Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

הדמיה של Pseudomonas aeruginosa בתוך כיח של חולי סיסטיק פיברוזיס

Published: July 16, 2020 doi: 10.3791/61631
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1,3, 1,4
1Translational Medicine, Hospital for Sick Children, 2Center for Microbial Pathogenesis, Department of Pediatrics, University of Pittsburgh, 3Microbiology, Department of Pediatric Laboratory Medicine, Hospital for Sick Children, 4Infectious Diseases, Department of Pediatrics, Hospital for Sick Children

Summary

פרוטוקול זה מספק שיטות להדמיה של תאי חיידקים ורב-סוכר סינתזת רב-סוכר (Psl) בתוך כיח של חולי סיסטיק פיברוזיס.

Abstract

גילוי מוקדם ומיגור של Pseudomonas aeruginosa בריאות של חולי סיסטיק פיברוזיס יכול להפחית את הסיכוי לפתח זיהום כרוני. התפתחות זיהומים כרוניים של P. aeruginosa קשורה לירידה בתפקוד הריאות ולעלייה בתחלואה. לכן, יש עניין רב להבהיר את הסיבות לכישלון למגר P. aeruginosa עם טיפול אנטיביוטי המתרחשת בכ 10-40% מהחולים ילדים. אחד הגורמים הרבים שיכולים להשפיע על פינוי הפונדקאי של P. aeruginosa ורגישות לאנטיביוטיקה הוא שינויים בארגון המרחבי (כגון צבירה או היווצרות ביופילם) וייצור פוליסכרידים. לכן, היינו מעוניינים לדמיין את המאפיינים באתרו של P. aeruginosa בתוך כיח של חולי CF. טכניקת ניקוי רקמות יושמה על דגימות כיח לאחר הטמעת הדגימות במטריצת הידרוג'ל כדי לשמור על המבנים התלת-ממדיים ביחס לתאים המארחים. לאחר ניקוי הרקמות, נוספו תוויות פלואורסצנטיות וצבעים כדי לאפשר הדמיה. הכלאה פלואורסצנטית באתרו בוצעה לצורך הדמיה של תאי חיידקים, קשירה של נוגדנים אנטי-PSL המסומנים באופן פלואורסצנטי להדמיה של האקסופוליסכריד וצביעה DAPI כדי להכתים תאים מארחים כדי לקבל תובנה מבנית. שיטות אלה אפשרו הדמיה ברזולוציה גבוהה של P. aeruginosa בתוך כיח של חולי CF באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי.

Introduction

במחקר זה, ניסויים תוכננו כדי לדמיין את המבנה in vivo של Pseudomonas aeruginosa בתוך כיח של חולי סיסטיק פיברוזיס ילדים (CF). זיהומים P. aeruginosa הופך כרוני ב 30-40% מאוכלוסיית CF ילדים; ברגע זיהומים כרוניים להתבסס, הם כמעט בלתי אפשרי לחסל1. P. aeruginosa מבודד מחולים עם זיהום מוקדם הם בדרך כלל רגישים יותר מיקרוביאלית, ולכן, אלה מטופלים עם אנטיביוטיקה אנטי pseudomonal כדי למנוע הקמת זיהום כרוני2. למרבה הצער, לא כל המבודדים של P. aeruginosa מנוקים ביעילות מהריאה לאחר טיפול אנטיביוטי. המנגנונים המדויקים הקשורים לכשל אנטיביוטי לא הובהרו במלואם. מחקרים קודמים הראו כי שינויים בצפיפות תאי ביופילם, צבירה וייצור רב-סוכר יכולים להשפיע על יעילות אנטיביוטיקה3. P. aeruginosa מייצר שלושה רב-סוכרים חוץ-תאיים: Pel, Psl ו-alginate4. לרוב הזנים של P. aeruginosa יש את היכולת הגנטית לבטא כל אחד מהאקסופוליסכרידים, אם כי לעתים קרובות סוג אחד של פוליסכריד מבוטא בעיקר5. אלגינט exopolysaccharide קשור לזיהומים כרוניים בריאה CF, וכתוצאה מכך פנוטיפ רירית 6,7. לרב-סוכרים Pel ו-Psl תפקידים רבים, כולל סיוע בהתקשרות ראשונית ושמירה על מבנה הביופילם, והענקת עמידות לאנטיביוטיקה8.

שיטות שמטרתן לדמיין מבנים in vivo של רקמות פותחו עבור מגוון רחב של סוגי מדגם 9,10,11. לאחרונה, הם הותאמו כדי לדמיין קהילות מיקרוביאליות in vivo בתוך כיח מחולי CF12. אופטימיזציה של פרוטוקול ניקוי רקמות במיוחד לזיהוי קהילות מיקרוביאליות בתוך כיח פותחה על ידי DePas et al., 201612. המונח MiPACT, ראשי תיבות של microbial identification after Passive CLARITY technique, נטבע לניקוי כיח CF11,12. עבור טכניקות ניקוי רקמות, הדגימות מתוקנות תחילה, ולאחר מכן הופכות לשקופות תוך השארת הארכיטקטורה הטבועה בהן ללא פגע לצורך צביעה והדמיה מיקרוסקופית11. תיקון וניקוי דגימות כיח CF מאפשרים לחוקרים לענות על שאלות הקשורות למבנה הביופילם, צפיפות תאי חיידקים, קשרים רב-מיקרוביאליים וקשרים בין פתוגנים לתאים מארחים. היתרון של בחינה ישירה של חיידקים שנשתמרו בתוך הכיח הוא שניתן לנתח אותם ולדמיין אותם בהקשר ספציפי למארח. למרות שגידול חוץ גופי של מבודדים קליניים במעבדה לניסויים יכול להיות אינפורמטיבי מאוד, שיטות כאלה אינן מסוגלות לשחזר באופן מלא את סביבת הריאות של CF, וכתוצאה מכך נוצר נתק בין תוצאות המעבדה לבין תוצאות המטופלים.

ניתן להשתמש בשיטות המוצגות כאן כדי לתקן ולנקות כיח כדי לדמיין חיידקים, בין אם מחולי CF או חולים עם זיהומים אחרים בדרכי הנשימה. הסוג הספציפי של צביעה וניתוח מיקרוסקופי המתואר כאן הוא הכלאה פלואורסצנטית באתרו (FISH), ואחריה קשירת נוגדנים נגד PSL בתוך ההידרוג'ל, וניתוח עוקב באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (CLSM). לאחר ניקוי רקמות, ניתן ליישם גם שיטות אחרות של אימונוהיסטוכימיה ומיקרוסקופ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

אישור ועדת האתיקה של המחקר (REB) נדרש כדי לאסוף ולאחסן דגימות כיח מנבדקים אנושיים. מחקרים המוצגים כאן אושרו על ידי בית החולים לילדים חולים REB#1000058579.

1. איסוף כיח

  1. יש לאחסן את הכיח הצפוי בכוס איסוף סטרילית ולאחסן מיד בטמפרטורה של 4°C למשך 24 שעות לכל היותר לפני הקיבוע.
    הערה: השארת הכיח זמן רב מדי בטמפרטורה של 4°C ללא קיבוע עלולה להוביל לפירוק התאים, במיוחד להתפרקות תאי הדם הלבנים. קיבוע בהקדם האפשרי עדיף.
  2. מעבירים את דגימות הכיח לצינור סטרילי של 15 מ"ל.
  3. הוסף נפח שווה של 4% paraformaldehyde (PFA) לדגימות כיח. לדוגמה, אם דגימת הכיח היא 0.5 מ"ל, הוסף 0.5 מ"ל של 4% PFA. מערבבים בהיפוך עדין.
  4. לדגור על כיח לילה ב 4 °C (75 °F).
  5. לשטוף את הדגימה על ידי הוספת 5 מ"ל של פוספט buffered מלוחים (PBS) לכל 2 מ"ל של כיח קבוע.
    הערה: אין צורך בצנטריפוגה לשלב שטיפה זה.
  6. בזהירות להסיר את supernatant עם פיפטה.
    הערה: הימנעו מלמצוץ את הכיח עם פיפטה על ידי הפניית הקצה הרחק מהכיח ושאפו לאט מאוד מהנוזל שעל פני השטח. שלב השטיפה אינו כרוך בצנטריפוגה כדי לא להפריע לשלמות המבנית של תקעי הכיח.
  7. חזור על שלבים 1.6-1.7 פעמיים נוספות.
  8. השהה מחדש את הגלולה בנפח פי 2 של PBS עם 0.01% (w/v) נתרן אזיד.
  9. לאחסן את הכיח ב 4 °C.

2. MiPACT (טכניקת ניקוי רקמות) עיבוד של כיח

  1. יש לנטרל את רכיבי ההידרוג'ל (30% 29:1 אקרילאמיד:bis-acrylamide, hardner ו-PBS) במיכל אטום המכיל אריזה אנאירובית לפני 72 שעות.
    הערה: האריזה האנאירובית והמיכל האטום נחוצים מכיוון שחמצן מעכב פילמור אקרילאמיד. לחלופין, ניתן להסיר חמצן על ידי ביצוע שלב זה במכסה מנוע אנאירובי, על ידי מריחת ואקום על מיכל אטום, או על ידי בעבוע גז N2 דרך תערובת האקרילאמיד.
    1. הוסף 2 מ"ל של 30% 29:1 תמיסת אקרילאמיד:ביס-אקרילאמיד לצינור 15 מ"ל כשהמכסה כבוי בתוך המיכל האנאירובי האטום.
    2. צור מלאי מרוכז של 10% (w/v) מקשה על ידי הוספת 0.5 גרם של מקשה ל- 5 מ"ל PBS בצינור של 15 מ"ל. השאירו את הפקק מחוץ לצינור ואחסנו במיכל האנאירובי האטום.
    3. השאירו כמה מ"ל של PBS סטרילי בצינור, כשהמכסה כבוי, בתוך המיכל האנאירובי.
  2. הפוך 5 מ"ל פתרון של הידרוג'ל עם ריכוז סופי של 0.2% מקשה ו 4% 29: 1 אקרילאמיד: bis-acrylamide ב PBS בצינור 15 מ"ל. מערבבים בהיפוך ומסננים.
  3. מוציאים דגימות כיח מהמקרר, ואז חותכים לחתיכות קטנות (בערך 5 מ"מ קוטר) בתנאים סטריליים עם אזמל.
    הערה: אם הכיח נוזלי למדי עדיין ניתן לבצע שלב זה, עם זאת, נדרשת סבלנות מוגברת ותרגול כדי להסיר את הכיח מתמיסת האחסון בפינצטה לפני השימוש באזמל כדי להפריד את השברים הרצויים.
  4. הניחו את דגימות הכיח החתוכות בתוך באר של מגלשת זכוכית כיסוי בעלת 8 תאים.
  5. הוסף 300 μL של תמיסת הידרוג'ל מעוקרת מסנן משלב 2.2 לכל אחת מהבארות המכילות כיח.
  6. הניחו את 8 תאי הזכוכית בתוך מיכל אטום המכיל אריזה אנאירובית למשך 3 שעות בטמפרטורה של 37°C.
    הערה: לאחר פולימר הידרוג'ל עם כיח מוטבע צריך להיות עקביות של ג'ל מוצק.
  7. העבירו את דגימות כיח ההידרוג'ל המוצק לצינור תרבית של 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל של 8% נתרן דודציל סולפט (SDS), pH 8, ואפשרו לדגימות להתנקות במשך 3-14 ימים בטמפרטורה של 37°C (עם או בלי טלטול), עד שהכיח הופך שקוף.
    הערה: זמני הניקוי תלויים בהרכב הכיח ובדרך כלל ניתן להפחית אותם עם רעידות. עם זאת, יש להקפיד שלא להגביר את מהירות הרעידה עד כדי הפרעה לשלמות הדגימה. לדגימות עשירות יותר בדנ"א לוקח זמן רב יותר להתנקות בהשוואה לדגימות עשירות בליחה.
  8. יש לרוקן את פתרון 8% SDS לתוך מיכל איסוף פסולת. באמצעות פינצטה סטרילית להעביר כל דגימה משובצת הידרוג'ל לצינור חרוטי סטרילי 50 מ"ל. הוסף 10 מ"ל של PBS לכל אחד צינורות חרוטי 50 מ"ל כדי לשטוף את hydrogels ולתת את הפתרון לשבת במשך 30 דקות עד 1 שעה לפני decanting. חזור על פעולה זו פעמיים נוספות.
    הערה: שלב שטיפה זה אינו כרוך בצנטריפוגה. עודף נוזל supernatant מוסרים בזהירות עם פיפטה.
  9. אחסנו דגימות שטופות ב-PBS עם 0.01% (w/v) נתרן אזיד ו-1x מעכב RNase ב-4°C.

3. פרוטוקול הכלאה פלואורסצנטית של הידרוג'ל באתרו (FISH)

  1. הסירו את דגימות ההידרוג'ל מתמיסת האחסון שלהן באמצעות פינצטה סטרילית והניחו את הדגימות על משטח סטרילי (כגון מגלשת זכוכית או צלחת פטרי).
  2. בעזרת אזמל סטרילי חותכים את ההידרוג'לים לפרוסות בעובי ~ 1 מ"מ.
  3. מניחים את חלקי ההידרוג'ל בקוטר 1 מ"מ בתוך צינורות סטריליים של 1.5 מ"ל.
  4. הכן 1 מ"ל את חיץ ההכלאה (25% פורממיד, 0.9 M NaCl, 20 mM Tris-HCl [pH 7.6], 0.01% SDS, מטוהר ונטול יונים H2O) בצינור של 1.5 מ"ל.
  5. הוסף את הגשושית PseaerA המסומנת באופן פלואורסצנטי (150.7 ננומטר12) למאגר ההכלאה וערבב באמצעות היפוך.
    הערה: יש להרחיק את תמיסת הפורמלין מלהבה פתוחה. ניתן להכין את חיץ ההכלאה בצורה מתקדמת ולאחסן באליציטוטים ב -20 ° C13.
  6. הוסף 200-500 μL של חיץ הכלאה לכל קטע ~ 1 מ"מ של הידרוג'ל וודא שכל דגימת ההידרוג'ל שקועה.
  7. אפשר לגשושית PseaerA לבצע הכלאה עם דגימות ההידרוג'ל על ידי הצבתן בחושך למשך ~ 18-24 שעות, ב 46 מעלות צלזיוס, מבלי לרעוד.
  8. מרוקנים את מאגר ההכלאה לתוך מיכל איסוף פסולת.
  9. יש לשטוף דגימות פעם אחת עם חיץ כביסה מעוקר מסנן (337.5 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA (חומצה Ethylenediaminetetraacetic) [pH 7.2], 0.01% SDS, ו מטוהר ו deionized H2O) על ידי הוספת 1 מ"ל של חיץ כביסה לכל אחד צינורות 1.5 מ"ל ולאחר מכן להסיר אותו.
    הערה: ניתן להכין מראש את חיץ הכביסה ולאחסן אותו בטמפרטורת החדר (RT).
  10. הוסף 1 מ"ל של חיץ כביסה טרי לצינורות, ולאחר מכן לדגור על הדגימות בחושך במשך 6 שעות ב 48 ° C, מבלי לרעוד.

4. קשירת נוגדנים הידרוג'ל ו-Psl0096

  1. הסירו באופן סטרילי את חיץ הכביסה באמצעות פיפטור 1 מ"ל.
  2. שטוף את הדגימות עם 2% BSA (w/v) בתמיסת PBS על ידי הוספה והסרה של 1 מ"ל של תמיסת 2% BSA.
  3. הוסף 500 μL של תמיסת 2% BSA/PBS לדגימות ההידרוג'ל כדי לחסום קשירת חלבונים לא ספציפיים. לאחר מכן דגרו על הדגימות למשך הלילה, בחושך, ב-RT, מבלי לרעוד.
  4. הסר באופן סטרילי את פתרון החסימה באמצעות פיפטה 1 מ"ל.
  5. הכן את תמיסת הנוגדנים Psl0096-Texas Red על ידי דילול הנוגדן לריכוז סופי של 0.112 מיקרוגרם/מ"ל ב-500 מיקרוליטר של 2% BSA/PBS טריים.
  6. הוסף את תמיסת הנוגדנים 500 μL לדגימות ההידרוג'ל ודגר אותן ב- RT במשך 6 שעות, מוגן מפני אור, ללא רעידות.

5. DAPI (4′,6′-diamidino-2-phenylindole) צביעה

  1. הכינו את תמיסת התאמת אינדקס השבירה (RIMS) על ידי הוספת 40 גרם של מדיום שיפוע צפיפות לא יוני, 30 מיקרוליטר של Tween20, 3 מיקרוגרם נתרן אזיד ו-30 מ"ל של PBS לבקבוק המכיל מוט ערבוב מגנטי. ערבבו את התמיסה במשך 15 דקות על בחש מגנטי, או עד להמסה מלאה.
  2. מסננים לעקר את התמיסה לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל באמצעות מזרק 10 מ"ל ומסנן סטרילי 0.2 מיקרומטר.
    הערה: ניתן לאחסן את התמיסה בטמפרטורה של 4°C למשך מספר חודשים.
  3. הסר את תמיסת הנוגדנים Psl0096-Texas Red עם פיפטה סטרילית של 1 מ"ל.
  4. שטפו את דגימות ההידרוג'ל על ידי הוספה ולאחר מכן הסרה של 1 מ"ל PBS.
  5. דגרו על דגימות ההידרוג'ל עם 250 μL של תמיסת RIMS ו-10 מיקרוגרם/מ"ל של DAPI ב-RT עם רעידות עדינות, בחושך, למשך הלילה.
  6. לפני ההדמיה הקונפוקלית יש להרכיב את הדגימות על תאי זילוח בקוטר 0.9 מ"מ או 1.7 מ"מ ולאטום באמצעות כיסוי זכוכית.
    הערה: לאחר FISH ו/או אימונוהיסטוכימיה ולפני טבילה ב-RIMS, ניתן למרוח כתמי לקטין פלואורסצנטיים אם רוצים הדמיה של רירית הכיח12.

6. הדמיה

  1. בצע הדמיה מיקרוסקופית קונפוקלית לסריקת לייזר בטכניקות סטנדרטיות בהגדלות של 25x, 40x, 63x או 100x.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

התכנון הכולל של הניסוי מסוכם באיור 1 ובאיור 2. איור 1 מספק סיכום של פרוטוקולי עיבוד כיח וניקוי כיח. עיבוד וניקוי כיח עשויים להימשך עד 17 יום. עם זאת, ניתן לעצור את הפרוטוקול, וניתן לאחסן דגימות לאחר קיבוע עם PFA (יום 2) או לאחר ניקוי רקמות (ימים 5-17 בהתאם לזמן הניקוי). באיור 2 מסוכמים פרוטוקולי הקישור של FISH ונוגדנים. פרוטוקולי FISH וצביעת נוגדנים אורכים 4 ימים אך יש להשלים אותם ולצלם תמונות קונפוקליות ברגע שמתחילים. באמצעות הפרוטוקולים לעיל, ניתן להשיג תמונות תלת-ממדיות ברזולוציה גבוהה של תאי P. aeruginosa עם המבנה באתרם בתוך כיח דמיוני.

ניקוי הכיח והיישום הבא של כתמים פלואורסצנטיים המשמשים בפרוטוקול זה מאפשר הדמיה מפורטת של P. aeruginosa בתוך הדגימות. דגימות הכיח שמוצגות באיור 3 ובאיור 4 נאספו מחולה CF ילדים (בן 17) עם זיהום P. aeruginosa חדש. באיור 3A, צבר של תאים נצפה בתוך דגימת כיח; המראה של מוטות צהבהבים-ירוקים נבע מחפיפה של כל שלושת הפלואורופורים. אף על פי שאין לנו ספירת תאים עבור דגימת הכיח הזו, מצאנו שמגבלת זיהוי הבדיקה היא 104 תאים/מ"ל (ראו איור משלים 1). באיור 3B, צורות מוט בודדות נראו בירוק מהקישור הספציפי למין של הגשושית PseaerA-488 לתאי P. aeruginosa. הנוגדן Psl0096-Texas Red שנראה באדום ממחיש היכן האקסופוליסכריד המדומה היה ממוקם בתוך הכיח; במקרה הזה, נראה שהנוגדן Psl0096 חופף בעיקר לתאי P. aeruginosa (איור 3C). שיטה זו אפשרה גם הדמיה של תאים פסאודומונליים בתוך הכיח ביחס לתאי חיידקים אחרים ומבנים מארחים. באיור 4, צביר של תאי P. aeruginosa נצפה פגוציטוזי בתוך תא אאוקריוטי, וצברי תאי קוקל קטנים אחרים נצפו בסביבה. הוכח כי נוגדן Psl0096 יכול גם להיקשר לצורה פלנקטונית P. aeruginosa המיוצר על ידי Psl (ראו איור משלים 2).

Figure 1
איור 1: דיאגרמת זרימה המדגימה את עיבוד הכיח ואת פרוטוקולי MiACT.
לסיכום, כיח קבוע לפני שהוא מוטמע בתמיסת פוליאקרילאמיד. לאחר פינוי, ניתן לאחסן את ההידרוג'ל בטמפרטורה של 4 °C או להשתמש בו עם פרוטוקול קשירת הנוגדנים FISH. תמונה זו נוצרה באמצעות BioRender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: דיאגרמת זרימה המציינת את פרוטוקולי הכלאה פלואורסצנטית באתרו וצביעת נוגדנים.
לאחר שהכיח התנקה לחלוטין בתוך מטריצת ההידרוג'ל, ניתן ליישם שיטות צביעה. תמונה זו נוצרה באמצעות BioRender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: תמונת אימונופלואורסנציה של דגימת כיח שנאספה ממטופל עם זיהום מוקדם של P. aeruginosa המוטבע במטריצת הידרוג'ל.
דגימת ההידרוג'ל עברה הכלאה עם בדיקה PsearA-Alexa488 (ירוק), נוגדן Psl0096-Texas Red (אדום) ו-DAPI (כחול). (A) דגימת כיח שנצפתה תחת כל 3 הערוצים, (B) כיח מתחת לתעלה הירוקה בלבד המציינת היכן קשורה הבדיקה PseaerA-488, ו-(C) כיח רק מתחת לתעלה האדומה שבה התרחשה הקשירה האדומה Psl0096-Texas. התמונות צולמו בהגדלה של פי 100. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: תמונת אימונופלואורסנציה של דגימת כיח שנאספה ממטופל עם זיהום מוקדם של P. aeruginosa המוטבע במטריצת הידרוג'ל.
דגימת ההידרוג'ל עברה הכלאה עם בדיקה PsearA-Alexa488 (ירוק), נוגדן Psl0096-Texas Red (אדום) ו-DAPI (כחול). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 1: הכלאה פלואורסצנטית באתרו של תרבית פלנקטונית של PAO1 עם הגשושית PseaerA-488. אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.

איור משלים 2: P. aeruginosa מוכתם ב-DAPI ובנוגדן Psl0096-Texas Red. (A) זן PAO1-Δpsl, ו-(B) זן PAO1. אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מטרת פרוטוקול זה היא לאפשר הצצה לארגון באתרו של תאי P. aeruginosa בכיח מחולי CF. דגימות כיח יש לאחסן ב 4 ° C עד עיבוד אם הם לא יכולים להיות קבועים מיד. הוכח כי מספרי תאי P. aeruginosa בכיח אינם משתנים באופן משמעותי אם הם מעובדים ב 1 שעות, 24 שעות, או 48 שעות, כאשר מאוחסנים ב 4 ° C, אם כי אם נשאר ב 25 ° C במשך 24 או 48 שעות, ספירת תאי חיידקים יגדל באופן משמעותי כתוצאה מצמיחת חיידקים14. עבור מחקר זה, דגימות כיח אוחסנו ב 4 ° C עד מקסימום של 24 שעות לאחר expectoration. יש לציין כי ספירת תאים דלקתיים הוכחה ירידה בכיח אם נשאר ב 4 ° C ועבד יותר מ 9 שעות מאוחר יותר15. לכן, חשוב לקחת בחשבון את התאים והסמנים הספציפיים שרוצים לדמיין בכיח כאשר מחליטים על זמן חיתוך לעיבוד דגימה.

עיבוד הדגימה בשיטה זו מתחיל עם קיבוע של דגימות כיח ב 4% PFA. Paraformaldehyde יקשר בין תאי חיידקים לבין המטריצה החוץ תאית שלהם, וישמור על המבנים שלהם לצורך הדמיה מיקרוסקופית וניתוח11,16. למרבה הצער, אם המטרה היא לקבל ספירה כוללת של תאים דלקתיים מסוימים בכיח, PFA הוכח להפחית את הספירה של תאים אלה ולכן קיבוע אחרים צריך להיחשב17. מגבלה נוספת של מחקר זה היא שזה יכול לקחת זמן רב עשוי לקחת יותר משבועיים כדי לבצע. לכן, זה לא יכול להיות מתאים לפיתוח לשיטת אבחון הדורשת החלטות טיפול תלויות זמן. יתר על כן, להבנת המגוון המיקרוביאלי הכולל בתוך דגימות כיח, שיטה זו לא תהיה מתאימה, אך ניתן לשלב אותה עם שיטות זיהוי מיקרוביאליות אחרות בעלות תפוקה גבוהה כגון qPCR.

הרכב של הידרוג'ל אקרילאמיד ניתן לשנות בהתאם לסוג הרקמה ואת היישום11. עבור דגימות לא יציבות כמו כיח CF, יש צורך לספק תמיכה מבנית עם תערובת אקרילאמיד:ביס-אקרילאמיד 29:1 (במקום רק אקרילאמיד). הכללת פרפורמלדהיד בהידרוג'ל יכולה לייצב עוד יותר את המבנה, עם פשרה של זמני דגירה ארוכים יותר כדי לאפשר דיפוזיה של בדיקות ונוגדנים9. הוספת פורמלדהיד להידרוג'ל יכולה גם למנוע נפיחות רקמות בתהליך הניקוי אם השפעה זו אינה רצויה11.

השיטה הנוכחית מכוונת באופן ספציפי לתאי P. aeruginosa בתוך כיח של חולי CF. שיטות חלופיות ושינויים לפרוטוקול זה יכולים להיחשב כדי להנחות אופטימיזציה של הדמיה של חיידקים אחרים. על ידי יישום בדיקות FISH ותגובת שרשרת הכלאה (HCR) ספציפיות למינים ולסוגים, ניתן לזהות פתוגנים אחרים של CF כגון Staphylococcus aureus, Streptococcus sp. ו- Achromobacter xylosoxidans 12. במחקר שלנו, התמקדנו באקסופוליסכריד פסאודומונלי Psl. מטרות אחרות, כולל אלגינט או Pel יכולות להיבדק עם נוגדנים פלואורסצנטיים ספציפיים עבור exopolysaccharides אלה בניסויים עתידיים. יישום שיטת MiPACT יחד עם FISH וצביעת נוגדנים עבור CLSM לוקח כמה שבועות כדי להשלים. אם שאלת המחקר אינה נוגעת להדמיה מרחבית תלת-ממדית של הכיח, ישנן שיטות מהירות יותר לדמיין את נוכחות החיידקים. שיטות קודמות ששימשו להדמיית חיידקים בתוך דגימות כיח משתמשות בחתך דק או מריחה וכוללות: FISH18, כתם גרם, וטכניקות אימונוהיסטוכימיה המיישמות נוגדנים ראשוניים וכתמי נגד כדי לאפשר הדמיה של אקסופוליסכרידים ביופילם ותאי חיידקים19,20.

ישנם מספר יישומים עתידיים פוטנציאליים של סוגים אלה של טכניקות הדמיה. היכולת לדמיין אורגניזמים חיידקיים שונים ואת האינטראקציה שלהם עם תאים מארחים, כגון פגוציטים, עשויה לקדם את הבנתנו מדוע זנים מסוימים של P. aeruginosa מנוקים ביעילות מדרכי הנשימה של CF בעוד זנים אחרים אינם. הדמיה של חיידקים בתוך דגימות נשימה עשויה לשמש גם כמדד ליעילות מיקרוביאלית וכתוצאת מחקר עבור תרופות אנטי-ביופילם חדשות21. בנוסף, הדמיה של הקשר המרחבי בין P. aeruginosa לבין אורגניזמים אחרים בתוך מיקרוביום הריאה של CF, כגון Staphylococcus aureus, עשויה לעזור להבהיר את התפקיד של זיהום משותף / נשאות בפתוגנזה של החמרות ריאתיות, ואת התגובה שלהם לטיפול אנטיביוטי. הדמיה In vivo של חיידקים יכולה להיות מיושמת גם על זיהומים אחרים, כולל אלה עם דלקת ריאות הקשורה להנשמה או זיהומים פצעים כרוניים22. כך ניתן להשתמש בתובנות שהושגו כדי להנחות את ההתפתחות הטיפולית העתידית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ללא.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות לקרן סיסטיק פיברוזיס שסיפקה מימון למחקר זה ול-MedImmune על תרומתם הנדיבה של נוגדנים נגד PSL0096. לצורך מחקר זה בוצעה הדמיה במתקן הדמיה CAMiLoD באוניברסיטת טורונטו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
29:1 acrylamide bisacrylamide, 30 % solution BioRad 161-0146
8-Chambered Coverglass Nunc Lab-Tek ThermoFischer Scientific 155411
Anaerogen2.5L Oxid Inc. 35108
Coverwell perfusion chambers Electron Microscopry Sciences 70326 -12/-14
HistoDenz Sigma D2158
Protect RNA Rnase Inhibitor Sigma R7387
PseaerA - GGTAACCGTCCCCCTTGC Eurofins Order Details: Product: Modified DNA Oligo; Name: PseaerA; Sequence: [Alexa488]GGTAACCGTCCCCCTTGC; Synthesis: 50 nmol; Purification: HPLC; Ship state: Full yield (dry)
Psl0096-Texas Red Medimmune The Psl0096-Texas red antibodies were a gift kindly provided by Medimmune and the company should be contacted for order inquiries.
VA-044 Hardener Wako 27776-21-21

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Banerjee, D., Stableforth, D. The treatment of respiratory pseudomonas infection in cystic fibrosis: What drug and which way. Drugs. 60 (5), 1053-1064 (2000).
  2. Rosenfeld, M., Ramsey, B. W., Gibson, R. L. Pseudomonas acquisition in young patients with cystic fibrosis: Pathophysiology, diagnosis, and management. Current Opinion in Pulmonary Medicine. 9 (6), 492-497 (2003).
  3. Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T. Tolerance and Resistance of Pseudomonas aeruginosa Biofilms to Antimicrobial Agents-How P. aeruginosa Can Escape Antibiotics. Frontiers in Microbiology. 10, 913 (2019).
  4. Billings, N., et al. The Extracellular Matrix Component Psl Provides Fast-Acting Antibiotic Defense in Pseudomonas aeruginosa Biofilms. PLoS Pathogens. 9 (8), 1003526 (2013).
  5. Franklin, M. J., Nivens, D. E., Weadge, J. T., Lynne Howell, P. Biosynthesis of the Pseudomonas aeruginosa extracellular polysaccharides, alginate, Pel, and Psl. Frontiers in Microbiology. 2, 167 (2011).
  6. Yang, L., et al. Polysaccharides serve as scaffold of biofilms formed by mucoid Pseudomonas aeruginosa. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 65 (2), 366-376 (2012).
  7. Wozniak, D. J., et al. Alginate is not a significant component of the extracellular polysaccharide matrix of PA14 and PAO1 Pseudomonas aeruginosa biofilms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7907-7912 (2003).
  8. Baker, P., et al. Exopolysaccharide biosynthetic glycoside hydrolases can be utilized to disrupt and prevent Pseudomonas aeruginosa biofilms. Science Advances. 2 (5), 1-9 (2016).
  9. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  10. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  11. Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nature Protocols. 10 (11), 1860-1896 (2015).
  12. DePas, W. H., et al. Exposing the three-dimensional biogeography and metabolic states of pathogens in cystic fibrosis sputum via hydrogel embedding, clearing, and rRNA labeling. mBio. 7 (5), 1-11 (2016).
  13. Molecular Instruments HCR v3.0 protocol for bacteria in suspension. , Available from: www.molecularinstruments.com 1-6 (2019).
  14. Murray, M. P., Doherty, C. J., Govan, J. R. W., Hill, A. T. Do processing time and storage of sputum influence quantitative bacteriology in bronchiectasis. Journal of Medical Microbiology. 59 (7), 829-833 (2010).
  15. Efthimiadis, A., Jayaram, L., Weston, S., Carruthers, S., Hargreave, F. E. Induced sputum: Time from expectoration to processing. European Respiratory Journal. 19 (4), 706-708 (2002).
  16. Chao, Y., Zhang, T. Optimization of fixation methods for observation of bacterial cell morphology and surface ultrastructures by atomic force microscopy. Applied Microbiology and Biotechnology. 92 (2), 381-392 (2011).
  17. St-Laurent, J., Boulay, M. E., Prince, P., Bissonnette, E., Boulet, L. P. Comparison of cell fixation methods of induced sputum specimens: An immunocytochemical analysis. Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 36-42 (2006).
  18. Hogardt, M., et al. Specific and rapid detection by fluorescent situ hybridization of bacteria in clinical samples obtained from cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Microbiology. 38 (2), 818-825 (2000).
  19. Hoffmann, N., et al. Erratum: Novel mouse model of chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection mimicking cystic fibrosis. Infection and Immunity. 73 (8), 5290 (2005).
  20. Nair, B., et al. Utility of Gram staining for evaluation of the quality of cystic fibrosis sputum samples. Journal of Clinical Microbiology. 40 (8), 2791-2794 (2002).
  21. Howlin, R. P., et al. Low-Dose Nitric Oxide as Targeted Anti-biofilm Adjunctive Therapy to Treat Chronic Pseudomonas aeruginosa Infection in Cystic Fibrosis. Molecular Therapy. 25 (9), 2104-2116 (2017).
  22. Pestrak, M. J., et al. Treatment with the Pseudomonas aeruginosa glycoside hydrolase PslG combats wound infection by improving antibiotic efficacy and host innate immune activity. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (6), 00234 (2019).

Tags

אימונולוגיה וזיהום גיליון 161 זיהום כרוני תפקודי ריאות תחלואה טיפול אנטיביוטי חולים בילדים ארגון מרחבי אגרגציה היווצרות ביופילם ייצור פוליסכרידים דגימות כיח טכניקת ניקוי רקמות מטריצת הידרוג'ל מבנים תלת ממדיים תוויות פלואורסצנטיות הכלאה פלואורסצנטית באתר נוגדנים נגד PSL אקסופוליסכריד צביעת DAPI תאים מארחים הדמיה ברזולוציה גבוהה
הדמיה של <em>Pseudomonas aeruginosa</em> בתוך כיח של חולי סיסטיק פיברוזיס
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jackson, L., DePas, W., Morris, A.… More

Jackson, L., DePas, W., Morris, A. J., Guttman, K., Yau, Y. C. W., Waters, V. Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients. J. Vis. Exp. (161), e61631, doi:10.3791/61631 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter