Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

En neonatal bildmodell av gramnegativ bakteriell sepsis

Published: August 12, 2020 doi: 10.3791/61609
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 1, 1,2
1Department of Microbiology, Immunology, & Cell Biology, West Virginia University School of Medicine, 2Vaccine Development Center at West Virginia University Health Sciences Center
* These authors contributed equally

Summary

Infektion av neonatal möss med bioluminescerande E. coli O1:K1:H7 resulterar i en septisk infektion med betydande pulmonell inflammation och lung patologi. Här beskriver vi förfaranden för att modellera och ytterligare studera neonatal sepsis med hjälp av längsgående intravital imaging parallellt med uppräkning av systematiska bakteriebördor, inflammatorisk profilering och lung histopatologi.

Abstract

Nyfödda löper en ökad risk för bakteriell sepsis på grund av den unika immunprofil de visar under de första månaderna av livet. Vi har upprättat ett protokoll för att studera patogenesen av E. coli O1:K1:H7, en serotyp som ansvarar för hög dödlighet i nyfödda. Vår metod utnyttjar intravital imaging av neonatal pups vid olika tidpunkter under utvecklingen av infektion. Denna avbildning, parallellt med mätning av bakterier i blodet, inflammatorisk profilering och vävnad histopatologi, innebär en rigorös strategi för att förstå infektionsdynamik under sepsis. I den aktuella rapporten modellerar vi två infektiösa inokulat för jämförelse av bakteriebelastningar och sjukdomens svårighetsgrad. Vi finner att subscapular infektion leder till spridas infektion genom 10 h post-infektion. Genom 24 h, infektion av luminescent E. coli var rikligt i blodet, lungor och andra perifera vävnader. Expression av inflammatoriska cytokiner i lungorna är signifikant vid 24 h, och detta följs av cellulär infiltration och bevis på vävnadsskador som ökar med smittsam dos. Intravital avbildning har vissa begränsningar. Detta inkluderar en luminescent signal tröskel och några komplikationer som kan uppstå med nyfödda under anestesi. Trots vissa begränsningar, finner vi att vår infektion modell erbjuder en insikt för att förstå longitudinella infektion dynamik under neonatal murine sepsis, som inte har undersökts noggrant hittills. Vi förväntar oss att denna modell också kan anpassas för att studera andra kritiska bakterieinfektioner under det tidiga livet.

Introduction

Bakteriell sepsis är ett betydande bekymmer för nyfödda som uppvisar en unik immunprofil under de första dagarna av livet som inte ger tillräckligt skydd mot infektion1. Neonatal sepsis fortsätter att vara en betydande amerikanska hälso-och sjukvårdsproblem står för större än 75.000 fall årligen i USA ensam2. För att studera dessa infektioner på djupet krävs nya djurmodeller som rekapitulerar aspekter av sjukdomar hos människor. Vi har etablerat en neonatal mus infektion modell med hjälp av Escherichia coli, O1:K1:H73. E. coli är den näst vanligaste orsaken till neonatal sepsis i USA, men ansvarig för majoriteten av sepsis-associerade dödlighet4,5. Det är dock den främsta orsaken när pre-term och mycket låg födelsevikt (VLBW) spädbarn anses självständigt5. Den K1 serotyp är oftast förknippas med invasiva blodomloppet infektioner och hjärnhinneinflammation hos nyfödda6,7. För närvarande finns det inga andra behandlingsalternativ utöver antibiotika och stödjande vård. Samtidigt fortsätter andelen antibiotikaresistens att stiga för många patogena bakterier, med vissa stammar av E. coli resistenta mot en mängd antibiotika som vanligen används vid behandling8. Således är det absolut nödvändigt att vi fortsätter att generera metoder för att studera mekanismerna för sepsis och värdsvaret hos nyfödda. Dessa resultat kan bidra till att förbättra nuvarande behandlingar och infektionsresultat.

Immuntillståndet hos nyfödda kännetecknas av både fenotypiska och funktionella skillnader jämfört med vuxna. Till exempel, förhöjda nivåer av antiinflammatoriska och regulatoriska cytokiner, såsom interleukin (IL)-10 och IL-27, har visat sig produceras av navelsträngen blod-härledda makrofager och är närvarande på högre nivåer i serum av murine nyfödda9,10,11. Detta är förenligt med lägre nivåer av IFN-α, IFN-ɣ, IL-12 och TNF-α som ofta rapporteras från neonatalceller jämfört med vuxna motsvarigheter10. Dessutom är neonatal immunsystemet skev mot en Th2 och reglerande T cell svar jämfört med vuxna12. Förhöjda antal neutrofiler, T-celler, B-celler, NK-celler och monocyter finns också i nyfödda, men med betydande funktionsnedsättningar. Detta inkluderar defekter i uttryck av cellytan markörer och antigen presentation som tyder på omognad13,14,15. Dessutom är neonatal neutrofiler väsentligt bristfälliga i sin förmåga att migrera till chemotactic faktorer16. Myeloida-härledda suppressorceller (MDSCs) finns också på förhöjda nivåer hos nyfödda och nyligen visat sig vara en källa till IL-2711. MDC är mycket suppressiv mot T-celler17. Tillsammans visar dessa data begränsningar i neonatal immunitet som lånar ut till ökad mottaglighet för infektion.

För att studera utvecklingen av bakteriebördan och dissekera skyddande värd immunsvar under neonatal sepsis, har vi utvecklat en ny infektion modell. Neonatal möss vid dag 3-4 i livet är svåra att injicera i intraperitoneal utrymme eller svans ven. I vår modell, dag 3 eller 4 ungar administreras den bakteriella inokulat eller PBS subkutant in i scapular regionen. En systemisk infektion utvecklas och med hjälp av självlysande E. coli O1:K1:H7, kan vi längsgående bild enskilda neonatal möss att följa den spridas bakteriebördan i perifera vävnader. Detta är den första rapporterade modellen att utnyttja intravital avbildning för att förstå kinetiken av spridning av bakterier under sepsis i murine nyfödda3.

Här beskriver vi ett protokoll för att inducera septiska E. coli infektioner i neonatal möss3. Vi beskriver hur man förbereder bakteriell inokulat för injektion, och hur man skörda vävnad för bedömning av patologi, mätning av inflammatoriska markörer genom genuttryck analys och uppräkning av bakteriebördan. Dessutom beskrivs också användning av luminescent E. coli för intravital avbildning av infekterade nyfödda och kvantifiering av bakteriellt dödande av neonatal immunceller. Dessa protokoll kan också anpassas för att studera andra viktiga bakteriella infektioner hos nyfödda. De data som presenteras här representerar en övergripande roman strategi för att förstå infektion dynamik i en översättlig neonatal sepsis modell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla förfaranden godkändes av West Virginia Institutionskommittéer för djurvård och användning och genomfördes i enlighet med rekommendationerna från Vägledning för vård och användning av laboratoriedjur av National Research Council18.

1. Beredning av bakteriell inokulat

  1. Strimma en Tryptic soja agar (TSA) platta med en inokukulerande slinga för isolering av en enda koloni från en frys lager av E. coli O1:K1:H7-lux som uttrycker stabilt luciferas och bär kanamycin motstånd3. Inkubera över natten vid 37 °C.
  2. Följande dag låta Luria buljong (LB) komma till rumstemperatur (25 °C) i ett biosäkerhetsskåp.
  3. Under en biosäkerhet skåp huva, identifiera en enda koloni från den streckade plattan och inokulera den i 3 mL lb kompletteras med kanamycin (30 μg/mL). Inkubera över natten vid 37 °C med skakningar (220 varv/min). Det här är startkulturen.
  4. Späd startkulturen 1:100 till en färsk 3 mL LB under en skåphuva för biosäkerhet och lämna tillbaka den till inkubatorn i 2-3 h vid 37 °C med skakningar (220 rpm). Det här är beståndet kultur.
  5. Läs av den optiska densiteten (OD) för både den tomma och lagerkulturen vid 600 nm med hjälp av en spektrofotometer. Tillsätt 100 μL lb (som inte innehåller några bakterier) i en brunn av en 96 väl plan bottenanalysplatta; detta är det tomma. Tillsätt sedan 100 μL från beståndet kultur till en separat brunn. Upprepa för ytterligare två replikat. Absorbansen avläses med hjälp av en tallriksläsare.
  6. Subtrahera blankabsorbansen från lagerkulturabsorbansvärdet (OD-värdet) och jämför med en tidigare genererad och validerad tillväxtkurva för att bestämma en approximation av bakterietätheten i lagerkulturen för beredning av smittsam dos.
  7. Generera målinokulat beroende på forskningsfrågan. Målinokulat på 2 x 106 (låg) och 7 x 106 (hög) kolonikondesenheter (CFUs) per mus (/mus) användes för denna studie.
    1. Dela upp måldosen per mus(Dos T) med den uppskattade koncentrationen av bakterier i lagerkulturen (Lager) för att få den volym bakterier som behövs från lagerröret (VS).
    2. Multiplicera VS med antalet möss (NM) som måste smittas tillsammans med tillräckligt för 5-10 extramaterial för den totala mängden bakterier som krävs för infektionen plus 5-10 ytterligare doser. Ta bort denna volym från lagerröret och lägg till den i ett nytt centrifugrör.
    3. Använd ekvationen nedan:
      DosT/Stock = VS x NM = total volym (VT) av bakterier som skall avlägsnas från lagerröret.
  1. Centrifugera bakterierna vid 2 000 x g i 5 min vid 4 °C och resuspend bakteriepelleten i 50 μL PBS (pH 7,2-7,6) per mus för att smittas (t.ex., för 10 doser av 2 x 106 bakterier varje dos, skulle pelleten på 2 x10 7 bakterier återanvändas i 500 μL PBS). Återigen rekommenderas att förbereda mer inokulat än vad som behövs. Förbered en lika stor volym pbs endast för kontroll inympningar. Bibehåll den smittsamma inokulat- och PBS-kontrollen på is tills infektionen.
  2. Utför sju tiofaldiga serieutspädningar i PBS i en 96 brunns bottenutspädningsplatta av plast, och plåt 25 μL av spädningarna i duplikat på kvadrant TSA-plattor kompletterade med kanamycin (30 μg/mL) för att räkna upp den faktiska mängd bakterier som administreras. Inkubera vid 37 °C över natten för kolonibildning före uppräkning.

2. Identifiering av djur

  1. Ordna ett tillräckligt antal avelspar så att kullar kan synkroniseras för åldersmatchade ungar. Åldersvariabilitet av ± 1 dag är acceptabelt.
  2. Identifiera en gravid C57BL/6 kvinnlig mus och monitor för födelse av kullen i förväg av det planerade experimentet för att exakt bestämma ålder.
  3. Till skilja emellan kontroll och infektera 3- eller 4- dag gammal pups, använda en par av liten, böter- tippat, iris sax till snip ändarna om svans om kontroll pups bara. De infekterade valparna får inte svansklipp. Innan du skär svansen, desinficera huden med en bomullstuss doused i 70% etanol. Applicera tryck på änden av svansen med en bomullstuss eller gasbinda efter behov.
    OBS: Denna procedur utförs under en biosäkerhet skåp huva. En svans klipp på cirka 1 / 8 av en tum är tillräcklig.
  4. För att identifiera ungar inom kontroll och infekterade grupper, använd en 1 mL insulinspruta med en 28 G x 1/2'' permanent nål för att tatuera ungarnas svansar. Innan tatuering, desinficera huden med en bomullstuss doused i 70% etanol. Denna procedur utförs under en biosäkerhet skåp huva.
  5. Att tatuera svansen, applicera animaliskt tatuering bläck på nålens spets. Nästa, noga hindra den pup med en hand, med deras svans fullt utsatt. Stick försiktigt in nålen under huden, samtidigt som en ytlig nivå av djup, och flytta nålen parallellt med huden några millimeter tills en liten markering, eller prick, har skapats. Vänta några sekunder innan du långsamt tar bort nålen från under huden, för att undvika att överskottsbläck frigörs från under huden.
  6. Applicera tryck på såret med en bomullstuss eller gasbinda efter behov. Ta bort överflödigt tatueringsbläck på ytan av huden med 70% etanol.
  7. Upprepa den här förlopp med följande musen inne om infektera och kontroll grupperna, fördriva tiden tillägga en i tillägg prick med var på varandra följande pup tatuerat ( e.g., pup 1 vilja har 1 pricka på deras svans, pup 2 vilja har två prick på deras svans, etc.).
    OBS: För ytterligare ett skikt av identifiering rekommenderas att använda separata färger av animaliskt tatueringstrubbe för kontroll- och infekterade grupper.

3. Subscapular inympning

OBS: För denna studie utfördes 2 experiment med en lågdos- och högdosgrupp som utsetts för varje experiment. I det första experimentet fick 7 ungar inokulat med låg dos (4 ungar användes som kontroller), och 5 ungar från ett separat skräp gavs den höga dosen (3 ungar användes som kontroller). De pups från experiment 1 som data för bara den 24 h tidspunkt. I det andra experimentet fick 8 ungar inokulat låg dos (2 ungar användes som kontroller), och 6 ungar fick inokulat med hög dos (2 ungar användes som kontroller). Pups från experiment 2 som data för den 0, 10, och 24 h tidpoints.

  1. Ålder match valpar ≤ 1 dag. Tilldela varje kull som antingen en låg dos eller en hög dos kull. Inom en kull slumpmässigt tilldela pups så en kontroll eller infektera pup.
  2. På dag 3 eller 4 postnatal, registrera vikter av alla ungar före inokulering med E. coli-lux eller PBS kontroll. Separera dammen från ungarna under denna tid för att säkerställa att de inte flyttas under infektionen.
  3. Inom ett biosäkerhetsskåp med hjälp av en insulinnål aspirera antingen PBS eller E. coli-lux-inokulatet. För detta arbete användes inokulat på 2 x 106 och 7 x 106 CFUs per mus. Håll både smittsam inokulat och PBS på is tills administrering via subscapular injektion.
  4. Placera den hos på en ren yta i biosäkerhet skåp huva och höja huden vid nacken som om att scruff valpen.
  5. I det utrymme som nu skapas mellan huden och djurets muskel, sätt in nålen, avfasa upp, precis under huden och injicera 50 μL PBS eller E. coli-lux. Släpp samtidigt den klämda delen av huden för att förhindra insprutningsbakströmning.
  6. Ta bort nålen långsamt och med omsorg. Placera pups tillbaka med dammar efter injektioner är klar.
    OBS: På grund av deras anatomiska stadium i utvecklingen, är det tekniskt utmanande att administrera en svans ven eller intraperitoneal injektion till neonatal ungar på dag 3-4. Således valdes subscapular infektion vägen för denna studie på grund av att det är lätt att verkställa.

4. Utvärdering av sjukdoms- och endpointkriterier

  1. Övervaka ungarna två gånger dagligen under hela infektionstiden. Notera eventuella avvikelser i utseende.
  2. Registrera vikter som en objektiv mätning av sjuklighet.
  3. Förutom viktförändringar, testa möjligheten för ungarna att rätta sig genom att placera den nyfödda på dorsala sidan. Sjuka djur kommer inte att kunna vända sig till den ventrala sidan och på fötterna eller kommer att slutföra denna åtgärd med svårighet.
  4. Kontrollera om följande för att markera djuren nära endpoint kriterier: mindre än 85% av normal kroppsvikt; minskad rörelse och oförmåga att rätta till sig själva, missfärgning av huden och ett mer grått eller transparent utseende till skillnad från rosa; känsla sval vid beröring, vägledande för minskad kroppstemperatur och hemorragisk blåmärken längs sidorna, också ett tecken på förväg sjukdom.
    OBS: Om de nyfödda har misslyckats med att gå upp i vikt under två dagar och passar någon av beskrivningarna i steg 4.4, har de uppfyllt endpointkriterier. Ungar som får den höga dosen uppfyller ofta endpointkriterier med 24 h. Kontrollungar inom låg- och högdoskullarna kommer att avlivas samtidigt för att möjliggöra jämförande analys mellan kontroll- och experimentgrupperna. Fortsätt till dödshjälp avsnittet nedan.

5. In vivo-avbildning av bakteriebörda

  1. Använd en microCT imager och programvara för bildbehandling och efterföljande analys.
    OBS: Pup hudfärg påverkar inte bildkvalitet.
  2. Placera buren med E. coli-lux-infekteradeneonatal möss och dammen i en BSL-2 nivå laminär flöde huva. Ta bort möss som ska avbildas, och placera i en transparent isofluran kammare i huven. Det rekommenderas att börja med oinfekterade kontroller för att mäta mängden isofluran som behövs.
  3. Öppna programvaran på datorn som är fäst vid mikroCT. Initiera systemet och vänta tills CCD-temperaturen låses vid -90 °C.
  4. Slå på isoflurane VAPORIZER på och justera ratten till 5% isofluran flöde. Håll möss i kammaren med denna isofluranblandning i 20-30 s tills de slutar röra sig; längre eller kortare anestesiexponeringstider kan behövas för vissa möss. När möss slutar röra sig, de är tillräckligt sövda, och kan avbildas.
  5. Flytta möss in i mikroct imaging kammaren och placera dem på bildrutan i benäget läge, med näsor vända vinkelrätt mot näsa kottar. Använd dental vax för att försiktigt hålla fast fötterna på bildrutan för att begränsa eventuella rörelser. Upp till 4 neonatalmöss kan avbildas åt gången.
  6. Vrid isoflurane SPRIDARE ner till 2-4% flöde för att hålla möss sövda under bildbehandling. Stäng mikroct bildkammare dörren. Kolla på mössen några sekunder senare. Om de börjar röra sig, douse en bomullstuss i isofluran och hålla den till näsan på djuret rör sig i 5 sekunder för att bedöva. Håll bomullstussen nära djuren under bildtagning. Var noga med att inte över bedöva och avsluta mössen.
  7. Med hjälp av programvaran väljer du alternativet Luminescent för avbildning. Använd ett excitationsfilter inställt på Block och utsläppsfiltret inställt på Open, 500 nm, 520 nm, 560 nm, 580 nm, 600 nm, och 620 nm. Det kommer att finnas sju totala utsläppsfilter som är inställda för lumininde.
  8. Avbilda mössen vid varje tidpunkt (0, 10 och 24 h efter infektion [hpi]) och spara alla bilder i en mapp för varje tidspunkt. Returnera ungarna till buren med dammen och kontrollera att alla ungar har återhämtat sig från anestesi.
  9. För att analysera 2D-bilder, öppna bilder i programvaran. Ändra enheter till Radiance (fotoner); detta kommer att förvandlas till Total Flux (fotoner/sekund).
  10. Analysera bara en bilduppsättning med dess flera emissionsfilter åt gången. Från varje bilduppsättning, ta del av de lägsta och högsta radiansvärden som finns längst ned till höger i varje bild (t.ex. om det finns 7 emissionsfilter kommer det att finnas 7 bilder, och 7 minimi- och maximivärden). Upprepa för varje bilduppsättning som ska jämföras.
  11. För att bestämma en skala som kommer att omfatta värden och lumininde för alla bilder, leta upp det lägsta minimivärdet och det högsta maximala värdet för varje bilduppsättning. För denna studie användes Open-filterbilderna som representativa.
    1. Framhäva och öppna bilden av val för att ändra skalan. På verktygspalettenklickar du på fliken Bildjustera och ändrar färgskalan till de lägsta lägsta och högsta maxvärden som tidigare identifierats. Spara varje bild som har angetts som en TIFF. Individuellt analysera varje tidpunkt på detta sätt för att säkerställa att rätt skala visas.
  12. Om du vill kvantifiera det totala flusset (mängden luminescent signal per mus) för varje enskild mus öppnar du en bild som tidigare beskrivits i steg 5.9-5.10. Öppna fliken ROI-verktyg på verktygspaletten och välj cirkelverktyget. Välj 1 cirkel om analysera ett område av lumininde.
  13. Flytta ROI till Overlay på området lumininde. Justera storleken på avkastningen på investeringen om det behövs.
    OBS: Om justering är nödvändig, justera ROIs i andra bilder comparably för att upprätthålla konsekvens. Välj Mät-ROIs. Fönstret ROI-mätningar kommer att öppnas som visar Total Flux (p/s), Genomsnittlig radiance (p/s/cm2/sr), Standardavvikelse för Radiance, Minsta radiance och Maximal radiance.
  14. Registrera totala fluxmätningar för varje bilduppsättning. Detta nummer är den kvantifierade mängden lumininde i musen i 2D-bilder.
  15. För att göra 3D-rekonstruerade mikroCT-bilder öppnar du panelen DLIT 3D-rekonstruktion på verktygspaletten och kontrollerar alla våglängder som ska inkluderas under fliken Analysera. Välj Rekonstruera.

6. Dödshjälp

  1. Bered och märk rör för vävnader/organ av intresse för obduktion och lämpliga applikationer i senare led.
  2. Separera nyfödda från dammen i ett biosäkerhetsskåp.
  3. Blötlägg en bomullstuss i veterinärklass isofluran och placera inuti en genomskinlig inneslutningskammare.
  4. Om blod samlas upp, preparera en P200-mikropipette med en spets och ha ett 1,5 mL-rör med 10 μL på 5 mM EDTA som antikoaguleringsmedel. En volym på 50-200 μL blod förväntas.
  5. Placera en ny i kammaren och övervaka valpen tills den blir orörlig.
  6. Snabbt, ta bort nyfödda och halshugga med sax. Om det får andas frisk luft under en längre period kan valpen återfå medvetandet. Nyfödda har minskad lungkapacitet i förhållande till vuxna möss, och andas därför inte tillräckligt djupt för dödshjälp enbart genom isofluran.
  7. Samla blod från stammen vid basen av huvudet med hjälp av en P200 mikropipette. För att maximera mängden blod som samlas in, utför detta steg så snabbt som möjligt efter halshuggning. Räkna upp bakterier i blodet genom serieutspädning och standardplåträkning enligt beskrivningen i steg 1.9.
  8. Sterilisera hela hos med 70% etanol före excision av vävnadsprover.

7. Skörd av vävnad

  1. Inom ett biosäkerhetsskåp, douse det nyfödda med 70% etanol för att förhindra kontaminering. Lägg djuret på dess högra sida.
  2. Med hjälp av tlyck, greppa huden på en punkt mellan buken och bakre vänstra benet och göra ett snitt med finspetsade kirurgiska sax. Fortsätt att skära bort huden som rör sig uppåt mot ryggen. Framåtskridande tills hela mjälten är utsatt.
  3. Använd kraftpiskarna för att greppa mjälten och ta bort den från buken, med hjälp av sax för att koppla bort bindväven. Placera mjälten i lösningen lämplig för dess nedströms applikation.
  4. För att erhålla lungorna, skala tillbaka huden på bröstet helt.
  5. In vid basen av bröstbenet med sax som hålls vertikalt, skär uppåt tills bröstkorgen är delad.
  6. Använd forceps för att greppa höger och vänster lungor individuellt och ta bort dem från brösthålan. Ta bort hjärtat från lungvävnaden genom att skära med en sax.
  7. Placera lungan i den lösning som är lämplig för dess nedströms applikation. För RNA-isolering, använd 500 μL guanidintiocyanat/fenol (GTCP). För histopatologi, använd 5 mL av 10% neutral-buffrad formalin.

8. RNA-isolering från lungvävnad för genuttryck

  1. Förkyler mikrocentrifugen till 4 °C.
  2. Finhacka lungvävnaden i GTCP med sax. Därefter homogeniserar du vävnaden med en batteridriven homogenisator. Fortsätt tills lösningen är så enhetlig som möjligt. Inkubera i rumstemperatur i 3-5 min.
  3. Med hjälp av filtrerade pipettspetsar, tillsätt 100 μL kloroform. Invertera röret i 15 s och inkubera 3-5 min i rumstemperatur.
  4. Centrifugera i 15 min vid 12 000 x g.
  5. Under spinnet, förbered 1,5 mL rör med 500 μL av 70% etanol. Montera och märk in kolonnerna och uppsamlingsrören från RNA-isoleringssatsen.
  6. Avlägsna försiktigt toppen, vattenskiktet utan att störa det interfasskikt som bildas vid centrifugeringen. Placera vattenskiktet i rören som innehåller 70% etanol.
  7. Flytta etanol- och lysateblandningen till kolonnen i uppsamlingsröret.
  8. Från denna punkt på, följ RNA isolering kit kommersiella produktprotokollet fram till den slutliga eluering av RNA.
  9. Analysera RNA för renhet och kvantitet. Använd omedelbart eller förvara vid -80 °C tills vidare används.

9. cDNA-syntes

  1. Märk PCR-rör och ställ åt sidan.
  2. Tillsätt 1 μg RNA till cDNA-reaktionsblandningen för varje prov.
  3. Lägg till reagenserna och mallen i PCR-röret enligt beskrivningen i cDNA-protokollet. Tillsätt enzymet till blandningen sist.
  4. Placera PCR-rör i en termocyklare med följande körinställningar: 5 min vid 25 °C, 40 min vid 42 °C, 15 min vid 85 °C och 4 °C slutligt håll.
  5. Ta bort PCR-rör från thermocycler och använd omedelbart eller förvara vid -20 °C tills vidare används.

10. Realtid kvantitativa PCR (qPCR) cykel

  1. Förbered en reaktion mix cocktail för var och en av de gener som skall analyseras. Varje 15 μL PCR-reaktion kräver 7,5 μL 2x reagensblandning, 0,75 μL av 20X 5'-FAM-märkt genspecifik primer/sond, och 3,75 μL nukleafritt vatten. Amplicons varierar vanligtvis från 60-120 bp.
  2. Tillsätt 3 μL cDNA-mall för varje försöksgrupp till lämpliga brunnar.
  3. Tillsätt 12 μL av den genspecifika reaktionsmixcocktailen till lämpliga brunnar.
  4. Täck plattan med optisk självhäftande film och centrifug i 1 min vid 1 000 x g för att avlägsna eventuella bubblor som kan ha bildats i brunnarna.
  5. Placera PCR-plattan i en PCR-termcycler i realtid.
  6. Ställ in körmetoden enligt följande: 3 min vid 95 °C, 40 cykler på 95 °C i 15 s följt av 60 °C i 1 min.
  7. Analysera data genom att normalisera den gen som är av intresse för en intern kontroll och uttrycka data från infekterade prover i förhållande till icke infekterade kontrollprover med formeln 2-ΔΔCt och en log2-transformation av siffrorna.

11. Lung histopatologi

  1. Ta bort lungorna från neonatalpvalpen enligt ovan.
  2. Placera vävnaden i en volym av 10% neutral-buffrad formalin så att förhållandet mellan lösning och vävnad är ungefär 20:1 i 3-7 dagar.
  3. Samordna med en lämplig histologitjänst för paraffininbäddning, snittning, och hematoxylin och eosin (H&E) färgning. För detta arbete, West Virginia University Histopatologi Core utnyttjades. Alternativt, följ tidigare beskrivna protokoll19.

12. In vitro bakteriell avlivningsanalys

  1. Ta bort mjälten från den oinfekterade neonatalpuppan enligt ovan och placera den i en 40 μm nylonkorg i en steril petriskål på 60 mm. Upprepa detta och pool mjälte i ett rör som skall skördas och homogeniseras tillsammans.
  2. Tillsätt 5 mL PBS kompletterat med 10% FBS.
  3. Disaggregate vävnaden med hjälp av en steril 3 mL spruta kolven tills en enda cell suspension skapas.
  4. Samla upp encellsupphängningen utanför nylonkorgen, överför till ett 15 mL-centrifugrör och pelletsceller vid 350 x g i 5 min.
  5. Suspend cellerna i röda blodkroppar lys buffert (2 mL för upp till 7-8 mjälte) och låt den stå i 5 min vid rumstemperatur för att eliminera erytrocyter.
  6. Tvätta splenocyter med PBS och pellet enligt ovan.
  7. Suspendera splenocyterna i 0,25 mL PBS kompletterat med 0,5% BSA och 2 mM EDTA enligt förväntad cellavkastning.
  8. Räkna splenocyterna med hjälp av en hemocytometer eller annan lämplig applicering.
  9. Isolera Ly6B.2+ (myeloisk population av granulocyter/inflammatoriska monocyter) celler med immunomagnetiska pärlor enligt tillverkarens protokoll.
  10. Frö Ly6B.2+ celler vid en densitet på 1 x 105 celler per brunn i en svart eller vit 96-brunnsplatta i en volym av 0,1 mL DMEM som innehåller 10% FBS, 2 mM glutamin, och 25 mM HEPES (komplett medium).
  11. Räkna upp bioluminescerande E. coli enligt beskrivningen i avsnitt 1 och bereda bakterieinokulat vid den önskade infektionsmultio rande (MOI) i en slutlig volym på 0,1 mL. Detta görs bäst genom att göra vad som är nödvändigt för alla brunnar vid en gemensam MOI i batch.
  12. Tillsätt 0,1 mL bakteriell inokulat eller komplett medium ensam som en kontroll. Inkubera fler-brunnsplattan vid 37 °C och 5% CO2 i 1 h.
  13. Byt ut media med 0,2 mL färska kompletta medier som innehåller gentamicin (100 μg/mL) genom att försiktigt ta bort media med en pipett och lägga till färska medier med en ny pipettspets. Återgå kulturen till inkubation för ytterligare 2 h.
  14. Vid 3 h post-infektion, mät lumineence i varje brunn av den lidded odlingsplattan från botten med hjälp av en tallrik läsare och sedan tillbaka kulturen till inkubation.
  15. Upprepa mätningar av lumininde vid andra önskade tidpunkter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Detta protokoll inducerad bakteriell sepsis i neonatal möss, och vi använde längsgående intravital imaging, uppräkning av bakterier i blodet, histologiska bedömningar av patologi och inflammatoriska cytokin uttryck profiler för att studera sjukdomsförloppet. Tecken på sjuklighet observerades hos neonatal pups infekterade med både låg (~ 2 x 106 CFUs) och hög (~ 7 x 106 CFUs) inokulat av E.coli över tid. Pups så som mottagen den belyst mer inoculum förevisat mer framträdande tecken av nöden så den inklusive nedsatte rörelseförmåga, oförmågan till rätta deras hållning, och nedsatte förmåga till upprätthålla en upprätt position vid 24 h post- infektion (hpi). Det fanns dock en rad sjuklighet som vissa valpar verkade värre än andra. Omedelbart efter infektion, en låg dos djur dog på grund av isofluran exponering under en bildbehandling session för att fastställa baslinjen. Genom 24 hpi, två av sex hög dos djur dukade under för den systemiska infektionen (33,3% dödlighet). Infekterade ungar som fick antingen en hög eller låg dos inokulat vägde betydligt mindre än deras kontrolls littermates vid 24 hpi (Figur 1A,B). Alla de ungar som fick de högre inokulat uppfyllde endpointkriterierna vid 24 hpi. Som sådan, alla infekterade ungar i denna grupp avlivades efter imaging. Bakterier i blodet räknades upp för en delmängd möss som fick det nedre inokulatet, och för alla djur som fick den högre inokulet sedan de alla avlivades. Resultaten från två utförda experiment på liknande sätt indikerar att medan de flesta djur hade höga halter av bakterier i blodet (CFUs/mL) vid 24 hpi, hade vissa djur inte påvisbara bakterier i blodet (Figur 1C). De senare tyder på att de rensat infektionen vid denna tidpunkt. Som väntat hade ungar som fick den högre inokulat nästan tre storleksordningar mer CFUs/mL vid 24 hpi i förhållande till ungar som fick den låga dosen inokulat (Figur 1C).

Levande djuravbildning av självlysande bakterier bekräftade ytterligare spridningen av bakterier och ökad tillväxt i neonatalungar över tiden vid 10 och 24 hpi (Figur 2 och figur 3). Dessutom, med hjälp av intravital avbildning med mikroCT, kunde vi identifiera infektionsfoci, inklusive hjärnan (Figur 2B), lungor (Figur 2B, Figur 3A,B), och andra perifera vävnader (Figur 2B). Lungorna hos vissa mycket infekterade möss visat ogenomskinliga regioner som överensstämmer med inflammatorisk konsolidering som samlokaliserade till luminescent bakteriell signal (Figur 3A). Dessa regioner av förmodat inflammatorisk exsudat finns inte i icke-infekterade kontroll lungor (Figur 3A). Ytterligare bevis på ett uttalat inflammatoriskt cytokinsvar inom lungorna hos infekterade ungar visas genom genuttrycksanalys av IL- 1β, IL- 6 och TNF- α. En signifikant ökning av uttryck i förhållande till kontroller observerades för alla tre cytokinerna i både de låga och höga inokulatgrupperna (figur 4A). Histopatologi av lungan undersöktes också på 24 hpi i kontroll och infekterade ungar. Trots liknande inflammatoriska cytokin profiler, en progressiv ökning av patologi var vanligen observeras från den lägre till den högre inokulat. Jämfört med vävnad från oinfekterade kontroller, lungorna av infekterade ungar visade anmärkningsvärda inflammatoriska förändringar, förtjockning av alveolar väggen, ökad alveolar blödning, och inflammatorisk infiltration (Figur 4B). Vid de svåraste infektionerna bidrog lungstockningen och blödningsområdena till en massiv minskning av det öppna luftrummet (Figur 4B). Tillsammans visar dessa resultat att i vår modell av tidig debut neonatal sepsis, spridning av självlysande bakterier kan följas över tiden från en subscapular inokulering webbplats till viktiga infektion högborgar och orsaka betydande inflammation och patologi i allvarligt infekterade djur.

För att studera värdfaktorer som bidrar till bakteriedödandet genom medfödda immunceller som monocyter, makrofager och neutrofiler utvecklade vi en känslig in vitro-analys för att mäta bakteriell clearance. Ly6B.2+ celler som isolerats från mjälten hos neonatal möss var infekterade med bioluminescerande E. coli på en rad AVH för 1 h och sedan behandlas med gentamicin att döda extracellulära bakterier. Vid 3, 6, 20 och 48 hpi mättes intracellulär luminegen med en multimode-läsare. Som väntat, med ökande MOI, spelades mer luminecent signal in vid 3 h (Bild 5). Gradvis förlorades denna signal, vägledande för bakteriell clearance (Figur 5). Denna analys är mottagliga för kompletterade cytokiner, neutralisering av utsöndrade effektorer, och tillägg av farmakologiska hämmare av cellulära vägar för att studera interventioner som kan främja bakteriell clearance och tjänar till att förbättra resultaten i neonatal sepsis modell som beskrivs här.

Figure 1
Figur 1: Förändringar i kroppsvikt och bakteriereplikation hos septiska neonatalmöss.
(A,B) Individuella musvikter inom en grupp (låg och hög) uttryckt i procent av medelvikten för parkamratkontrollungar. Data presenteras som medelprocent ± SEM. Enskilda t-tester vid varje tidspunkt efter infektionen avslöjar betydande skillnader vid 24 h mellan kontrollungar och ungar som fick den låga inokulaten (p<0,0001) (A), eller mellan kontrollungar och ungar som fick den höga inokulaturen (p=0,0031) (B). (C) CFU/mL i blodet vid 24 hpi var log omvandlas och presenteras som medelvärdet ± SEM. Mann-Whitney test avslöjar en trend mot betydelse mellan den låga och höga dos inokulat (p=0,0882). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Intravital avbildning visar på spridning av bakterier hos neonatala möss över tid.
(A) En representativ neonatalmus (#1) som är infekterad med ett inokulat på ~2 x 106 CFUs visas vid tidpunkten 0, 10 och 24 hpi. En kolorimetrisk skala med de lägsta och högsta radiansvärdena per tidspunkt visas för varje tidspunkt. Möss vid 0 och 10 h visas på både sin tidspunktskala och 24 h-skalan för att påvisa förändringar i bakterietillväxt över tiden. (B) Representativa 3D-rekonstruerade mikroCT-bilder av samma neonatalmus vid 10 och 24 hpi visas. Varje tidspunkt har bilder vid overhead, transaxial, och korona perspektiv. I den transaxiala bilden vid 24 hpi, har planet flyttat mot periferin av musen för att bättre visa infektion högborgar i de perifera vävnaderna. Vita pilar indikerar hjärnan och njuren vid 10 hpi och njure och lunga vid 24 hpi. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Lungor är en plats för större infektion under bakteriell sepsis hos nyfödda.
(A) Representativa 3D-rekonstruerade mikroCT-bilder av en neonatal mus (#5) som är infekterad med ett inokulat på ~7 x 106 CFUs visas vid 24 hpi jämfört med en oinfekterad kontroll. Båda mössen visas i det transaxiala perspektivet och lungorna indikeras av vita pilar. Den infekterade musen placerades på två utstrålning (fotoner/sek) skalor. Skala #1 omfattar alla 6 våglängder (500, 520, 560, 580, 600, 620 nm) och skalan #2 omfattar endast 500, 520 och 560 nm våglängder. Denna andra skala tillät oss att visualisera en ökad signal i bakterier i lungorna eftersom lägre våglängder är mer absorberas av vävnad och producera starkare signal. (B) Representativa 3D-rekonstruerade mikroCT-bilder av en neonatal mus (#4) som är infekterade med ett inokulat på ~7 x 106 CFUs visas vid 24 hpi. Denna tidpunkt har bilder på overhead, sagittal, transaxial, och korona perspektiv. Vita pilar indikerar infektionsfoci i lungorna. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Inflammation och associerade histopatologiska fynd i lungorna hos septiska nyfödda.
Vid 24 hpi lungorna skördades från ungar som fick ~ 2 x 106 eller 7 x 106 CFUs eller icke-infekterade kontroller. (A) RNA isolerades och uttrycket av IL-1β, IL-6, eller TNF-α som bestäms i förhållande till icke-infekterade kontroller genom kvantitativ realtids-PCR med hjälp av formeln 2-ΔΔCt. Data visas som medelvärdet log2 omvandlas förändring i uttryck ± SEM för varje inokulat som anges. Statistisk signifikans fastställdes med hjälp av oparade t-tester av ΔCt-värden mellan enskilda cytokingener och den interna kontrollen i konfidensintervallet på 95%. Asterisker anger p<0,01. (B-D) Histopatologic delar av H&E färgat lung vävnader (20x, område av intresse konstruerad till urklippsmask och utvidgade för tydlighetens skull) visas. Lungvävnader från en representativ oinfekterad kontroll (B) eller infekterad hos vid den låga (C) eller hög (D) inokulat visas. Gula pilar indikerar alveolar förtjockning (C) eller blödningar (D). Skala bar = 500 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 5
Bild 5: En in vitro-analys för bakteriell clearance.
Ly6B.2+ celler var isolerade från mjältarna av oinfekterade kontroll nyfödda. Celler var seedade i 96-väl plattor och infekterade med luciferase-uttrycker E. coli O1:K1:H7 vid en multiplicity av infektion (MOI) av 10, 50 eller 250 som anges. Efter 1 h ersattes mediet med färskt som innehöll gentamicin (100 μg/mL). Medel relativa ljusenheter (RLU) ± SE för ett enskilt experiment representativt för flera visas. Statistisk signifikans i 95% konfidensintervallet fastställdes med hjälp av oparade t tester med Welch's korrigering; asterisker anger p<0,05. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vår subscapular infektion modell för att inducera bakteriell sepsis i neonatal möss är en ny metod för att studera den longitudinella spridningen av bakteriella patogener i realtid. Intravital avbildning ger möjlighet att utforska bakteriespridning i realtid hos nyfödda. Detta är avgörande för att förstå kinetiken vid bakteriespridning och att ytterligare studera värdresponsen och -skadan vid lämplig fas av sjukdom. Musungar administreras en subkutan, subscapular injektion av bakteriell inokulat. Denna injektionsteknik är enklare än andra vanligt förekommande alternativ, såsom svansvenen och intraperitoneala infektioner, eftersom det kräver mindre precision inom ett injektionsställe. Den här är viktig givit den liten storlek om pups. Den intravitaal avbildningen möjliggör en longitudinell bedömning av bakteriespridning och spridning till perifera vävnader och det centrala nervsystemet över tid utan att djuret behöver offras. Liknande bildframställningsmetoder och tekniker har använts för studier av cancerbiologi och metastas20,21. Dessutom, medan en annan studie har hänvisat till användning av bioluminescerande avbildning under en E. coli infektion hos neonatal råttor22, här, har vi tillämpat metoden för neonatal möss, där vår metodik möjliggör utvärdering av bakteriell kinetik under murine sepsis. Visualisering av bakterierna är baserad på emission av bioluminescerande ljus vid olika våglängder från bakterier (t.ex. bakteriell luciferasaktivitet) inom djuret. Bioluminescens visualiseras sedan genom en kyld laddad kopplade enhet (CCD) kamera. Den resulterande visualiserade bioluminescens kan sedan rekonstrueras till en 3D-bild som visar både rumsliga- och tidsberoende effekter av bakterier inom ett djur. För en extra, mer nyanserad lager av datainsamling, framgångsrik djuridentifiering genom svans tatuering möjliggör en upprepad åtgärder bedömning av enskilda ungar över tiden och identifiering av möjliga extremvärden inom en viss experimentell grupp.

Den mest framgångsrika tillämpningen av den beskrivna modellen kräver noggrannhet vid beredning av bakterieinokulat. Här beskriver vi en optimerad metod för bakteriell beredning med hjälp av en på förinställd och validerad E. coli tillväxtkurva som minskar variationen mellan målet och faktiska inokulat. Detta möjliggör experimentell reproducerbarhet vid ett avsett inokulat. Införandet av två inokulat i vår modell visat dos-beroende resultat i blod CFUs, dödlighet och lung patologi. Vissa aspekter av sjukdomsbanan var dock inte dosberoende. Misslyckandet att gå upp i vikt hos infekterade djur var inte beroende av inokulat vid 24 hpi. Dessutom observerades liknande nivåer av inflammatoriska cytokin uttryck i lungan som svar på infektion med båda inokulat. Huruvida detta mönster skulle replikeras i alla vävnader där bakterier observerades, såsom njure, lever, mjälte och hjärna, återstår att fastställa. Förutom sepsis är E. coli O1:K1:H7 associerad med meningit i neonatalpopulationen23. Denna hjärninfektion uppstår när bakterier från periferin invaderar och tränger in i blod-hjärnbarriären. Framtida studier kommer att utforska denna aspekt av modellen genom analys av förändringar i snäva junction protein uttryck, samt testa olika områden av bakteriella inokulat. En ytterligare modifiering under intravital avbildning omfattar tillägg av en singular bomullstuss, doused i isofluran, som är placerad cirka 2-3 inches bort från möss under bildbehandling. Som svar på tidigare experiment där neonatalungarna har återfått medvetandet under bildsessionen, vilket förhindrar korrekt bildförvärv, placerar vi nu bomullstussen tillräckligt nära mössen för att hålla dem kontinuerligt sövda under bildbehandling. Det är dock viktigt att detta inte görs så nära att de misslyckas med att återhämta sig från anestesin.

Även flexibel och lätt anpassningsbar för studier av kinetik av olika bakterier i olika djur- och sjukdomsmodeller, har vårt protokoll vissa begränsningar att överväga. Den första begränsningen att beakta är att den subscapular infektionsvägen inte speglar en naturlig överföringsväg. Ett primärt mål i utvecklingen av vår modell från början var dock att fastställa ett lätt reproducerbart leveranssätt som skulle kunna användas för att fastställa en systemisk infektion som replikerar aspekter av mänskliga sjukdomar. Därför i detta betänkande beskriver vi en modell av människors tidiga debut sepsis sjukdom syndrom, inte en modell av naturlig överföring. Det finns en etablerad modell av oral leverans i neonatal råttor som replikerar vissa aspekter av gemensamma mänskliga överföring, såsom inledande kolonisering av E. coli infektion i alimentära kanalen och efterföljande spridning till blodomloppet och perifera vävnader, inklusive hjärnan22. Den modell som inrättats av Witcomb och kollegor innehåller också bioluminescerande E. coli och intravital bildbehandling. Dessutom är det avgörande att minimera isofluran exponering, samt injicera, svans tatuering, och hantera ungar så snabbt som möjligt utan att kompromissa noggrannhet och precision av de tekniker i ett försök att mildra stressnivåer för både nyfödda och dammar. I något fall, om den pups erfarenhet ökat mänsklig- iduced och/ eller experimentell bemanipulationer, den moderdjur kanna stopp ammande och omsorg för den pups, resulterande i sänkt överlevnaden unrelated till infektionen. På motsvarande sätt, pups så pass de/vi/du/ni är utsatt till isofluran för långvarig period bortom den cirka 10 minuterna av en tänkbar session har en ökat riskera av död; alltså är det avgörande att leverera precis tillräckligt isofluran för att tillräckligt söva mössen, men inte tillräckligt för att avliva dem. En sista fråga om hänsyn är känslighetsgränsen. Vävnader i vilka mindre än 104 CFUs/mL E. coli uppräknades den självlysande signal som registrerats faller vid den låga delen av det påvisbara intervallet, enligt skalningsmetoden som används i bildåtergivningsprogrammet3. Således, vissa vävnader kan koloniseras med låga nivåer av bakterier men visas utan synlig bioluminescens.

För närvarande, de flesta studier utnyttja vuxna metoder för bakteriell spridning, såsom intraperitoneal (i.p.) och svansen blodådarna injektioner för nyfödda. Pluschke och Pelkonen analyserade effekten av E. coli K1 på neonatal möss genom i.p., svansven, och orala infektioner24. Denna studie visade att olika genotyper av möss med immunodeficiencies är mer mottagliga för K1-stammen; dock, många aspekter av värd immunsvar mot infektion samt mekanismerna för bakteriell spridning lämnas oadresserade. Deshmukh och kollegor infekterade neonatal möss intraperitoneally med E. coli K1 eller K. pneumoniae och mätt CFUs i mjälte och lever på 72 hpi25. Denna studie analyserade också vissa aspekter av värdrespons på infektion baserat på pre-exponering av möss till antibiotika. Grundlig undersökning av bakteriell spridning till perifera vävnader och blod över tiden parallellt med inflammatorisk profilering i samma vävnad (andra än granulocytos) togs dock inte upp. Andra studier av neonatal sepsis hos möss med Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Grupp B Streptococcus, och E. coli utforska varierande aspekter av värd immunsystemet som svar på infektion. Men ingen av dessa studier utnyttja intravital avbildning för att utforska kinetiken av bakteriell spridning eller lokalisering av infektion foci23,25,26,27. Vår metod för infektion och intravital bildbehandling, i kombination med bakteriell börda bedömning och inflammatorisk profilering av perifera vävnader, tillåter oss att omfattande undersöka aspekter av både värd och patogen under infektion, vilket ger en mer exakt förståelse av värd-patogen samspelet under sepsis.

Vi avser att utnyttja denna infektion och bildframställning modell för att främja vår förståelse av tidig debut neonatal sepsis med hjälp av en mängd patogena bakterier som vanligen ansvarar för sepsis hos nyfödda, inklusive grupp B streptococci, K. pneuomoniae, och Listeria monocytogenes. Denna infektion modell kommer att tillåta oss att longitudinellt jämföra spridning av olika bakteriella patogener parallellt med värd svaret hos nyfödda. Dessutom är denna modell anpassningsbar till den adoptivöverföring av specifika (fluorescerande konjugerade) immuncelltyper för att studera deras migration till infektionsplatser och efterföljande påverkan på värdrespons och kontroll av bakterier. Detta ger möjlighet att bättre förstå de värd-patogen interaktioner som uppstår under sepsis i början av livet på sätt som inte tidigare har visats.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av institutionella medel till C.M.R.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL Insulin Syringe Coviden 1188128012 Inoculum or PBS injection
10% Neutral Buffered Formalin VWR 89370-094 Histopathology
ACK Lysis Buffer Gibco LSA1049201 Bacterial clearance assay
Animal Tattoo Ink Paste Ketchum KI1482039 Animal identification
Animal Tattoo Ink Green Paste Ketchum KI1471039 Animal identification
Anti-Ly-6B.2 Microbeads Miltenyi Biotec 130-100-781 Cell isolation
Escherichia coli O1:K1:H7 ATCC 11775
Escherichia coli O1:K1:H7-lux (expresses luciferase) N/A N/A Constructed in-house at WVU
E.Z.N.A. HP Total Extraction RNA Kit Omega Bio-tek R6812 RNA extration
DPBS, 1X Corning 21-031-CV
Difco Tryptic Soy Agar Becton, Dickinson and Company 236950 Bacterial growth
IL-1 beta Primer/Probe (Mm00434228) Thermo Fisher Scientific 4331182 Cytokine expression qPCR
IL-6 Primer/Probe (Mm00446190) Thermo Fisher Scientific 4331182 Cytokine expression qPCR
iQ Supermix Bio-Rad 1708860 Real-time quantitative PCR
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708891 cDNA synthesis
Isolation Buffer Miltenyi Biotec N/A Bacterial clearance assay
IVIS Spectrum CT and Living Image 4.5 Software Perkin Elmer N/A Intravital imaging
LB Broth, Lennox Fisher BioReagents BP1427-500 Bacterial growth
EASYstrainer (Nylon Basket) Greiner Bio-one 542 040 Cell strainer
SpectraMax iD3 Molecular Devices N/A Plate reader
Pellet Pestle Motor Grainger 6HAZ6 Tissue homogenization
Polypropylene Pellet Pestles Grainger 6HAY5 Tissue homogenization
Prime Thermal Cycler Techne 3PRIMEBASE/02 cDNA synthesis
TNF-alpha Primer/Probe (Mm00443258) Thermo Fisher Scientific 4331182 Cytokine expression qPCR
TriReagent (GTCP) Molecular Research Center TR 118 RNA extration

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Qazi, S. A., Stoll, B. J. Neonatal sepsis: a major global public health challenge. Pediatr Infect Dis J. 28, 1-2 (2009).
  2. Simonsen, K. A., Anderson-Berry, A. L., Delair, S. F., Davies, H. D. Early-onset neonatal sepsis. Clinical Microbiology Reviews. 27 (1), 21-47 (2014).
  3. Seman, B. G., et al. Elevated levels of interleukin-27 in early life compromise protective immunity in a mouse model of Gram-negative neonatal sepsis. Infections and Immunity. , (2019).
  4. Schrag, S. J., et al. Epidemiology of Invasive Early-Onset Neonatal Sepsis, 2005 to 2014. Pediatrics. 138 (6), 20162013 (2016).
  5. Stoll, B. J., et al. Early onset neonatal sepsis: the burden of group B Streptococcal and E. coli disease continues. Pediatrics. 127 (5), 817-826 (2011).
  6. Weston, E. J., et al. The burden of invasive early-onset neonatal sepsis in the United States, 2005-2008. Pediatrics and Infectious Disease Journal. 30 (11), 937-941 (2011).
  7. Hornik, C. P., et al. Early and late onset sepsis in very-low-birth-weight infants from a large group of neonatal intensive care units. Early Human Development. , Suppl 2 69 (2012).
  8. Vergnano, S., Sharland, M., Kazembe, P., Mwansambo, C., Heath, P. T. Neonatal sepsis: an international perspective. Archives of Disease in Childhood: Fetal and Neonatal Edition. 90 (3), 220-224 (2005).
  9. Kraft, J. D., et al. Neonatal macrophages express elevated levels of interleukin-27 that oppose immune responses. Immunology. 139 (4), 484-493 (2013).
  10. Basha, S., Surendran, N., Pichichero, M. Immune responses in neonates. Expert Reviews of Clinical Immunology. 10 (9), 1171-1184 (2014).
  11. Gleave Parson, M., et al. Murine myeloid-derived suppressor cells are a source of elevated levels of interleukin-27 in early life and compromise control of bacterial infection. Immunology and Cell Biology. 97 (5), 445-446 (2018).
  12. Adkins, B., Leclerc, C., Marshall-Clarke, S. Neonatal adaptive immunity comes of age. Nature Reviews Immunology. 4 (7), 553-564 (2004).
  13. Kim, S. K., Keeney, S. E., Alpard, S. K., Schmalstieg, F. C. Comparison of L-selectin and CD11b on neutrophils of adults and neonates during the first month of life. Pediatrics Research. 53 (1), 132-136 (2003).
  14. Velilla, P. A., Rugeles, M. T., Chougnet, C. A. Defective antigen-presenting cell function in human neonates. Clinical Immunology. 121 (3), 251-259 (2006).
  15. Le Garff-Tavernier, M., et al. Human NK cells display major phenotypic and functional changes over the life span. Aging Cell. 9 (4), 527-535 (2010).
  16. Weinberger, B., et al. Mechanisms underlying reduced responsiveness of neonatal neutrophils to distinct chemoattractants. Journal of Leukocyte Biology. 70 (6), 969-976 (2001).
  17. Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system. Nature Reviewss Immunology. 9 (3), 162-174 (2009).
  18. National Research Council. Guide for the care and use of laboratory animals, 8th ed. , National Academies Press. Washington, DC. (2011).
  19. Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification. Journal of Visualized Experiments. (125), e55796 (2017).
  20. Bayarmagnai, B., Perrin, L., Esmaeili Pourfarhangi, K., Gligorijevic, B. Intravital Imaging of Tumor Cell Motility in the Tumor Microenvironment Context. Methods in Molecular Biology. 1749, 175-193 (2018).
  21. Beerling, E., Ritsma, L., Vrisekoop, N., Derksen, P. W., van Rheenen, J. Intravital microscopy: new insights into metastasis of tumors. Journal of Cell Science. 124, Pt 3 299-310 (2011).
  22. Witcomb, L. A., Collins, J. W., McCarthy, A. J., Frankel, G., Taylor, P. W. Bioluminescent Imaging Reveals Novel Patterns of Colonization and Invasion in Systemic Escherichia coli K1 Experimental Infection in the Neonatal Rat. Infection and Immunity. 83 (12), 4528 (2015).
  23. Singh, K., et al. Inter-alpha inhibitor protein administration improves survival from neonatal sepsis in mice. Pediatric Research. 68 (3), 242-247 (2010).
  24. Pluschke, G., Pelkonen, S. Host factors in the resistance of newborn mice to K1 Escherichia coli infection. Microb. Patho. , 93-102 (1988).
  25. Mancuso, G., et al. Role of interleukin 12 in experimental neonatal sepsis caused by group B streptococci. Infections and Immunity. 65 (9), 3731-3735 (1997).
  26. Thammavongsa, V., Rauch, S., Kim, H. K., Missiakas, D. M., Schneewind, O. Protein A-neutralizing monoclonal antibody protects neonatal mice against Staphylococcus aureus. Vaccine. 33 (4), 523-526 (2015).
  27. Andrade, E. B., et al. TLR2-induced IL-10 production impairs neutrophil recruitment to infected tissues during neonatal bacterial sepsis. Journal of Immunology. 191 (9), 4759-4768 (2013).

Tags

Immunologi och infektion Utgåva 162 bioluminescens intravital avbildning E. coli subscapular inoculation nyfödda sepsis inflammation cytokiner
En neonatal bildmodell av gramnegativ bakteriell sepsis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Seman, B. G., Povroznik, J. M.,… More

Seman, B. G., Povroznik, J. M., Vance, J. K., Rawson, T. W., Robinson, C. M. A Neonatal Imaging Model of Gram-Negative Bacterial Sepsis. J. Vis. Exp. (162), e61609, doi:10.3791/61609 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter