Een neonatale beeldvorming model van gram-negatieve bacteriële sepsis

Summary

Infectie van neonatale muizen met bioluminescente E. coli O1:K1:H7 resulteert in een septische infectie met significante longontsteking en longpathologie. Hier beschrijven we procedures om neonatale sepsis te modelleren en verder te bestuderen met behulp van longitudinale intravitale beeldvorming parallel met de opsomsoming van systemische bacteriële lasten, ontstekingsprofilering en longsentopathologie.

Abstract

Neonaten hebben een verhoogd risico op bacteriële sepsis als gevolg van het unieke immuunsysteem profiel dat ze vertonen in de eerste maanden van het leven. We hebben een protocol opgesteld voor het bestuderen van de pathogenese van E. coli O1:K1:H7, een serotype dat verantwoordelijk is voor hoge sterftecijfers bij pasgeborenen. Onze methode maakt gebruik van intravital beeldvorming van neonatale pups op verschillende tijdstippen tijdens de progressie van infectie. Deze beeldvorming, parallel met het meten van bacteriën in het bloed, ontstekingsprofilering en weefsel histopathologie, betekent een rigoureuze benadering van het begrijpen van infectiedynamica tijdens sepsis. In het huidige rapport modelleren we twee infectieuze entculums voor de vergelijking van bacteriële lasten en de ernst van de ziekte. We vinden dat subscapulaire infectie leidt tot verspreide infectie door 10 uur na infectie. Tegen 24 uur, infectie van luminescente E. coli was overvloedig in het bloed, longen, en andere perifere weefsels. Expressie van inflammatoire cytokinen in de longen is significant bij 24 uur, en dit wordt gevolgd door cellulaire infiltratie en bewijs van weefselschade die toeneemt met infectieuze dosis. Intravital imaging heeft wel een aantal beperkingen. Dit omvat een lichtgevende signaaldrempel en enkele complicaties die kunnen ontstaan bij neonaten tijdens anesthesie. Ondanks enkele beperkingen, vinden we dat onze infectie model biedt een inzicht voor het begrijpen van longitudinale infectie dynamiek tijdens neonatale murine sepsis, die niet grondig is onderzocht tot op heden. We verwachten dat dit model ook kan worden aangepast aan andere kritische bacteriële infecties te bestuderen tijdens het vroege leven.

Introduction

Bacteriële sepsis is een belangrijke zorg voor neonaten die een uniek immuunprofiel vertonen in de eerste dagen van het leven dat geen adequate bescherming biedt tegen infectie^1. Neonatale sepsis blijft een belangrijke Amerikaanse gezondheidszorg probleem goed voor meer dan 75.000 gevallen per jaar in de VS alleen^{al 2}. Om deze infecties grondig te bestuderen, zijn nieuwe diermodellen nodig die aspecten van de menselijke ziekte samenvatten. We hebben een neonatale muis infectie model met behulp van Escherichia coli, O1:K1:H7³. E. coli is de tweede belangrijkste oorzaak van neonatale sepsis in de VS, maar verantwoordelijk voor de meerderheid van de sepsis-geassocieerde mortaliteit^4,5. Echter, het is de belangrijkste oorzaak wanneer pre-term en zeer laag geboortegewicht (VLBW) baby's worden beschouwd als onafhankelijk⁵. Het K1-serotype wordt het vaakst geassocieerd met invasieve bloedbaaninfecties en meningitis bij neonaten^6,7. Momenteel zijn er geen andere behandelingsopties dan antibiotica en ondersteunende zorg. Ondertussen blijven de tarieven van antibioticaresistentie stijgen voor veel pathogene bacteriën, met sommige stammen van E. coli resistent tegen een veelheid van antibiotica vaak gebruikt in behandeling⁸. Het is dus absoluut noodzakelijk dat we methoden blijven genereren om de mechanismen van sepsis en de gastheerrespons in neonaten te bestuderen. Deze resultaten kunnen helpen om te verbeteren op de huidige behandelingen en infectie resultaten.

De immuuntoestand van neonaten wordt gekenmerkt door zowel fenotypische als functionele verschillen in vergelijking met volwassenen. Zo is aangetoond dat verhoogde niveaus van ontstekingsremmende en regulerende cytokinen, zoals interleukine (IL)-10 en IL-27, worden geproduceerd door door navelstrengbloed afgeleide macrofagen en zijn zij op grotere niveaus aanwezig in het serum van murine neonaten^9,10,11. Dit komt overeen met lagere niveaus van IFN-α, IFN-ɣ, IL-12 en TNF-α die vaak worden gerapporteerd vanuit neonatale cellen in vergelijking met volwassen tegenhangers¹⁰. Bovendien is het neonatale immuunsysteem scheef in de richting van een Th2 en regelgevende T-celrespons in vergelijking met volwassenen¹². Verhoogde aantallen neutrofielen, T-cellen, B-cellen, NK-cellen en monocyten zijn ook aanwezig in neonaten, maar met aanzienlijke functionele beperkingen. Dit omvat defecten in expressie van celoppervlakmarkeringen en antigeenpresentatie die onrijpheid¹³,^14,15suggereren . Bovendien, neonatale neutrofielen zijn aanzienlijk tekort in hun vermogen om te migreren naar chemotactische factoren¹⁶. Myeloïde-afgeleide suppressor cellen (MDSCs) zijn ook gevonden op verhoogde niveaus in neonaten en onlangs aangetoond dat een bron van IL-27¹¹. MDC's zijn zeer onderdrukkend in de richting van T-cellen¹⁷. Gezamenlijk tonen deze gegevens beperkingen aan in neonatale immuniteit die de gevoeligheid voor infectie verhogen.

Om de progressie van de bacteriële last te bestuderen en beschermende gastheer immuunreacties te ontleden tijdens neonatale sepsis, hebben we een nieuw infectiemodel ontwikkeld. Neonatale muizen op dagen 3-4 van het leven zijn moeilijk te injecteren in de intraperitoneale ruimte of staartader. In ons model worden dag 3 of 4 pups het bacteriële entmateriaal of PBS onderhuids toegediend in het scapulaire gebied. Een systemische infectie ontwikkelt zich en met behulp van luminescente E. coli O1:K1:H7, kunnen we langswaarts beeld individuele neonatale muizen om de verspreide bacteriële last in perifere weefsels te volgen. Dit is het eerste gerapporteerde model dat intravital beeldvorming gebruikt om de kinetiek van verspreiding van bacteriën tijdens sepsis bij murine neonaten te begrijpen³.

Hier beschrijven we een protocol om septische E. coli-infecties bij neonatale muizen³te induceren. We beschrijven hoe het bacteriële entmateriaal voor injectie moet worden voorbereid en hoe weefsel kan worden geoogst voor de beoordeling van pathologie, het meten van ontstekingsmarkers door genexpressieanalyse en opsomring van de bacteriële last. Daarnaast wordt ook het gebruik van luminescente E. coli voor intravitale beeldvorming van geïnfecteerde neonaten en kwantificering van bacteriële doden door neonatale immuuncellen beschreven. Deze protocollen kunnen ook worden aangepast om andere belangrijke bacteriële infecties in neonaten te bestuderen. De hier gepresenteerde gegevens vertegenwoordigen een algemene nieuwe benadering van het begrijpen van infectiedynamiek in een vertaalbaar neonatale sepsismodel.

Protocol

Alle procedures werden goedgekeurd door de West Virginia Institutional Animal Care and Use Committees en uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen van de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals door de National Research Council¹⁸.

1. Bereiding van bacteriële inoculum

1. Streep een tryptische soja agar (TSA) plaat met een inenting lus voor isolatie van een enkele kolonie uit een vriezer voorraad van E. coli O1:K1:H7-lux die stabiel uitdrukt luciferase en draagt kanamycine weerstand³. Incubeer 's nachts bij 37 °C.
2. De volgende dag kan Luria bouillon (LB) op kamertemperatuur (25 °C) komen in een bioveiligheidskast.
3. Identificeer onder een kap van een bioveiligheidskabinet een enkele kolonie van de gestreepte plaat en inent het in 3 mL LB aangevuld met kanamycine (30 μg/mL). Incubeer 's nachts bij 37 °C met schudden (220 rpm). Dit is de starterscultuur.
4. Verdun de startercultuur 1:100 tot een verse 3 mL LB onder een bioveiligheidskauch en breng deze terug naar de couveuse voor 2-3 uur bij 37 °C met schudden (220 rpm). Dit is de aandelencultuur.
5. Lees de optische dichtheid (OD) van zowel de blanco- als de voorraadcultuur op 600 nm met behulp van een spectrofotometer. Voeg 100 μL LB (zonder bacteriën) toe in een put van een 96 goed platte bodemtestplaat; Dit is de blanco. Voeg vervolgens 100 μL van de voorraadcultuur toe aan een aparte put. Herhaal dit voor twee extra replicaties. De absorptie wordt gelezen met behulp van een plaatlezer.
6. Trek de blanco absorptie van de absorberende waarde van de voorraadcultuur (de OD-waarde) af en vergelijk deze met een eerder gegenereerde en gevalideerde groeicurve om een benadering van de bacteriële dichtheid in de voorraadcultuur voor de bereiding van infectieuze dosis te bepalen.
7. Het genereren van doelentarmen, afhankelijk van de onderzoeksvraag. Voor deze studie werden doelenoculum van 2 x^{10 6} (laag) en 7 x^{10 6} (hoge) kolonievormende eenheden (CFUs) per muis (/muis) gebruikt.
   1. Verdeel de doeldosis per muis (dosis_T)door de geschatte concentratie van bacteriën in de voorraadcultuur (Stock) om het benodigde volume bacteriën uit de stockbuis (V_S)te krijgen.
   2. Vermenigvuldig V S met het aantal muizen (N_M)die moeten worden besmet, samen met genoeg voor 5-10_extra's voor de totale hoeveelheid bacteriën die nodig zijn voor de infectie plus 5-10 extra doses. Haal dit volume uit de voorraadbuis en voeg het toe aan een nieuwe centrifugebuis.
   3. Gebruik de onderstaande vergelijking:
      Dosis_T/Stock = V_S x N_M = totaal volume (V_T)van bacteriën die uit de voorraadbuis moeten worden verwijderd.

8. Centrifugeren de bacteriën op 2.000 x g gedurende 5 min bij 4 °C en resuspend de bacteriële pellet in 50 μL PBS (pH 7.2-7.6) per te besmette muis (bijv. voor 10 doses van 2 x 10⁶ bacteriën per dosis zou de pellet van 2 x 10⁷ bacteriën opnieuw worden opgetrokken in 500 μL PBS). Nogmaals, het wordt aanbevolen om meer entmateriaal voor te bereiden dan nodig is. Bereid een gelijk volume pbs alleen voor de controle inentingen. Behoud de infectieuze entmateriaal en PBS controle op ijs tot infectie.
9. Voer zeven tienvoudige seriële verdunningen uit in PBS in een 96 goed plastic bodemverdunningsplaat en plaat 25 μL van de verdunningen in tweevoud op kwadrant TSA-platen aangevuld met kanamycine (30 μg/mL) om de werkelijke hoeveelheid toegediende bacteriën op te sommen. Incubeer bij 37 °C 's nachts voor kolonievorming voorafgaand aan de opsomring.

2. Identificatie van dieren

1. Schik een voldoende aantal broedparen zodanig dat nesten kunnen worden gesynchroniseerd voor leeftijdsgegelijke pups. Leeftijdsvariabiliteit van ± 1 dag is aanvaardbaar.
2. Identificeer een zwangere C57BL/6 vrouwelijke muis en controleer voor de geboorte van het nest voorafgaand aan het geplande experiment om de leeftijd nauwkeurig te bepalen.
3. Om onderscheid te maken tussen controle en geïnfecteerde 3- of 4-daagse oude pups, gebruik dan een paar kleine, fijngepuntige irisschaar om de uiteinden van de staarten van de controlepups alleen te knippen. De besmette pups krijgen geen staartsnips. Ontsmet de huid voor het snijden van de staart met een katoenen bal die voor 70% ethanol wordt overgoten. Druk uitoefenen op het einde van de staart met een katoenen bal of gaas als dat nodig is.
   LET OP: Deze procedure wordt uitgevoerd onder een bioveiligheidskabinetkap. Een staartsnip van ongeveer 1/8 van een inch is voldoende.
4. Om pups binnen de controle- en geïnfecteerde groepen te identificeren, gebruikt u een 1 mL insulinespuit met een permanente naald van 28 G x 1/2 om de staarten van de pups te tatoeëren. Ontsmet de huid voor het tatoeëren met een katoenen bal die voor 70% ethanol wordt overgoten. Deze procedure wordt uitgevoerd onder een bioveiligheidskabinetkap.
5. Om de staart te tatoeëren, breng dier tattoo inkt op het puntje van de naald. Vervolgens, zorgvuldig beperken de pup met een hand, met hun staart volledig blootgesteld. Steek de naald voorzichtig onder de huid, met behoud van een oppervlakkig niveau van diepte, en beweeg de naald parallel met de huid een paar millimeter tot een kleine markering, of stip, is gemaakt. Wacht een paar seconden voordat langzaam verwijderen van de naald onder de huid, om te voorkomen dat overtollige inkt vrijkomen van onder de huid.
6. Druk uitoefenen op de wond met een katoenen bal of gaas als dat nodig is. Verwijder overtollige tatoeage inkt op het oppervlak van de huid met 70% ethanol.
7. Herhaal dit proces met latere muizen in de geïnfecteerde en controlegroepen, terwijl het toevoegen van een extra stip met elke opeenvolgende pup getatoeëerd (bijvoorbeeld, pup 1 zal hebben 1 punt op hun staart, pup 2 zal twee stippen op hun staart, enz.).
   OPMERKING: Voor een extra laag van identificatie, is het raadzaam om aparte kleuren van dierlijke tattoo inkt te gebruiken voor de controle en geïnfecteerde groepen.

3. Subscapulaire inenting

OPMERKING: Voor deze studie werden 2 experimenten uitgevoerd met een lage dosis en een groep met hoge dosis die voor elk experiment is aangewezen. In het eerste experiment kregen 7 pups het lage dosis-entmateriaal (4 pups werden gebruikt als controle), en 5 pups uit een apart nest kregen de hoge dosis (3 pups werden gebruikt als controles). De pups van experiment 1 leverden gegevens voor alleen het 24 uur tijdpunt. In het tweede experiment kregen 8 pups het lage dosis-entmateriaal (2 pups werden gebruikt als controles), en 6 pups kregen het hoge dosis-entmateriaal (2 pups werden gebruikt als controles). Pups uit experiment 2 leverden gegevens voor de 0, 10 en 24 uur tijdpunten.

1. Leeftijd match pups ≤ 1 dag. Wijs elk nest toe als een lage dosis of een strooisel met een hoge dosis. Binnen een nest willekeurig pups toewijzen als een controle of geïnfecteerde pup.
2. Op dag 3 of 4 postnatale, record gewichten van alle pups voorafgaand aan inenting met E. coli-lux of de PBS controle. Scheid de dam van de pups gedurende deze tijd om ervoor te zorgen dat ze niet worden verplaatst tijdens de infectie.
3. Binnen een bioveiligheidskast met behulp van een insulinenaald, aspirate ofwel PBS of de E. coli-lux entmateriaal. Voor dit werk werden inoculums van 2 x 10⁶ en 7 x 10⁶ CFUs per muis gebruikt. Houd zowel infectieuze enentmateriaal als PBS op ijs tot toediening via subscapulaire injectie.
4. Plaats het neonaat op een schoon oppervlak in de bioveiligheidskauch en verhoog de huid bij de nek als of de pup te sjofelen.
5. In de ruimte die nu tussen de huid en de spier van het dier wordt gecreëerd, steek de naald in, schuin, net onder de huid en injecteer 50 μL PBS of E. coli-lux. Laat tegelijkertijd het beknelde gedeelte van de huid los om terugstroom van injectie te voorkomen.
6. Verwijder de naald langzaam en met zorg. Plaats pups terug met dammen na injecties zijn afgewerkt.
   OPMERKING: Vanwege hun anatomische fase in ontwikkeling is het technisch een uitdaging om een staartader of intraperitoneale injectie toe te dienen aan neonatale pups op dag 3-4. Zo werd de subscapulaire infectie route gekozen voor deze studie vanwege het gemak van uitvoering.

4. Evaluatie van ziekte- en eindpuntcriteria

1. Controleer de pups twee keer per dag gedurende de duur van de infectie. Let op eventuele afwijkingen in het uiterlijk.
2. Leg gewichten vast als een objectieve meting van morbiditeit.
3. Test naast gewichtsveranderingen het vermogen van de pups om zichzelf recht te zetten door het neonaat aan de rugzijde te plaatsen. Zieke dieren zullen niet in staat zijn om te draaien naar de ventrale kant en op de voeten of zal deze actie te voltooien met moeite.
4. Controleer of de dieren dicht bij de eindpuntencriteria liggen: minder dan 85% van het normale lichaamsgewicht; verminderde beweging en onvermogen om zichzelf recht te zetten; verkleuring van de huid en een meer grijze of transparante uitstraling in tegenstelling tot roze; gevoel koel aan de aanraking, indicatief voor verminderde lichaamstemperatuur en hemorragische blauwe plekken langs de zijkanten, ook indicatief voor vooraf ziekte.
   OPMERKING: Als de neonaten er niet in geslaagd zijn om gewicht te winnen gedurende twee dagen en passen in een van de beschrijvingen in stap 4.4, hebben ze voldaan aan eindpuntcriteria. Pups die de hoge dosis krijgen, voldoen vaak 24 uur per 24 uur aan eindpuntcriteria. Controlepups binnen de lage en hoge dosis nesten zullen tegelijkertijd worden geëuthanaseerd om een vergelijkende analyse tussen de controle en experimentele groepen mogelijk te maken. Ga verder met de euthanasie sectie hieronder.

5. In vivo beeldvorming van bacteriële lasten

1. Gebruik een microCT imager en software voor beeldvorming en latere analyse.
   OPMERKING: De huidskleur van de pup heeft geen invloed op de beeldkwaliteit.
2. Plaats de kooi met E. coli-lux-geïnfecteerde neonatale muizen en dam in een BSL-2 niveau laminaire flow hood. Verwijder muizen om te worden afgebeeld, en plaats in een transparante isoflurane kamer in de kap. Het wordt aanbevolen om te beginnen met niet-geïnfecteerde controles om de hoeveelheid isoflurane te meten die nodig is.
3. Open de software op de computer die aan de microCT is gekoppeld. Initialiseer het systeem en wacht tot de CCD-temperatuur op -90 °C is vergrendeld.
4. Zet de isoflurane vaporizer aan en stel de wijzerplaat in op 5% isoflurane flow. Houd muizen in de kamer met dit isoflurane mengsel voor 20-30 s totdat ze stoppen met bewegen; langere of kortere anesthesie blootstelling tijden nodig kunnen zijn voor sommige muizen. Zodra muizen stoppen met bewegen, zijn ze voldoende verdoofd en kunnen ze worden afgebeeld.
5. Verplaats muizen in de microCT imaging kamer en plaats ze op de imaging box in de gevoelige positie, met neuzen geconfronteerd loodrecht op neuskegels. Gebruik tandwas om voorzichtig beperken van de voeten op de imaging box om elke beweging te beperken. Er kunnen maximaal 4 neonatale muizen tegelijk worden afgebeeld.
6. Zet de isoflurane vaporizer tot 2-4% stroom om muizen verdoofd te houden tijdens beeldvorming. Sluit de deur van de microCT-beeldkamer. Controleer de muizen een paar seconden later. Als ze beginnen te bewegen, douse een katoenen bal in isoflurane en houd het aan de neus van het dier bewegen voor 5 seconden te verdoven. Houd de katoenen bal in de buurt van de dieren tijdens de beeldvorming. Wees voorzichtig niet te verdoven en eindigen de muizen.
7. Kies met behulp van de software de luminescent-optie voor beeldvorming. Gebruik een excitatiefilter ingesteld op Blokkeren en het emissiefilter ingesteld op Openen, 500 nm, 520 nm, 560 nm, 580 nm, 600 nm en 620 nm. Er zullen zeven totale emissiefilters zijn ingesteld voor luminescentie.
8. Beeld de muizen op elk moment punt (0, 10 en 24 uur na infectie [hpi]) en sla alle afbeeldingen op een map voor elk keer punt. Breng de pups terug naar de kooi met de dam en controleer of alle pups zijn hersteld van anesthesie.
9. Als u 2D-afbeeldingen wilt analyseren, opent u afbeeldingen in de software. Wissel eenheden naar Radiance (fotonen); dit zal veranderen in de Total Flux (fotonen/seconde).
10. Analyseer slechts één afbeeldingsset met meerdere emissiefilters tegelijk. Neem bij elke afbeeldingsset nota van de minimale en maximale stralingswaarden die zich in de rechterbenedenhoek van elke afbeelding bevinden (bijvoorbeeld als er 7 emissiefilters zijn, zullen er 7 afbeeldingen en 7 minimum- en maximumwaarden zijn). Herhaal dit voor elke afbeeldingsset die moet worden vergeleken.
11. Als u een schaal wilt bepalen die de waarden en luminescentie voor alle afbeeldingen omvat, zoekt u de laagste minimumwaarde en de hoogste maximumwaarde voor elke afbeeldingsset. Voor deze studie werden de open filterafbeeldingen gebruikt als representatief.
    1. Markeer en open de afbeelding van keuze om de schaal te wijzigen. Klik op het gereedschapspaletop het tabblad Afbeelding aanpassen en wijzig de kleurschaal in de laagste minimum- en hoogste maximumwaarden die eerder zijn geïdentificeerd. Sla elke afbeeldingsset op als een TIFF. Analyseer elk keer afzonderlijk op deze manier om ervoor te zorgen dat de juiste schaal wordt weergegeven.
12. Open een afbeelding zoals eerder beschreven in stap 5.9-5.10 om de totale flux (hoeveelheid lichtsignaal per muis) te kwantificeren. Open het tabblad HULPMIDDELEN voor ROI op het gereedschappalet en selecteer het gereedschap Cirkel. Kies 1 cirkel als u één gebied van luminescentie analyseert.
13. Verplaats ROI naar Overlay op het gebied van luminescentie. Pas indien nodig de grootte van de ROI aan.
    OPMERKING: Als aanpassing nodig is, past u DE ROI's in andere afbeeldingen vergelijkbaar aan om de consistentie te behouden. Kies ROI's meten. Het venster ROI-metingen wordt geopend met Totale Flux (p/s), Gemiddelde uitstraling (p/s/cm²/sr), standaarddeviatie van uitstraling, minimale uitstraling en maximale uitstraling.
14. Record totale flux metingen voor elke afbeelding set. Dit getal is de gekwantificeerde hoeveelheid luminescentie in de muis in 2D-beelden.
15. Als u 3D gereconstrueerde microCT-afbeeldingen wilt maken, opent u het deelvenster DLIT 3D-reconstructie op het gereedschapspalet en controleert u alle golflengten die moeten worden opgenomen onder het tabblad Analyseren. Selecteer Reconstrueren.

6. Euthanasie

1. Bereid en etiketteert buizen voor weefsels/organen van belang voor obductie en passende downstream toepassingen.
2. Scheid de neonaten van de dam in een bioveiligheidskast.
3. Week een katoenen bal in veterinaire kwaliteit isoflurane en plaats binnenkant van een transparante insluiting kamer.
4. Als u bloed verzamelt, bereidt u een P200-micropipet met een punt en heeft u een buis van 1,5 mL met 10 μL van 5 mM EDTA als antistollingsmiddel. Er wordt een volume van 50-200 μL bloed verwacht.
5. Plaats een neonaat in de kamer en controleer de pup totdat deze bewegingloos wordt.
6. Verwijder snel neonaat en onthoofd met een schaar. Indien toegestaan om frisse lucht in te ademen voor een langere periode, kan de pup weer bij bewustzijn. Neonaten hebben een verminderde longcapaciteit ten opzichte van volwassen muizen, en ademen daarom niet diep genoeg voor euthanasie door isoflurane alleen.
7. Verzamel bloed uit de stam aan de basis van het hoofd met behulp van een P200 micropipet. Om de hoeveelheid bloed te maximaliseren die wordt verzameld, voert u deze stap zo snel mogelijk uit na onthoofding. Sommen bacteriën in het bloed door seriële verdunning en standaard plaat tellen zoals beschreven in stap 1.9.
8. Steriliseren het gehele neonaat met 70% ethanol voorafgaand aan excisie van weefselmonsters.

7. Weefseloogst

1. In een bioveiligheidskast doven we het neonaat met 70% ethanol om besmetting te voorkomen. Leg het dier aan de rechterkant.
2. Met behulp van tangen, pak de huid op een punt tussen de buik en het achterste linkerbeen en maak een incisie met fijngetipte chirurgische schaar. Blijf de huid wegsnijden en naar boven naar de achterkant. Vooruitgang totdat de hele milt is blootgesteld.
3. Gebruik de tangen om de milt te grijpen en te verwijderen uit de buik, met behulp van een schaar om het bindweefsel los te koppelen. Plaats de milt in de oplossing die geschikt is voor de downstream-toepassing.
4. Om de longen te verkrijgen, schil de huid van de borst volledig terug.
5. Het invoeren aan de basis van het borstbeen met een schaar verticaal gehouden, naar boven gesneden totdat de ribbenkast is gesplitst.
6. Gebruik tangen om de rechter- en linkerlongen individueel te grijpen en ze uit de borstholte te verwijderen. Verwijder het hart uit het longweefsel door te snijden met een schaar.
7. Plaats de long in de oplossing die geschikt is voor de downstream-toepassing. Gebruik voor RNA-isolatie 500 μL guanidine thiocyanaat/fenol (GTCP). Gebruik voor histopathologie 5 mL van 10% neutraal gebufferd formaline.

8. RNA isolatie van longweefsel voor genexpressie

1. Koel de microcentrifuge voor tot 4 °C.
2. Hak het longweefsel in GTCP met een schaar. Vervolgens homogeniseren het weefsel met een batterij-aangedreven homogenisator. Ga door tot de oplossing zo uniform mogelijk is. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3-5 min.
3. Voeg met gefilterde pipettips 100 μL chloroform toe. Keer de buis voor 15 s en incubeer 3-5 min bij kamertemperatuur.
4. Centrifuge gedurende 15 minuten op 12.000 x g.
5. Bereid tijdens de spin 1,5 mL buizen met 500 μL ethanol. Monteer en label de kolommen en verzamelbuizen uit de RNA isolatiekit.
6. Verwijder voorzichtig de bovenste, waterige laag zonder de interfaselaag te verstoren die tijdens centrifugatie is gevormd. Plaats de waterige laag in de buizen met 70% ethanol.
7. Verplaats de ethanol en lysaat mengsel naar de kolom in de opvangbuis.
8. Vanaf dit punt, volg de RNA isolatie kit commerciële product protocol tot de uiteindelijke elutie van RNA.
9. Analyseer het RNA op zuiverheid en kwantiteit. Gebruik onmiddellijk of bewaar op -80 °C tot verder gebruik.

9. cDNA-synthese

1. Label PCR buizen en zet apart.
2. Voeg voor elk monster 1 μg RNA toe aan het cDNA-reactiemengsel.
3. Voeg de reagentia en sjabloon toe aan de PCR-buis zoals beschreven in het cDNA-protocol. Voeg het enzym als laatste toe aan het mengsel.
4. Plaats PCR-buizen in een thermocycler met de volgende run-instellingen: 5 min bij 25 °C, 40 min bij 42 °C, 15 min bij 85 °C en 4 °C laatste wachtruimte.
5. Verwijder PCR-buizen uit de thermocycler en gebruik onmiddellijk of bewaar bij -20 °C tot verder gebruik.

10. Real-time kwantitatieve PCR (qPCR) cyclus

1. Bereid een reactiemixcocktail voor elk van de te analyseren genen. Elke 15 μL PCR-reactie vereist 7,5 μL 2x reagensmix, 0,75 μL 20x 5'-FAM-gelabeld gen-specifieke primer/sonde, en 3,75 μL nuclease-vrij water. Amplicons variëren meestal van 60-120 bp.
2. Voeg 3 μL cDNA-sjabloon voor elke experimentele groep toe aan de juiste putten.
3. Voeg 12 μL van de genspecifieke reactiemixcocktail toe aan de juiste putten.
4. Bedek de plaat met optische kleeffolie en centrifuge gedurende 1 min op 1.000 x g om eventuele bellen die zich in de putten hebben gevormd te verwijderen.
5. Plaats de PCR-plaat in een real-time PCR-thermocycler.
6. Stel de runmethode als volgt in: 3 min op 95 °C, 40 cycli van 95 °C voor 15 s gevolgd door 60 °C gedurende 1 min.
7. Analyseer gegevens door het gen van belang te normaliseren naar een interne controle en uit te drukken gegevens van geïnfecteerde monsters met betrekking tot niet-geïnfecteerde controle monsters met behulp van de 2^-ΔΔCt formule en een log₂ transformatie van de nummers.

11. Long histopathologie

1. Verwijder de longen van de neonatale pup zoals hierboven beschreven.
2. Plaats het weefsel in een volume van 10% neutraal gebufferde formaline, zodat de verhouding van de oplossing tot weefsel is ongeveer 20:1 voor 3-7 dagen.
3. Coördineer met een geschikte histologiedienst voor paraffineinbedding, sectioning en hematoxylin en eosine (H&E) kleuring. Voor dit werk werd de West Virginia University Histopathology Core gebruikt. U ook eerder beschreven protocollen¹⁹volgen.

12. In vitro bacteriële doden test

1. Verwijder de milt van de niet-geïnfecteerde neonatale pup zoals hierboven beschreven en plaats deze in een nylon mand van 40 μm in een steriele petrischaal van 60 mm. Herhaal dit en zwembad milt in een buis te worden geoogst en gehomogeniseerd samen.
2. Voeg 5 mL PBS toe aangevuld met 10% FBS.
3. Desagggregateren van het weefsel met behulp van een steriele 3 mL spuit zuiger totdat een enkele cel suspensie is gemaakt.
4. Verzamel de eencellige suspensie buiten de nylon mand, breng over op een 15 mL centrifugebuis en pelletcellen op 350 x g gedurende 5 minuten.
5. Hang de cellen op in de rode bloedcelbuffer (2 mL voor maximaal 7-8 milt) en laat deze 5 minuten staan bij kamertemperatuur om erytrocyten te elimineren.
6. Was splenocyten met PBS en pellet zoals hierboven.
7. Schort de splenocyten op in 0,25 mL PBS aangevuld met 0,5% BSA en 2 mM EDTA volgens de verwachte celopbrengst.
8. Tel de splenocyten met behulp van een hemocytometer of een andere geschikte toepassing.
9. Isoleer Ly6B.2⁺ (myeloïde populatie granulocyten/inflammatoire monocyten) cellen met immunomagnetische kralen volgens het fabrikantprotocol.
10. Seed Ly6B.2⁺ cellen bij een dichtheid van 1 x 10⁵ cellen per put in een zwarte of witte 96-put plaat in een volume van 0,1 mL DMEM dat 10% FBS, 2 mM glutamine en 25 mM HEPES (compleet medium) bevat.
11. Sommen bioluminescente E. coli op zoals beschreven in sectie 1 en bereid het bacteriële entmateriaal voor op de gewenste veelheid van infectie (MOI) in een eindvolume van 0,1 mL. Dit kan het beste worden gedaan door het maken van wat nodig is voor alle putten op een gemeenschappelijke MOI in batch.
12. Voeg 0,1 mL bacteriële entmateriaal of compleet medium alleen als een controle. Broed de meerputplaat uit op 37 °C en 5% CO₂ gedurende 1 uur.
13. Vervang de media door 0,2 mL verse complete media die gentamicine (100 μg/mL) bevat door de media voorzichtig te verwijderen door een pipet en verse media toe te voegen met een nieuwe pipettip. Breng de cultuur terug naar incubatie voor nog eens 2 uur.
14. Meet bij 3 uur na infectie de luminescentie in elke put van de dekselcultuurplaat van de bodem met behulp van een plaatlezer en breng de cultuur vervolgens terug naar incubatie.
15. Herhaal metingen van luminescentie op andere gewenste tijdstippen.

Representative Results

Dit protocol veroorzaakte bacteriële sepsis bij neonatale muizen, en we gebruikten longitudinale intravitale beeldvorming, opsoming van bacteriën in het bloed, histologische beoordelingen van pathologie en inflammatoire cytokine-expressieprofielen om het verloop van de ziekte te bestuderen. Tekenen van morbiditeit werden waargenomen bij neonatale pups besmet met zowel lage (~ 2 x 10⁶ CFUs) en hoge (~ 7 x 10⁶ CFUs) inoculums van E.coli na verloop van tijd. Pups die het grotere entmateriaal kregen, vertoonden meer prominente tekenen van nood, zoals verminderde mobiliteit, het onvermogen om hun houding te corrigeren en het verminderde vermogen om een rechtopstaande positie te behouden met 24 uur na infectie (hpi). Er was echter een reeks morbiditeit als sommige pups leek erger dan anderen. Onmiddellijk na infectie stierf een dier met een lage dosis als gevolg van blootstelling aan isofluranen tijdens een beeldvormingssessie om de uitgangswaarde vast te stellen. Met 24 hpi bezweken twee van de zes hoogdosis dieren aan de systemische infectie (33,3% sterfte). Besmette pups die een hoge of lage dosis entrieculum kregen, wogen aanzienlijk minder dan hun controle nestgenoten met 24 hpi (figuur 1A,B). Alle pups die het hogere entmateriaal kregen, voldeden aan eindpuntcriteria bij 24 pk. Als zodanig werden alle geïnfecteerde pups in deze groep geëuthanaseerd na beeldvorming. Bacteriën in het bloed werden opgesomd voor een subset van muizen die het onderste entmateriaal kregen, en voor alle dieren die het hogere entmateriaal kregen omdat ze allemaal geëuthanaseerd waren. De resultaten van twee uitgevoerde experimenten wijzen er op dezelfde manier op dat terwijl de meeste dieren een hoog bacteriegehalte in het bloed hadden (CFUs/mL) bij 24 hpi, sommige dieren geen detecteerbare bacteriën in het bloedhadden (figuur 1C). De laatste suggereren dat ze de infectie gewist door dit moment punt. Zoals verwacht hadden pups die het hogere entmateriaal kregen bijna drie ordes van grootte meer CFUs/mL bij 24 hpi ten opzichte van pups die het lage dosis-entmateriaal kregen (figuur 1C).

Levende dierlijke beeldvorming van lichtgevende bacteriën bevestigde verder de verspreiding van bacteriën en de toename van de groei van neonatale pups in de tijd op 10 en 24 hpi (figuur 2 en figuur 3). Bovendien, met behulp van intravital imaging met de microCT, waren we in staat om infectie foci te identificeren, met inbegrip van de hersenen (Figuur 2B), longen (Figuur 2B, Figuur 3A,B), en andere perifere weefsels (Figuur 2B). De longen van sommige sterk geïnfecteerde muizen toonden ondoorzichtige regio's aan die in overeenstemming zijn met ontstekingsconsolidatie die co-localiseerde naar luminescente bacteriële signaal(figuur 3A). Deze gebieden van vermoedelijke ontstekingsexsudaat worden niet gevonden in niet-geïnfecteerde controlelongen(figuur 3A). Verder bewijs van een uitgesproken ontstekingscytokinerespons in de longen van geïnfecteerde pups wordt aangetoond door genexpressieanalyse van IL-1β, IL-6 en TNF-α. Voor alle drie de cytokinen in zowel de lage als de hoge entmateriaalgroepen(figuur 4A)werd een aanzienlijke toename van de expressie ten opzichte van de controles waargenomen. Histopathologie van de long werd ook onderzocht bij 24 hpi in controle en besmette pups. Ondanks vergelijkbare ontstekingscytokineprofielen werd vaak een geleidelijke toename van pathologie waargenomen van de lagere naar het hogere entmateriaal. Vergeleken met weefsel van niet-geïnfecteerde controles vertoonden de longen van geïnfecteerde pups opmerkelijke ontstekingsveranderingen, verdikking van de alveololatorwand, verhoogde alveololaatbloedingen en ontstekingsinfiltratie(figuur 4B). Bij de ernstigste infecties droegen de longcongestie en de bloedingsgebieden bij tot een enorme vermindering van het openluchtruimtegebied (figuur 4B). Gezamenlijk tonen deze resultaten aan dat in ons model van vroege neonatale sepsis de verspreiding van lichtgevende bacteriën in de loop van de tijd kan worden gevolgd van een subscapulaire inentingsplaats naar belangrijke infectiefoci en significante ontsteking en pathologie bij ernstig geïnfecteerde dieren kan veroorzaken.

Om gastheerfactoren te bestuderen die bijdragen aan bacteriële moord door aangeboren immuuncellen zoals monocyten, macrofagen en neutrofielen, ontwikkelden we een gevoelige in vitro test om bacteriële klaring te meten. Ly6B.2⁺ cellen geïsoleerd van de milt van neonatale muizen werden besmet met bioluminescente E. coli op een bereik van MOIs voor 1 uur en vervolgens behandeld met gentamicine om extracellulaire bacteriën te doden. Op 3, 6, 20 en 48 hpi werd intracellulaire luminescentie gemeten met een multimode reader. Zoals verwacht, met toenemende MOI, meer lichtgevend signaal werd opgenomen op 3 uur (Figuur 5). Geleidelijk aan ging dit signaal verloren, wat wijst op bacteriële klaring(figuur 5). Deze test is vatbaar voor aangevulde cytokinen, neutralisatie van gesetinte effectoren, en de toevoeging van farmacologische remmers van cellulaire trajecten om interventies te bestuderen die bacteriële klaring kunnen bevorderen en dienen om de resultaten in het neonatale sepsismodel te verbeteren dat hier wordt beschreven.

Figuur 1: Veranderingen in lichaamsgewicht en bacteriële replicatie bij septische neonatale muizen.
(A,B) Individuele muisgewichten binnen een groep (laag en hoog) uitgedrukt als een percentage van het gemiddelde gewicht van nestmaat controle pups. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde percentage ± SEM. Individuele t-tests op elk tijdpunt na infectie tonen significante verschillen aan bij 24 uur tussen controlepups en pups die het lage entmateriaal hebben ontvangen (p<0,0001) (A), of tussen controlepups en pups die het hoge entmateriaal kregen (p=0,0031) (B). (C) CFU/mL in het bloed bij 24 hpi werden log getransformeerd en gepresenteerd als de gemiddelde ± SEM. Mann-Whitney test onthult een trend naar betekenis tussen de lage en hoge dosis inenculums (p=0,0882). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: Intravital imaging toont de verspreiding van bacteriën in neonatale muizen in de tijd.
(A) Een representatieve neonatale muis (#1) die besmet is met een entmateriaal van ~2 x 10⁶ CFUS wordt op dat moment 0, 10 en 24 pk weergegeven. Voor elk tijdspunt wordt een colorimetrische schaal met de minimale en maximale stralingswaarden per tijdspunt weergegeven. Muizen om 0 en 10 uur worden weergegeven op zowel hun tijdspunt schaal en de 24 uur schaal om veranderingen in bacteriële groei in de tijd aan te tonen. (B) Representatieve 3D gereconstrueerde microCT beelden van dezelfde neonatale muis op 10 en 24 hpi worden getoond. Elke keer punt heeft beelden op overhead, transaxiale, en coronale perspectieven. In het transaxiale beeld op 24 hpi, het vliegtuig is verhuisd naar de periferie van de muis om beter weer te geven infectie foci in de perifere weefsels. Witte pijlen geven de hersenen en nieren op 10 hpi en de nier en long op 24 hpi. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: Longen zijn een plaats van grote infectie tijdens bacteriële sepsis bij neonaten.
(A) Representatieve 3D gereconstrueerde microCT-beelden van een neonatale muis (#5) die besmet is met een entmateriaal van ~7 x 10⁶ CFUS worden weergegeven bij 24 pki in vergelijking met een niet-geïnfecteerde controle. Beide muizen worden weergegeven in het transaxiale perspectief en longen worden aangegeven door witte pijlen. De geïnfecteerde muis werd geplaatst op twee stralen (fotonen / sec) schalen. Schaal #1 omvat alle 6 golflengten (500, 520, 560, 580, 600, 620 nm) en schaal #2 omvat slechts 500, 520 en 560 nm golflengten. Deze tweede schaal stelde ons in staat om een verhoogd signaal in bacteriën in de longen te visualiseren, omdat lagere golflengten meer worden geabsorbeerd door weefsel en produceren sterker signaal. (B) Representatieve 3D gereconstrueerde microCT beelden van een neonatale muis (#4) besmet met een entmateriaal van ~ 7 x 10⁶ CFUS worden getoond op 24 hpi. Dit keerpunt heeft beelden op de overhead, sagittale, transaxiale en coronale perspectieven. Witte pijlen wijzen op infectie foci in de longen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: Ontsteking en bijbehorende histopathologische bevindingen in de longen van septische neonaten.
Bij 24 hpi werden de longen geoogst van pups die ~2 x 10⁶ of 7 x 10⁶ CFUs of niet-geïnfecteerde controles kregen. a) RNA werd geïsoleerd en de uitdrukking van IL-1β, IL-6, of TNF-α zoals bepaald ten opzichte van niet-geïnfecteerde controles door kwantitatieve real-time PCR met behulp van de formule 2^-ΔΔCt. De gegevens worden weergegeven als de gemiddelde log₂ getransformeerde verandering in expressie ± SEM voor elk entmateriaal zoals aangegeven. Statistische significantie werd bepaald aan de hand van ongepaarde t-tests van ΔCt-waarden tussen individuele cytokinegenen en de interne controle in het betrouwbaarheidsinterval van 95%. Sterretjes geven p<0.01 aan. (B-D) Histopathologische delen van H&E gekleurde longweefsels (20x, interessegebied dat is opgebouwd in knipmasker en voor de duidelijkheid vergroot) worden getoond. Longweefsels van een representatieve niet-geïnfecteerde controle(B)of geïnfecteerd neonaat bij het lage(C)of hoge(D)entmateriaal worden weergegeven. Gele pijlen geven alveololerende verdikking(C) of bloeding(D). Schaalbalk = 500 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 5: Een in vitro test voor bacteriële klaring.
Ly6B.2⁺ cellen werden geïsoleerd van de milt van niet-geïnfecteerde controle neonaten. Cellen werden gezaaid in 96-well platen en besmet met luciferase-uitdrukken E. coli O1:K1:H7 bij een veelheid van infectie (MOI) van 10, 50, of 250 zoals aangegeven. Na 1 uur werd het medium vervangen door vers dat gentamicine (100 μg/mL) bevatte. Gemiddelde relatieve lichteenheden (RLU) ± SE voor een individueel experiment dat representatief is voor meerdere personen. Statistische significantie in het betrouwbaarheidsinterval van 95% werd bepaald aan de hand van ongepaarde t-tests met de correctie van Welch; sterretjes geven p<0,05 aan. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussion

Ons subscapulaire infectiemodel voor het induceren van bacteriële sepsis bij neonatale muizen is een nieuwe methode om de longitudinale verspreiding van bacteriële pathogenen in realtime te bestuderen. Intravital imaging biedt de mogelijkheid om bacteriële verspreiding in real time te verkennen in neonaten. Dit is van cruciaal belang om de kinetiek van bacteriële verspreiding te begrijpen en de respons en schade van de gastheer in de juiste fase van de ziekte verder te bestuderen. Muispups krijgen een onderhuidse, subcapulaire injectie van bacteriële entmateriaal toegediend. Deze injectietechniek is eenvoudiger dan andere veelgebruikte alternatieven, zoals de staartader en intraperitoneale infecties, omdat het minder precisie vereist binnen een injectieplaats. Dit is belangrijk gezien de kleine omvang van de pups. De intravital imaging zorgt voor een longitudinale beoordeling van bacteriële proliferatie en verspreiding in perifere weefsels en het centrale zenuwstelsel na verloop van tijd zonder de noodzaak om het dier op te offeren. Soortgelijke beeldvorming benaderingen en technologieën zijn gebruikt voor de studie van kankerbiologie en metastase^20,21. Bovendien, terwijl een andere studie heeft aangehaald het gebruik van bioluminescente beeldvorming tijdens een E. coli infectie bij neonatale ratten²², hier hebben we de aanpak van neonatale muizen toegepast, waarin onze methodologie maakt evaluatie van bacteriële kinetiek tijdens murine sepsis. Visualisatie van de bacteriën is gebaseerd op de emissie van bioluminescent licht op verschillende golflengten van bacteriën (bijvoorbeeld bacteriële luciferase activiteit) binnen het dier. Bioluminescentie wordt vervolgens gevisualiseerd door middel van een gekoelde gekoppelde apparaat (CCD) camera. De resulterende gevisualiseerde bioluminescentie kan vervolgens worden gereconstrueerd tot een 3D-beeld dat zowel ruimtelijke als temporele afhankelijke effecten van bacteriën in een dier laat zien. Voor een toegevoegde, meer genuanceerde laag van gegevensverwerving, succesvolle dieridentificatie door staarttattoo zorgt voor een herhaalde maatregelenbeoordeling van individuele pups in de tijd en de identificatie van mogelijke uitschieters binnen een bepaalde experimentele groep.

De meest succesvolle toepassing van het beschreven model vereist nauwkeurigheid bij de bereiding van het bacteriële entmateriaal. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde methode voor bacteriële voorbereiding met behulp van een vooraf vastgestelde en gevalideerde E. coli-groeicurve die variatie tussen het doel en het werkelijke entmateriaal vermindert. Dit maakt experimentele reproduceerbaarheid bij een voorgenomen entmateriaal mogelijk. De opname van twee entculums in ons model toonde dosisafhankelijke uitkomsten aan in bloed-CFUs, mortaliteit en longpathologie. Sommige aspecten van het ziektetraject waren echter niet dosisafhankelijk. Het uitblijven van gewichtstoename bij besmette dieren was niet afhankelijk van het entmateriaal bij 24 hpi. Bovendien werden vergelijkbare niveaus van inflammatoire cytokineexpressie waargenomen in de long in reactie op infectie met beide entmateriaal. Of dit patroon zou worden gerepliceerd in alle weefsels waar bacteriën werden waargenomen, zoals de nier, lever, milt en hersenen, moet nog worden bepaald. Naast sepsis wordt E. coli O1:K1:H7 geassocieerd met meningitis bij neonatale populatie²³. Deze herseninfectie treedt op wanneer bacteriën uit de periferie binnenvallen en de bloed-hersenbarrière binnendringen. Toekomstige studies zullen dit aspect van het model verkennen door analyse van veranderingen in de strakke verbinding eiwitexpressie, evenals test verschillende reeksen van bacteriële entculums. Een extra wijziging tijdens intravital imaging omvat de toevoeging van een enkelvoud katoenen bal, overgoten in isoflurane, die is geplaatst ongeveer 2-3 centimeter afstand van de muizen tijdens de beeldvorming. In reactie op eerdere experimenten waarin de neonatale pups het bewustzijn hebben herwonnen tijdens de beeldvormingssessie, waardoor nauwkeurige beeldverwerving wordt voorkomen, plaatsen we nu de katoenen bal dicht genoeg bij de muizen om ze continu verdoofd te houden tijdens de beeldvorming. Het is echter belangrijk dat dit niet zo dichtbij wordt gedaan dat ze niet herstellen van de anesthesie.

Hoewel flexibel en gemakkelijk aanpasbaar voor de studie van de kinetiek van verschillende bacteriën in verschillende dier- en ziektemodellen, heeft ons protocol een aantal beperkingen om rekening mee te houden. De eerste beperking om te overwegen is dat de subscapulaire route van infectie geen natuurlijke transmissieroute weerspiegelt. Echter, een primaire doelstelling in de ontwikkeling van ons model vanaf het begin was het vaststellen van een gemakkelijk reproduceerbare wijze van levering die kan worden gebruikt om een systemische infectie die aspecten van de menselijke ziekte repliceert vast te stellen. Daarom beschrijven we in dit rapport een model van het vroege sepsisziektesyndroom bij de mens, niet een model van natuurlijke overdracht. Er is een vastgesteld model van orale levering bij neonatale ratten die een aantal aspecten van gemeenschappelijke menselijke overdracht repliceert, zoals de eerste kolonisatie van E. coli-infectie in het voedingskanaal en de daaropvolgende verspreiding naar de bloedbaan en perifere weefsels, met inbegrip van de hersenen²². Het model van Witcomb en collega's bevat ook bioluminescente E. coli en intravital imaging. Bovendien is het van cruciaal belang om isoflurane blootstelling te minimaliseren, evenals injecteren, staart tattoo, en omgaan pups zo snel mogelijk zonder afbreuk te doen aan de nauwkeurigheid en precisie van de technieken in een poging om stress niveaus voor zowel de neonaten en de dammen te beperken. In sommige gevallen, als de pups ervaren verbeterde door de mens veroorzaakte en / of experimentele manipulaties, de moeders kunnen stoppen met verpleging en de zorg voor de pups, wat resulteert in verminderde overleving niet gerelateerd aan de infectie. Evenzo hebben pups die gedurende langere perioden na de ongeveer 10 minuten van een beeldvormingssessie aan isoflureren worden blootgesteld, een verhoogd risico op overlijden; daarom is het van cruciaal belang om net genoeg isoflurane te leveren om de muizen voldoende te verdoven, maar niet genoeg om ze te euthanaseren. Een laatste punt van overweging is de grens van gevoeligheid. Weefsels waarin minder dan 10⁴ CFUs/mL E. coli werden opgesomd, vallen het opgenomen luminescente signaal aan de lage kant van het detecteerbare bereik, volgens de schaalmethode die wordt gebruikt in de beeldvormingssoftware³. Zo kunnen sommige weefsels worden gekoloniseerd met lage niveaus van bacteriën, maar verschijnen zonder zichtbare bioluminescentie.

Momenteel maken de meeste studies gebruik van volwassen methoden van bacteriële verspreiding, zoals intraperitoneale (i.p.) en staartader injecties voor neonaten. Pluschke en Pelkonen analyseerden het effect van E. coli K1 op neonatale muizen via i.p., staartader en orale infecties²⁴. Deze studie toonde aan dat verschillende genotypen van muizen met immunodeficiëncies gevoeliger zijn voor de K1-stam; echter, veel aspecten van gastheer immuunrespons op infectie, alsmede de mechanismen voor bacteriële verspreiding worden ongeadresseerd. Deshmukh en collega's besmet neonatale muizen intraperitoneally met E. coli K1 of K. pneumoniae en gemeten CFUs in de milt en lever op 72 hpi²⁵. Deze studie analyseerde ook een aantal aspecten van de respons op de gastheer op infectie op basis van pre-blootstelling van muizen aan antibiotica. Grondig onderzoek naar bacteriële verspreiding naar perifere weefsels en bloed in de loop van de tijd parallel met ontstekingsprofilering in hetzelfde weefsel (anders dan granulocytose) werd echter niet aangepakt. Andere studies van neonatale sepsis bij muizen met Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Groep B Streptococcus, en E. coli verkennen verschillende aspecten van het immuunsysteem van de gastheer in reactie op infectie. Geen van deze studies maakt echter gebruik van intravital imaging om de kinetiek van bacteriële verspreiding of lokalisatie van infectie foci^23,25,26,27te onderzoeken . Onze infectiemethode en intravitale beeldvorming, gecombineerd met bacteriële lastenbeoordeling en ontstekingsprofilering van perifere weefsels, stelt ons in staat om aspecten van zowel de gastheer als de ziekteverwekker tijdens infectie uitgebreid te onderzoeken, waardoor een nauwkeuriger inzicht wordt verlend van het samenspel van gastheerpathogen tijdens sepsis.

We zijn van plan om deze infectie en beeldvorming model te gebruiken om ons begrip van vroeg beginnende neonatale sepsis met behulp van een verscheidenheid van pathogene bacteriën vaak verantwoordelijk voor sepsis in neonaten, met inbegrip van Groep B streptococci, K. pneuomoniae, en Listeria monocytogenes. Dit infectiemodel zal ons in staat stellen om de verspreiding van verschillende bacteriële pathogenen in de lengterichting parallel met de gastheerrespons in neonaten te vergelijken. Bovendien is dit model aanpasbaar aan de adoptieoverdracht van specifieke (fluorescerende geconjugeerde) immuunceltypen om hun migratie naar infectielocaties te bestuderen en de daaropvolgende invloed op de gastheerrespons en -controle van bacteriën. Dit biedt de mogelijkheid om de interacties met gastheer-ziekteverwekkers die tijdens sepsis in het vroege leven optreden, beter te begrijpen op manieren die nog niet eerder zijn aangetoond.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Insulin Syringe	Coviden	1188128012	Inoculum or PBS injection
10% Neutral Buffered Formalin	VWR	89370-094	Histopathology
ACK Lysis Buffer	Gibco	LSA1049201	Bacterial clearance assay
Animal Tattoo Ink Paste	Ketchum	KI1482039	Animal identification
Animal Tattoo Ink Green Paste	Ketchum	KI1471039	Animal identification
Anti-Ly-6B.2 Microbeads	Miltenyi Biotec	130-100-781	Cell isolation
Escherichia coli O1:K1:H7	ATCC	11775
Escherichia coli O1:K1:H7-lux (expresses luciferase)	N/A	N/A	Constructed in-house at WVU
E.Z.N.A. HP Total Extraction RNA Kit	Omega Bio-tek	R6812	RNA extration
DPBS, 1X	Corning	21-031-CV
Difco Tryptic Soy Agar	Becton, Dickinson and Company	236950	Bacterial growth
IL-1 beta Primer/Probe (Mm00434228)	Thermo Fisher Scientific	4331182	Cytokine expression qPCR
IL-6 Primer/Probe (Mm00446190)	Thermo Fisher Scientific	4331182	Cytokine expression qPCR
iQ Supermix	Bio-Rad	1708860	Real-time quantitative PCR
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad	1708891	cDNA synthesis
Isolation Buffer	Miltenyi Biotec	N/A	Bacterial clearance assay
IVIS Spectrum CT and Living Image 4.5 Software	Perkin Elmer	N/A	Intravital imaging
LB Broth, Lennox	Fisher BioReagents	BP1427-500	Bacterial growth
EASYstrainer (Nylon Basket)	Greiner Bio-one	542 040	Cell strainer
SpectraMax iD3	Molecular Devices	N/A	Plate reader
Pellet Pestle Motor	Grainger	6HAZ6	Tissue homogenization
Polypropylene Pellet Pestles	Grainger	6HAY5	Tissue homogenization
Prime Thermal Cycler	Techne	3PRIMEBASE/02	cDNA synthesis
TNF-alpha Primer/Probe (Mm00443258)	Thermo Fisher Scientific	4331182	Cytokine expression qPCR
TriReagent (GTCP)	Molecular Research Center	TR 118	RNA extration