Summary
Denne protokol tilvejebringer metoder til visualisering af bakterieceller og polysaccharidsyntese locus (Psl) polysaccharid i sputum hos patienter med cystisk fibrose.
Abstract
Tidlig påvisning og udryddelse af Pseudomonas aeruginosa i lungerne hos patienter med cystisk fibrose kan reducere risikoen for at udvikle kronisk infektion. Udviklingen af kroniske P. aeruginosa-infektioner er forbundet med et fald i lungefunktionen og øget sygelighed. Derfor er der stor interesse for at belyse årsagerne til, at det ikke er lykkedes at udrydde P. aeruginosa med antibiotikabehandling, som forekommer hos ca. 10-40% af pædiatriske patienter. En af mange faktorer, der kan påvirke værtsclearance af P. aeruginosa og antibiotikafølsomhed, er variationer i rumlig organisation (såsom aggregering eller biofilmdannelse) og polysaccharidproduktion. Derfor var vi interesserede i at visualisere in situ-egenskaberne ved P. aeruginosa inden for sputum hos CF-patienter. En vævsrensningsteknik blev anvendt på sputumprøver efter indlejring af prøverne i en hydrogelmatrix for at bevare 3D-strukturerne i forhold til værtsceller. Efter vævsrensning blev fluorescerende etiketter og farvestoffer tilsat for at muliggøre visualisering. Fluorescens in situ hybridisering blev udført til visualisering af bakterieceller, binding af fluorescerende mærkede anti-Psl-antistoffer til visualisering af exopolysaccharidet og DAPI-farvning til pletværtsceller for at opnå strukturel indsigt. Disse metoder tillod højopløsningsbilleddannelse af P. aeruginosa i sputum hos CF-patienter via konfokal laserscanningsmikroskopi.
Introduction
I denne undersøgelse blev eksperimenter designet til at visualisere in vivo-strukturen af Pseudomonas aeruginosa inden for sputum hos pædiatriske cystisk fibrose (CF) patienter. P. aeruginosa-infektioner bliver kroniske hos 30-40% af den pædiatriske CF-population; Når kroniske infektioner bliver etableret, er de næsten umulige at fjerne1. P. aeruginosa-isolater fra patienter med tidlig infektion er generelt mere modtagelige for antimikrobielle stoffer, derfor behandles disse med antipseudomonale antibiotika for at forhindre etablering af kronisk infektion2. Desværre fjernes ikke alle P. aeruginosa-isolater effektivt fra lungen efter antibiotikabehandling. De præcise mekanismer forbundet med antibiotikasvigt er ikke blevet fuldt belyst. Tidligere undersøgelser har vist, at variationer i biofilmcelletæthed, aggregering og polysaccharidproduktion kan påvirke antibiotikaeffektiviteten3. P. aeruginosa producerer tre ekstracellulære polysaccharider: Pel, Psl og alginat4. De fleste stammer af P. aeruginosa har den genetiske kapacitet til at udtrykke hver af exopolysacchariderne, selvom ofte en type polysaccharid udtrykkes overvejende5. Exopolysaccharidalginatet er forbundet med kroniske infektioner i CF-lungen, hvilket resulterer i en mucoid fænotype 6,7. Polysacchariderne Pel og Psl har flere funktioner, herunder medvirken til indledende vedhæftning og vedligeholdelse af biofilmstruktur og tildeling af antibiotikaresistens8.
Der er udviklet metoder til visualisering af in vivo-strukturer i væv for en række prøvetyper 9,10,11. For nylig er de blevet skræddersyet til at visualisere in vivo mikrobielle samfund inden for sputum fra CF-patienter12. Optimeringen af en vævsrensningsprotokol specifikt til identifikation af mikrobielle samfund inden for sputum blev udviklet af DePas et al., 201612. Udtrykket MiPACT, som står for microbial identifikation efter Passive CLARITY technique blev opfundet til clearing af CF sputum11,12. For vævsrensningsteknikker fastgøres prøverne først og gøres derefter gennemsigtige, mens deres iboende arkitektur forbliver intakt til farvning og mikroskopisk visualisering11. Fastgørelse og rydning af CF-sputumprøver giver forskere mulighed for at besvare spørgsmål relateret til biofilmstruktur, bakteriel celletæthed, polymikrobielle foreninger og foreninger mellem patogener og værtsceller. Fordelen ved direkte at undersøge bakterier, der er bevaret i spyttet, er, at de kan analyseres og visualiseres i en værtsspecifik sammenhæng. Selvom in vitro-vækst af kliniske isolater i laboratoriet til forsøg kan være meget informativ, er sådanne metoder ikke i stand til fuldt ud at genskabe CF-lungemiljøet, hvilket resulterer i en afbrydelse mellem laboratorieresultater og patientresultater.
De metoder, der præsenteres her, kan bruges til at fikse og rydde sputum for at visualisere bakterier, hvad enten det er fra CF-patienter eller patienter med andre luftvejsinfektioner. Den specifikke type farvning og mikroskopisk analyse beskrevet heri er fluorescens in situ hybridisering (FISH), efterfulgt af anti-Psl-antistofbinding i hydrogelen og efterfølgende analyse via konfokal laserscanningsmikroskopi (CLSM). Efter vævsrensning kan andre immunhistokemiske og mikroskopiske metoder også anvendes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forskningsetisk Råd (REB) godkendelse er påkrævet for at indsamle og opbevare sputumprøver fra mennesker. Undersøgelser, der præsenteres heri, blev godkendt af Hospital for Sick Children REB#1000058579.
1. Opsamling af sputum
- Ekspektoreret sputum opbevares i et sterilt opsamlingsbæger og opbevares straks ved 4 °C i højst 24 timer inden fikseringen.
BEMÆRK: Hvis spyttet efterlades for længe ved 4 °C uden fiksering, kan det føre til cellulær nedbrydning, især nedbrydning af hvide blodlegemer. Fastgørelse så hurtigt som muligt foretrækkes. - Overfør sputumprøverne til et sterilt 15 ml rør.
- Tilsæt et lige så stort volumen 4% paraformaldehyd (PFA) til sputumprøverne. For eksempel, hvis sputumprøven er 0,5 ml, tilsættes 0,5 ml 4% PFA. Bland ved blid inversion.
- Sputummet inkuberes natten over ved 4 °C.
- Prøven vaskes ved at tilsætte 5 ml fosfatbufret saltvand (PBS) til hver 2 ml fast spyt.
BEMÆRK: Der kræves ingen centrifugering til dette vasketrin. - Supernatanten fjernes forsigtigt med en pipette.
BEMÆRK: Undgå at suge spyttet op med pipetten ved at pege spidsen væk fra sputummet og meget langsomt opsuge overfladevæsken. Vasketrinnet involverer ikke centrifugering for ikke at forstyrre sputumproppernes strukturelle integritet. - Gentag trin 1.6-1.7 to gange mere.
- Pellet resuspenderes i 2x volumenet PBS med 0,01 % (w/v) natriumazid.
- Opbevar spyttet ved 4 °C.
2. MiPACT (vævsrensningsteknik) behandling af sputum
- Afgasning af hydrogelkomponenterne (30% 29: 1 acrylamid: bis-acrylamid, hårdner og PBS) i en forseglet beholder indeholdende en anaerob pakning inden 72 timer.
BEMÆRK: Den anaerobe pakke og forseglede beholder er nødvendige, fordi ilt hæmmer acrylamidpolymerisation. Alternativt kan ilt fjernes ved at udføre dette trin i en anaerob hætte, ved at påføre et vakuum på en forseglet beholder eller ved at bobleN2-gas gennem acrylamidblandingen.- Tilsæt 2 ml af en 30% 29:1 acrylamid:bis-acrylamidopløsning til et 15 ml rør med hætten af inde i den forseglede anaerobe beholder.
- Lav en koncentreret bestand på 10% (w / v) hærder ved at tilsætte 0,5 g hærder til 5 ml PBS i et 15 ml rør. Lad hætten stå af røret og opbevar i den forseglede anaerobe beholder.
- Efterlad et par ml steril PBS i et rør med hætten af inde i den anaerobe beholder.
- Lav 5 ml opløsning af hydrogel med en slutkoncentration på 0,2% hærder og 4% 29: 1 acrylamid: bis-acrylamid i PBS i et 15 ml rør. Bland ved inversion og filtrer steriliser.
- Fjern sputumprøver fra køleskabet, og skær derefter i små sektioner (ca. 5 mm i diameter) under sterile forhold med en skalpel.
BEMÆRK: Hvis sputummet er ret flydende, kan dette trin stadig udføres, men det kræver øget tålmodighed og øvelse at fjerne sputumet fra opbevaringsopløsningen med pincet, inden skalpellen bruges til at adskille de ønskede fraktioner. - Anbring de skårne sputumprøver inde i en brønd på et 8-kammers dækglasglas.
- Der tilsættes 300 μL filtersteriliseret hydrogelopløsning fra trin 2.2 til hver af hullerne, der indeholder sputum.
- Dækglasset med 8 kamre anbringes i en forseglet beholder indeholdende en anaerob pakning i 3 timer ved 37 °C.
BEMÆRK: Når hydrogelen er polymeriseret, skal den med indlejret sputum være konsistensen af fast gel. - Overfør de størknede hydrogelsputumprøver til et 15 ml kulturrør indeholdende 5 ml 8% natriumdodecylsulfat (SDS), pH 8, og lad prøverne klare i 3-14 dage ved 37 ° C (med eller uden omrystning), indtil sputumet bliver gennemsigtigt.
BEMÆRK: Clearingstider afhænger af sputumsammensætning og kan generelt reduceres ved omrystning. Pas dog på ikke at øge rystehastigheden til det punkt, at det forstyrrer prøvens integritet. Flere DNA-rige prøver tager længere tid at rydde sammenlignet med slimrige prøver. - Dekanter 8% SDS-opløsningen i en affaldsindsamlingsbeholder. Ved hjælp af sterile pincetter overføres hver hydrogelindlejret prøve til et sterilt 50 ml konisk rør. Tilsæt 10 ml PBS til hvert af de 50 ml koniske rør for at vaske hydrogelerne, og lad opløsningen sidde i 30 minutter til 1 time før dekantering. Gentag dette 2x flere gange.
BEMÆRK: Dette vasketrin involverer ikke centrifugering. Overskydende væske og supernatant fjernes forsigtigt med en pipette. - Opbevar vaskede prøver i PBS med 0,01 % (w/v) natriumazid og 1x RNase-hæmmer ved 4 °C.
3. Hydrogel fluorescerende in situ hybridisering (FISH) protokol
- Fjern hydrogelprøverne fra deres opbevaringsopløsning ved hjælp af sterile pincetter og anbring prøverne på en steril overflade (såsom et glasglas eller petriskål).
- Brug en steril skalpel til at skære hydrogelerne i ~ 1 mm tykke skiver.
- Anbring 1 mm sektioner af hydrogel inde i sterile 1,5 ml rør.
- Forbered 1 ml hybridiseringsbufferen (25% formamid, 0,9 M NaCl, 20 mM Tris-HCl [pH 7,6], 0,01% SDS, renset og deioniseret H2O) i et 1,5 ml rør.
- Tilsæt den fluorescerende mærkede PseaerA-sonde (150,7 nM12) til hybridiseringsbufferen og bland ved inversion.
BEMÆRK: Formalinopløsning skal holdes væk fra åben ild. Hybridiseringsbufferen kan fremstilles i avanceret og opbevares i alikvoter ved -20 °C13. - Der tilsættes 200-500 μL hybridiseringsbuffer til hver ~1 mm sektion hydrogel, og sørg for, at hele hydrogelprøven er nedsænket.
- Lad PseaerA-sonden hybridisere med hydrogelprøverne ved at placere dem i mørke i ~ 18-24 timer ved 46 °C uden at ryste.
- Dekanter hybridiseringsbufferen i en affaldsindsamlingsbeholder.
- Skyl prøverne en gang med filtersteriliseret vaskebuffer (337,5 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA (ethylendiamintetraeddikesyre) [pH 7,2], 0,01% SDS og renset og deioniseret H2O) ved at tilføje 1 ml vaskebuffer til hvert af de 1,5 ml rør og fjern det derefter.
BEMÆRK: Vaskebufferen kan laves på forhånd og opbevares ved stuetemperatur (RT). - Der tilsættes 1 ml friskvaskebuffer til glassene, og prøverne inkuberes derefter mørkt i 6 timer ved 48 °C uden omrystning.
4. Hydrogel og Psl0096 antistofbinding
- Fjern vaskebufferen sterilt med en 1 ml pipettor.
- Prøverne skylles med en 2% BSA (w/v) i PBS-opløsning ved at tilsætte og fjerne 1 ml af 2% BSA-opløsningen.
- Der tilsættes 500 μL af 2% BSA/PBS-opløsningen til hydrogelprøverne for at blokere uspecifik proteinbinding. Derefter inkuberes prøverne natten over, i mørke, ved RT uden at ryste.
- Fjern blokeringsopløsningen sterilt med en 1 ml pipette.
- Forbered Psl0096-Texas Red antistofopløsningen ved at fortynde antistoffet til en slutkoncentration på 0,112 μg/ml i 500 μL frisk 2% BSA/PBS.
- Der tilsættes 500 μL antistofopløsning til hydrogelprøverne og inkuberes ved RT i 6 timer, beskyttet mod lys, uden omrystning.
5. DAPI (4′,6′-diamidino-2-phenylindol) farvning
- Der fremstilles en opløsning af brydningsindeksmatchning (RIMS) ved at tilsætte 40 g ikke-ionisk densitetsgradientmedium, 30 μL Tween20, 3 μg natriumazid og 30 ml PBS til en kolbe indeholdende en magnetisk omrøringsstang. Opløsningen omrøres i 15 minutter på en magnetomrører, eller indtil den er helt opløst.
- Filtersteriliser opløsningen i et 50 ml konisk rør ved hjælp af en 10 ml sprøjte og et sterilt 0,2 μm filter.
BEMÆRK: Opløsningen kan opbevares ved 4 °C i flere måneder. - Fjern Psl0096-Texas Red antistofopløsningen med en steril 1 ml pipette.
- Hydrogelprøverne skylles ved at tilsætte og derefter fjerne 1 ml PBS.
- Hydrogelprøverne inkuberes med 250 μL RIMS-opløsning og 10 μg/ml DAPI ved RT under forsigtig omrystning i mørke natten over.
- Før konfokal billeddannelse monteres prøverne på 0,9 mm eller 1,7 mm perfusionskamre og forsegles med et glasdæksel.
BEMÆRK: Efter FISH og/eller immunhistokemi og før nedsænkning i RIMS kan fluorescerende lektinpletter påføres, hvis visualisering af sputumslimhinde ønskes12.
6. Billedbehandling
- Udfør konfokal laserscanningsmikroskopibilleddannelse ved hjælp af standardteknikker ved 25x, 40x, 63x eller 100x forstørrelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eksperimentets overordnede design er opsummeret i figur 1 og figur 2. Figur 1 giver et resumé af sputumbehandlings- og sputumrydningsprotokollerne. Sputumbehandling og rydning kan tage op til 17 dage. Protokollen kan dog stoppes, og prøver kan opbevares efter fiksering med PFA (dag 2) eller efter vævsrydning (dag 5-17 afhængigt af clearingtid). I figur 2 opsummeres FISH- og antistofbindingsprotokollerne. FISH- og antistoffarvningsprotokollerne tager 4 dage at gennemføre, men skal udfyldes og konfokale billeder tages, når de er startet. Ved hjælp af ovenstående protokoller kan 3D-billeder i høj opløsning af P. aeruginosa-celler opnås med deres in-situ-struktur inden for sputum visualiseret.
Rydning af sputum og efterfølgende påføring af fluorescerende pletter, der anvendes i denne protokol, muliggør detaljeret visualisering af P. aeruginosa i prøverne. Sputumprøverne vist i figur 3 og figur 4 blev indsamlet fra en pædiatrisk CF-patient (17 år) med en nyopstået P. aeruginosa-infektion. I figur 3A blev der set et aggregat af celler inden for en sputumprøve; Udseendet af gulgrønne stænger skyldtes overlapningen af alle tre fluoroforer. Selvom vi ikke har celletal for denne sputumprøve, fandt vi, at sondedetektionsgrænsen var 104 celler / ml (se supplerende figur 1). I figur 3B blev individuelle stavformer set i grønt fra den artsspecifikke binding af PseaerA-488-sonden til P. aeruginosa-celler. Psl0096-Texas Red antistof set i rødt illustrerer, hvor pseudomonal exopolysaccharid var placeret i sputummet; i dette tilfælde syntes Psl0096-antistoffet at overlappe mest med P. aeruginosa-cellerne (figur 3C). Denne metode tillod også visualisering af pseudomonale celler i sputumet i forhold til andre bakterieceller og værtsstrukturer. I figur 4 blev en klynge af P. aeruginosa-celler set fagocytoseret i en eukaryot celle, og andre små kokcelleklynger blev observeret i nærheden. Det er blevet påvist, at Psl0096-antistoffet også kan binde til Psl-produceret form planktonisk P. aeruginosa (se supplerende figur 2).
Figur 1: Flowdiagram, der illustrerer sputumbehandling og MiPACT-protokoller.
Sammenfattende fikseres sputum, inden det indlejres i en polyacrylamidopløsning. Når hydrogelen er renset, kan den enten opbevares ved 4 °C eller anvendes sammen med FISH- og antistofbindingsprotokollen. Dette billede blev oprettet med BioRender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Flowdiagram, der angiver fluorescensen in situ hybridisering og antistoffarvningsprotokoller.
Når sputumet er helt ryddet inden for hydrogelmatrixen, kan farvningsmetoder påføres. Dette billede blev oprettet med BioRender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Immunofluorescensbillede af en sputumprøve indsamlet fra en patient med en tidlig P. aeruginosa-infektion indlejret i en hydrogelmatrix.
Hydrogelprøven blev hybridiseret med en PsearA-Alexa488-sonde (grøn), et Psl0096-Texas rødt antistof (rød) og DAPI (blå). (A) sputumprøve set under alle 3 kanaler, (B) sputum under kun den grønne kanal, der angiver, hvor PseaerA-488-sonden bundt, og (C) sputum under kun den røde kanal, hvor Psl0096-Texas rød binding opstod. Billeder blev taget ved 100x forstørrelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Immunofluorescensbillede af en sputumprøve indsamlet fra en patient med en tidlig P. aeruginosa-infektion indlejret i en hydrogelmatrix.
Hydrogelprøven blev hybridiseret med en PsearA-Alexa488-sonde (grøn), et Psl0096-Texas rødt antistof (rød) og DAPI (blå). Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1: Fluorescens in situ hybridisering af en planktonkultur af PAO1 med PseaerA-488 sonden. Klik her for at downloade denne figur.
Supplerende figur 2: P. aeruginosa farvet med DAPI og Psl0096-Texas Red antistof. (A) stamme PAO1-Δpsl og (B) stamme PAO1. Klik her for at downloade denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Formålet med denne protokol er at give et indblik i in-situ organisationen af P. aeruginosa-celler i sputum fra CF-patienter. Sputumprøver skal opbevares ved 4 °C, indtil de er behandlet, hvis de ikke umiddelbart kan fikseres. Det er blevet påvist, at P. aeruginosa-celleantallet i sputum ikke ændres signifikant, hvis det behandles ved 1 time, 24 timer eller 48 timer, når det opbevares ved 4 ° C, men hvis det efterlades ved 25 ° C i 24 eller 48 timer, vil bakteriecelletal stige betydeligt som følge af bakterievækst14. Til denne undersøgelse blev sputumprøver opbevaret ved 4 ° C op til maksimalt 24 timer efter ekspektorering. Det skal bemærkes, at inflammatoriske celletal har vist sig at falde i sputum, hvis de efterlades ved 4 °C og behandles mere end 9 timer senere15. Derfor er det vigtigt at overveje de specifikke celler og markører, man ønsker at visualisere i sputum, når man beslutter sig for en skæringstid for prøvebehandling.
Prøvebehandling ved denne metode begynder med fiksering af sputumprøver i 4 % PFA. Paraformaldehyd vil tværbinde bakterieceller og deres ekstracellulære matrix og bevare deres strukturer til mikroskopisk visualisering og analyse11,16. Desværre, hvis målet er at få total celletælling på visse inflammatoriske celler i sputum, har PFA vist sig at reducere antallet af disse celler, så andre fikseringsmidler bør overvejes17. En anden begrænsning ved denne undersøgelse er, at det kan være tidskrævende og kan tage over to uger at udføre. Det er således muligvis ikke egnet til udvikling til en diagnostisk metode, der kræver tidsfølsomme behandlingsbeslutninger. For at forstå den samlede mikrobielle mangfoldighed inden for sputumprøver ville denne metode desuden ikke være egnet, men kunne parres med andre mikrobielle detektionsmetoder med høj kapacitet, såsom en qPCR.
Sammensætningen af acrylamidhydrogelen kan ændres afhængigt af vævstype og anvendelse11. For ustabile prøver som CF-sputum er det nødvendigt at yde strukturel støtte med en 29: 1 acrylamid: bis-acrylamidblanding (i stedet for kun acrylamid). Inkludering af paraformaldehyd i hydrogelen kan yderligere stabilisere strukturen med afvejning af længere inkubationstider for at tillade diffusion af sonder og antistoffer9. Tilsætning af formaldehyd til hydrogelen kan også forhindre vævshævelse under clearingprocessen, hvis denne virkning er uønsket11.
Den nuværende metode er specifikt rettet mod P. aeruginosa-celler i sputum hos CF-patienter. Alternative metoder og modifikationer til denne protokol kan overvejes for at guide optimering af visualisering af andre bakterier. Ved at anvende arts- og slægtsspecifikke FISH- og hybridiseringskædereaktionsprober (HCR) kan andre CF-patogener såsom Staphylococcus aureus, Streptococcus sp. og Achromobacter xylosoxidaner identificeres12. I vores undersøgelse målrettede vi det pseudomonale exopolysaccharid Psl. Andre mål, herunder alginat eller Pel, kan undersøges med fluorescerende antistoffer, der er specifikke for disse exopolysaccharider i fremtidige forsøg. Anvendelse af MiPACT-metoden sammen med FISH og antistoffarvning til CLSM tager et par uger at gennemføre. Hvis forskningsspørgsmålet ikke vedrører den 3-dimensionelle rumlige visualisering af sputummet, er der hurtigere metoder til at visualisere bakterier til stede. Tidligere metoder, der anvendes til at visualisere bakterier i sputumprøver, bruger tynd sektionering eller udtværing og inkluderer: FISH18, Gram-plet og immunhistokemiske teknikker, der anvender primære antistoffer og modpletter for at muliggøre visualisering af biofilm exopolysaccharider og bakterieceller 19,20.
Der er flere potentielle fremtidige anvendelser af disse typer billeddannelsesteknikker. Evnen til at visualisere forskellige bakterielle organismer og deres interaktion med værtsceller, såsom fagocytter, kan fremme vores forståelse af, hvorfor nogle P. aeruginosa-stammer effektivt ryddes fra CF-luftveje, mens andre stammer ikke er. Billeddannende bakterier i respiratoriske prøver kan også anvendes som et mål for antimikrobiel effekt og som et undersøgelsesresultat for nye antibiofilmlægemidler21. Derudover kan visualisering af det rumlige forhold mellem P. aeruginosa og andre organismer inden for CF-lungemikrobiomet, såsom Staphylococcus aureus, bidrage til at belyse rollen som co-infektion / kolonisering i patogenesen af lungeeksacerbationer og deres reaktion på antibiotikabehandling. In vivo-billeddannelse af bakterier kan også anvendes på andre infektioner, herunder dem med respiratorassocierede lungebetændelser eller kroniske sårinfektioner22. De opnåede indsigter kan således bruges til at styre den fremtidige terapeutiske udvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende Cystic Fibrosis Foundation, der gav finansiering til denne forskning og MedImmune for deres generøse donation af anti-Psl0096 antistoffer. Til denne undersøgelse blev billeddannelse udført på CAMiLoD-billeddannelsesanlægget ved University of Toronto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 29:1 acrylamide bisacrylamide, 30 % solution | BioRad | 161-0146 | |
| 8-Chambered Coverglass Nunc Lab-Tek | ThermoFischer Scientific | 155411 | |
| Anaerogen2.5L | Oxid Inc. | 35108 | |
| Coverwell perfusion chambers | Electron Microscopry Sciences | 70326 -12/-14 | |
| HistoDenz | Sigma | D2158 | |
| Protect RNA Rnase Inhibitor | Sigma | R7387 | |
| PseaerA - GGTAACCGTCCCCCTTGC | Eurofins | Order Details: Product: Modified DNA Oligo; Name: PseaerA; Sequence: [Alexa488]GGTAACCGTCCCCCTTGC; Synthesis: 50 nmol; Purification: HPLC; Ship state: Full yield (dry) | |
| Psl0096-Texas Red | Medimmune | The Psl0096-Texas red antibodies were a gift kindly provided by Medimmune and the company should be contacted for order inquiries. | |
| VA-044 Hardener | Wako | 27776-21-21 |
References
- Banerjee, D., Stableforth, D. The treatment of respiratory pseudomonas infection in cystic fibrosis: What drug and which way. Drugs. 60 (5), 1053-1064 (2000).
- Rosenfeld, M., Ramsey, B. W., Gibson, R. L. Pseudomonas acquisition in young patients with cystic fibrosis: Pathophysiology, diagnosis, and management. Current Opinion in Pulmonary Medicine. 9 (6), 492-497 (2003).
- Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T. Tolerance and Resistance of Pseudomonas aeruginosa Biofilms to Antimicrobial Agents-How P. aeruginosa Can Escape Antibiotics. Frontiers in Microbiology. 10, 913 (2019).
- Billings, N., et al. The Extracellular Matrix Component Psl Provides Fast-Acting Antibiotic Defense in Pseudomonas aeruginosa Biofilms. PLoS Pathogens. 9 (8), 1003526 (2013).
- Franklin, M. J., Nivens, D. E., Weadge, J. T., Lynne Howell, P. Biosynthesis of the Pseudomonas aeruginosa extracellular polysaccharides, alginate, Pel, and Psl. Frontiers in Microbiology. 2, 167 (2011).
- Yang, L., et al. Polysaccharides serve as scaffold of biofilms formed by mucoid Pseudomonas aeruginosa. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 65 (2), 366-376 (2012).
- Wozniak, D. J., et al. Alginate is not a significant component of the extracellular polysaccharide matrix of PA14 and PAO1 Pseudomonas aeruginosa biofilms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7907-7912 (2003).
- Baker, P., et al. Exopolysaccharide biosynthetic glycoside hydrolases can be utilized to disrupt and prevent Pseudomonas aeruginosa biofilms. Science Advances. 2 (5), 1-9 (2016).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nature Protocols. 10 (11), 1860-1896 (2015).
- DePas, W. H., et al. Exposing the three-dimensional biogeography and metabolic states of pathogens in cystic fibrosis sputum via hydrogel embedding, clearing, and rRNA labeling. mBio. 7 (5), 1-11 (2016).
- Molecular Instruments HCR v3.0 protocol for bacteria in suspension. , Available from: www.molecularinstruments.com 1-6 (2019).
- Murray, M. P., Doherty, C. J., Govan, J. R. W., Hill, A. T. Do processing time and storage of sputum influence quantitative bacteriology in bronchiectasis. Journal of Medical Microbiology. 59 (7), 829-833 (2010).
- Efthimiadis, A., Jayaram, L., Weston, S., Carruthers, S., Hargreave, F. E. Induced sputum: Time from expectoration to processing. European Respiratory Journal. 19 (4), 706-708 (2002).
- Chao, Y., Zhang, T. Optimization of fixation methods for observation of bacterial cell morphology and surface ultrastructures by atomic force microscopy. Applied Microbiology and Biotechnology. 92 (2), 381-392 (2011).
- St-Laurent, J., Boulay, M. E., Prince, P., Bissonnette, E., Boulet, L. P. Comparison of cell fixation methods of induced sputum specimens: An immunocytochemical analysis. Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 36-42 (2006).
- Hogardt, M., et al. Specific and rapid detection by fluorescent situ hybridization of bacteria in clinical samples obtained from cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Microbiology. 38 (2), 818-825 (2000).
- Hoffmann, N., et al. Erratum: Novel mouse model of chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection mimicking cystic fibrosis. Infection and Immunity. 73 (8), 5290 (2005).
- Nair, B., et al. Utility of Gram staining for evaluation of the quality of cystic fibrosis sputum samples. Journal of Clinical Microbiology. 40 (8), 2791-2794 (2002).
- Howlin, R. P., et al. Low-Dose Nitric Oxide as Targeted Anti-biofilm Adjunctive Therapy to Treat Chronic Pseudomonas aeruginosa Infection in Cystic Fibrosis. Molecular Therapy. 25 (9), 2104-2116 (2017).
- Pestrak, M. J., et al. Treatment with the Pseudomonas aeruginosa glycoside hydrolase PslG combats wound infection by improving antibiotic efficacy and host innate immune activity. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (6), 00234 (2019).
