Summary
Dit protocol biedt methoden voor visualisatie van bacteriële cellen en polysaccharidesyntheselocus (Psl) polysaccharide in het sputum van cystische fibrosepatiënten.
Abstract
Vroege opsporing en uitroeiing van Pseudomonas aeruginosa in de longen van patiënten met cystische fibrose kan de kans op het ontwikkelen van een chronische infectie verminderen. De ontwikkeling van chronische P. aeruginosa-infecties gaat gepaard met een afname van de longfunctie en verhoogde morbiditeit. Daarom is er een groot belang bij het ophelderen van de redenen voor het niet uitroeien van P. aeruginosa met antibiotische therapie, die voorkomt bij ongeveer 10-40% van de pediatrische patiënten. Een van de vele factoren die van invloed kunnen zijn op de klaring van P. aeruginosa door de gastheer en de gevoeligheid voor antibiotica, zijn variaties in ruimtelijke organisatie (zoals aggregatie of biofilmvorming) en polysaccharideproductie. Daarom waren we geïnteresseerd in het visualiseren van de in situ kenmerken van P. aeruginosa in het sputum van CF-patiënten. Een weefselopruimingstechniek werd toegepast op sputummonsters na het inbedden van de monsters in een hydrogelmatrix om de 3D-structuren ten opzichte van gastheercellen te behouden. Na het opruimen van het weefsel werden fluorescerende labels en kleurstoffen toegevoegd om visualisatie mogelijk te maken. Fluorescentie in situ hybridisatie werd uitgevoerd voor de visualisatie van bacteriële cellen, binding van fluorescerend gelabelde anti-Psl-antilichamen voor de visualisatie van het exopolysaccharide en DAPI-kleuring om gastheercellen te kleuren om structureel inzicht te verkrijgen. Deze methoden maakten het mogelijk om P. aeruginosa met hoge resolutie in het sputum van CF-patiënten te impliceren via confocale laserscanmicroscopie.
Introduction
In deze studie werden experimenten ontworpen om de in vivo structuur van Pseudomonas aeruginosa in het sputum van pediatrische cystische fibrose (CF) patiënten te visualiseren. P. aeruginosa-infecties worden chronisch bij 30-40% van de pediatrische CF-populatie; Als chronische infecties eenmaal zijn vastgesteld, zijn ze bijna onmogelijk te elimineren1. P. aeruginosa-isolaten van patiënten met een vroege infectie zijn over het algemeen vatbaarder voor antimicrobiële stoffen, daarom worden deze behandeld met antipseudomonale antibiotica om het ontstaan van chronische infectie tevoorkomen2. Helaas worden niet alle P. aeruginosa-isolaten effectief uit de longen verwijderd na antibioticatherapie. De precieze mechanismen die verband houden met antibioticafalen zijn niet volledig opgehelderd. Eerdere studies hebben aangetoond dat variaties in de dichtheid, aggregatie en productie van polysachariden van biofilmcellen de werkzaamheid van antibiotica kunnen beïnvloeden3. P. aeruginosa produceert drie extracellulaire polysachariden: Pel, Psl en alginaat4. De meeste stammen van P. aeruginosa hebben de genetische capaciteit om elk van de exopolysachariden tot expressie te brengen, hoewel vaak één type polysacharide overwegend tot expressie wordt gebracht5. Het exopolysacharide alginaat wordt in verband gebracht met chronische infecties in de CF-long, wat resulteert in een mucoïde fenotype 6,7. De polysachariden Pel en Psl hebben meerdere functies, waaronder het helpen bij de initiële hechting en het behoud van de biofilmstructuur, en het verlenen van antibioticaresistentie8.
Methoden gericht op het visualiseren van in vivo structuren van weefsels zijn ontwikkeld voor een verscheidenheid aan monstertypes 9,10,11. Meer recentelijk zijn ze op maat gemaakt om in vivo microbiële gemeenschappen in sputum van CF-patiënten te visualiseren12. De optimalisatie van een weefselopruimingsprotocol specifiek voor de identificatie van microbiële gemeenschappen in sputum is ontwikkeld door DePas et al., 201612. De term MiPACT, wat staat voor microbial identification after Passive CLARITY technique, werd bedacht voor het opruimen van CF-sputum11,12. Voor weefselopruimingstechnieken worden de monsters eerst gefixeerd en vervolgens transparant gemaakt, terwijl hun inherente architectuur intact blijft voor kleuring en microscopische visualisatie11. Door CF-sputummonsters te fixeren en op te ruimen, kunnen onderzoekers vragen beantwoorden met betrekking tot biofilmstructuur, bacteriële celdichtheid, polymicrobiële associaties en associaties tussen ziekteverwekkers en gastheercellen. Het voordeel van het direct onderzoeken van bacteriën die in het sputum bewaard zijn gebleven, is dat ze kunnen worden geanalyseerd en gevisualiseerd in een gastheerspecifieke context. Hoewel in vitro groei van klinische isolaten in het laboratorium voor experimenten zeer informatief kan zijn, zijn dergelijke methoden niet in staat om de CF-longomgeving volledig na te bootsen, wat resulteert in een discrepantie tussen laboratoriumresultaten en patiëntresultaten.
De hier gepresenteerde methoden kunnen worden gebruikt om sputum te fixeren en te verwijderen om bacteriën te visualiseren, of het nu gaat om CF-patiënten of patiënten met andere luchtweginfecties. Het specifieke type kleuring en microscopische analyse dat hierin wordt beschreven, is fluorescentie in situ hybridisatie (FISH), gevolgd door anti-Psl-antilichaambinding in de hydrogel en daaropvolgende analyse via confocale laserscanningmicroscopie (CLSM). Na weefselopruiming kunnen ook andere immunohistochemie en microscopiemethoden worden toegepast.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Goedkeuring van de Research Ethics Board (REB) is vereist om sputummonsters van menselijke proefpersonen te verzamelen en op te slaan. De hierin gepresenteerde studies zijn goedgekeurd door het Hospital for Sick Children REB#1000058579.
1. Sputum-collectie
- Bewaar slijm in een steriele opvangbeker en bewaar onmiddellijk bij 4 °C gedurende maximaal 24 uur voorafgaand aan de fixatie.
OPMERKING: Als u het sputum te lang op 4 °C laat staan zonder fixatie, kan dit leiden tot cellulaire afbraak, met name afbraak van witte bloedcellen. Zo snel mogelijk fixeren heeft de voorkeur. - Breng de sputummonsters over in een steriele buis van 15 ml.
- Voeg een gelijk volume van 4% paraformaldehyde (PFA) toe aan de sputummonsters. Als het sputummonster bijvoorbeeld 0,5 ml is, voeg dan 0,5 ml 4% PFA toe. Meng door zachte inversie.
- Incubeer het sputum een nacht bij 4 °C.
- Was het monster door 5 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe te voegen aan elke 2 ml vast sputum.
NOTITIE: Er is geen centrifugeren nodig voor deze wasstap. - Verwijder het supernatans voorzichtig met een pipet.
NOTITIE: Vermijd het opzuigen van het sputum met de pipet door de punt van het sputum af te richten en zeer langzaam de oppervlaktevloeistof op te zuigen. De wasstap omvat geen centrifugeren om de structurele integriteit van de sputumpluggen niet te verstoren. - Herhaal stap 1.6-1.7 nog twee keer.
- Resuspendeer de pellet in 2x het volume PBS met 0,01 % (m/v) natriumazide.
- Bewaar het sputum bij 4 °C.
2. MiPACT (tissue clearing technique) verwerking van sputum
- Ontgas de hydrogelcomponenten (30% 29:1 acrylamide:bis-acrylamide, verharder en PBS) in een afgesloten container met een anaërobe verpakking voorafgaand gedurende 72 uur.
NOTITIE: De anaërobe verpakking en de verzegelde container zijn nodig omdat zuurstof de polymerisatie van acrylamide remt. Als alternatief kan zuurstof worden verwijderd door deze stap uit te voeren in een anaërobe kap, door een vacuüm toe te passen op een afgesloten container of doorN2-gas door het acrylamidemengsel te laten borrelen.- Voeg 2 ml van een 30% 29:1 acrylamide:bis-acrylamide-oplossing toe aan een tube van 15 ml met de dop eraf in de afgesloten anaërobe container.
- Maak een geconcentreerde bouillon van 10% (m/v) verharder door 0,5 g verharder toe te voegen aan 5 ml PBS in een tube van 15 ml. Laat de dop van de tube en bewaar in de afgesloten anaërobe container.
- Laat een paar ml steriele PBS in een buisje, met de dop eraf, in de anaërobe container.
- Maak 5 ml hydrogeloplossing met een eindconcentratie van 0,2% verharder en 4% 29:1 acrylamide:bis-acrylamide in PBS in een tube van 15 ml. Meng door inversie en filter steriliseren.
- Haal sputummonsters uit de koelkast en snijd ze vervolgens onder steriele omstandigheden met een scalpel in kleine secties (ongeveer 5 mm in diameter).
OPMERKING: Als het sputum vrij vloeibaar is, kan deze stap nog steeds worden uitgevoerd, maar het vergt meer geduld en oefening om het sputum met een pincet uit de bewaaroplossing te verwijderen voordat u het scalpel gebruikt om de gewenste fracties te scheiden. - Plaats de gesneden sputummonsters in een putje van een dekglaasje met 8 kamers.
- Voeg 300 μL filter gesteriliseerde hydrogeloplossing uit stap 2.2 toe aan elk van de putjes die sputum bevatten.
- Plaats het afdekglas met 8 kamers gedurende 3 uur bij 37 °C in een afgesloten container met een anaërobe verpakking.
OPMERKING: Eenmaal gepolymeriseerd, moet de hydrogel met ingebed sputum de consistentie van stevige gel hebben. - Breng de gestolde hydrogel-sputummonsters over in een kweekbuis van 15 ml met 5 ml 8% natriumdodecylsulfaat (SDS), pH 8, en laat de monsters 3-14 dagen klaren bij 37 °C (met of zonder schudden), totdat het sputum transparant wordt.
OPMERKING: De opruimingstijden zijn afhankelijk van de samenstelling van het sputum en kunnen over het algemeen worden verkort door te schudden. Zorg er echter voor dat u de schudsnelheid niet zodanig verhoogt dat de integriteit van het monster wordt verstoord. Meer DNA-rijke monsters hebben meer tijd nodig om te wissen in vergelijking met slijmrijke monsters. - Doe de 8% SDS-oplossing in een afvalcontainer. Breng met een steriel pincet elk in hydrogel ingebed monster over in een steriele conische buis van 50 ml. Voeg 10 ml PBS toe aan elk van de conische buizen van 50 ml om de hydrogels te wassen en laat de oplossing 30 minuten tot 1 uur intrekken voordat u het decanteert. Herhaal dit nog 2x meer.
NOTITIE: Bij deze wasstap wordt niet gecentrifugeerd. Overtollig vocht en supernatans worden voorzichtig verwijderd met een pipet. - Bewaar gewassen monsters in PBS met 0,01% (m/v) natriumazide en 1x RNaseremmer bij 4 °C.
3. Hydrogel fluorescerende in situ hybridisatie (FISH) protocol
- Haal de hydrogelmonsters met een steriel pincet uit hun bewaaroplossing en plaats de monsters op een steriel oppervlak (zoals een glasplaatje of petrischaal).
- Snijd de hydrogels met een steriel scalpel in plakjes van ~ 1 mm dik.
- Plaats de stukjes hydrogel van 1 mm in steriele buisjes van 1,5 ml.
- Bereid 1 ml de hybridisatiebuffer (25% formamide, 0,9 M NaCl, 20 mM Tris-HCl [pH 7,6], 0,01% SDS, gezuiverd en gedeïoniseerd H2O) in een buisje van 1,5 ml.
- Voeg de fluorescerend gelabelde PseaerA-sonde (150,7 nM12) toe aan de hybridisatiebuffer en meng door inversie.
NOTITIE: Formaline-oplossing moet uit de buurt van open vuur worden gehouden. De hybridisatiebuffer kan vooraf worden bereid en in aliquots bij -20 °C13 worden opgeslagen. - Voeg 200-500 μL hybridisatiebuffer toe aan elk stuk hydrogel van ~1 mm en zorg ervoor dat het hele hydrogelmonster wordt ondergedompeld.
- Laat de PseaerA-sonde hybridiseren met de hydrogelmonsters door ze ~ 18-24 uur in het donker te plaatsen, bij 46 °C, zonder te schudden.
- Decanteer de hybridisatiebuffer in een afvalcontainer.
- Spoel de monsters eenmaal af met een gesteriliseerde wasbuffer met filter (337,5 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA (ethyleendiaminetetra-azijnzuur) [pH 7,2], 0,01% SDS en gezuiverde en gedeïoniseerde H2O) door 1 ml wasbuffer toe te voegen aan elk van de 1,5 ml buizen en deze vervolgens te verwijderen.
NOTITIE: De wasbuffer kan van tevoren worden gemaakt en bij kamertemperatuur (RT) worden bewaard. - Voeg 1 ml verse wasbuffer toe aan de buizen en incubeer de monsters vervolgens gedurende 6 uur in het donker bij 48 °C, zonder te schudden.
4. Hydrogel en Psl0096-antilichaambinding
- Verwijder de wasbuffer steriel met een pipettor van 1 ml.
- Spoel de monsters met een 2% BSA (w/v) in PBS-oplossing door 1 ml van de 2% BSA-oplossing toe te voegen en te verwijderen.
- Voeg 500 μL van de 2% BSA/PBS-oplossing toe aan de hydrogelmonsters om niet-specifieke eiwitbinding te blokkeren. Incubeer de monsters vervolgens 's nachts, in het donker, bij RT, zonder te schudden.
- Verwijder de blokkerende oplossing steriel met behulp van een pipet van 1 ml.
- Bereid de Psl0096-Texas Red-antilichaamoplossing voor door het antilichaam te verdunnen tot een eindconcentratie van 0,112 μg/ml in 500 μL verse 2% BSA/PBS.
- Voeg de 500 μL antilichaamoplossing toe aan de hydrogelmonsters en incubeer ze gedurende 6 uur bij RT, beschermd tegen licht, zonder te schudden.
5. DAPI (4′,6′-diamidino-2-fenylindol) kleuring
- Bereid de brekingsindex-matchingoplossing (RIMS) door 40 g niet-ionisch dichtheidsgradiëntmedium, 30 μl Tween20, 3 μg natriumazide en 30 ml PBS toe te voegen aan een kolf met een magnetische roerstaaf. Roer de oplossing gedurende 15 minuten op een magnetische roerder, of tot het volledig is opgelost.
- Filter steriliseer de oplossing in een conische buis van 50 ml met behulp van een spuit van 10 ml en een steriel filter van 0,2 μm.
OPMERKING: De oplossing kan enkele maanden bij 4 °C worden bewaard. - Verwijder de Psl0096-Texas Red-antilichaamoplossing met een steriele pipet van 1 ml.
- Spoel de hydrogelmonsters af door 1 ml PBS toe te voegen en vervolgens te verwijderen.
- Incubeer de hydrogelmonsters met 250 μL RIMS-oplossing en 10 μg/ml DAPI bij RT met zacht schudden, in het donker, gedurende een nacht.
- Voorafgaand aan confocale beeldvorming monteert u de monsters op perfusiekamers van 0,9 mm of 1,7 mm en sluit u ze af met een glazen dekglaasje.
OPMERKING: Na FISH en/of immunohistochemie en vóór onderdompeling in RIMS kunnen fluorescerende lectinekleuringen worden aangebracht als visualisatie van sputumslijm gewenst is12.
6. Beeldvorming
- Voer confocale laserscanmicroscopiebeeldvorming uit met behulp van standaardtechnieken bij vergrotingen van 25x, 40x, 63x of 100x.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De algemene opzet van het experiment is samengevat in figuur 1 en figuur 2. Figuur 1 geeft een samenvatting van de protocollen voor sputumverwerking en sputumzuivering. Het verwerken en opruimen van sputum kan tot 17 dagen duren. Het protocol kan echter worden gestopt en monsters kunnen worden bewaard na fixatie met PFA (dag 2) of na weefselopruiming (dag 5-17, afhankelijk van de opruimtijd). In figuur 2 zijn de FISH- en antilichaambindingsprotocollen samengevat. De FISH- en antilichaamkleuringsprotocollen nemen 4 dagen in beslag, maar moeten worden voltooid en confocale beelden worden gemaakt zodra ze zijn gestart. Met behulp van de bovenstaande protocollen kunnen 3D-beelden met hoge resolutie van P. aeruginosa-cellen worden verkregen met hun in-situ structuur in sputum gevisualiseerd.
Het verwijderen van sputum en het vervolgens aanbrengen van fluorescerende kleurstoffen die in dit protocol worden gebruikt, maakt een gedetailleerde visualisatie van P. aeruginosa in de monsters mogelijk. De sputummonsters die in figuur 3 en figuur 4 worden getoond, zijn verzameld bij een pediatrische CF-patiënt (17 jaar oud) met een nieuw ontstane P. aeruginosa-infectie. In figuur 3A werd een aggregaat van cellen gezien in een sputummonster; Het verschijnen van geelgroene staafjes was te wijten aan de overlapping van alle drie de fluoroforen. Hoewel we geen celtellingen hebben voor dit sputummonster, vonden we dat de detectielimiet van de sonde 104 cellen/ml was (zie aanvullende figuur 1). In figuur 3B waren individuele staafvormen in het groen te zien van de soortspecifieke binding van de PseaerA-488-sonde aan P. aeruginosa-cellen. Het Psl0096-Texas Red-antilichaam dat in rood wordt gezien, illustreert waar het pseudomonale exopolysaccharide zich in het sputum bevond; in dit geval bleek het Psl0096-antilichaam vooral te overlappen met de P. aeruginosa-cellen (Figuur 3C). Deze methode maakte het ook mogelijk om pseudomonale cellen in het sputum te visualiseren in relatie tot andere bacteriële cellen en gastheerstructuren. In figuur 4 werd een cluster van P. aeruginosa-cellen gefagagocytoseerd in een eukaryote cel en andere kleine kokcelclusters werden in de buurt waargenomen. Het is aangetoond dat het Psl0096-antilichaam ook kan binden aan Psl geproduceerd door planktonische P. aeruginosa (zie aanvullende figuur 2).
Figuur 1: Stroomdiagram ter illustratie van de sputumverwerking en MiPACT-protocollen.
Samengevat wordt sputum gefixeerd voordat het wordt ingebed in een polyacrylamideoplossing. Eenmaal geklaard, kan de hydrogel worden bewaard bij 4 °C of worden gebruikt met het FISH- en antilichaambindingsprotocol. Deze afbeelding is gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Stroomdiagram dat de fluorescentie in situ hybridisatie en antilichaamkleuringsprotocollen aangeeft.
Zodra het sputum volledig is verdwenen binnen de hydrogelmatrix, kunnen kleuringsmethoden worden toegepast. Deze afbeelding is gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Immunofluorescentiebeeld van een sputummonster verzameld bij een patiënt met een vroege P. aeruginosa-infectie ingebed in een hydrogelmatrix.
Het hydrogelmonster werd gehybridiseerd met een PsearA-Alexa488-sonde (groen), een Psl0096-Texas Red-antilichaam (rood) en DAPI (blauw). (A) sputummonster bekeken onder alle 3 kanalen, (B) sputum onder alleen het groene kanaal dat aangeeft waar de PseaerA-488-sonde naartoe gaat, en (C) sputum onder alleen het rode kanaal waar de Psl0096-Texas rode binding plaatsvond. De foto's zijn gemaakt met een vergroting van 100x. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Immunofluorescentiebeeld van een sputummonster verzameld bij een patiënt met een vroege P. aeruginosa-infectie ingebed in een hydrogelmatrix.
Het hydrogelmonster werd gehybridiseerd met een PsearA-Alexa488-sonde (groen), een Psl0096-Texas Red-antilichaam (rood) en DAPI (blauw). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Fluorescentie in situ hybridisatie van een planktoncultuur van PAO1 met de PseaerA-488 sonde. Klik hier om deze afbeelding te downloaden.
Aanvullende figuur 2: P. aeruginosa gekleurd met DAPI en het Psl0096-Texas Red-antilichaam. (A) stam PAO1-Δpsl en (B) stam PAO1. Klik hier om deze afbeelding te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het doel van dit protocol is om een glimp op te vangen van de in-situ organisatie van P. aeruginosa-cellen in sputum van CF-patiënten. Sputummonsters moeten bij 4 °C worden bewaard totdat ze worden verwerkt als ze niet onmiddellijk kunnen worden gefixeerd. Het is aangetoond dat het aantal P. aeruginosa-cellen in sputum niet significant verandert als het wordt verwerkt om 1 uur, 24 uur of 48 uur, wanneer het wordt bewaard bij 4 °C, hoewel het aantal bacteriële cellen aanzienlijk zal toenemen als het gedurende 24 of 48 uur bij 25 °C wordt bewaard als gevolg van bacteriegroei14. Voor dit onderzoek werden sputummonsters bewaard bij 4 °C tot maximaal 24 uur na slijm. Opgemerkt moet worden dat is aangetoond dat het aantal ontstekingscellen in sputum afneemt als het bij 4 °C wordt gelaten en meer dan 9 uur later wordtverwerkt15. Daarom is het belangrijk om rekening te houden met de specifieke cellen en markers die men in sputum wil visualiseren bij het bepalen van een cut-off tijd voor monsterverwerking.
De monsterverwerking bij deze methode begint met de fixatie van sputummonsters in 4 % PFA. Paraformaldehyde zal bacteriële cellen en hun extracellulaire matrix verknopen, waarbij hun structuren behouden blijven voor microscopische visualisatie en analyse11,16. Helaas, als het doel is om het totale aantal cellen op bepaalde ontstekingscellen in sputum te krijgen, is aangetoond dat PFA het aantal van deze cellen verlaagt, dus andere fixeermiddelen moeten worden overwogen17. Een andere beperking van dit onderzoek is dat het tijdrovend kan zijn en meer dan twee weken kan duren om uit te voeren. Het is dus mogelijk dat het niet geschikt is om te worden ontwikkeld tot een diagnostische methode die tijdgevoelige behandelbeslissingen vereist. Bovendien zou deze methode voor het begrijpen van de totale microbiële diversiteit in sputummonsters niet geschikt zijn, maar zou deze kunnen worden gecombineerd met andere microbiële detectiemethoden met een hoge doorvoer, zoals qPCR.
De samenstelling van de acrylamidehydrogel kan worden gewijzigd, afhankelijk van het weefseltype en de toepassing11. Voor onstabiele monsters zoals CF-sputum is het noodzakelijk om structurele ondersteuning te bieden met een 29:1 acrylamide:bis-acrylamidemengsel (in plaats van alleen acrylamide). Het opnemen van paraformaldehyde in de hydrogel kan de structuur verder stabiliseren, met de afweging van langere incubatietijden om diffusie van sondes en antilichamen mogelijk te maken9. Het toevoegen van formaldehyde aan de hydrogel kan ook zwelling van het weefsel tijdens het opruimingsproces voorkomen als dat effect ongewenst is11.
De huidige methode richt zich specifiek op P. aeruginosa-cellen in het sputum van CF-patiënten. Alternatieve methoden en aanpassingen aan dit protocol kunnen worden overwogen om de visualisatie van andere bacteriën te optimaliseren. Door soort- en genusspecifieke FISH- en hybridisatiekettingreactie (HCR)-sondes toe te passen, kunnen andere CF-pathogenen zoals Staphylococcus aureus, Streptococcus sp. en Achromobacter xylosoxidans worden geïdentificeerd12. In onze studie richtten we ons op het pseudomonale exopolysacharide Psl. Andere doelwitten, waaronder alginaat of Pel, kunnen in toekomstige experimenten worden onderzocht met fluorescerende antilichamen die specifiek zijn voor deze exopolysacchariden. Het toepassen van de MiPACT-methode samen met FISH en antilichaamkleuring voor CLSM duurt een paar weken. Als de onderzoeksvraag geen betrekking heeft op de 3-dimensionale ruimtelijke visualisatie van het sputum, zijn er snellere methoden om aanwezige bacteriën te visualiseren. Eerdere methoden die worden gebruikt om bacteriën in sputummonsters te visualiseren, maken gebruik van dunne secties of uitsmeren en omvatten: FISH18, Gram-kleuring en immunohistochemische technieken die primaire antilichamen en tegenvlekken toepassen om de visualisatie van biofilm-exopolysacchariden en bacteriële cellen mogelijk te maken19,20.
Er zijn verschillende mogelijke toekomstige toepassingen van dit soort beeldvormingstechnieken. Het vermogen om verschillende bacteriële organismen en hun interactie met gastheercellen, zoals fagocyten, te visualiseren, kan ons begrip vergroten van waarom sommige P. aeruginosa-stammen effectief uit de CF-luchtwegen worden verwijderd, terwijl andere stammen dat niet zijn. Het beeldvormen van bacteriën in respiratoire monsters kan ook worden gebruikt als een maatstaf voor de antimicrobiële werkzaamheid en als een studieresultaat voor nieuwe anti-biofilmgeneesmiddelen21. Bovendien kan het visualiseren van de ruimtelijke relatie tussen P. aeruginosa en andere organismen binnen het CF-longmicrobioom, zoals Staphylococcus aureus, helpen om de rol van co-infectie/kolonisatie in de pathogenese van pulmonale exacerbaties en hun reactie op antibioticabehandeling op te helderen. In vivo beeldvorming van bacteriën kan ook worden toegepast op andere infecties, waaronder die met beademingsgerelateerde pneumonieën of chronischewondinfecties22. De opgedane inzichten kunnen dus worden gebruikt om toekomstige therapeutische ontwikkeling te sturen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen.
Acknowledgments
De auteurs willen graag de Cystic Fibrosis Foundation bedanken die dit onderzoek financierde en MedImmune voor hun genereuze donatie van anti-Psl0096-antilichamen. Voor deze studie werd beeldvorming uitgevoerd in de CAMiLoD-beeldvormingsfaciliteit van de Universiteit van Toronto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 29:1 acrylamide bisacrylamide, 30 % solution | BioRad | 161-0146 | |
| 8-Chambered Coverglass Nunc Lab-Tek | ThermoFischer Scientific | 155411 | |
| Anaerogen2.5L | Oxid Inc. | 35108 | |
| Coverwell perfusion chambers | Electron Microscopry Sciences | 70326 -12/-14 | |
| HistoDenz | Sigma | D2158 | |
| Protect RNA Rnase Inhibitor | Sigma | R7387 | |
| PseaerA - GGTAACCGTCCCCCTTGC | Eurofins | Order Details: Product: Modified DNA Oligo; Name: PseaerA; Sequence: [Alexa488]GGTAACCGTCCCCCTTGC; Synthesis: 50 nmol; Purification: HPLC; Ship state: Full yield (dry) | |
| Psl0096-Texas Red | Medimmune | The Psl0096-Texas red antibodies were a gift kindly provided by Medimmune and the company should be contacted for order inquiries. | |
| VA-044 Hardener | Wako | 27776-21-21 |
References
- Banerjee, D., Stableforth, D. The treatment of respiratory pseudomonas infection in cystic fibrosis: What drug and which way. Drugs. 60 (5), 1053-1064 (2000).
- Rosenfeld, M., Ramsey, B. W., Gibson, R. L. Pseudomonas acquisition in young patients with cystic fibrosis: Pathophysiology, diagnosis, and management. Current Opinion in Pulmonary Medicine. 9 (6), 492-497 (2003).
- Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T. Tolerance and Resistance of Pseudomonas aeruginosa Biofilms to Antimicrobial Agents-How P. aeruginosa Can Escape Antibiotics. Frontiers in Microbiology. 10, 913 (2019).
- Billings, N., et al. The Extracellular Matrix Component Psl Provides Fast-Acting Antibiotic Defense in Pseudomonas aeruginosa Biofilms. PLoS Pathogens. 9 (8), 1003526 (2013).
- Franklin, M. J., Nivens, D. E., Weadge, J. T., Lynne Howell, P. Biosynthesis of the Pseudomonas aeruginosa extracellular polysaccharides, alginate, Pel, and Psl. Frontiers in Microbiology. 2, 167 (2011).
- Yang, L., et al. Polysaccharides serve as scaffold of biofilms formed by mucoid Pseudomonas aeruginosa. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 65 (2), 366-376 (2012).
- Wozniak, D. J., et al. Alginate is not a significant component of the extracellular polysaccharide matrix of PA14 and PAO1 Pseudomonas aeruginosa biofilms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7907-7912 (2003).
- Baker, P., et al. Exopolysaccharide biosynthetic glycoside hydrolases can be utilized to disrupt and prevent Pseudomonas aeruginosa biofilms. Science Advances. 2 (5), 1-9 (2016).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nature Protocols. 10 (11), 1860-1896 (2015).
- DePas, W. H., et al. Exposing the three-dimensional biogeography and metabolic states of pathogens in cystic fibrosis sputum via hydrogel embedding, clearing, and rRNA labeling. mBio. 7 (5), 1-11 (2016).
- Molecular Instruments HCR v3.0 protocol for bacteria in suspension. , Available from: www.molecularinstruments.com 1-6 (2019).
- Murray, M. P., Doherty, C. J., Govan, J. R. W., Hill, A. T. Do processing time and storage of sputum influence quantitative bacteriology in bronchiectasis. Journal of Medical Microbiology. 59 (7), 829-833 (2010).
- Efthimiadis, A., Jayaram, L., Weston, S., Carruthers, S., Hargreave, F. E. Induced sputum: Time from expectoration to processing. European Respiratory Journal. 19 (4), 706-708 (2002).
- Chao, Y., Zhang, T. Optimization of fixation methods for observation of bacterial cell morphology and surface ultrastructures by atomic force microscopy. Applied Microbiology and Biotechnology. 92 (2), 381-392 (2011).
- St-Laurent, J., Boulay, M. E., Prince, P., Bissonnette, E., Boulet, L. P. Comparison of cell fixation methods of induced sputum specimens: An immunocytochemical analysis. Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 36-42 (2006).
- Hogardt, M., et al. Specific and rapid detection by fluorescent situ hybridization of bacteria in clinical samples obtained from cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Microbiology. 38 (2), 818-825 (2000).
- Hoffmann, N., et al. Erratum: Novel mouse model of chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection mimicking cystic fibrosis. Infection and Immunity. 73 (8), 5290 (2005).
- Nair, B., et al. Utility of Gram staining for evaluation of the quality of cystic fibrosis sputum samples. Journal of Clinical Microbiology. 40 (8), 2791-2794 (2002).
- Howlin, R. P., et al. Low-Dose Nitric Oxide as Targeted Anti-biofilm Adjunctive Therapy to Treat Chronic Pseudomonas aeruginosa Infection in Cystic Fibrosis. Molecular Therapy. 25 (9), 2104-2116 (2017).
- Pestrak, M. J., et al. Treatment with the Pseudomonas aeruginosa glycoside hydrolase PslG combats wound infection by improving antibiotic efficacy and host innate immune activity. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (6), 00234 (2019).
