и патогена во время инфекции, обеспечивая более точное понимание взаимодействия хозяина и патогена во время сепсиса.
Мы намерены использовать эту инфекцию и визуализацию модели для дальнейшего нашего понимания раннего начала неонатального сепсиса с использованием различных патогенных бактерий, обычно ответственных за сепсис у новорожденных, в том числе группы B стрептококков, K. pneuomoniae, и Listeria monocytogenes. Эта инфекционная модель позволит нам продольно сравнить распространение различных бактериальных патогенов параллельно с реакцией хозяина у новорожденных. Кроме того, эта модель адаптируется к приемной передаче специфических (флуоресцентно конъюгированных) типов иммунных клеток для изучения их миграции в места инфекции и последующего влияния на реакцию хозяина и контроль над бактериями. Это дает возможность лучше понять взаимодействия хозяина и патогена, которые происходят во время сепсиса в раннем возрасте таким образом, что ранее не было продемонстрировано.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов, чтобы раскрыть.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана институциональными фондами C.M.R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Insulin Syringe | Coviden | 1188128012 | Inoculum or PBS injection |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 89370-094 | Histopathology |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | LSA1049201 | Bacterial clearance assay |
| Animal Tattoo Ink Paste | Ketchum | KI1482039 | Animal identification |
| Animal Tattoo Ink Green Paste | Ketchum | KI1471039 | Animal identification |
| Anti-Ly-6B.2 Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-100-781 | Cell isolation |
| Escherichia coli O1:K1:H7 | ATCC | 11775 | |
| Escherichia coli O1:K1:H7-lux (expresses luciferase) | N/A | N/A | Constructed in-house at WVU |
| E.Z.N.A. HP Total Extraction RNA Kit | Omega Bio-tek | R6812 | RNA extration |
| DPBS, 1X | Corning | 21-031-CV | |
| Difco Tryptic Soy Agar | Becton, Dickinson and Company | 236950 | Bacterial growth |
| IL-1 beta Primer/Probe (Mm00434228) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Cytokine expression qPCR |
| IL-6 Primer/Probe (Mm00446190) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Cytokine expression qPCR |
| iQ Supermix | Bio-Rad | 1708860 | Real-time quantitative PCR |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708891 | cDNA synthesis |
| Isolation Buffer | Miltenyi Biotec | N/A | Bacterial clearance assay |
| IVIS Spectrum CT and Living Image 4.5 Software | Perkin Elmer | N/A | Intravital imaging |
| LB Broth, Lennox | Fisher BioReagents | BP1427-500 | Bacterial growth |
| EASYstrainer (Nylon Basket) | Greiner Bio-one | 542 040 | Cell strainer |
| SpectraMax iD3 | Molecular Devices | N/A | Plate reader |
| Pellet Pestle Motor | Grainger | 6HAZ6 | Tissue homogenization |
| Polypropylene Pellet Pestles | Grainger | 6HAY5 | Tissue homogenization |
| Prime Thermal Cycler | Techne | 3PRIMEBASE/02 | cDNA synthesis |
| TNF-alpha Primer/Probe (Mm00443258) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Cytokine expression qPCR |
| TriReagent (GTCP) | Molecular Research Center | TR 118 | RNA extration |
References
- Qazi, S. A., Stoll, B. J. Neonatal sepsis: a major global public health challenge. Pediatr Infect Dis J. 28, 1-2 (2009).
- Simonsen, K. A., Anderson-Berry, A. L., Delair, S. F., Davies, H. D.
- Seman, B. G., et al. Elevated levels of interleukin-27 in early life compromise protective immunity in a mouse model of Gram-negative neonatal sepsis. Infections and Immunity. , (2019).
- Schrag, S. J., et al. Epidemiology of Invasive Early-Onset Neonatal Sepsis, 2005 to 2014. Pediatrics. 138 (6), 20162013 (2016).
- Stoll, B. J., et al. Early onset neonatal sepsis: the burden of group B Streptococcal and E. coli disease continues. Pediatrics. 127 (5), 817-826 (2011).
- Weston, E. J., et al. The burden of invasive early-onset neonatal sepsis in the United States, 2005-2008. Pediatrics and Infectious Disease Journal. 30 (11), 937-941 (2011).
- Hornik, C. P., et al. Early and late onset sepsis in very-low-birth-weight infants from a large group of neonatal intensive care units. Early Human Development. , Suppl 2 69 (2012).
- Vergnano, S., Sharland, M., Kazembe, P., Mwansambo, C., Heath, P. T. Neonatal sepsis: an international perspective. Archives of Disease in Childhood: Fetal and Neonatal Edition. 90 (3), 220-224 (2005).
- Kraft, J. D., et al. Neonatal macrophages express elevated levels of interleukin-27 that oppose immune responses. Immunology. 139 (4), 484-493 (2013).
- Basha, S., Surendran, N., Pichichero, M.
- Gleave Parson, M., et al. Murine myeloid-derived suppressor cells are a source of elevated levels of interleukin-27 in early life and compromise control of bacterial infection. Immunology and Cell Biology. 97 (5), 445-446 (2018).
- Adkins, B., Leclerc, C., Marshall-Clarke, S. Neonatal adaptive immunity comes of age. Nature Reviews Immunology. 4 (7), 553-564 (2004).
- Kim, S. K., Keeney, S. E., Alpard, S. K., Schmalstieg, F. C. Comparison of L-selectin and CD11b on neutrophils of adults and neonates during the first month of life. Pediatrics Research. 53 (1), 132-136 (2003).
- Velilla, P. A., Rugeles, M. T., Chougnet, C. A. Defective antigen-presenting cell function in human neonates. Clinical Immunology. 121 (3), 251-259 (2006).
- Le Garff-Tavernier, M., et al. Human NK cells display major phenotypic and functional changes over the life span. Aging Cell. 9 (4), 527-535 (2010).
- Weinberger, B., et al. Mechanisms underlying reduced responsiveness of neonatal neutrophils to distinct chemoattractants. Journal of Leukocyte Biology. 70 (6), 969-976 (2001).
- Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system. Nature Reviewss Immunology. 9 (3), 162-174 (2009).
- National Research Council. Guide for the care and use of laboratory animals, 8th ed. , National Academies Press. Washington, DC. (2011).
- Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification. Journal of Visualized Experiments. (125), e55796 (2017).
- Bayarmagnai, B., Perrin, L., Esmaeili Pourfarhangi, K., Gligorijevic, B. Intravital Imaging of Tumor Cell Motility in the Tumor Microenvironment Context. Methods in Molecular Biology. 1749, 175-193 (2018).
- Beerling, E., Ritsma, L., Vrisekoop, N., Derksen, P. W., van Rheenen, J. Intravital microscopy: new insights into metastasis of tumors. Journal of Cell Science. 124, Pt 3 299-310 (2011).
- Witcomb, L. A., Collins, J. W., McCarthy, A. J., Frankel, G., Taylor, P. W. Bioluminescent Imaging Reveals Novel Patterns of Colonization and Invasion in Systemic Escherichia coli K1 Experimental Infection in the Neonatal Rat. Infection and Immunity. 83 (12), 4528 (2015).
- Singh, K., et al. Inter-alpha inhibitor protein administration improves survival from neonatal sepsis in mice. Pediatric Research. 68 (3), 242-247 (2010).
- Pluschke, G., Pelkonen, S. Host factors in the resistance of newborn mice to K1 Escherichia coli infection. Microb. Patho. , 93-102 (1988).
- Mancuso, G., et al. Role of interleukin 12 in experimental neonatal sepsis caused by group B streptococci. Infections and Immunity. 65 (9), 3731-3735 (1997).
- Thammavongsa, V., Rauch, S., Kim, H. K., Missiakas, D. M., Schneewind, O. Protein A-neutralizing monoclonal antibody protects neonatal mice against Staphylococcus aureus. Vaccine. 33 (4), 523-526 (2015).
- Andrade, E. B., et al. TLR2-induced IL-10 production impairs neutrophil recruitment to infected tissues during neonatal bacterial sepsis. Journal of Immunology. 191 (9), 4759-4768 (2013).
