La infección de ratones neonatales con E. coli O1:K1:H7 bioluminiscente produce una infección séptica con inflamación pulmonar significativa y patología pulmonar. Aquí, describimos procedimientos para modelar y estudiar más a fondo la sepsis neonatal utilizando imágenes intravitales longitudinales en paralelo con la enumeración de cargas bacterianas sistémicas, perfiles inflamatorios e histopatología pulmonar.
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Artículo de método
Un modelo de imagen neonatal de sepsis bacteriana gram-negativa
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
Los neonatos tienen un mayor riesgo de sepsis bacteriana debido al perfil inmune único que muestran en los primeros meses de vida. Hemos establecido un protocolo para estudiar la patogénesis de E. coli O1:K1:H7, un serotipo responsable de altas tasas de mortalidad en neonatos. Nuestro método utiliza imágenes intravitales de cachorros neonatales en diferentes momentos durante la progresión de la infección. Esta imagen, paralela a la medición de bacterias en la sangre, el perfilo inflamatorio y la histopatología tisular, significa un enfoque riguroso para entender la dinámica de la infección durante la sepsis. En el informe actual, modelamos dos inóculos infecciosos para la comparación de las cargas bacterianas y la gravedad de la enfermedad. Encontramos que la infección subescapular conduce a la infección diseminada por 10 h después de la infección. A las 24 horas, la infección de E. coli luminiscente era abundante en la sangre, los pulmones y otros tejidos periféricos. La expresión de citoquinas inflamatorias en los pulmones es significativa a las 24 h, y esto es seguido por la infiltración celular y la evidencia de daño tisular que aumenta con la dosis infecciosa. Las imágenes intravitales tienen algunas limitaciones. Esto incluye un umbral de señal luminiscente y algunas complicaciones que pueden surgir con los neonatos durante la anestesia. A pesar de algunas limitaciones, encontramos que nuestro modelo de infección ofrece una visión para entender la dinámica longitudinal de la infección durante la sepsis murina neonatal, que no ha sido examinada a fondo hasta la fecha. Esperamos que este modelo también se pueda adaptar para estudiar otras infecciones bacterianas críticas durante la vida temprana.
Introducción
La sepsis bacteriana es una preocupación significativa para los neonatos que presentan un perfil inmune único en los primeros días de vida que no proporciona una protección adecuada contra la infección1. La sepsis neonatal sigue siendo un problema de atención médica importante en los Estados Unidos que representa más de 75.000 casos anuales solo en los Estados Unidos2. Para estudiar estas infecciones en profundidad, se requieren nuevos modelos animales que recapitulan aspectos de la enfermedad humana. Hemos establecido un modelo de infección de ratón neonatal utilizando Escherichia coli,O1:K1:H....
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Protocolo
Todos los procedimientos fueron aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales de Virginia Occidental y llevados a cabo de acuerdo con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio por el Consejo Nacional de Investigación18.
1. Preparación del Inóculo Bacterial
- Raya una placa de agar de soja tríptica (TSA) con un bucle de inoculación para el aislamiento de una sola colonia de un stock congelador de E. coli O1:K1:H7-lux que expresa establemente la luciferasa y lleva resistencia a la kanamicina3. Incubar durant....
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Resultados
Este protocolo indujo sepsis bacteriana en ratones neonatales, y utilizamos imágenes intravitales longitudinales, enumeración de bacterias en la sangre, evaluaciones histológicas de patología y perfiles inflamatorios de expresión de citoquinas para estudiar el curso de la enfermedad. Se observaron signos de morbilidad en cachorros neonatales infectados con inóculos bajos (2 x10 6 UFC) y altos (7 x 106 UFC) de E.coli a lo largo del tiempo. Los cachorros que recibieron el mayor inóculo mostra.......
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Discusión
Nuestro modelo de infección subescapular para inducir sepsis bacteriana en ratones neonatales es un método novedoso para estudiar la propagación longitudinal de patógenos bacterianos en tiempo real. La imagen intravital ofrece la oportunidad de explorar la diseminación bacteriana en tiempo real en neonatos. Esto es fundamental para entender la cinética de la diseminación bacteriana y para seguir estudiando la respuesta del huésped y el daño en la fase apropiada de la enfermedad. A los cachorros de ratón se les administra.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por fondos institucionales a C.M.R.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1 ml de insulina Jeringa de | inóculo 1188128012 Coviden | o inyección de PBS | |
| 10% Formalina tamponada neutra | VWR | 89370-094 | Histopatología |
| Tampón de lisis ACK | Gibco | LSA1049201 | Ensayo de aclaramiento bacteriano |
| Pasta de tinta para tatuajes de animales | Ketchum | KI1482039 | Identificación de animales |
| tinta para tatuajes de animales | Ketchum | KI1471039 | Identificación animal |
| Microperlas Anti-Ly-6B.2 | Miltenyi Biotec | 130-100-781 | Aislamiento |
| celularEscherichia coli O1:K1:H7 | ATCC | 11775 | |
| Escherichia coli O1:K1:H7-lux (expresa luciferasa) | N/A | N/A | Construido internamente en WVU |
| E.Z.N.A. Kit de ARN de extracción total HP | Omega Bio-tek | R6812 | Extracción de ARN |
| DPBS, 1X | Corning | 21-031-CV | |
| Agar de soja tríptico Difco | Becton, Dickinson and Company | 236950 | Crecimiento bacteriano |
| IL-1 beta Imprimador/Sonda (Mm00434228) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Expresión de citocinas qPCR |
| IL-6 Primer/Sonda (Mm00446190) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Expresión de citocinas qPCR |
| iQ Supermix | Bio-Rad | 1708860 | PCR cuantitativa en tiempo real |
| iScript Kit de síntesis de ADNc | Bio-Rad | 1708891 | Síntesis de ADNc |
| Tampón de aislamiento | Miltenyi Biotec | N/A | Ensayo de depuración bacteriana |
| IVIS Spectrum CT y Living Image 4.5 Software | Perkin Elmer | N/A | Imágenes intravitales |
| Caldo LB, Lennox | Fisher BioReactivos | BP1427-500 | Crecimiento bacteriano |
| EASYstrainer (Cesta de nylon) | Greiner Bio-one | 542 040 | Colador de células |
| SpectraMax iD3 | Molecular Devices | N/A | Lector de placas |
| Pellet Mortle Motor | Grainger | 6HAZ6 | Homogeneización de tejidos |
| Pellet de polipropileno Morteros | Grainger | 6HAY5 | Homogeneización de tejidos |
| Prime Thermal Cycler | Techne | 3PRIMEBASE/02 | Síntesis de ADNc |
| TNF-alfa Cebador/Sonda (Mm00443258) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 Expresión de citoquinas qPCR | |
| TriReagent (GTCP) | Centro de Investigación Molecular | TR 118 | Extracción de ARN |
Referencias
- Qazi, S. A., Stoll, B. J. Neonatal sepsis: a major global public health challenge. Pediatr Infect Dis J. 28, 1-2 (2009).
- Simonsen, K. A., Anderson-Berry, A. L., Delair, S. F., Davies, H. D. Early-onset neonatal sepsis. Clinical Microbiology Reviews. 27 (1), 21-47 (2014). <....
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