Summary
Bu protokol, kistik fibrozis hastalarının balgamındaki bakteri hücrelerinin ve polisakkarit sentez lokusu (Psl) polisakkaritinin görüntülenmesi için yöntemler sağlar.
Abstract
Kistik fibroz hastalarının akciğerlerinde Pseudomonas aeruginosa'nın erken tespiti ve eradikasyonu, kronik enfeksiyon gelişme şansını azaltabilir. Kronik P. aeruginosa enfeksiyonlarının gelişimi, akciğer fonksiyonlarında azalma ve artmış morbidite ile ilişkilidir. Bu nedenle, pediatrik hastaların yaklaşık %10-40'ında görülen antibiyotik tedavisi ile P. aeruginosa'nın eradike edilememesinin nedenlerinin aydınlatılmasına büyük ilgi vardır. P. aeruginosa'nın konakçı klirensini ve antibiyotik duyarlılığını etkileyebilecek birçok faktörden biri, mekansal organizasyondaki (agregasyon veya biyofilm oluşumu gibi) ve polisakkarit üretimindeki farklılıklardır. Bu nedenle, KF hastalarının balgamında P. aeruginosa'nın in situ özelliklerini görselleştirmek istedik. Balgam örneklerine, konakçı hücrelere göre 3 boyutlu yapıları korumak için örnekleri bir hidrojel matrisine gömdükten sonra bir doku temizleme tekniği uygulandı. Doku temizlendikten sonra, görselleştirmeye izin vermek için floresan etiketler ve boyalar eklendi. Bakteri hücrelerinin görselleştirilmesi için floresan in situ hibridizasyon, ekzopolisakkaritin görselleştirilmesi için floresan etiketli anti-Psl-antikorlarının bağlanması ve yapısal içgörü elde etmek için konakçı hücreleri boyamak için DAPI boyama gerçekleştirildi. Bu yöntemler, konfokal lazer tarama mikroskobu ile KF hastalarının balgamında P. aeruginosa'nın yüksek çözünürlüklü görüntülenmesine izin verdi.
Introduction
Bu çalışmada, pediatrik kistik fibrozis (KF) hastalarının balgamında Pseudomonas aeruginosa'nın in vivo yapısını görselleştirmek için deneyler tasarlanmıştır. P. aeruginosa enfeksiyonları pediatrik KF popülasyonunun% 30-40'ında kronikleşir; Kronik enfeksiyonlar bir kez yerleştikten sonra, ortadan kaldırılması neredeyse imkansızdır1. Erken enfeksiyonu olan hastalardan P. aeruginosa izolatları genellikle antimikrobiyallere daha duyarlıdır, bu nedenle bunlar kronik enfeksiyonun oluşmasını önlemek için anti-psödomonal antibiyotiklerle tedavi edilir2. Ne yazık ki, tüm P. aeruginosa izolatları antibiyotik tedavisini takiben akciğerden etkili bir şekilde temizlenmez. Antibiyotik yetmezliği ile ilişkili kesin mekanizmalar tam olarak aydınlatılamamıştır. Önceki çalışmalar, biyofilm hücre yoğunluğu, agregasyonu ve polisakkarit üretimindeki değişikliklerin antibiyotik etkinliğini etkileyebileceğini göstermiştir3. P. aeruginosa üç hücre dışı polisakkarit üretir: Pel, Psl ve aljinat4. P. aeruginosa'nın çoğu suşu, ekzopolisakkaritlerin her birini eksprese etmek için genetik kapasiteye sahiptir, ancak genellikle bir tür polisakkarit ağırlıklı olarak5 eksprese edilir. Ekzopolisakkarit aljinat, KF akciğerindeki kronik enfeksiyonlarla ilişkilidir ve bu da mukoid fenotip 6,7 ile sonuçlanır. Polisakkaritler Pel ve Psl, ilk bağlanmaya ve biyofilm yapısının korunmasına yardımcı olmak ve antibiyotik direnci kazandırmak dahil olmak üzere birçok işleve sahiptir8.
Dokuların in vivo yapılarını görselleştirmeyi amaçlayan yöntemler, çeşitli numune tipleri için geliştirilmiştir 9,10,11. Daha yakın zamanlarda, KF hastalarından balgam içindeki in vivo mikrobiyal toplulukları görselleştirmek için uyarlanmışlardır12. Özellikle balgam içindeki mikrobiyal toplulukların tanımlanması için bir doku temizleme protokolünün optimizasyonu DePas ve ark., 201612 tarafından geliştirilmiştir. Passive CLARITY technique'den sonra microbial iidentification anlamına gelen MiPACT terimi, CF balgam11,12'nin temizlenmesi için icat edildi. Doku temizleme teknikleri için, örnekler önce sabitlenir, daha sonra boyama ve mikroskobik görselleştirme için doğal mimarileri bozulmadan bırakılırken şeffaf hale getirilir11. KF balgam örneklerinin sabitlenmesi ve temizlenmesi, araştırmacıların biyofilm yapısı, bakteriyel hücre yoğunluğu, polimikrobiyal ilişkiler ve patojenler ile konakçı hücreler arasındaki ilişkiler ile ilgili soruları yanıtlamasına olanak tanır. Balgam içinde korunmuş bakterileri doğrudan incelemenin avantajı, konakçıya özgü bir bağlamda analiz edilebilmeleri ve görselleştirilebilmeleridir. Deney için laboratuvarda klinik izolatların in vitro büyümesi çok bilgilendirici olabilse de, bu tür yöntemler KF akciğer ortamını tam olarak yeniden oluşturamaz ve bu da laboratuvar sonuçları ile hasta sonuçları arasında bir kopukluğa neden olur.
Burada sunulan yöntemler, KF hastalarından veya diğer solunum yolu enfeksiyonları olan hastalardan bakterileri görselleştirmek için balgamı sabitlemek ve temizlemek için kullanılabilir. Burada tarif edilen spesifik boyama ve mikroskobik analiz türü, floresan in situ hibridizasyon (FISH), ardından hidrojel içinde anti-Psl-antikor bağlanması ve ardından konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) yoluyla analizdir. Doku temizliğini takiben diğer immünohistokimya ve mikroskopi yöntemleri de uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
İnsan deneklerden balgam örneklerinin toplanması ve saklanması için Araştırma Etik Kurulu (REB) onayı gereklidir. Burada sunulan çalışmalar Hasta Çocuklar Hastanesi REB # 1000058579 tarafından onaylanmıştır.
1. Balgam Toplama
- Balgam söktürücü balgamı steril bir toplama kabında saklayın ve fiksasyondan hemen önce en fazla 24 saat 4 °C'de saklayın.
NOT: Balgamı fiksasyon olmadan 4 ° C'de çok uzun süre bırakmak, hücresel bozulmaya, özellikle beyaz kan hücrelerinin bozulmasına neden olabilir. Mümkün olan en kısa sürede sabitleme tercih edilir. - Balgam örneklerini steril 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
- Balgam örneklerine eşit hacimde %4 paraformaldehit (PFA) ekleyin. Örneğin, balgam örneği 0.5 mL ise, 0.5 mL %4 PFA ekleyin. Hafifçe ters çevirerek karıştırın.
- Balgamı gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
- Her 2 mL sabit balgama 5 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyerek numuneyi yıkayın.
NOT: Bu yıkama adımı için santrifüj gerekmez. - Süpernatanı bir pipetle dikkatlice çıkarın.
NOT: Ucu balgamdan uzağa doğrultarak balgamı pipetle emmekten kaçının ve yüzeydeki sıvıyı çok yavaş bir şekilde aspire edin. Yıkama adımı, balgam tıkaçlarının yapısal bütünlüğünü bozmamak için santrifüj içermez. - 1.6-1.7 adımlarını iki kez daha tekrarlayın.
- Pelet, %0,01 (a/h) sodyum azid ile PBS hacminin 2 katı kadar yeniden süspanse edilir.
- Balgamı 4 °C'de saklayın.
2. Balgamın MiPACT (doku temizleme tekniği) işlenmesi
- Hidrojel bileşenlerini (%30 29:1 akrilamid: bis-akrilamid, sertleştirici ve PBS) 72 saat önce anaerobik bir paket içeren kapalı bir kapta gazdan arındırın.
NOT: Anaerobik paket ve kapalı kap gereklidir çünkü oksijen akrilamid polimerizasyonunu inhibe eder. Alternatif olarak, bu adım anaerobik bir başlıkta gerçekleştirilerek, kapalı bir kaba vakum uygulanarak veyaN2 gazının akrilamid karışımından köpürtülmesiyle oksijen çıkarılabilir.- Kapalı anaerobik kabın içinde kapağı kapalı olacak şekilde 15 mL'lik bir tüpe 2 mL %30 29:1 akrilamid: bis-akrilamid çözeltisi ekleyin.
- 15 mL'lik bir tüpte 5 mL PBS'ye 0,5 g sertleştirici ekleyerek konsantre bir %10 (a/h) sertleştirici stoğu yapın. Kapağı tüpün dışında bırakın ve kapalı anaerobik kapta saklayın.
- Anaerobik kabın içinde, kapağı kapalı olarak bir tüpte birkaç mL steril PBS bırakın.
- 15 mL'lik bir tüpte PBS'de nihai konsantrasyonu %0.2 sertleştirici ve %4 29:1 akrilamid olan 5 mL hidrojel çözeltisi yapın. Ters çevirerek karıştırın ve filtre sterilize edin.
- Balgam örneklerini buzdolabından çıkarın, ardından steril koşullar altında bir neşter ile küçük bölümler halinde (kabaca 5 mm çapında) kesin.
NOT: Balgam oldukça akışkansa, bu adım yine de gerçekleştirilebilir, ancak istenen fraksiyonları ayırmak için neşteri kullanmadan önce balgamı cımbızla saklama solüsyonundan çıkarmak daha fazla sabır ve pratik gerektirir. - Kesilen balgam örneklerini 8 odacıklı bir kapak camı slaytının kuyusuna yerleştirin.
- Balgam içeren kuyucukların her birine adım 2.2'den 300 μL filtre sterilize hidrojel çözeltisi ekleyin.
- 8 odacıklı kapak camını anaerobik paket içeren kapalı bir kabın içine 37 °C'de 3 saat yerleştirin.
NOT: Gömülü balgam ile hidrojel polimerize edildikten sonra sert jel kıvamında olmalıdır. - Katılaşmış hidrojel balgam numunelerini 5 mL %8 sodyum dodesil sülfat (SDS), pH 8 içeren 15 mL'lik bir kültür tüpüne aktarın ve numunelerin 37 °C'de (çalkalayarak veya çalkalanmadan) 3-14 gün boyunca balgam şeffaf hale gelene kadar temizlenmesine izin verin.
NOT: Temizleme süreleri balgam bileşimine bağlıdır ve genellikle çalkalama ile azaltılabilir. Ancak çalkalama hızını numune bütünlüğünü bozacak kadar artırmamaya özen gösterin. DNA açısından zengin örneklerin temizlenmesi, mukus açısından zengin örneklere kıyasla daha uzun sürer. - %8 SDS çözeltisini bir atık toplama kabına boşaltın. Steril cımbız kullanarak, hidrojel gömülü her numuneyi steril 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Hidrojelleri yıkamak için 50 mL'lik konik tüplerin her birine 10 mL PBS ekleyin ve çözeltiyi boşaltmadan önce 30 dakika ila 1 saat bekletin. Bunu 2 kat daha tekrarlayın.
NOT: Bu yıkama adımı santrifüj içermez. Fazla sıvı ve süpernatant bir pipetle dikkatlice çıkarılır. - Yıkanmış numuneleri 4 °C'de %0,01 (a/h) sodyum azid ve 1x RNaz inhibitörü ile PBS'de saklayın.
3. Hidrojel floresan in situ hibridizasyon (FISH) protokolü
- Hidrojel numunelerini steril cımbız kullanarak saklama solüsyonlarından çıkarın ve numuneleri steril bir yüzeye (cam slayt veya Petri kabı gibi) yerleştirin.
- Steril bir neşter kullanarak hidrojelleri ~ 1 mm kalınlığında dilimler halinde kesin.
- Hidrojelin 1 mm'lik bölümlerini steril 1,5 mL'lik tüplerin içine yerleştirin.
- 1.5 mL'lik bir tüpte 1 mL hibridizasyon tamponu (%25 formamid, 0.9 M NaCl, 20 mM Tris-HCl [pH 7.6], %0.01 SDS, saflaştırılmış ve deiyonizeH2O) hazırlayın.
- Floresan etiketli PseaerA probunu (150.7 nM12) hibridizasyon tamponuna ekleyin ve ters çevirerek karıştırın.
NOT: Formalin çözeltisi açık alevden uzak tutulmalıdır. Hibridizasyon tamponu önceden hazırlanabilir ve -20 ° C'de alikotlarda saklanabilir13. - Hidrojelin her ~1 mm'lik bölümüne 200-500 μL hibridizasyon tamponu ekleyin ve hidrojel numunesinin tamamının suya daldırıldığından emin olun.
- PseaerA probunun hidrojel numunelerini ~ 18-24 saat, 46 °C'de çalkalamadan karanlıkta bırakarak hibridize olmasına izin verin.
- Hibridizasyon tamponunu bir atık toplama kabına boşaltın.
- 1,5 mL'lik tüplerin her birine 1 mL yıkama tamponu ekleyerek numuneleri filtreyle sterilize edilmiş yıkama tamponu (337,5 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA (Etilendiamintetraasetik asit) [pH 7,2], %0,01 SDS ve saflaştırılmış ve deiyonizeH2O) ile bir kez durulayın ve ardından çıkarın.
NOT: Yıkama tamponu önceden yapılabilir ve oda sıcaklığında (RT) saklanabilir. - Tüplere 1 mL taze yıkama tamponu ekleyin, ardından numuneleri karanlıkta 48 °C'de 6 saat çalkalamadan inkübe edin.
4. Hidrojel ve Psl0096 antikor bağlanması
- Yıkama tamponunu 1 mL'lik bir pipetleyici kullanarak steril olarak çıkarın.
- %2 BSA çözeltisinden 1 mL ekleyip çıkararak numuneleri PBS çözeltisinde %2 BSA (a/h) ile durulayın.
- Spesifik olmayan protein bağlanmasını bloke etmek için hidrojel numunelerine 500 μL %2 BSA/PBS çözeltisi ekleyin. Daha sonra numuneleri gece boyunca, karanlıkta, RT'de çalkalamadan inkübe edin.
- 1 mL'lik bir pipet kullanarak bloke edici solüsyonu steril olarak çıkarın.
- Antikoru 500 μL taze %2 BSA/PBS içinde 0.112 μg/mL'lik nihai konsantrasyona seyrelterek Psl0096-Texas Red antikor çözeltisini hazırlayın.
- 500 μL'lik antikor çözeltisini hidrojel örneklerine ekleyin ve bunları RT'de 6 saat boyunca ışıktan korunarak, çalkalamadan inkübe edin.
5. DAPI (4′,6′-diamidino-2-fenilindol) boyama
- Manyetik karıştırma çubuğu içeren bir şişeye 40 g iyonik olmayan yoğunluk gradyan ortamı, 30 μL Tween20, 3 μg sodyum azid ve 30 mL PBS ekleyerek kırılma indisi eşleştirme çözeltisini (RIMS) hazırlayın. Çözeltiyi manyetik bir karıştırıcı üzerinde 15 dakika veya tamamen eriyene kadar karıştırın.
- Filtre, 10 mL'lik bir şırınga ve steril 0.2 μm'lik bir filtre kullanarak çözeltiyi 50 mL'lik bir konik tüpe sterilize eder.
NOT: Çözelti 4 °C'de birkaç ay saklanabilir. - Psl0096-Texas Red antikor solüsyonunu steril 1 mL'lik bir pipetle çıkarın.
- Hidrojel örneklerini 1 mL PBS ekleyip çıkararak durulayın.
- Hidrojel numunelerini 250 μL RIMS çözeltisi ve 10 μg/mL DAPI ile RT'de gece boyunca karanlıkta hafifçe çalkalayarak inkübe edin.
- Konfokal görüntülemeden önce, numuneleri 0,9 mm veya 1,7 mm perfüzyon odalarına monte edin ve bir cam lamel ile kapatın.
NOT: FISH ve/veya immünohistokimyadan sonra ve RIMS'e daldırılmadan önce, balgam mukozasının görüntülenmesi isteniyorsa floresan lektin boyaları uygulanabilir12.
6. Görüntüleme
- 25x, 40x, 63x veya 100x büyütmelerde standart teknikleri kullanarak konfokal lazer tarama mikroskobu görüntüleme gerçekleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deneyin genel tasarımı Şekil 1 ve Şekil 2'de özetlenmiştir. Şekil 1 , balgam işleme ve balgam temizleme protokollerinin bir özetini sağlar. Balgam işleme ve temizleme 17 güne kadar sürebilir. Bununla birlikte, protokol durdurulabilir ve numuneler PFA ile fiksasyondan sonra (2. gün) veya doku temizliğinden sonra (temizleme süresine bağlı olarak 5-17. günler) saklanabilir. Şekil 2'de FISH ve antikor bağlanma protokolleri özetlenmiştir. FISH ve antikor boyama protokollerinin tamamlanması 4 gün sürer, ancak başladıktan sonra tamamlanmalı ve konfokal görüntüler alınmalıdır. Yukarıdaki protokoller kullanılarak, P. aeruginosa hücrelerinin yüksek çözünürlüklü 3 boyutlu görüntüleri, balgam içinde in-situ yapıları ile görselleştirilebilir.
Balgamın temizlenmesi ve ardından bu protokolde kullanılan floresan boyaların uygulanması, numuneler içinde P. aeruginosa'nın ayrıntılı olarak görüntülenmesini sağlar. Şekil 3 ve Şekil 4'te gösterilen balgam örnekleri, yeni başlayan P. aeruginosa enfeksiyonu olan bir pediatrik KF hastasından (17 yaşında) toplanmıştır. Şekil 3A'da, bir balgam örneğinde bir hücre kümesi görüldü; Sarımsı yeşil çubukların görünümü, üç floroforun üst üste binmesinden kaynaklanıyordu. Bu balgam örneği için hücre sayımımız olmamasına rağmen, prob saptama sınırını 104 hücre/mL olarak bulduk (bkz. Ek Şekil 1). Şekil 3B'de, PseaerA-488 sondasının türe özgü bağlanmasından P. aeruginosa hücrelerine bireysel çubuk şekilleri yeşil renkte görülmüştür. Kırmızı renkte görülen Psl0096-Texas Red antikoru, psödomonal ekzopolisakkaritin balgam içinde nerede bulunduğunu gösterir; bu durumda Psl0096-antikorunun çoğunlukla P. aeruginosa hücreleri ile örtüştüğü görülmüştür (Şekil 3C). Bu yöntem aynı zamanda balgam içindeki psödomonal hücrelerin diğer bakteri hücreleri ve konakçı yapılarla ilişkili olarak görüntülenmesine de izin verdi. Şekil 4'te, ökaryotik bir hücre içinde fagosite edilmiş bir P. aeruginosa hücresi kümesi ve çevresinde diğer küçük kokkal hücre kümeleri gözlenmiştir. Psl0096 antikorunun, planktonik P. aeruginosa'dan üretilen Psl'ye de bağlanabildiği gösterilmiştir (bkz. Ek Şekil 2).
Şekil 1: Balgam işleme ve MiPACT protokollerini gösteren akış diyagramı.
Özetle, balgam bir poliakrilamid çözeltisine gömülmeden önce sabitlenir. Temizlendikten sonra hidrojel 4 °C'de saklanabilir veya FISH ve antikor bağlama protokolü ile birlikte kullanılabilir. Bu görüntü BioRender.com ile oluşturuldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Floresan in situ hibridizasyon ve antikor boyama protokollerini gösteren akış diyagramı.
Balgam hidrojel matriks içinde tamamen temizlendikten sonra boyama yöntemleri uygulanabilir. Bu görüntü BioRender.com ile oluşturuldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Bir hidrojel matrisine gömülü erken P. aeruginosa enfeksiyonu olan bir hastadan toplanan balgam örneğinin immünofloresan görüntüsü.
Hidrojel numunesi bir PsearA-Alexa488 probu (yeşil), bir Psl0096-Texas Red antikoru (kırmızı) ve DAPI (mavi) ile hibritlendi. (A) 3 kanalın tümü altında görüntülenen balgam örneği, (B) PseaerA-488 sondasının nereye bağlandığını gösteren yalnızca yeşil kanal altında balgam ve (C) yalnızca Psl0096-Texas kırmızı bağlanmasının meydana geldiği kırmızı kanal altında balgam. Görüntüler 100x büyütme ile çekilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Bir hidrojel matrisine gömülü erken P. aeruginosa enfeksiyonu olan bir hastadan toplanan balgam örneğinin immünofloresan görüntüsü.
Hidrojel numunesi bir PsearA-Alexa488 probu (yeşil), bir Psl0096-Texas Red antikoru (kırmızı) ve DAPI (mavi) ile hibritlendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: PseaerA-488 probu ile PAO1'in planktonik kültürünün floresan in situ hibridizasyonu. Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 2: P. aeruginosa , DAPI ve Psl0096-Texas Red antikoru ile boyanmıştır. (A) PAO1-Δpsl gerinim ve (B) PAO1 gerinim. Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokolün amacı, KF hastalarından balgamda P. aeruginosa hücrelerinin in-situ organizasyonuna bir bakış sağlamaktır. Balgam örnekleri, hemen sabitlenemiyorlarsa işlenene kadar 4 °C'de saklanmalıdır. Balgamdaki P. aeruginosa hücre sayılarının, 4 °C'de saklandığında 1 saat, 24 saat veya 48 saatte işlenirse önemli ölçüde değişmediği, ancak 24 veya 48 saat boyunca 25 °C'de bırakılırsa, bakteri büyümesinin bir sonucu olarak bakteri hücre sayılarının önemli ölçüde artacağı gösterilmiştir14. Bu çalışma için balgam örnekleri balgam söktürmeden sonra 4 °C'de maksimum 24 saate kadar saklanmıştır. 4 ° C'de bırakılırsa ve 9 saatten fazla sonra işlenirse balgamda inflamatuar hücre sayılarının azaldığı gösterilmiştir15. Bu nedenle, numune işleme için bir kesme süresine karar verirken balgamda görselleştirmek istenen spesifik hücreleri ve belirteçleri dikkate almak önemlidir.
Bu yöntemde numune işleme, balgam numunelerinin %4 PFA'da fiksasyonu ile başlar. Paraformaldehit, bakteri hücrelerini ve hücre dışı matrislerini çapraz bağlayarak mikroskobik görselleştirme ve analiz için yapılarını koruyacaktır11,16. Ne yazık ki, amaç balgamdaki bazı inflamatuar hücrelerin toplam hücre sayısını elde etmekse, PFA'nın bu hücrelerin sayısını azalttığı gösterilmiştir, bu nedenle diğer fiksatifler düşünülmelidir17. Bu çalışmanın bir diğer sınırlaması, zaman alıcı olabilmesi ve gerçekleştirilmesinin iki haftadan fazla sürebilmesidir. Bu nedenle, zamana duyarlı tedavi kararları gerektiren bir tanı yöntemine dönüşmeye uygun olmayabilir. Ayrıca, balgam numunelerindeki toplam mikrobiyal çeşitliliği anlamak için bu yöntem uygun olmaz, ancak qPCR gibi diğer yüksek verimli mikrobiyal tespit yöntemleriyle eşleştirilebilir.
Akrilamid hidrojelin bileşimi, doku tipine ve uygulamaya bağlı olarak değiştirilebilir11. CF balgam gibi kararsız numuneler için 29:1 akrilamid:bis-akrilamid karışımı (sadece akrilamid yerine) ile yapısal destek sağlamak gerekir. Hidrojele paraformaldehitin dahil edilmesi, probların ve antikorlarındifüzyonuna izin vermek için daha uzun inkübasyon sürelerinin değiş tokuşu ile yapıyı daha da stabilize edebilir 9. Hidrojele formaldehit eklenmesi, bu etki istenmiyorsa, temizleme işlemi sırasında doku şişmesini de önleyebilir11.
Mevcut yöntem özellikle KF hastalarının balgamındaki P. aeruginosa hücrelerini hedef almaktadır. Bu protokole alternatif yöntemler ve modifikasyonlar, diğer bakterilerin görselleştirilmesinin optimizasyonuna rehberlik etmek için düşünülebilir. Türlere ve cinse özgü FISH ve hibridizasyon zincir reaksiyonu (HCR) probları uygulanarak, Staphylococcus aureus, Streptococcus sp. ve Achromobacter xylosoxidans gibi diğer KF patojenleri tanımlanabilir12. Çalışmamızda psödomonal ekzopolisakkarit Psl'yi hedefledik. Aljinat veya Pel dahil olmak üzere diğer hedefler, gelecekteki deneylerde bu ekzopolisakkaritlere özgü floresan antikorlarla incelenebilir. MiPACT yönteminin FISH ve CLSM için antikor boyama ile birlikte uygulanmasının tamamlanması birkaç hafta sürer. Araştırma sorusu balgamın 3 boyutlu uzamsal görselleştirmesi ile ilgili değilse, mevcut bakterileri görselleştirmek için daha hızlı yöntemler vardır. Balgam örneklerinde bakterileri görselleştirmek için kullanılan önceki yöntemler, ince kesitleme veya yayma kullanır ve şunları içerir: FISH18, Gram boyama ve biyofilm ekzopolisakkaritlerin ve bakteri hücrelerinin19,20 görselleştirilmesine izin vermek için birincil antikorlar ve karşı boyalar uygulayan immünohistokimya teknikleri.
Bu tür görüntüleme tekniklerinin gelecekteki birkaç potansiyel uygulaması vardır. Farklı bakteriyel organizmaları ve bunların fagositler gibi konakçı hücrelerle etkileşimini görselleştirme yeteneği, bazı P. aeruginosa suşlarının KF hava yollarından etkili bir şekilde temizlendiğini, diğer suşların ise temizlenmediğini anlamamızı sağlayabilir. Solunum örneklerinde bakteri görüntüleme, antimikrobiyal etkinliğin bir ölçüsü olarak ve yeni anti-biyofilm ilaçlar için bir çalışma sonucu olarak da kullanılabilir21. Ek olarak, P. aeruginosa ile Staphylococcus aureus gibi KF akciğer mikrobiyomundaki diğer organizmalar arasındaki uzamsal ilişkiyi görselleştirmek, pulmoner alevlenmelerin patogenezinde ko-enfeksiyon/kolonizasyonun rolünü ve antibiyotik tedavisine yanıtlarını aydınlatmaya yardımcı olabilir. Bakterilerin in vivo görüntülemesi, ventilatörle ilişkili pnömoniler veya kronik yara enfeksiyonları olanlar da dahil olmak üzere diğer enfeksiyonlara da uygulanabilir22. Böylece elde edilen içgörüler gelecekteki terapötik gelişime rehberlik etmek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hiç kimse.
Acknowledgments
Yazarlar, bu araştırma için fon sağlayan Kistik Fibrozis Vakfı'na ve cömert anti-Psl0096 antikor bağışları için MedImmuno'ya teşekkür etmek istiyor. Bu çalışma için görüntüleme, Toronto Üniversitesi'ndeki CAMiLoD görüntüleme tesisinde gerçekleştirildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 29:1 acrylamide bisacrylamide, 30 % solution | BioRad | 161-0146 | |
| 8-Chambered Coverglass Nunc Lab-Tek | ThermoFischer Scientific | 155411 | |
| Anaerogen2.5L | Oxid Inc. | 35108 | |
| Coverwell perfusion chambers | Electron Microscopry Sciences | 70326 -12/-14 | |
| HistoDenz | Sigma | D2158 | |
| Protect RNA Rnase Inhibitor | Sigma | R7387 | |
| PseaerA - GGTAACCGTCCCCCTTGC | Eurofins | Order Details: Product: Modified DNA Oligo; Name: PseaerA; Sequence: [Alexa488]GGTAACCGTCCCCCTTGC; Synthesis: 50 nmol; Purification: HPLC; Ship state: Full yield (dry) | |
| Psl0096-Texas Red | Medimmune | The Psl0096-Texas red antibodies were a gift kindly provided by Medimmune and the company should be contacted for order inquiries. | |
| VA-044 Hardener | Wako | 27776-21-21 |
References
- Banerjee, D., Stableforth, D. The treatment of respiratory pseudomonas infection in cystic fibrosis: What drug and which way. Drugs. 60 (5), 1053-1064 (2000).
- Rosenfeld, M., Ramsey, B. W., Gibson, R. L. Pseudomonas acquisition in young patients with cystic fibrosis: Pathophysiology, diagnosis, and management. Current Opinion in Pulmonary Medicine. 9 (6), 492-497 (2003).
- Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T. Tolerance and Resistance of Pseudomonas aeruginosa Biofilms to Antimicrobial Agents-How P. aeruginosa Can Escape Antibiotics. Frontiers in Microbiology. 10, 913 (2019).
- Billings, N., et al. The Extracellular Matrix Component Psl Provides Fast-Acting Antibiotic Defense in Pseudomonas aeruginosa Biofilms. PLoS Pathogens. 9 (8), 1003526 (2013).
- Franklin, M. J., Nivens, D. E., Weadge, J. T., Lynne Howell, P. Biosynthesis of the Pseudomonas aeruginosa extracellular polysaccharides, alginate, Pel, and Psl. Frontiers in Microbiology. 2, 167 (2011).
- Yang, L., et al. Polysaccharides serve as scaffold of biofilms formed by mucoid Pseudomonas aeruginosa. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 65 (2), 366-376 (2012).
- Wozniak, D. J., et al. Alginate is not a significant component of the extracellular polysaccharide matrix of PA14 and PAO1 Pseudomonas aeruginosa biofilms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7907-7912 (2003).
- Baker, P., et al. Exopolysaccharide biosynthetic glycoside hydrolases can be utilized to disrupt and prevent Pseudomonas aeruginosa biofilms. Science Advances. 2 (5), 1-9 (2016).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nature Protocols. 10 (11), 1860-1896 (2015).
- DePas, W. H., et al. Exposing the three-dimensional biogeography and metabolic states of pathogens in cystic fibrosis sputum via hydrogel embedding, clearing, and rRNA labeling. mBio. 7 (5), 1-11 (2016).
- Molecular Instruments HCR v3.0 protocol for bacteria in suspension. , Available from: www.molecularinstruments.com 1-6 (2019).
- Murray, M. P., Doherty, C. J., Govan, J. R. W., Hill, A. T. Do processing time and storage of sputum influence quantitative bacteriology in bronchiectasis. Journal of Medical Microbiology. 59 (7), 829-833 (2010).
- Efthimiadis, A., Jayaram, L., Weston, S., Carruthers, S., Hargreave, F. E. Induced sputum: Time from expectoration to processing. European Respiratory Journal. 19 (4), 706-708 (2002).
- Chao, Y., Zhang, T. Optimization of fixation methods for observation of bacterial cell morphology and surface ultrastructures by atomic force microscopy. Applied Microbiology and Biotechnology. 92 (2), 381-392 (2011).
- St-Laurent, J., Boulay, M. E., Prince, P., Bissonnette, E., Boulet, L. P. Comparison of cell fixation methods of induced sputum specimens: An immunocytochemical analysis. Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 36-42 (2006).
- Hogardt, M., et al. Specific and rapid detection by fluorescent situ hybridization of bacteria in clinical samples obtained from cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Microbiology. 38 (2), 818-825 (2000).
- Hoffmann, N., et al. Erratum: Novel mouse model of chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection mimicking cystic fibrosis. Infection and Immunity. 73 (8), 5290 (2005).
- Nair, B., et al. Utility of Gram staining for evaluation of the quality of cystic fibrosis sputum samples. Journal of Clinical Microbiology. 40 (8), 2791-2794 (2002).
- Howlin, R. P., et al. Low-Dose Nitric Oxide as Targeted Anti-biofilm Adjunctive Therapy to Treat Chronic Pseudomonas aeruginosa Infection in Cystic Fibrosis. Molecular Therapy. 25 (9), 2104-2116 (2017).
- Pestrak, M. J., et al. Treatment with the Pseudomonas aeruginosa glycoside hydrolase PslG combats wound infection by improving antibiotic efficacy and host innate immune activity. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (6), 00234 (2019).
