Summary
يوفر هذا البروتوكول طرقا لتصور الخلايا البكتيرية ومجمع تخليق السكاريد (Psl) داخل البلغم لمرضى التليف الكيسي.
Abstract
يمكن أن يقلل الاكتشاف المبكر والقضاء على الزائفة الزنجارية داخل رئتي مرضى التليف الكيسي من فرصة الإصابة بعدوى مزمنة. يرتبط تطور عدوى P. aeruginosa المزمنة بانخفاض وظائف الرئة وزيادة المراضة. لذلك ، هناك اهتمام كبير بتوضيح أسباب الفشل في القضاء على P. aeruginosa بالعلاج بالمضادات الحيوية الذي يحدث في حوالي 10-40 ٪ من مرضى الأطفال. أحد العوامل العديدة التي يمكن أن تؤثر على تصفية العائل من المتصورة الزنجارية وقابلية المضادات الحيوية هو الاختلافات في التنظيم المكاني (مثل التجميع أو تكوين الأغشية الحيوية) وإنتاج السكريات. لذلك ، كنا مهتمين بتصور الخصائص الموضعية ل P. aeruginosa داخل بلغم مرضى التليف الكيسي. تم تطبيق تقنية إزالة الأنسجة على عينات البلغم بعد تضمين العينات في مصفوفة هيدروجيل للاحتفاظ بهياكل 3D بالنسبة للخلايا المضيفة. بعد إزالة الأنسجة ، تمت إضافة ملصقات الفلورسنت والأصباغ للسماح بالتصور. تم إجراء التهجين الفلوري في الموقع لتصور الخلايا البكتيرية ، وربط الأجسام المضادة المضادة ل PSL ذات العلامات الفلورية لتصور عديد السكاريد الخارجي وتلطيخ DAPI لتلطيخ الخلايا المضيفة للحصول على رؤية هيكلية. سمحت هذه الطرق بالتصوير عالي الدقة ل P. aeruginosa داخل البلغم لمرضى التليف الكيسي عبر الفحص المجهري بالليزر متحد البؤر.
Introduction
في هذه الدراسة ، تم تصميم التجارب لتصور البنية في الجسم الحي ل Pseudomonas aeruginosa داخل البلغم لمرضى التليف الكيسي للأطفال (CF). تصبح عدوى P. aeruginosa مزمنة في 30-40 ٪ من السكان المصابين بالتليف الكيسي لدى الأطفال. بمجرد أن تصبح العدوى المزمنة ثابتة ، يكاد يكون من المستحيل القضاء عليها1. تكون عزلات P. aeruginosa من المرضى الذين يعانون من العدوى المبكرة أكثر عرضة بشكل عام لمضادات الميكروبات ، وبالتالي ، يتم علاجها بالمضادات الحيوية المضادة للزائفة لمنع حدوث عدوى مزمنة2. لسوء الحظ ، لا يتم إزالة جميع عزلات P. aeruginosa بشكل فعال من الرئة بعد العلاج بالمضادات الحيوية. لم يتم توضيح الآليات الدقيقة المرتبطة بفشل المضادات الحيوية بشكل كامل. أظهرت الدراسات السابقة أن الاختلافات في كثافة خلايا الأغشية الحيوية والتجميع وإنتاج السكريات يمكن أن تؤثر على فعالية المضادات الحيوية3. تنتج P. aeruginosa ثلاثة سكريات خارج الخلية: Pel و Psl والجينات4. معظم سلالات P. aeruginosa لديها القدرة الوراثية للتعبير عن كل من عديدات السكاريد الخارجية ، على الرغم من أنه غالبا ما يتم التعبير عن نوع واحد من السكريات في الغالب5. يرتبط ألجينات السكاريد الخارجية بالتهابات مزمنة في رئة التليف الكيسي ، مما يؤدي إلى النمط الظاهري المخاطي 6,7. السكريات Pel و Psl لها وظائف متعددة بما في ذلك المساعدة في التعلق الأولي والحفاظ على بنية الأغشية الحيوية ، ومنح مقاومة المضادات الحيوية8.
تم تطوير طرق تهدف إلى تصور هياكل الأنسجة في الجسم الحي لمجموعة متنوعة من أنواع العينات9،10،11. في الآونة الأخيرة ، تم تصميمها لتصور المجتمعات الميكروبية في الجسم الحي داخل البلغم من مرضى التليف الكيسي12. تم تطوير تحسين بروتوكول إزالة الأنسجة خصيصا لتحديد المجتمعات الميكروبية داخل البلغم بواسطة DePas et al.، 201612. تمت صياغة مصطلح MiPACT ، الذي يرمز إلى microbial iتحديد بعد Passive CLARITY technique لإزالة البلغم CF11,12. بالنسبة لتقنيات إزالة الأنسجة ، يتم تثبيت العينات أولا ، ثم يتم جعلها شفافة مع ترك بنيتها المتأصلة سليمة للتلطيخ والتصور المجهري11. يسمح تثبيت عينات البلغم CF وإزالتها للباحثين بالإجابة على الأسئلة المتعلقة ببنية الأغشية الحيوية ، وكثافة الخلايا البكتيرية ، والارتباطات متعددة الميكروبات ، والارتباطات بين مسببات الأمراض والخلايا المضيفة. ميزة الفحص المباشر للبكتيريا التي تم الحفاظ عليها داخل البلغم هي أنه يمكن تحليلها وتصورها في سياق خاص بالمضيف. على الرغم من أن النمو في المختبر للعزلات السريرية في المختبر للتجربة يمكن أن يكون مفيدا للغاية ، إلا أن هذه الأساليب غير قادرة على إعادة إنشاء بيئة الرئة التليف الكيسي بالكامل ، مما يؤدي إلى انفصال بين نتائج المختبر ونتائج المرضى.
يمكن استخدام الطرق المعروضة هنا لإصلاح وإزالة البلغم لتصور البكتيريا ، سواء من مرضى التليف الكيسي أو المرضى الذين يعانون من التهابات الجهاز التنفسي الأخرى. النوع المحدد من التلوين والتحليل المجهري الموصوف هنا هو التهجين الفلوري في الموقع (FISH) ، يليه ارتباط الأجسام المضادة ل PSL داخل الهيدروجيل ، والتحليل اللاحق عبر مجهر المسح بالليزر متحد البؤر (CLSM). بعد إزالة الأنسجة ، يمكن أيضا تطبيق طرق الكيمياء المناعية والفحص المجهري الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
مطلوب موافقة مجلس أخلاقيات البحث (REB) لجمع وتخزين عينات البلغم من البشر. تمت الموافقة على الدراسات المقدمة هنا من قبل مستشفى الأطفال المرضى REB # 1000058579.
1. جمع البلغم
- قم بتخزين البلغم البلغم في كوب تجميع معقم وخزنه على الفور في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة أقصاها 24 ساعة قبل التثبيت.
ملاحظة: ترك البلغم لفترة طويلة جدا عند 4 درجات مئوية دون تثبيت يمكن أن يؤدي إلى تدهور الخلايا ، وخاصة تدهور خلايا الدم البيضاء. يفضل التثبيت في أسرع وقت ممكن. - نقل عينات البلغم إلى أنبوب معقم سعة 15 مل.
- أضف حجما مساويا من 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) إلى عينات البلغم. على سبيل المثال ، إذا كانت عينة البلغم 0.5 مل ، أضف 0.5 مل من 4٪ PFA. تخلط عن طريق انعكاس لطيف.
- احتضان البلغم طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
- اغسل العينة بإضافة 5 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لكل 2 مل من البلغم الثابت.
ملاحظة: لا يوجد طرد مركزي مطلوب لخطوة الغسيل هذه. - إزالة بعناية طاف مع ماصة.
ملاحظة: تجنب امتصاص البلغم مع الماصة عن طريق توجيه الطرف بعيدا عن البلغم ونضح السائل السطحي ببطء شديد. لا تتضمن خطوة الغسيل الطرد المركزي لعدم الإخلال بالسلامة الهيكلية لسدادات البلغم. - كرر الخطوات 1.6-1.7 مرتين أخريين.
- أعد تعليق الحبيبات في 2x حجم PBS مع 0.01٪ (وزن / حجم) أزيد الصوديوم.
- يخزن البلغم على حرارة 4 درجات مئوية.
2. MiPACT (تقنية إزالة الأنسجة) معالجة البلغم
- قم بإزالة مكونات الهيدروجيل (30٪ 29: 1 أكريلاميد: ثنائي أكريلاميد ، هاردنر ، و PBS) في حاوية محكمة الغلق تحتوي على عبوة لاهوائية قبل 72 ساعة.
ملاحظة: العبوة اللاهوائية والحاوية المختومة ضرورية لأن الأكسجين يمنع بلمرة مادة الأكريلاميد. بدلا من ذلك ، يمكن إزالة الأكسجين عن طريق تنفيذ هذه الخطوة في غطاء لاهوائي ، أو عن طريق وضع فراغ على حاوية مغلقة ، أو عن طريق فقاعات غاز N2 من خلال خليط الأكريلاميد.- أضف 2 مل من 30٪ 29: 1 مادة الأكريلاميد: محلول ثنائي الأكريلاميد إلى أنبوب سعة 15 مل مع إزالة الغطاء داخل الحاوية اللاهوائية محكمة الغلق.
- اصنع مخزونا مركزا من 10٪ (وزن / حجم) مقوي بإضافة 0.5 جم من المقسى إلى 5 مل من PBS في أنبوب سعة 15 مل. اترك الغطاء بعيدا عن الأنبوب واحفظه في الحاوية اللاهوائية المغلقة.
- اترك بضعة مل من برنامج تلفزيوني معقم في أنبوب ، مع إزالة الغطاء ، داخل الحاوية اللاهوائية.
- اصنع محلول 5 مل من هيدروجيل بتركيز نهائي بنسبة 0.2٪ مقوي و 4٪ 29: 1 أكريلاميد: ثنائي أكريلاميد في برنامج تلفزيوني في أنبوب 15 مل. تخلط عن طريق الانقلاب وتصفية تعقيم.
- قم بإزالة عينات البلغم من الثلاجة ، ثم قطعها إلى أقسام صغيرة (قطرها حوالي 5 مم) تحت ظروف معقمة بمشرط.
ملاحظة: إذا كان البلغم سائلا تماما ، فلا يزال من الممكن تنفيذ هذه الخطوة ، ومع ذلك ، فإن الأمر يتطلب المزيد من الصبر والممارسة لإزالة البلغم من محلول التخزين باستخدام الملقط قبل استخدام المشرط لفصل الكسور المطلوبة. - ضع عينات البلغم المقطوعة داخل بئر من شريحة زجاجية ذات 8 غرف.
- أضف 300 ميكرولتر من محلول هيدروجيل معقم بالفلتر من الخطوة 2.2 إلى كل بئر من الآبار التي تحتوي على البلغم.
- ضع الغطاء الزجاجي المكون من 8 حجرات داخل وعاء مغلق يحتوي على عبوة لاهوائية لمدة 3 ساعات عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: بمجرد بلمرة الهيدروجيل مع البلغم المضمن يجب أن يكون اتساق هلام صلب. - انقل عينات البلغم الهيدروجيل المتصلب إلى أنبوب مزرعة سعة 15 مل يحتوي على 5 مل من كبريتات دوديسيل الصوديوم 8٪ (SDS) ، ودرجة الحموضة 8 ، واسمح للعينات بالتنظيف لمدة 3-14 يوما عند 37 درجة مئوية (مع أو بدون اهتزاز) ، حتى يصبح البلغم شفافا.
ملاحظة: تعتمد أوقات التطهير على تكوين البلغم ويمكن تقليلها بشكل عام مع الهز. ومع ذلك ، احرص على عدم زيادة سرعة الاهتزاز إلى درجة تعطيل سلامة العينة. تستغرق المزيد من العينات الغنية بالحمض النووي وقتا أطول للمسح مقارنة بالعينات الغنية بالمخاط. - صب محلول SDS بنسبة 8٪ في حاوية لجمع النفايات. باستخدام ملاقط معقمة ، قم بنقل كل عينة مدمجة في هيدروجيل إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل. أضف 10 مل من PBS إلى كل من الأنابيب المخروطية سعة 50 مل لغسل الهلاميات المائية واترك المحلول لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة قبل الصب. كرر هذا 2x مرات أكثر.
ملاحظة: لا تتضمن خطوة الغسيل هذه الطرد المركزي. تتم إزالة السوائل الزائدة والمواد الطافية بعناية باستخدام ماصة. - قم بتخزين العينات المغسولة في برنامج تلفزيوني مع 0.01٪ (وزن / حجم) أزيد الصوديوم ومثبط 1x RNase عند 4 درجات مئوية.
3. بروتوكول التهجين الفلوري الهيدروجيل في الموقع (FISH)
- قم بإزالة عينات الهيدروجيل من محلول التخزين الخاص بها باستخدام ملاقط معقمة وضع العينات على سطح معقم (مثل شريحة زجاجية أو طبق بتري).
- باستخدام مشرط معقم قطع الهلاميات المائية إلى شرائح ~ 1 مم.
- ضع أقسام 1 مم من هيدروجيل داخل أنابيب معقمة سعة 1.5 مل.
- تحضير 1 مل من المخزن المؤقت للتهجين (25٪ فورماميد ، 0.9 م كلوريد الصوديوم ، 20 مللي مول Tris-HCl [درجة الحموضة 7.6] ، 0.01٪ SDS ، منقى ومنزوع الأيونات H2O) في أنبوب 1.5 مل.
- أضف مسبار PseaerA المسمى بالفلورسنت (150.7 نانومتر12) إلى مخزن التهجين المؤقت واخلطه عن طريق الانقلاب.
ملاحظة: يجب أن يبقى محلول الفورمالين بعيدا عن اللهب المكشوف. يمكن تحضير مخزن التهجين بشكل متقدم وتخزينه في قسامات عند -20 درجة مئوية13. - أضف 200-500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتهجين إلى كل قسم ~ 1 مم من هيدروجيل وتأكد من غمر عينة الهيدروجيل بالكامل.
- اسمح لمسبار PseaerA بالتهجين مع عينات الهيدروجيل عن طريق وضعها في الظلام لمدة ~ 18-24 ساعة ، عند 46 درجة مئوية ، دون اهتزاز.
- صب المخزن المؤقت للتهجين في حاوية لجمع النفايات.
- اشطف العينات مرة واحدة باستخدام محلول الغسيل المعقم بالفلتر (337.5 مللي مول كلوريد الصوديوم ، 20 مللي متر Tris-HCl ، 5 مللي متر EDTA (حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك) [pH 7.2] ، 0.01٪ SDS ، وتنقية وإزالة الأيوناتH 2O) عن طريق إضافة 1 مل من محلول الغسيل إلى كل أنبوب من أنابيب 1.5 مل ثم إزالته.
ملاحظة: يمكن عمل المخزن المؤقت للغسيل مسبقا وتخزينه في درجة حرارة الغرفة (RT). - أضف 1 مل من محلول الغسيل الطازج إلى الأنابيب ، ثم احتضن العينات في الظلام لمدة 6 ساعات عند 48 درجة مئوية ، دون رج.
4. هيدروجيل و Psl0096 ربط الأجسام المضادة
- قم بإزالة المخزن المؤقت للغسيل بشكل معقم باستخدام ماصة سعة 1 مل.
- اشطف العينات باستخدام 2٪ BSA (w / v) في محلول PBS عن طريق إضافة وإزالة 1 مل من محلول 2٪ BSA.
- أضف 500 ميكرولتر من محلول 2٪ BSA / PBS إلى عينات الهيدروجيل لمنع ارتباط البروتين غير المحدد. ثم احتضان العينات بين عشية وضحاها ، في الظلام ، في RT ، دون اهتزاز.
- قم بإزالة محلول الحجب بشكل معقم باستخدام ماصة سعة 1 مل.
- قم بإعداد محلول الأجسام المضادة Psl0096-Texas Red عن طريق تخفيف الجسم المضاد إلى تركيز نهائي قدره 0.112 ميكروغرام / مل في 500 ميكرولتر من 2٪ BSA / PBS الطازجة.
- أضف محلول الأجسام المضادة 500 ميكرولتر إلى عينات هيدروجيل واحتضانها في RT لمدة 6 ساعات ، محمية من الضوء ، دون اهتزاز.
5. دابي (4 ′ ، 6 ′-دياميدينو -2-فينيليندول) تلطيخ
- قم بإعداد محلول مطابقة معامل الانكسار (RIMS) بإضافة 40 جم من وسط تدرج الكثافة غير الأيوني ، و 30 ميكرولتر من Tween20 ، و 3 ميكروغرام من أزيد الصوديوم ، و 30 مل من PBS إلى دورق يحتوي على قضيب تحريك مغناطيسي. حرك المحلول لمدة 15 دقيقة على محرك مغناطيسي ، أو حتى يذوب تماما.
- مرشح تعقيم الحل في أنبوب مخروطي 50 مل باستخدام حقنة 10 مل ومرشح معقم 0.2 ميكرومتر.
ملاحظة: يمكن تخزين المحلول عند 4 درجات مئوية لعدة أشهر. - قم بإزالة محلول الأجسام المضادة Psl0096-Texas Red باستخدام ماصة معقمة سعة 1 مل.
- شطف عينات هيدروجيل عن طريق إضافة ثم إزالة 1 مل من برنامج تلفزيوني.
- احتضان عينات الهيدروجيل ب 250 ميكرولتر من محلول RIMS و 10 ميكروغرام / مل من DAPI في RT مع اهتزاز لطيف ، في الظلام ، طوال الليل.
- قبل التصوير متحد البؤر ، قم بتركيب العينات على غرف نضح 0.9 مم أو 1.7 مم وأغلقها بغطاء زجاجي.
ملاحظة: بعد FISH و / أو الكيمياء الهيستولوجية المناعية وقبل الغمر في الحافات ، يمكن تطبيق بقع الليكتين الفلورية إذا كان تصور مخاط البلغم مطلوبا12.
6. التصوير
- قم بإجراء التصوير المجهري بالمسح الضوئي بالليزر متحد البؤر باستخدام التقنيات القياسية بتكبير 25x أو 40x أو 63x أو 100x.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يلخص الشكل 1 والشكل 2 التصميم العام للتجربة. يقدم الشكل 1 ملخصا لبروتوكولات معالجة البلغم وإزالة البلغم. قد تستغرق معالجة البلغم وإزالته ما يصل إلى 17 يوما. على الرغم من ذلك ، قد يتم إيقاف البروتوكول ، ويمكن تخزين العينات بعد التثبيت باستخدام PFA (اليوم 2) أو بعد إزالة الأنسجة (أيام 5-17 حسب وقت التطهير). في الشكل 2 ، يتم تلخيص بروتوكولات ربط FISH والأجسام المضادة. تستغرق بروتوكولات تلطيخ FISH والأجسام المضادة 4 أيام لإكمالها ولكن يجب إكمالها والتقاط الصور متحدة البؤر بمجرد بدئها. باستخدام البروتوكولات المذكورة أعلاه ، يمكن الحصول على صور 3D عالية الدقة لخلايا P. aeruginosa مع هيكلها في الموقع داخل البلغم المرئي.
يسمح إزالة البلغم والتطبيق اللاحق لبقع الفلورسنت المستخدمة في هذا البروتوكول بتصور مفصل ل P. aeruginosa داخل العينات. تم جمع عينات البلغم الموضحة في الشكل 3 والشكل 4 من مريض التليف الكيسي للأطفال (17 عاما) مصاب بعدوى P. aeruginosa جديدة. في الشكل 3 أ ، شوهد تجمع من الخلايا داخل عينة البلغم. كان ظهور قضبان خضراء مصفرة بسبب تداخل جميع الفلوروفورات الثلاثة. على الرغم من أنه ليس لدينا عدد الخلايا لعينة البلغم هذه ، فقد وجدنا أن حد الكشف عن المسبار هو 104 خلايا / مل (انظر الشكل التكميلي 1). في الشكل 3B ، شوهدت أشكال قضبان فردية باللون الأخضر من الارتباط الخاص بالأنواع لمسبار PseaerA-488 بخلايا P. aeruginosa. يوضح الجسم المضاد Psl0096-Texas Red الذي شوهد باللون الأحمر مكان وجود عديد السكاريد الخارجي الكاذب داخل البلغم. في هذه الحالة ، يبدو أن الجسم المضاد Psl0096 يتداخل في الغالب مع خلايا P. aeruginosa (الشكل 3C). سمحت هذه الطريقة أيضا بتصور الخلايا الزائفة داخل البلغم فيما يتعلق بالخلايا البكتيرية الأخرى والهياكل المضيفة. في الشكل 4، شوهدت مجموعة من خلايا المتصورة الزنجارية البلعمة داخل خلية حقيقية النواة، ولوحظت تجمعات أخرى صغيرة من الخلايا المكورة في المنطقة المجاورة. لقد ثبت أن الجسم المضاد Psl0096 يمكن أن يرتبط أيضا بالعوالق P . aeruginosa المنتجة من Psl (انظر الشكل التكميلي 2).
الشكل 1: مخطط تدفق يوضح معالجة البلغم وبروتوكولات MiPACT.
باختصار ، يتم إصلاح البلغم قبل تضمينه في محلول بولي أكريلاميد. بمجرد مسح الهيدروجيل ، يمكن تخزينه عند 4 درجات مئوية أو استخدامه مع بروتوكول ربط FISH والأجسام المضادة. تم إنشاء هذه الصورة باستخدام BioRender.com. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مخطط التدفق الذي يشير إلى التهجين الفلوري في الموقع وبروتوكولات تلطيخ الأجسام المضادة.
بمجرد إزالة البلغم تماما داخل طرق تلطيخ مصفوفة هيدروجيل يمكن تطبيقها. تم إنشاء هذه الصورة باستخدام BioRender.com. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: صورة مضان مناعي لعينة بلغم تم جمعها من مريض مصاب بعدوى P. aeruginosa المبكرة المضمنة في مصفوفة هيدروجيل.
تم تهجين عينة الهيدروجيل باستخدام مسبار PsearA-Alexa488 (أخضر) ، وجسم مضاد Psl0096-Texas Red (أحمر) ، و DAPI (أزرق). (أ) عينة البلغم التي تم عرضها تحت جميع القنوات ال 3 ، (ب) البلغم تحت القناة الخضراء فقط التي تشير إلى مكان ارتباط مسبار PseaerA-488 ، و (ج) البلغم تحت القناة الحمراء فقط حيث حدث الارتباط الأحمر Psl0096-Texas. تم التقاط الصور بتكبير 100x. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: صورة التألق المناعي لعينة بلغم تم جمعها من مريض مصاب بعدوى المتصورة الزنجارية المبكرة المضمنة في مصفوفة هيدروجيلية.
تم تهجين عينة الهيدروجيل باستخدام مسبار PsearA-Alexa488 (أخضر) ، وجسم مضاد Psl0096-Texas Red (أحمر) ، و DAPI (أزرق). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1: التهجين الفلوري في الموقع لثقافة العوالق PAO1 مع مسبار PseaerA-488. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الرقم.
الشكل التكميلي 2: P. aeruginosa ملطخة ب DAPI والجسم المضاد Psl0096-Texas Red. (أ) سلالة PAO1-Δpsl ، و (ب) سلالة PAO1. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الغرض من هذا البروتوكول هو السماح بإلقاء نظرة على التنظيم في الموقع لخلايا P. aeruginosa في البلغم من مرضى التليف الكيسي. يجب تخزين عينات البلغم عند 4 درجات مئوية حتى تتم معالجتها إذا تعذر إصلاحها على الفور. لقد ثبت أن أعداد خلايا P. aeruginosa في البلغم لا تتغير بشكل كبير إذا تمت معالجتها في 1 ساعة أو 24 ساعة أو 48 ساعة ، عند تخزينها عند 4 درجات مئوية ، على الرغم من أنه إذا تركت عند 25 درجة مئوية لمدة 24 أو 48 ساعة ، فإن عدد الخلايا البكتيرية سيزداد بشكل كبير نتيجة لنمو البكتيريا14. في هذه الدراسة ، تم تخزين عينات البلغم عند 4 درجات مئوية بحد أقصى 24 ساعة بعد البلغم. وتجدر الإشارة إلى أن عدد الخلايا الالتهابية قد ثبت أنه ينخفض في البلغم إذا ترك عند 4 درجات مئوية وتمت معالجته أكثر من 9 ساعات في وقت لاحق15. لذلك ، من المهم مراعاة الخلايا والعلامات المحددة التي يرغب المرء في تصورها في البلغم عند اتخاذ قرار بشأن الوقت النهائي لمعالجة العينات.
تبدأ معالجة العينات بهذه الطريقة بتثبيت عينات البلغم في 4٪ PFA. سيقوم بارافورمالدهيد بربط الخلايا البكتيرية ومصفوفتها خارج الخلية ، مع الحفاظ على هياكلها للتصور والتحليل المجهري11,16. لسوء الحظ ، إذا كان الهدف هو الحصول على إجمالي عدد الخلايا على بعض الخلايا الالتهابية في البلغم ، فقد ثبت أن PFA يقلل من عدد هذه الخلايا وبالتالي يجب اعتبار المثبتات الأخرى17. هناك قيد آخر لهذه الدراسة وهو أنها قد تستغرق وقتا طويلا وقد تستغرق أكثر من أسبوعين لتنفيذها. وبالتالي ، قد لا يكون مناسبا للتطوير إلى طريقة تشخيصية تتطلب قرارات علاج حساسة للوقت. علاوة على ذلك ، لفهم التنوع الميكروبي الكلي داخل عينات البلغم ، لن تكون هذه الطريقة مناسبة ، ولكن يمكن إقرانها بطرق أخرى للكشف عن الميكروبات عالية الإنتاجية مثل qPCR.
يمكن تغيير تكوين هيدروجيل الأكريلاميد اعتمادا على نوع الأنسجة والتطبيق11. بالنسبة للعينات غير المستقرة مثل البلغم CF ، من الضروري توفير الدعم الهيكلي بمزيج 29: 1 من مادة الأكريلاميد: ثنائي الأكريلاميد (بدلا من مادة الأكريلاميد فقط). يمكن أن يؤدي تضمين بارافورمالدهيد في الهيدروجيل إلى زيادة استقرار الهيكل ، مع مقايضة أوقات الحضانة الأطول للسماح بنشر المجسات والأجسام المضادة9. يمكن أن تؤدي إضافة الفورمالديهايد إلى الهيدروجيل أيضا إلى منع تورم الأنسجة أثناء عملية التطهير إذا كان هذا التأثير غير مرغوب فيه11.
تستهدف الطريقة الحالية على وجه التحديد خلايا P. aeruginosa داخل البلغم لمرضى التليف الكيسي. يمكن النظر في طرق بديلة وتعديلات على هذا البروتوكول لتوجيه تحسين تصور البكتيريا الأخرى. من خلال تطبيق مجسات تفاعل سلسلة التهجين (HCR) الخاصة بالأنواع والجنس ، يمكن تحديد مسببات الأمراض الأخرى في التليف الكيسي مثل المكورات العنقودية الذهبية والمكورات العقدية sp. و Achromobacter xylosoxidans 12. في دراستنا ، استهدفنا Psl عديد السكاريد الخارجي الكاذب. يمكن فحص أهداف أخرى ، بما في ذلك الجينات أو Pel باستخدام الأجسام المضادة الفلورية الخاصة بهذه السكريات الخارجية في التجارب المستقبلية. يستغرق تطبيق طريقة MiPACT جنبا إلى جنب مع FISH وتلطيخ الأجسام المضادة ل CLSM أسبوعين حتى يكتمل. إذا كان سؤال البحث لا يتعلق بالتصور المكاني 3 الأبعاد للبلغم ، فهناك طرق أكثر سرعة لتصور البكتيريا الموجودة. تستخدم الطرق السابقة المستخدمة لتصور البكتيريا داخل عينات البلغم التقسيم الرقيق أو التلطيخ وتشمل: FISH18 ، صبغة غرام ، وتقنيات الكيمياء المناعية التي تطبق الأجسام المضادة الأولية والبقع المضادة للسماح بتصور عديدات السكاريد الخارجية للغشاء الحيوي والخلايا البكتيرية19،20.
هناك العديد من التطبيقات المستقبلية المحتملة لهذه الأنواع من تقنيات التصوير. إن القدرة على تصور الكائنات البكتيرية المختلفة وتفاعلها مع الخلايا المضيفة ، مثل الخلايا البلعمية ، قد تزيد من فهمنا لسبب إزالة بعض سلالات P. aeruginosa بشكل فعال من الشعب الهوائية CF في حين أن السلالات الأخرى ليست كذلك. يمكن أيضا استخدام بكتيريا التصوير داخل عينات الجهاز التنفسي كمقياس لفعالية مضادات الميكروبات وكنتيجة دراسة للعقاقير الجديدة المضادة للغشاء الحيوي21. بالإضافة إلى ذلك ، فإن تصور العلاقة المكانية بين P. aeruginosa والكائنات الحية الأخرى داخل ميكروبيوم الرئة CF ، مثل المكورات العنقودية الذهبية ، قد يساعد في توضيح دور العدوى / الاستعمار المشترك في التسبب في التفاقم الرئوي ، واستجابتها للعلاج بالمضادات الحيوية. يمكن تطبيق التصوير في الجسم الحي للبكتيريا على عدوى أخرى أيضا ، بما في ذلك أولئك الذين يعانون من الالتهاب الرئوي المرتبط بجهاز التنفس الصناعي أو التهابات الجروح المزمنة22. وبالتالي يمكن استخدام الأفكار المكتسبة لتوجيه التطوير العلاجي في المستقبل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
اي.
Acknowledgments
يود المؤلفون أن يشكروا مؤسسة التليف الكيسي التي قدمت التمويل لهذا البحث و MedImmune لتبرعهم السخي بالأجسام المضادة ل Psl0096. تم إجراء التصوير لهذه الدراسة في منشأة التصوير CAMiLoD في جامعة تورنتو.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 29:1 acrylamide bisacrylamide, 30 % solution | BioRad | 161-0146 | |
| 8-Chambered Coverglass Nunc Lab-Tek | ThermoFischer Scientific | 155411 | |
| Anaerogen2.5L | Oxid Inc. | 35108 | |
| Coverwell perfusion chambers | Electron Microscopry Sciences | 70326 -12/-14 | |
| HistoDenz | Sigma | D2158 | |
| Protect RNA Rnase Inhibitor | Sigma | R7387 | |
| PseaerA - GGTAACCGTCCCCCTTGC | Eurofins | Order Details: Product: Modified DNA Oligo; Name: PseaerA; Sequence: [Alexa488]GGTAACCGTCCCCCTTGC; Synthesis: 50 nmol; Purification: HPLC; Ship state: Full yield (dry) | |
| Psl0096-Texas Red | Medimmune | The Psl0096-Texas red antibodies were a gift kindly provided by Medimmune and the company should be contacted for order inquiries. | |
| VA-044 Hardener | Wako | 27776-21-21 |
References
- Banerjee, D., Stableforth, D. The treatment of respiratory pseudomonas infection in cystic fibrosis: What drug and which way. Drugs. 60 (5), 1053-1064 (2000).
- Rosenfeld, M., Ramsey, B. W., Gibson, R. L. Pseudomonas acquisition in young patients with cystic fibrosis: Pathophysiology, diagnosis, and management. Current Opinion in Pulmonary Medicine. 9 (6), 492-497 (2003).
- Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T. Tolerance and Resistance of Pseudomonas aeruginosa Biofilms to Antimicrobial Agents-How P. aeruginosa Can Escape Antibiotics. Frontiers in Microbiology. 10, 913 (2019).
- Billings, N., et al. The Extracellular Matrix Component Psl Provides Fast-Acting Antibiotic Defense in Pseudomonas aeruginosa Biofilms. PLoS Pathogens. 9 (8), 1003526 (2013).
- Franklin, M. J., Nivens, D. E., Weadge, J. T., Lynne Howell, P. Biosynthesis of the Pseudomonas aeruginosa extracellular polysaccharides, alginate, Pel, and Psl. Frontiers in Microbiology. 2, 167 (2011).
- Yang, L., et al. Polysaccharides serve as scaffold of biofilms formed by mucoid Pseudomonas aeruginosa. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 65 (2), 366-376 (2012).
- Wozniak, D. J., et al. Alginate is not a significant component of the extracellular polysaccharide matrix of PA14 and PAO1 Pseudomonas aeruginosa biofilms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7907-7912 (2003).
- Baker, P., et al. Exopolysaccharide biosynthetic glycoside hydrolases can be utilized to disrupt and prevent Pseudomonas aeruginosa biofilms. Science Advances. 2 (5), 1-9 (2016).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nature Protocols. 10 (11), 1860-1896 (2015).
- DePas, W. H., et al. Exposing the three-dimensional biogeography and metabolic states of pathogens in cystic fibrosis sputum via hydrogel embedding, clearing, and rRNA labeling. mBio. 7 (5), 1-11 (2016).
- Molecular Instruments HCR v3.0 protocol for bacteria in suspension. , Available from: www.molecularinstruments.com 1-6 (2019).
- Murray, M. P., Doherty, C. J., Govan, J. R. W., Hill, A. T. Do processing time and storage of sputum influence quantitative bacteriology in bronchiectasis. Journal of Medical Microbiology. 59 (7), 829-833 (2010).
- Efthimiadis, A., Jayaram, L., Weston, S., Carruthers, S., Hargreave, F. E. Induced sputum: Time from expectoration to processing. European Respiratory Journal. 19 (4), 706-708 (2002).
- Chao, Y., Zhang, T. Optimization of fixation methods for observation of bacterial cell morphology and surface ultrastructures by atomic force microscopy. Applied Microbiology and Biotechnology. 92 (2), 381-392 (2011).
- St-Laurent, J., Boulay, M. E., Prince, P., Bissonnette, E., Boulet, L. P. Comparison of cell fixation methods of induced sputum specimens: An immunocytochemical analysis. Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 36-42 (2006).
- Hogardt, M., et al. Specific and rapid detection by fluorescent situ hybridization of bacteria in clinical samples obtained from cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Microbiology. 38 (2), 818-825 (2000).
- Hoffmann, N., et al. Erratum: Novel mouse model of chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection mimicking cystic fibrosis. Infection and Immunity. 73 (8), 5290 (2005).
- Nair, B., et al. Utility of Gram staining for evaluation of the quality of cystic fibrosis sputum samples. Journal of Clinical Microbiology. 40 (8), 2791-2794 (2002).
- Howlin, R. P., et al. Low-Dose Nitric Oxide as Targeted Anti-biofilm Adjunctive Therapy to Treat Chronic Pseudomonas aeruginosa Infection in Cystic Fibrosis. Molecular Therapy. 25 (9), 2104-2116 (2017).
- Pestrak, M. J., et al. Treatment with the Pseudomonas aeruginosa glycoside hydrolase PslG combats wound infection by improving antibiotic efficacy and host innate immune activity. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (6), 00234 (2019).
