Summary
La infección de ratones neonatales con E. coli O1:K1:H7 bioluminiscente produce una infección séptica con inflamación pulmonar significativa y patología pulmonar. Aquí, describimos procedimientos para modelar y estudiar más a fondo la sepsis neonatal utilizando imágenes intravitales longitudinales en paralelo con la enumeración de cargas bacterianas sistémicas, perfiles inflamatorios e histopatología pulmonar.
Abstract
Los neonatos tienen un mayor riesgo de sepsis bacteriana debido al perfil inmune único que muestran en los primeros meses de vida. Hemos establecido un protocolo para estudiar la patogénesis de E. coli O1:K1:H7, un serotipo responsable de altas tasas de mortalidad en neonatos. Nuestro método utiliza imágenes intravitales de cachorros neonatales en diferentes momentos durante la progresión de la infección. Esta imagen, paralela a la medición de bacterias en la sangre, el perfilo inflamatorio y la histopatología tisular, significa un enfoque riguroso para entender la dinámica de la infección durante la sepsis. En el informe actual, modelamos dos inóculos infecciosos para la comparación de las cargas bacterianas y la gravedad de la enfermedad. Encontramos que la infección subescapular conduce a la infección diseminada por 10 h después de la infección. A las 24 horas, la infección de E. coli luminiscente era abundante en la sangre, los pulmones y otros tejidos periféricos. La expresión de citoquinas inflamatorias en los pulmones es significativa a las 24 h, y esto es seguido por la infiltración celular y la evidencia de daño tisular que aumenta con la dosis infecciosa. Las imágenes intravitales tienen algunas limitaciones. Esto incluye un umbral de señal luminiscente y algunas complicaciones que pueden surgir con los neonatos durante la anestesia. A pesar de algunas limitaciones, encontramos que nuestro modelo de infección ofrece una visión para entender la dinámica longitudinal de la infección durante la sepsis murina neonatal, que no ha sido examinada a fondo hasta la fecha. Esperamos que este modelo también se pueda adaptar para estudiar otras infecciones bacterianas críticas durante la vida temprana.
Introduction
La sepsis bacteriana es una preocupación significativa para los neonatos que presentan un perfil inmune único en los primeros días de vida que no proporciona una protección adecuada contra la infección1. La sepsis neonatal sigue siendo un problema de atención médica importante en los Estados Unidos que representa más de 75.000 casos anuales solo en los Estados Unidos2. Para estudiar estas infecciones en profundidad, se requieren nuevos modelos animales que recapitulan aspectos de la enfermedad humana. Hemos establecido un modelo de infección de ratón neonatal utilizando Escherichia coli,O1:K1:H73. E. coli es la segunda causa principal de sepsis neonatal en los Estados Unidos, pero responsable de la mayoría de la mortalidad asociada a la sepsis4,5. Sin embargo, es la causa principal cuando los bebés prematuros y con muy bajo peso al nacer (VLBW) se consideran independientemente5. El serotipo K1 se asocia con mayor frecuencia con infecciones invasivas del torrente sanguíneo y meningitis en neonatos6,7. Actualmente, no hay otras opciones de tratamiento más allá de los antibióticos y la atención de apoyo. Mientras tanto, las tasas de resistencia a los antibióticos siguen aumentando para muchas bacterias patógenas, con algunas cepas de E. coli resistentes a una multitud de antibióticos comúnmente utilizados en el tratamiento8. Por lo tanto, es imperativo que sigamos generando métodos para estudiar los mecanismos de la sepsis y la respuesta del huésped en los neonatos. Estos resultados pueden ayudar a mejorar los tratamientos actuales y los resultados de la infección.
El estado inmunológico de los neonatos se caracteriza por diferencias fenotípicas y funcionales en comparación con los adultos. Por ejemplo, se ha demostrado que los niveles elevados de citoquinas antiinflamatorias y reglamentarias, como la interleucina (IL)-10 y la IL-27, se producen por macrófagos derivados de la sangre del cordón umbilical y están presentes a niveles mayores en el suero de neonatos muriados9,10,11. Esto es consistente con los niveles más bajos de α IFN, IFN-ɣ, IL-12 y TNF-α que se notifican con frecuencia de células neonatales en comparación con las contrapartes adultas10. Además, el sistema inmunitario neonatal está sesgado hacia una respuesta de la célula T Th2 y reguladora en comparación con los adultos12. Un número elevado de neutrófilos, células T, células B, células NK y monocitos también están presentes en los neonatos, pero con deficiencias funcionales significativas. Esto incluye defectos en la expresión de marcadores de superficie celular y presentación de antígenos que sugieren inmadurez13,14,15. Además, los neutrófilos neonatales son significativamente deficientes en su capacidad de migrar a factores quimiotácticos16. Las células supresoras derivadas de mieloides (MDSC) también se encuentran en niveles elevados en neonatos y recientemente se ha demostrado que son una fuente de IL-2711. Los MDSC son altamente supresivos hacia las células T17. Colectivamente, estos datos demuestran limitaciones en la inmunidad neonatal que prestan a una mayor susceptibilidad a la infección.
Para estudiar la progresión de la carga bacteriana y diseccionar las respuestas inmunitarias del huésped protector durante la sepsis neonatal, hemos desarrollado un nuevo modelo de infección. Los ratones neonatales en los días 3-4 de vida son difíciles de inyectar en el espacio intraperitoneal o en la vena de la cola. En nuestro modelo, día 3 o 4 cachorros se administran el inóculo bacteriano o PBS por vía subcutánea en la región escapular. Una infección sistémica se desarrolla y utilizando E. coli luminiscente O1:K1:H7, podemos imaginar longitudinalmente ratones neonatales individuales para seguir la carga bacteriana diseminada en los tejidos periféricos. Este es el primer modelo reportado para utilizar imágenes intravitales para entender la cinética de la diseminación de bacterias durante la sepsis en neonatos muridos3.
Aquí, describimos un protocolo para inducir infecciones sépticas de E. coli en ratones neonatales3. Describimos cómo preparar el inóculo bacteriano para inyección, y cómo cosechar tejido para la evaluación de la patología, la medición de marcadores inflamatorios por análisis de expresión génica, y la enumeración de la carga bacteriana. Además, también se describe el uso de E. coli luminiscente para imágenes intravitales de neonatos infectados y la cuantificación de la matanza bacteriana por parte de células inmunitarias neonatales. Estos protocolos también pueden adaptarse para estudiar otras infecciones bacterianas importantes en neonatos. Los datos presentados aquí representan un enfoque novedoso general para entender la dinámica de la infección en un modelo de sepsis neonatal traducible.
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Protocol
Todos los procedimientos fueron aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales de Virginia Occidental y llevados a cabo de acuerdo con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio por el Consejo Nacional de Investigación18.
1. Preparación del Inóculo Bacterial
- Raya una placa de agar de soja tríptica (TSA) con un bucle de inoculación para el aislamiento de una sola colonia de un stock congelador de E. coli O1:K1:H7-lux que expresa establemente la luciferasa y lleva resistencia a la kanamicina3. Incubar durante la noche a 37oC.
- Al día siguiente permitir que el caldo de Luria (LB) llegue a temperatura ambiente (25 oC) en un gabinete de bioseguridad.
- Bajo una campana del gabinete de bioseguridad, identifique una sola colonia de la placa rayada y inocularla en 3 ml de LB complementada con kanamicina (30 g/ml). Incubar durante la noche a 37oC con agitación (220 rpm). Esta es la cultura de inicio.
- Diluir el cultivo de arranque 1:100 en un fresco de 3 ml de LB bajo una campana de gabinete de bioseguridad y devolverlo a la incubadora durante 2-3 h a 37 oC con temblor (220 rpm). Esta es la cultura de las acciones.
- Lea la densidad óptica (OD) del cultivo en blanco y de stock a 600 nm utilizando un espectrofotómetro. Añadir 100 l de LB (que no contenga bacterias) en un pocó si hay una placa de ensayo de fondo plano de 96 pozos; este es el espacio en blanco. A continuación, añada 100 l del cultivo de stock a un pozo separado. Repita el proceso para dos réplicas adicionales. La absorbancia se lee con un lector de placas.
- Restar la absorbancia en blanco del valor de absorción del cultivo de stock (el valor de OD) y comparar con una curva de crecimiento previamente generada y validada para determinar una aproximación de la densidad bacteriana en el cultivo de stock para la preparación de la dosis infecciosa.
- Generar inóculos objetivo dependiendo de la pregunta de investigación. Para este estudio se utilizaron inóculo objetivo de 2 x10 6 (bajo) y 7 x10 6 (altos) unidades formadoras de colonias (altas) por ratón (/ratón).
- Divida la dosis objetivo por ratón (DosisT) por la concentración estimada de bacterias en el cultivo de stock (Stock) para obtener el volumen de bacterias necesarias del tubo de stock (VS).
- Multiplicar VS por el número de ratones (NM) que necesitan ser infectados junto con suficiente para 5-10 extras para la cantidad total de bacterias necesarias para la infección más 5-10 dosis adicionales. Retire este volumen del tubo de almacenamiento y agréguelo a un nuevo tubo de centrífuga.
- Utilice la siguiente ecuación:
DosisT/Stock á VS x NM - volumen total (VT) de bacterias que se eliminarán del tubo de stock.
- Centrifugar las bacterias a 2.000 x g durante 5 min a 4 oC y resuspender el gránulo bacteriano en 50 l de PBS (pH 7.2-7.6) por ratón a infectar (p. ej., para 10 dosis de 2 x 106 bacterias cada dosis, el pellet de 2 x 107 bacterias se resuspendía en 500 l de PBS). Una vez más, se recomienda preparar más inóculo del necesario. Prepare un volumen igual de PBS solo para inoculaciones de control. Mantener el control infeccioso del inóculo y el PBS sobre el hielo hasta la infección.
- Realizar siete diluciones seriales de diez veces en PBS en una placa de dilución inferior de plástico de 96 pozos, y la placa de 25 l de las diluciones en duplicado en placas TSA cuadrantes complementadas con kanamicina (30 g/ml) para enumerar la cantidad real de bacterias administradas. Incubar a 37oC durante la noche para la formación de colonias antes de la enumeración.
2. Identificación animal
- Organizar un número suficiente de parejas reproductoras de tal manera que las camadas puedan sincronizarse para los cachorros emparejados por edad. La variabilidad de la edad de ± 1 día es aceptable.
- Identifique un ratón hembra C57BL/6 embarazada y monitoree el nacimiento de la camada antes del experimento planeado para determinar con precisión la edad.
- Para distinguir entre el control y los cachorros infectados de 3 o 4 días de edad, utilice un par de tijeras de iris pequeñas de punta fina para cortar los extremos de las colas de los cachorros de control solamente. Los cachorros infectados no reciben recortes de cola. Antes de cortar la cola, desinfectar la piel con una bola de algodón empacada en 70% etanol. Aplique presión en el extremo de la cola con una bola de algodón o gasa según sea necesario.
NOTA: Este procedimiento se realiza bajo una campana de gabinete de bioseguridad. Un recorte de cola de aproximadamente 1/8 de pulgada es suficiente. - Para identificar cachorros dentro del control y grupos infectados, utilice una jeringa de insulina de 1 ml con una aguja permanente de 28 G x 1/2'' para tatuar las colas de los cachorros. Antes de tatuar, desinfectar la piel con una bola de algodón empacada en 70% etanol. Este procedimiento se realiza bajo una campana de gabinete de bioseguridad.
- Para tatuar la cola, aplica tinta de tatuaje animal en la punta de la aguja. A continuación, sujeta cuidadosamente al cachorro con una mano, con la cola completamente expuesta. Inserte suavemente la aguja debajo de la piel, manteniendo un nivel superficial de profundidad, y mueva la aguja paralela con la piel unos pocos milímetros hasta que se haya creado una pequeña marca, o punto. Espere unos segundos antes de retirar lentamente la aguja de debajo de la piel, para evitar el exceso de la falta de aire de la tinta que se desprende de debajo de la piel.
- Aplique presión sobre la herida con una bola de algodón o una gasa según sea necesario. Retire el exceso de tinta de tatuaje en la superficie de la piel con 70% de etanol.
- Repita este proceso con ratones posteriores en los grupos infectados y de control, mientras que la adición de un punto adicional con cada cachorro sucesivo tatuado (por ejemplo, cachorro 1 tendrá 1 punto en su cola, cachorro 2 tendrá dos puntos en su cola, etc.).
NOTA: Para una capa adicional de identificación, se recomienda utilizar colores separados de tinta de tatuaje animal para el control y grupos infectados.
3. Inoculación subescapular
NOTA: Para este estudio, se realizaron 2 experimentos con un grupo de dosis baja y dosis altas designados para cada experimento. En el primer experimento, 7 cachorros recibieron la dosis baja de inóculo (4 cachorros se utilizaron como controles), y 5 cachorros de una camada separada recibieron la dosis alta (3 cachorros se utilizaron como controles). Los cachorros del experimento 1 proporcionaron datos solo para el punto de tiempo de 24 horas. En el segundo experimento, se les dio a 8 cachorros la dosis baja de inóculo (se utilizaron 2 cachorros como controles), y 6 cachorros recibieron la dosis alta de inóculo (2 cachorros se utilizaron como controles). Los cachorros del experimento 2 proporcionaron datos para los puntos de tiempo de 0, 10 y 24 horas.
- Los cachorros de partido de edad ≤ 1 día. Asigne cada camada como una dosis baja o una camada de dosis alta. Dentro de una camada asignar aleatoriamente cachorros como un control o cachorro infectado.
- En el día 3 o 4 postnatal, registre los pesos de todos los cachorros antes de la inoculación con E. coli-lux o el control PBS. Separe la presa de los cachorros durante este tiempo para asegurarse de que no se mueven durante la infección.
- Dentro de un gabinete de bioseguridad utilizando una aguja de insulina, aspirar PBS o el inóculo E. coli-lux. Para este trabajo, se utilizaron inóculos de 2 x 106 y 7 x 106 6 UFC por ratón. Mantenga el inóculo infeccioso y el PBS en hielo hasta la administración mediante inyección subescapular.
- Coloque el neonato sobre una superficie limpia en la capucha del gabinete de bioseguridad y levante la piel en la nuca como si fuera a escrúpulos al cachorro.
- En el espacio creado ahora entre la piel y el músculo del animal, inserte la aguja, bisele, justo debajo de la piel e inyecte 50 l de PBS o E. coli-lux. Suelte simultáneamente la porción pellizcada de la piel para evitar el contraflujo de la inyección.
- Retire la aguja lentamente y con cuidado. Coloque a los cachorros de nuevo con las presas después de que las inyecciones hayan terminado.
NOTA: Debido a su etapa anatómica en el desarrollo, es técnicamente difícil administrar una vena de cola o una inyección intraperitoneal a los cachorros neonatales en el día 3-4. Por lo tanto, la ruta de infección subescapular fue elegida para este estudio debido a la facilidad de ejecución.
4. Evaluación de la enfermedad y criterios finales
- Controlar a los cachorros dos veces al día durante toda la duración de la infección. Tenga en cuenta cualquier anomalía en la apariencia.
- Registre los pesos como una medida objetiva de la morbilidad.
- Además de los cambios de peso, probar la capacidad de los cachorros para a derecharse colocando el neonato en el lado dorsal. Los animales enfermos no podrán dar la vuelta al lado ventral y a los pies o completarán esta acción con dificultad.
- Compruebe lo siguiente para marcar los animales cerca de los criterios finales: menos del 85% del peso corporal normal; disminución del movimiento y la incapacidad para encarnarse; decoloración de la piel y un aspecto más gris o transparente en comparación con el rosa; sensación de frío al tacto, indicativo de disminución de la temperatura corporal y hematomas hemorrágicos a lo largo de los lados, también indicativo de enfermedad avanzada.
NOTA: Si los neonatos no han podido aumentar de peso durante dos días y se ajustan a cualquiera de las descripciones de los pasos 4.4, han cumplido los criterios de punto final. Los cachorros que reciben la dosis alta a menudo cumplen los criterios finales en 24 h. Los cachorros de control dentro de las camadas de dosis baja y alta serán eutanasiados al mismo tiempo para permitir un análisis comparativo entre los grupos de control y experimentales. Proceda a la sección de eutanasia a continuación.
5. Imágenes in vivo de la carga bacteriana
- Utilice un imager microCT y un software para la creación de imágenes y el análisis posterior.
NOTA: El color de la piel del cachorro no afecta la calidad de las imágenes. - Coloque la jaula con ratones neonatales infectados por E. coli-luxy presa en una capucha de flujo laminar de nivel BSL-2. Retire los ratones que se van a tomar la imagen y colóquelos en una cámara de isoflurano transparente dentro de la capucha. Se recomienda comenzar con controles no infectados para medir la cantidad de isoflurano necesaria.
- Abra el software del ordenador conectado al microCT. Inicializar el sistema y esperar a que la temperatura del CCD se bloquee a -90 oC.
- Encienda el vaporizador de isoflurano y ajuste el dial al flujo de isoflurano del 5%. Mantener los ratones en la cámara con esta mezcla de isoflurano durante 20-30 s hasta que dejen de moverse; algunos ratones pueden necesitar tiempos de exposición a la anestesia más largos o más cortos. Una vez que los ratones dejan de moverse, son lo suficientemente anestesiados y pueden ser imageados.
- Mueva los ratones a la cámara de imágenes microCT y colóquelos en la caja de imágenes en la posición propensa, con narices orientadas perpendicularmente a los conos nasales. Use cera dental para sujetar suavemente los pies en la caja de imágenes para limitar cualquier movimiento. Se pueden tomar imágenes de hasta 4 ratones neonatales a la vez.
- Gire el vaporizador de isoflurano a un flujo de 2-4% para mantener a los ratones anestesiados durante la toma de imágenes. Cierre la puerta de la cámara de imágenes microCT. Revise a los ratones unos segundos más tarde. Si comienzan a moverse, douse una bola de algodón en isoflurano y sosténlo a la nariz del animal moviéndose durante 5 segundos para anestesiar. Mantenga la bola de algodón cerca de los animales durante la toma de imágenes. Tenga cuidado de no anestesiar y terminar con los ratones.
- Con el software, elija la opción Luminescent para la creación de imágenes. Utilice un filtro de excitación establecido en Bloquear y el filtro de emisión establecido en Open, 500 nm, 520 nm, 560 nm, 580 nm, 600 nm y 620 nm. Habrá siete filtros de emisión total configurados para luminiscencia.
- Imagen de los ratones en cada punto de tiempo (0, 10 y 24 h después de la infección [hpi]) y guarde todas las imágenes en una carpeta para cada punto de tiempo. Devolver a los cachorros a la jaula con la presa y comprobar que todos los cachorros se han recuperado de la anestesia.
- Para analizar imágenes 2D, abra imágenes en el software. Cambie las unidades a Radiance (fotones); esto se convertirá en el Flujo Total (fotones/segundo).
- Analice solo un conjunto de imágenes con sus múltiples filtros de emisión a la vez. De cada conjunto de imágenes, tome nota de los valores de resplandor mínimo y máximo situados en la esquina inferior derecha de cada imagen (por ejemplo, si hay 7 filtros de emisión, habrá 7 imágenes y 7 valores mínimos y máximos). Repita el proceso para cada conjunto de imágenes que se va a comparar.
- Para determinar una escala que abarque los valores y la luminiscencia de todas las imágenes, localice el valor mínimo más bajo y el valor máximo más alto para cada conjunto de imágenes. Para este estudio, las imágenes de filtro abierto se utilizaron como representante.
- Resalte y abra la imagen de su elección para cambiar la escala. En la Paleta de herramientas, haga clic en la pestaña Ajuste de imagen y cambie la Escala de color a los valores mínimos y máximos más altos identificados anteriormente. Guarde cada conjunto de imágenes como TIFF. Analice individualmente cada punto de tiempo de esta manera para asegurarse de que se muestra la escala correcta.
- Para cuantificar el flujo total (cantidad de señal luminiscente por ratón) para cada ratón individual, abra una imagen como se describió anteriormente en el paso 5.9-5.10. Abra la pestaña Herramientas de ROI en la Paleta de herramientas y seleccione la herramienta de círculo. Elija 1 círculo si analiza un área de luminiscencia.
- Mueva el ROI a Superponer en el área de luminiscencia. Ajuste el tamaño del ROI si es necesario.
NOTA: Si es necesario realizar un ajuste, ajuste los ROI en otras imágenes de forma comparable para mantener la coherencia. Elija Medir ROI . Se abrirá la ventana Mediciones de ROI que muestra Total Flux (p/s), Average Radiance (p/s/cm2/sr), Desviación estándar de radiación, Radiancia mínima y Radiancia máxima. - Registre las mediciones de flujo total para cada conjunto de imágenes. Este número es la cantidad cuantificada de luminiscencia en el ratón en imágenes 2D.
- Para crear imágenes microCT reconstruidas en 3D, abra el panel Reconstrucción 3D de DLIT en la paleta de herramientas y compruebe todas las longitudes de onda que se incluirán en la pestaña Analizar .
6. Eutanasia
- Preparar y etiquetar tubos para tejidos/órganos de interés para la necropsía y aplicaciones posteriores apropiadas.
- Separe a los neonatos de la presa en un gabinete de bioseguridad.
- Remoje una bola de algodón en isoflurano de grado veterinario y colóquela dentro de una cámara de contención transparente.
- Si recoge sangre, prepare una micropipeta P200 con una punta y tenga un tubo de 1,5 ml con 10 l de EDTA de 5 mM como anticoagulante. Se espera un volumen de 50-200 l de sangre.
- Coloque un neonato en la cámara y monitoree al cachorro hasta que quede inmóvil.
- Rápidamente, retire el neonato y decapitar con tijeras. Si se le permite respirar aire fresco durante un período prolongado, el cachorro puede recuperar la conciencia. Los neonatos han reducido la capacidad pulmonar en relación con los ratones adultos y, por lo tanto, no respiran lo suficientemente profundamente para la eutanasia solo por isoflurano.
- Recoger la sangre del tronco en la base de la cabeza con una micropipeta P200. Para maximizar la cantidad de sangre recolectada, realice este paso lo más rápido posible después de la decapitación. Enumerar las bacterias en la sangre por dilución en serie y conteo de placas estándar como se describe en el paso 1.9.
- Esterilice todo el neonato con 70% de etanol antes de la escisión de las muestras de tejido.
7. Recolección de tejidos
- Dentro de un gabinete de bioseguridad, douse el neonato con 70% etanol para evitar la contaminación. Poner el animal en su lado derecho.
- Usando fórceps, agarra la piel en un punto entre el abdomen y la pierna izquierda trasera y haz una incisión con tijeras quirúrgicas de punta fina. Continúe cortando la piel moviéndose hacia arriba hacia la parte posterior. Progresa hasta que todo el bazo esté expuesto.
- Usa los fórceps para agarrar el bazo y extraerlo del abdomen, usando tijeras para desconectar el tejido conectivo. Coloque el bazo en la solución adecuada para su aplicación posterior.
- Para obtener los pulmones, pelar la piel del pecho por completo.
- Entrando en la base del esternón con tijeras sujetas verticalmente, corte hacia arriba hasta que la caja torácica se divida.
- Usa fórceps para agarrar los pulmones derecho e izquierdo individualmente y retíralos de la cavidad torácica. Retire el corazón del tejido pulmonar cortando con tijeras.
- Coloque el pulmón en la solución adecuada para su aplicación posterior. Para el aislamiento de ARN, utilice 500 l de tiocianato/fenol de guanidina (GTCP). Para la histopatología, utilice 5 ml de formalina con búfer neutro al 10%.
8. Aislamiento de ARN del tejido pulmonar para la expresión génica
- Pre-enfriar la microcentrífuga a 4 oC.
- Mince el tejido pulmonar en GTCP con tijeras. A continuación, homogeneizar el tejido con un homogeneizador alimentado por batería. Continúe hasta que la solución sea lo más uniforme posible. Incubar a temperatura ambiente durante 3-5 min.
- Usando puntas de pipeta filtradas, agregue 100 l de cloroformo. Invertir el tubo durante 15 s e incubar 3-5 min a temperatura ambiente.
- Centrífuga durante 15 min a 12.000 x g.
- Durante el giro, preparar tubos de 1,5 ml con 500 l de etanol al 70%. Ensamble y etiquete las columnas y los tubos de recogida del kit de aislamiento de ARN.
- Retire cuidadosamente la capa superior y acuosa sin alterar la capa de interfase que se formó durante la centrifugación. Coloque la capa acuosa en los tubos que contienen 70% de etanol.
- Mueva la mezcla de etanol y izado a la columna del tubo de recogida.
- A partir de este momento, siga el protocolo de producto comercial del kit de aislamiento de ARN hasta la elución final del ARN.
- Analice el ARN en busca de pureza y cantidad. Utilizar inmediatamente o conservar a -80 oC hasta su uso posterior.
9. síntesis de ADNn.
- Etiquetar los tubos PCR y reservar.
- Añadir 1 g de ARN a la mezcla de reacción del ADNn a larta de CINA para cada muestra.
- Agregue los reactivos y la plantilla al tubo PCR como se describe en el protocolo cDNA. Añadir la enzima a la mezcla en último lugar.
- Coloque los tubos de PCR en un termociclador con los siguientes ajustes de carrera: 5 min a 25oC, 40 min a 42oC, 15 min a 85oC y 4oC de retención final.
- Retire los tubos PCR del termociclo y úselos inmediatamente o guárdelos a -20 oC hasta su uso posterior.
10. Ciclo de PCR cuantitativo en tiempo real (qPCR)
- Preparar un cóctel de mezcla de reacción para cada uno de los genes a analizar. Cada reacción de PCR de 15 l requiere 7,5 l de mezcla de reactivos de 2x, 0,75 l de imprimación/sonda específica de 20X 5'-FAM y 3,75 ml de agua sin nucleasas. Los amplicons suelen oscilar entre 60-120 bp.
- Agregue 3 l de plantilla de ADNc para cada grupo experimental a los pozos apropiados.
- Agregue 12 l del cóctel de mezcla de reacción específico del gen a los pomos apropiados.
- Cubra la placa con película adhesiva óptica y centrífuga durante 1 min a 1.000 x g para eliminar cualquier burbuja que pueda haberse formado en los pozos.
- Coloque la placa PCR en un termociclador PCR en tiempo real.
- Establezca el método de carrera de la siguiente manera: 3 min a 95 oC, 40 ciclos de 95 oC durante 15 s seguidos de 60 oC durante 1 min.
- Analizar los datos normalizando el gen de interés a un control interno y expresar los datos de muestras infectadas en relación con las muestras de control no infectadas utilizando la fórmula 2-Ct y una transformación del registro2 de los números.
11. Histopatología pulmonar
- Retire los pulmones del cachorro neonatal como se describió anteriormente.
- Coloque el tejido en un volumen de formalina de búfer neutro al 10% de modo que la proporción de solución al tejido sea de aproximadamente 20:1 durante 3-7 días.
- Coordinar con un servicio de histología apropiado para la incrustación de parafina, seccionamiento, y hematoxilina y eosina (H&E) tinción. Para este trabajo, se utilizó el Núcleo de Histopatología de la Universidad de Virginia Occidental. Alternativamente, siga los protocolos descritos anteriormente19.
12. Ensayo de muerte bacteriana in vitro
- Retire el bazo del cachorro neonatal no infectado como se describió anteriormente y colóquelo en una cesta de nylon de 40 m dentro de un plato estéril de 60 mm de Petri. Repita esto y agrupe el bazo en un tubo para ser cosechado y homogeneizado juntos.
- Añadir 5 mL de PBS complementado con 10% FBS.
- Desagregue el tejido utilizando un émbolo estéril de jeringa de 3 ml hasta que se cree una sola suspensión celular.
- Recoger la suspensión de una sola célula fuera de la cesta de nylon, transferir a un tubo centrífuga de 15 ml, y células de pellet a 350 x g durante 5 min.
- Suspenda las células en el tampón de lylisis de glóbulos rojos (2 ml para hasta 7-8 bazos) y déjelo reposar durante 5 minutos a temperatura ambiente para eliminar los eritrocitos.
- Lave los splenocitos con PBS y pellets como se indica arriba.
- Suspenda los espleocitos en 0,25 ml de PBS complementados con 0,5% de BSA y EDTA de 2 mM según el rendimiento celular esperado.
- Cuente los esplocitos utilizando un hemocicómetro u otra aplicación apropiada.
- Aislar Ly6B.2+ (población mieloide de granulocitos/monocitos inflamatorios) células con perlas inmunomagnéticas según el protocolo del fabricante.
- Semilla Ly6B.2+ células a una densidad de 1 x 105 células por pozo en una placa negra o blanca de 96 pozos en un volumen de 0,1 ml de DMEM que contiene 10% FBS, 2 mM de glutamina y 25 mM HEPES (medio completo).
- Enumerar la E. coli bioluminiscente como se describe en la sección 1 y preparar el inóculo bacteriano en la multiplicidad de infección deseada (MOI) en un volumen final de 0,1 ml. Esto se hace mejor haciendo lo que es necesario para todos los pozos en un MOI común en lote.
- Añadir 0,1 ml de inóculo bacteriano o medio completo solo como control. Incubar la placa multi-pozo a 37oC y 5% deCO2 durante 1 h.
- Sustituya el soporte por 0,2 ml de medios nuevos y completos que contengan gentamicina (100 g/ml) retirando suavemente los medios con una pipeta y añadiendo medios frescos con una nueva punta de pipeta. Devolver el cultivo a la incubación durante 2 h adicionales.
- A las 3 horas después de la infección, mida la luminiscencia en cada pocólite de la placa de cultivo tapada desde la parte inferior usando un lector de placas y luego devuelva el cultivo a la incubación.
- Repita las medidas de luminiscencia en otros puntos de tiempo deseados.
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Representative Results
Este protocolo indujo sepsis bacteriana en ratones neonatales, y utilizamos imágenes intravitales longitudinales, enumeración de bacterias en la sangre, evaluaciones histológicas de patología y perfiles inflamatorios de expresión de citoquinas para estudiar el curso de la enfermedad. Se observaron signos de morbilidad en cachorros neonatales infectados con inóculos bajos (2 x10 6 UFC) y altos (7 x 106 UFC) de E.coli a lo largo del tiempo. Los cachorros que recibieron el mayor inóculo mostraron signos más prominentes de angustia que incluían movilidad reducida, la incapacidad para corregir su postura y la capacidad de deterioro de la capacidad de mantener una posición vertical por 24 h después de la infección (hpi). Había, sin embargo, una gama de morbilidad ya que algunos cachorros parecían peor que otros. Inmediatamente después de la infección, un animal en dosis bajas murió debido a la exposición a isoflurano durante una sesión de diagnóstico por imágenes para establecer la línea de base. En 24 hpi, dos de los seis animales en dosis altas sucumbieron a la infección sistémica (33,3% de mortalidad). Los cachorros infectados que recibieron un inóculo de dosis alta o baja pesaban significativamente menos que sus littermatos de control a 24 hpi (Figura 1A,B). Todos los cachorros que recibieron el inóculo más alto cumplieron con los criterios finales a 24 hpi. Como tal, todos los cachorros infectados en este grupo fueron eutanasiados después de la toma de imágenes. Las bacterias en la sangre se enumeraron para un subconjunto de ratones que recibieron el inóculo inferior, y para todos los animales que recibieron el inóculo más alto ya que todos fueron eutanasiados. Los resultados de dos experimentos realizados de manera similar indican que mientras que la mayoría de los animales tenían altos niveles de bacterias en la sangre (CFU/ml) a 24 hpi, algunos animales no tenían bacterias detectables en la sangre(Figura 1C). Estos últimos sugieren que eliminaron la infección en este momento. Como era de esperar, los cachorros que recibieron el inóculo más alto tenían casi tres órdenes de magnitud más UFC/ml a 24 hpi en relación con los cachorros que recibieron la dosis baja de inóculo (Figura 1C).
Las imágenes animales vivos de bacterias luminiscentes confirmaron aún más la diseminación de bacterias y el aumento del crecimiento en cachorros neonatales a lo largo del tiempo a 10 y 24 hpi(Figura 2 y Figura 3). Además, utilizando imágenes intravitales con el microCT, pudimos identificar los focos de infección, incluyendo el cerebro (Figura 2B), los pulmones(Figura 2B, Figura 3A,B) y otros tejidos periféricos (Figura 2B). Los pulmones de algunos ratones altamente infectados demostraron regiones opacas consistentes con la consolidación inflamatoria que co-localizada a la señal bacteriana luminiscente (Figura 3A). Estas regiones de presunto exudado inflamatorio no se encuentran en los pulmones de control no infectados (Figura 3A). Se demuestra más evidencia de una respuesta pronunciada de citoquinas inflamatorias dentro de los pulmones de los cachorros infectados mediante el análisis de la expresión génica de IL-1, IL-6 y TNF-α. Se observó un aumento significativo de la expresión en relación con los controles de las tres citoquinas en los grupos de inóculos bajos y altos(Figura 4A). La histopatología del pulmón también se examinó a 24 hpi en control y a los cachorros infectados. A pesar de los perfiles de citoquinas inflamatorias similares, se observó comúnmente un aumento progresivo de la patología desde el inóculo inferior al más alto. En comparación con el tejido de los controles no infectados, los pulmones de los cachorros infectados mostraron cambios inflamatorios notables, engrosamiento de la pared alveolar, aumento de la hemorragia alveolar y infiltración inflamatoria (Figura 4B). En las infecciones más graves, la congestión pulmonar y las zonas de hemorragia contribuyeron a una reducción masiva del espacio al aire libre(Figura 4B). En conjunto, estos resultados demuestran que en nuestro modelo de sepsis neonatal de inicio temprano, la diseminación de bacterias luminiscentes puede seguirse a lo largo del tiempo desde un sitio de inoculación subescapular hasta focos de infección importantes y causar inflamación y patología significativas en animales gravemente infectados.
Para estudiar los factores del huésped que contribuyen a la muerte bacteriana por las células inmunitarias innatas como monocitos, macrófagos y neutrófilos, desarrollamos un ensayo in vitro sensible para medir el aclaramiento bacteriano. Ly6B.2+ células aisladas de los bazos de ratones neonatales fueron infectadas con E. coli bioluminiscente en un rango de MOIs durante 1 h y luego tratadas con gentamicina para matar bacterias extracelulares. Con 3, 6, 20 y 48 hpi, la luminiscencia intracelular se midió con un lector multimodo. Como era de esperar, con el aumento del MOI, se registró más señal luminiscente a 3 h(Figura 5). Poco a poco, esta señal se perdió, indicativamente el aclaramiento bacteriano (Figura 5). Este ensayo es susceptible de citoquinas suplementadas, neutralización de efectores secretos, y la adición de inhibidores farmacológicos de vías celulares para estudiar intervenciones que pueden promover el aclaramiento bacteriano y servir para mejorar los resultados en el modelo de sepsis neonatal descrito aquí.
Figura 1: Cambios en el peso corporal y la replicación bacteriana en ratones neonatales sépticos.
(A,B) Pesos individuales del ratón dentro de un grupo (bajo y alto) expresados como un porcentaje del peso medio de los cachorros de control de littermate. Los datos se presentan como porcentaje medio ± SEM. Las pruebas t individuales en cada punto de tiempo posterior a la infección revelan diferencias significativas a las 24 horas entre los cachorros de control y los cachorros que recibieron el inóculo bajo (p<0.0001) (A), o entre los cachorros de control y los cachorros que recibieron el alto inóculo(p.0.0031) (B). (C) La prueba de CFU/ml en la sangre a 24 hpi fueron transformadas y presentadas como la media ± prueba SEM. Mann-Whitney revela una tendencia hacia la importancia entre los inóculos de dosis baja y alta(p.0.0882). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Las imágenes intravitales demuestran la diseminación de bacterias en ratones neonatales con el tiempo.
(A) Un ratón neonatal representativo (#1) infectado con un inóculo de 2 x 106 UFC se muestra en el momento 0, 10 y 24 hpi. Se muestra una escala colorimétrica con los valores de resplandor mínimo y máximo por punto de tiempo para cada punto de tiempo. Los ratones a 0 y 10 h se muestran tanto en su escala de punto de tiempo como en la escala de 24 horas para demostrar cambios en el crecimiento bacteriano a lo largo del tiempo. (B) Se muestran imágenes microCT reconstruidas en 3D del mismo ratón neonatal a 10 y 24 hpi. Cada punto de tiempo tiene imágenes en perspectivas aéreas, transaxiales y coronales. En la imagen transaxial a 24 hpi, el avión se ha movido hacia la periferia del ratón para mostrar mejor los focos de infección en los tejidos periféricos. Las flechas blancas indican el cerebro y el riñón a 10 hpi y el riñón y el pulmón a 24 hpi. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Los pulmones son un sitio de infección importante durante la sepsis bacteriana en neonatos.
(A) Las imágenes microCT reconstruidas en 3D representativas de un ratón neonatal (#5) infectado con un inóculo de 7 x 106 UFC se muestran a 24 hpi en comparación con un control no infectado. Ambos ratones se muestran en la perspectiva transaxial y los pulmones están indicados por flechas blancas. El ratón infectado se colocó en dos escalas de resplandor (fotones/seg). La escala #1 incluye las 6 longitudes de onda (500, 520, 560, 580, 600, 620 nm) y la escala #2 incluye solo 500, 520 y 560 nm de longitud de onda. Esta segunda escala nos permitió visualizar una mayor señal en las bacterias en los pulmones porque las longitudes de onda más bajas son más altamente absorbidas por el tejido y producen una señal más fuerte. (B) Las imágenes microCT reconstruidas en 3D representativas de un ratón neonatal (#4) infectado con un inóculo de 7 x 106 UFC se muestran a 24 hpi. Este punto de tiempo tiene imágenes en las perspectivas de la parte superior, sagital, transaxial y coronal. Las flechas blancas indican focos de infección en los pulmones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Inflamación y hallazgos histopatológicos asociados en los pulmones de los neonatos sépticos.
A 24 hpi, los pulmones fueron cosechados de cachorros que recibieron 2 x 106 o 7 x 106 UFC o controles no infectados. (A) el ARN se aisló y la expresión de IL-1, IL-6 o TNF-α según se determinó en relación con los controles no infectados por PCR cuantitativo en tiempo real utilizando la fórmula 2- . Los datos se muestran como el cambio de la secuencia del registromedio 2 en la expresión ± SEM para cada inóculo como se indica. La significación estadística se determinó utilizando pruebas t no asolibadas de valores de Citoquinas individuales y el control interno en el intervalo de confianza del 95%. Los asteriscos indican p<0.01. (B-D) Se muestran secciones histopatológicas de los tejidos pulmonares manchados de H&E (20x, área de interés construida en máscara de recorte y agrandada para mayor claridad). Se muestran tejidos pulmonares de un control no infectado representativo (B) o neonato infectado en el inóculo bajo (C) o alto (D). Las flechas amarillas indican engrosamiento alveolar (C) o hemorragia (D). Barra de escala a 500 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Un ensayo in vitro para el aclaramiento bacteriano.
Las células Ly6B.2+ se aislaron del bazo de los neonatos de control no infectados. Las células se sembraron en placas de 96 pozos e infectadas con E. coli O1:K1:H7 que expresa la luciferasa en una multiplicidad de infección (MOI) de 10, 50 o 250 como se indica. Después de 1 h, el medio fue reemplazado por fresco que contenía gentamicina (100 g/ml). Se muestran las unidades de luz relativa media (RLU) ± SE para un experimento individual representativo de múltiples. La significancia estadística en el intervalo de confianza del 95% se determinó utilizando pruebas t no pares con la corrección de Welch; asteriscos indican p<0.05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Nuestro modelo de infección subescapular para inducir sepsis bacteriana en ratones neonatales es un método novedoso para estudiar la propagación longitudinal de patógenos bacterianos en tiempo real. La imagen intravital ofrece la oportunidad de explorar la diseminación bacteriana en tiempo real en neonatos. Esto es fundamental para entender la cinética de la diseminación bacteriana y para seguir estudiando la respuesta del huésped y el daño en la fase apropiada de la enfermedad. A los cachorros de ratón se les administra una inyección subcutánea y subescapular de inóculo bacteriano. Esta técnica de inyección es más simple que otras alternativas de uso común, como la vena de la cola y las infecciones intraperitoneales, ya que requiere menos precisión dentro de un sitio de inyección. Esto es importante dado el pequeño tamaño de los cachorros. Las imágenes intravitales permiten una evaluación longitudinal de la proliferación bacteriana y la diseminación en los tejidos periféricos y el sistema nervioso central a lo largo del tiempo sin la necesidad de sacrificar al animal. Se han utilizado enfoques y tecnologías de imagen similares para el estudio de la biología del cáncer y la metástasis20,21. Además, mientras que otro estudio ha citado el uso de imágenes bioluminiscentes durante una infección por E. coli en ratas neonatales22,aquí, hemos aplicado el enfoque a ratones neonatales, en el que nuestra metodología permite la evaluación de la cinética bacteriana durante la sepsis murina. La visualización de las bacterias se basa en la emisión de luz bioluminiscente a varias longitudes de onda de bacterias (por ejemplo, actividad bacteriana de luciferasa) dentro del animal. La bioluminiscencia se visualiza a través de una cámara de dispositivo acoplado (CCD) cargada en frío. La bioluminiscencia visualizada resultante se puede reconstruir en una imagen 3D que muestra los efectos espaciales y temporales de las bacterias dentro de un animal. Para una capa adicional y más matizada de adquisición de datos, la identificación exitosa de animales a través del tatuaje de cola permite una evaluación de medidas repetidas de cachorros individuales a lo largo del tiempo y la identificación de posibles valores atípicos dentro de un grupo experimental determinado.
La aplicación más exitosa del modelo descrito requiere precisión en la preparación del inóculo bacteriano. Aquí, describimos un método optimizado para la preparación bacteriana utilizando una curva de crecimiento de E. coli preestablecida y validada que reduce la variación entre el objetivo y el inóculo real. Esto permite la reproducibilidad experimental en un inóculo previsto. La inclusión de dos inóculos en nuestro modelo demostró resultados dependientes de la dosis en las UFC en sangre, mortalidad y patología pulmonar. Sin embargo, algunos aspectos de la trayectoria de la enfermedad no dependían de la dosis. La falta de aumento de peso en animales infectados no dependía del inóculo a 24 hpi. Además, se observaron niveles similares de expresión inflamatoria de citoquinas en el pulmón en respuesta a la infección con ambos inóculos. Queda por determinar si este patrón se replicaría o no en todos los tejidos donde se observaron bacterias, como el riñón, el hígado, el bazo y el cerebro. Además de la sepsis, E. coli O1:K1:H7 se asocia con meningitis en la población neonatal23. Esta infección cerebral ocurre cuando las bacterias de la periferia invaden y penetran la barrera hematoencefálica. Estudios futuros explorarán este aspecto del modelo a través del análisis de los cambios en la expresión de proteínas de unión estrecha, así como probar diferentes rangos de inóculos bacterianos. Una modificación adicional durante las imágenes intravitales incluye la adición de una bola de algodón singular, doused en isoflurano, que se coloca aproximadamente a 2-3 pulgadas de distancia de los ratones durante la toma de imágenes. En respuesta a experimentos anteriores en los que los cachorros neonatales han recobrado la conciencia durante la sesión de imágenes, evitando la adquisición precisa de imágenes, ahora colocamos la bola de algodón lo suficientemente cerca de los ratones para mantenerlos continuamente anestesiados durante la toma de imágenes. Sin embargo, es importante que esto no se haga tan cerca que no se recuperen de la anestesia.
Aunque flexible y fácilmente adaptable para el estudio de la cinética de diferentes bacterias en varios modelos animales y de enfermedades, nuestro protocolo tiene algunas limitaciones a tener en cuenta. La primera limitación a tener en cuenta es que la vía subescapular de la infección no refleja una vía natural de transmisión. Sin embargo, un objetivo principal en el desarrollo de nuestro modelo desde el principio fue establecer un modo de parto fácilmente reproducible que pudiera utilizarse para establecer una infección sistémica que replica aspectos de la enfermedad humana. Por lo tanto, en este informe, describimos un modelo de síndrome de la enfermedad de sepsis de inicio temprano humano, no un modelo de transmisión natural. Existe un modelo establecido de parto oral en ratas neonatales que replica algunos aspectos de la transmisión humana común, como la colonización inicial de la infección por E. coli en el canal alimentario y la posterior diseminación al torrente sanguíneo y a los tejidos periféricos, incluido el cerebro22. El modelo establecido por Witcomb y sus colegas también incorpora E. coli bioluminiscente e imágenes intravitales. Además, es crucial minimizar la exposición al isoflurano, así como inyectar, tatuar la cola y manejar cachorros lo más rápido posible sin comprometer la precisión y precisión de las técnicas en un intento de mitigar los niveles de estrés tanto para los neonatos como para las presas. En algunos casos, si los cachorros experimentan manipulaciones mejoradas inducidas por el hombre y/o experimentales, las presas pueden dejar de amamantar y cuidar a los cachorros, lo que resulta en una disminución de la supervivencia no relacionada con la infección. Del mismo modo, los cachorros que están expuestos al isoflurano durante períodos prolongados más allá de los aproximadamente 10 minutos de una sesión de diagnóstico por imágenes tienen un mayor riesgo de muerte; por lo tanto, es crucial suministrar suficiente isoflurano para anestesiar lo suficiente a los ratones, pero no lo suficiente para eutanasiarlos. Un último punto de consideración es el límite de sensibilidad. Los tejidos en los que se enumeraron menos de10 4 UFC/ml E. coli la señal luminiscente registrada cae en el extremo inferior del rango detectable, según el método de escalado utilizado en el software de imágenes3. Por lo tanto, algunos tejidos pueden ser colonizados con niveles bajos de bacterias, pero aparecen sin bioluminiscencia visible.
Actualmente, la mayoría de los estudios utilizan métodos adultos de diseminación bacteriana, como inyecciones intraperitoneales (i.p.) y venas de cola para neonatos. Pluschke y Pelkonen analizaron el efecto de E. coli K1 en ratones neonatales a través de i.p., vena de la cola e infecciones orales24. Este estudio demostró que diferentes genotipos de ratones con inmunodeficiencias son más susceptibles a la cepa K1; sin embargo, muchos aspectos de la respuesta inmune del huésped a la infección, así como los mecanismos para la propagación bacteriana se dejan sin abordar. Deshmukh y sus colegas infectaron ratones neonatales por vía intraperitoneal con E. coli K1 o K. pneumoniae y midieron UFC en el bazo y el hígado a 72 hpi25. Este estudio también analizó algunos aspectos de la respuesta del huésped a la infección basada en la exposición previa de ratones a antibióticos. Sin embargo, no se abordó una investigación exhaustiva de la diseminación bacteriana a los tejidos periféricos y la sangre a lo largo del tiempo en paralelo con el perfiles inflamatorios en el mismo tejido (excepto la granulocitosis). Otros estudios de sepsis neonatal en ratones con Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Grupo B Streptococcusy E. coli exploran diversos aspectos del sistema inmunitario huésped en respuesta a la infección. Sin embargo, ninguno de estos estudios utiliza imágenes intravitales para explorar la cinética de la diseminación bacteriana o la localización de los focos de infección23,25,26,27. Nuestro método de infección e imágenes intravitales, combinado con la evaluación de la carga bacteriana y el perfilado inflamatorio de los tejidos periféricos, nos permite examinar exhaustivamente los aspectos del huésped y el patógeno durante la infección, proporcionando una comprensión más precisa de la interacción huésped-patógeno durante la sepsis.
Tenemos la intención de utilizar este modelo de infección e imágenes para promover nuestra comprensión de la sepsis neonatal de inicio temprano utilizando una variedad de bacterias patógenas comúnmente responsables de la sepsis en neonatos, incluyendo estreptococos del Grupo B, K. pneuomoniaey Listeria monocytogenes. Este modelo de infección nos permitirá comparar longitudinalmente la diseminación de diferentes patógenos bacterianos en paralelo con la respuesta del huésped en neonatos. Además, este modelo es adaptable a la transferencia adoptiva de tipos de células inmunitarias específicas (conjugadas fluorescentemente) para estudiar su migración a sitios de infección y la posterior influencia en la respuesta del huésped y el control de bacterias. Esto otorga la oportunidad de comprender mejor las interacciones huésped-patógeno que ocurren durante la sepsis en la vida temprana de maneras que no se han demostrado previamente.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por fondos institucionales a C.M.R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Insulin Syringe | Coviden | 1188128012 | Inoculum or PBS injection |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 89370-094 | Histopathology |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | LSA1049201 | Bacterial clearance assay |
| Animal Tattoo Ink Paste | Ketchum | KI1482039 | Animal identification |
| Animal Tattoo Ink Green Paste | Ketchum | KI1471039 | Animal identification |
| Anti-Ly-6B.2 Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-100-781 | Cell isolation |
| Escherichia coli O1:K1:H7 | ATCC | 11775 | |
| Escherichia coli O1:K1:H7-lux (expresses luciferase) | N/A | N/A | Constructed in-house at WVU |
| E.Z.N.A. HP Total Extraction RNA Kit | Omega Bio-tek | R6812 | RNA extration |
| DPBS, 1X | Corning | 21-031-CV | |
| Difco Tryptic Soy Agar | Becton, Dickinson and Company | 236950 | Bacterial growth |
| IL-1 beta Primer/Probe (Mm00434228) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Cytokine expression qPCR |
| IL-6 Primer/Probe (Mm00446190) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Cytokine expression qPCR |
| iQ Supermix | Bio-Rad | 1708860 | Real-time quantitative PCR |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708891 | cDNA synthesis |
| Isolation Buffer | Miltenyi Biotec | N/A | Bacterial clearance assay |
| IVIS Spectrum CT and Living Image 4.5 Software | Perkin Elmer | N/A | Intravital imaging |
| LB Broth, Lennox | Fisher BioReagents | BP1427-500 | Bacterial growth |
| EASYstrainer (Nylon Basket) | Greiner Bio-one | 542 040 | Cell strainer |
| SpectraMax iD3 | Molecular Devices | N/A | Plate reader |
| Pellet Pestle Motor | Grainger | 6HAZ6 | Tissue homogenization |
| Polypropylene Pellet Pestles | Grainger | 6HAY5 | Tissue homogenization |
| Prime Thermal Cycler | Techne | 3PRIMEBASE/02 | cDNA synthesis |
| TNF-alpha Primer/Probe (Mm00443258) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Cytokine expression qPCR |
| TriReagent (GTCP) | Molecular Research Center | TR 118 | RNA extration |
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