Summary
Denne protokollen gir metoder for visualisering av bakterieceller og polysakkaridsynteselokus (Psl) polysakkarid i sputum hos pasienter med cystisk fibrose.
Abstract
Tidlig påvisning og utryddelse av Pseudomonas aeruginosa i lungene hos pasienter med cystisk fibrose kan redusere sjansen for å utvikle kronisk infeksjon. Utviklingen av kroniske P. aeruginosa-infeksjoner er forbundet med nedsatt lungefunksjon og økt morbiditet. Derfor er det stor interesse for å belyse årsakene til manglende utryddelse av P. aeruginosa med antibiotikabehandling som forekommer hos ca. 10-40% av pediatriske pasienter. En av mange faktorer som kan påvirke vertsclearance av P. aeruginosa og antibiotikafølsomhet er variasjoner i romlig organisering (som aggregering eller biofilmdannelse) og polysakkaridproduksjon. Derfor var vi interessert i å visualisere in situ-karakteristikkene til P. aeruginosa i sputum hos CF-pasienter. En vevsryddingsteknikk ble brukt på sputumprøver etter å ha lagt prøvene inn i en hydrogelmatrise for å beholde 3D-strukturer i forhold til vertsceller. Etter fjerning av vev ble fluorescerende etiketter og fargestoffer tilsatt for å tillate visualisering. Fluorescens in situ hybridisering ble utført for visualisering av bakterieceller, binding av fluorescerende merkede anti-Psl-antistoffer for visualisering av eksopolysakkarid og DAPI-farging for å flekke vertsceller for å oppnå strukturell innsikt. Disse metodene tillot høyoppløselig avbildning av P. aeruginosa i sputum hos CF-pasienter via konfokal laserskanningsmikroskopi.
Introduction
I denne studien ble eksperimenter designet for å visualisere in vivo-strukturen til Pseudomonas aeruginosa i sputum hos pediatriske pasienter med cystisk fibrose (CF). P. aeruginosa-infeksjoner blir kroniske hos 30-40% av den pediatriske CF-populasjonen; Når kroniske infeksjoner blir etablert, er de nesten umulige å eliminere1. P. aeruginosa-isolater fra pasienter med tidlig infeksjon er generelt mer utsatt for antimikrobielle midler, derfor behandles disse med antipseudomonale antibiotika for å forhindre etablering av kronisk infeksjon2. Dessverre fjernes ikke alle P. aeruginosa-isolater effektivt fra lungene etter antibiotikabehandling. De nøyaktige mekanismene knyttet til antibiotikasvikt er ikke fullstendig klarlagt. Tidligere studier har vist at variasjoner i biofilmcelletetthet, aggregering og polysakkaridproduksjon kan påvirke antibiotikaeffekt3. P. aeruginosa produserer tre ekstracellulære polysakkarider: Pel, PSL og alginat4. De fleste stammer av P. aeruginosa har genetisk kapasitet til å uttrykke hvert av eksopolysakkaridene, men ofte uttrykkes en type polysakkarid overveiende5. Eksopolysakkaridalginatet er assosiert med kroniske infeksjoner i CF-lungen, noe som resulterer i en mucoid fenotype 6,7. Polysakkaridene Pel og Psl har flere funksjoner, inkludert å hjelpe innledende vedlegg og vedlikehold av biofilmstruktur, og gi antibiotikaresistens8.
Metoder rettet mot å visualisere in vivo strukturer av vev er utviklet for en rekke prøvetyper 9,10,11. Mer nylig har de blitt skreddersydd for å visualisere in vivo mikrobielle samfunn i sputum fra CF-pasienter12. Optimaliseringen av en vevsryddingsprotokoll spesielt for identifisering av mikrobielle samfunn i sputum ble utviklet av DePas et al., 201612. Begrepet MiPACT, som står for microbial iidentifikasjon etter Passive CLARITY technique ble laget for clearing av CF sputum11,12. For vevsryddingsteknikker blir prøvene først fiksert, deretter gjort gjennomsiktige mens de lar sin iboende arkitektur være intakt for farging og mikroskopisk visualisering11. Fiksering og rydding av CF-sputumprøver tillater forskere å svare på spørsmål relatert til biofilmstruktur, bakteriell celletetthet, polymikrobielle foreninger og foreninger mellom patogener og vertsceller. Fordelen med å direkte undersøke bakterier som har blitt bevart i sputumet er at de kan analyseres og visualiseres i en vertsspesifikk sammenheng. Selv om in vitro vekst av kliniske isolater i laboratoriet for eksperimentering kan være svært informativ, er slike metoder ikke i stand til å gjenskape CF-lungemiljøet fullt ut, noe som resulterer i en frakobling mellom laboratorieresultater og pasientutfall.
Metodene som presenteres her kan brukes til å fikse og fjerne sputum for å visualisere bakterier, enten fra CF-pasienter eller pasienter med andre luftveisinfeksjoner. Den spesifikke typen farging og mikroskopisk analyse beskrevet her er fluorescens in situ hybridisering (FISH), etterfulgt av anti-Psl-antistoffbinding i hydrogelen, og påfølgende analyse via konfokal laserskanningsmikroskopi (CLSM). Etter vevsfjerning kan også andre immunhistokjemiske og mikroskopiske metoder anvendes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Det kreves godkjenning fra Research Ethics Board (REB) for å samle inn og lagre sputumprøver fra mennesker. Studier presentert her ble godkjent av Hospital for Sick Children REB#1000058579.
1. Sputum samling
- Oppbevar ekspektorert sputum i et sterilt oppsamlingskopp og oppbevar umiddelbart ved 4 °C i maksimalt 24 timer før fiksering.
Hvis du lar sputumet stå for lenge ved 4 °C uten fiksering, kan det føre til cellulær nedbrytning, spesielt nedbrytning av hvite blodlegemer. Fiksering så snart som mulig foretrekkes. - Overfør sputumprøvene til et sterilt 15 ml rør.
- Tilsett et likt volum på 4% paraformaldehyd (PFA) til sputumprøvene. For eksempel, hvis sputumprøven er 0,5 ml, tilsett 0,5 ml 4% PFA. Bland med forsiktig inversjon.
- Inkuber sputumet over natten ved 4 °C.
- Vask prøven ved å tilsette 5 ml fosfatbufret saltvann (PBS) til hver 2 ml fast sputum.
NOTAT: Det er ingen sentrifugering nødvendig for dette vasketrinnet. - Fjern forsiktig supernatanten med en pipette.
MERK: Unngå å suge opp sputumet med pipetten ved å peke spissen bort fra sputumet og aspirere veldig sakte av overflatevæsken. Vasketrinnet innebærer ikke sentrifugering for ikke å forstyrre den strukturelle integriteten til sputumpluggene. - Gjenta trinn 1.6-1.7 to ganger til.
- Resuspender pelleten i 2x volumet av PBS med 0,01 % (w/v) natriumazid.
- Oppbevar sputum ved 4 °C.
2. MiPACT (tissue clearing technique) behandling av sputum
- Degas hydrogelkomponentene (30% 29: 1 akrylamid: bis-akrylamid, herder og PBS) i en lukket beholder som inneholder en anaerob pakke før 72 timer.
MERK: Den anaerobe pakningen og den forseglede beholderen er nødvendig fordi oksygen hemmer akrylamidpolymerisering. Alternativt kan oksygen fjernes ved å utføre dette trinnet i en anaerob hette, ved å påføre et vakuum på en forseglet beholder, eller ved å boble N2-gass gjennom akrylamidblandingen.- Tilsett 2 ml av en 30% 29: 1 akrylamid: bis-akrylamidoppløsning til et 15 ml rør med lokket av inne i den forseglede anaerobe beholderen.
- Lag en konsentrert bestand av 10% (w / v) herder ved å tilsette 0,5 g herder til 5 ml PBS i et 15 ml rør. La hetten av røret og oppbevar i den forseglede anaerobe beholderen.
- La noen ml steril PBS ligge i et rør, med hetten av, inne i den anaerobe beholderen.
- Lag 5 ml oppløsning av hydrogel med en endelig konsentrasjon på 0,2% herder og 4% 29: 1 akrylamid: bis-akrylamid i PBS i et 15 ml rør. Bland ved inversjon og filtrer sterilisering.
- Fjern sputumprøver fra kjøleskapet, og kutt deretter i små seksjoner (omtrent 5 mm i diameter) under sterile forhold med en skalpell.
MERK: Hvis sputumet er ganske flytende, kan dette trinnet fortsatt utføres, men det tar økt tålmodighet og praksis å fjerne sputumet fra lagringsløsningen med pinsett før du bruker skalpellen for å skille de ønskede fraksjonene. - Plasser de kuttede sputumprøvene inne i en brønn med et 8-kammerglassglass.
- Tilsett 300 μL filtersterilisert hydrogelløsning fra trinn 2.2 til hver av brønnene som inneholder sputum.
- Plasser glassglasset med 8 kammer i en forseglet beholder som inneholder en anaerob pakning i 3 timer ved 37 °C.
MERK: Når polymerisert hydrogelen med innebygd sputum bør være konsistensen av fast gel. - Overfør de størknede hydrogelsputumprøvene til et 15 ml kulturrør inneholdende 5 ml 8% natriumdodecylsulfat (SDS), pH 8, og la prøvene tømmes i 3-14 dager ved 37 ° C (med eller uten risting), til sputumet blir gjennomsiktig.
MERK: Clearing ganger avhenger av sputum sammensetning og kan generelt reduseres med risting. Pass imidlertid på at du ikke øker ristehastigheten til det punktet at du forstyrrer prøveintegriteten. Flere DNA-rike prøver tar lengre tid å fjerne sammenlignet med slimrike prøver. - Dekanter 8 % SDS-løsningen i en avfallsbeholder. Ved hjelp av steril pinsett overfører du hver hydrogel-innebygd prøve til et sterilt 50 ml konisk rør. Tilsett 10 ml PBS til hvert av de 50 ml koniske rørene for å vaske hydrogelene og la løsningen sitte i 30 minutter til 1 time før dekantering. Gjenta dette 2x flere ganger.
NOTAT: Dette vasketrinnet innebærer ikke sentrifugering. Overflødig væske og supernatant fjernes forsiktig med en pipette. - Oppbevar vaskede prøver i PBS med 0,01 % (w/v) natriumazid og 1x RNasehemmer ved 4 °C.
3. Hydrogel fluorescerende in situ hybridisering (FISH) protokoll
- Fjern hydrogelprøvene fra lagringsløsningen ved hjelp av steril pinsett og plasser prøvene på en steril overflate (for eksempel et glassglass eller petriskål).
- Bruk en steril skalpell til å kutte hydrogelene i ~ 1 mm tykke skiver.
- Plasser 1 mm seksjoner av hydrogel inne i sterile 1,5 ml rør.
- Forbered 1 ml hybridiseringsbufferen (25% formamid, 0,9 M NaCl, 20 mM Tris-HCl [pH 7,6], 0,01% SDS, renset og avionisert H2O) i et 1,5 ml rør.
- Legg den fluorescerende merkede PseaerA-sonden (150,7 nM12) til hybridiseringsbufferen og bland ved inversjon.
MERK: Formalinoppløsning bør holdes borte fra åpen flamme. Hybridiseringsbufferen kan fremstilles på avansert og lagres i alikoter ved -20 °C13. - Tilsett 200-500 μL hybridiseringsbuffer til hver ~ 1 mm seksjon av hydrogel og sørg for at hele hydrogelprøven er nedsenket.
- La PseaerA-sonden hybridisere med hydrogelprøvene ved å plassere dem i mørket i ~ 18-24 timer, ved 46 °C, uten å riste.
- Dekanter hybridiseringsbufferen i en avfallsbeholder.
- Skyll prøvene én gang med filtersterilisert vaskebuffer (337,5 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA (etylendiamintetraeddiksyre) [pH 7,2], 0,01 % SDS og renset og avionisert H2O) ved å tilsette 1 ml vaskebuffer til hvert av de 1,5 ml rørene og deretter fjerne den.
MERK: Vaskebufferen kan lages på forhånd og oppbevares ved romtemperatur (RT). - Tilsett 1 ml fersk vaskebuffer i tubene, og inkuber deretter prøvene i mørket i 6 timer ved 48 °C, uten å riste.
4. Hydrogel og Psl0096 antistoffbinding
- Fjern vaskebufferen sterilt med en 1 ml pipettor.
- Skyll prøvene med en 2% BSA (w / v) i PBS-oppløsning ved å tilsette og fjerne 1 ml av 2% BSA-oppløsningen.
- Tilsett 500 μL av 2% BSA / PBS-løsningen til hydrogelprøvene for å blokkere uspesifikk proteinbinding. Deretter ruge prøvene over natten, i mørket, på RT, uten å riste.
- Fjern blokkeringsoppløsningen sterilt med en 1 ml pipette.
- Klargjør Psl0096-Texas Red antistoffoppløsning ved å fortynne antistoffet til en endelig konsentrasjon på 0,112 μg / ml i 500 mikrol fersk 2% BSA / PBS.
- Tilsett 500 μL antistoffoppløsningen til hydrogelprøvene og inkuber dem ved RT i 6 timer, beskyttet mot lys, uten risting.
5. DAPI (4',6'-diamidino-2-fenylindol) farging
- Forbered brytningsindeksmatchingsløsningen (RIMS) ved å tilsette 40 g ikke-ionisk tetthetsgradientmedium, 30 μL Tween20, 3 μg natriumazid og 30 ml PBS til en kolbe som inneholder en magnetisk rørestang. Rør oppløsningen i 15 minutter på en magnetomrører, eller til den er helt oppløst.
- Filtrer steriliser oppløsningen til et 50 ml konisk rør ved hjelp av en 10 ml sprøyte og et sterilt 0,2 μm filter.
MERK: Oppløsningen kan oppbevares ved 4 °C i flere måneder. - Fjern Psl0096-Texas Red antistoffoppløsningen med en steril 1 ml pipette.
- Skyll hydrogelprøvene ved å tilsette og deretter fjerne 1 ml PBS.
- Inkuber hydrogelprøvene med 250 μL RIMS-løsning og 10 μg / ml DAPI ved RT med forsiktig risting, i mørket, over natten.
- Før konfokal avbildning monteres prøvene på 0,9 mm eller 1,7 mm perfusjonskamre og forsegles med et glassdeksel.
MERK: Etter FISH og/eller immunhistokjemi og før nedsenkning i RIMS kan fluorescerende lektinflekker påføres hvis visualisering av sputumslim ønskes12.
6. Bildebehandling
- Utfør konfokal laserskanningsmikroskopiavbildning ved hjelp av standardteknikker ved 25x, 40x, 63x eller 100x forstørrelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den overordnede utformingen av eksperimentet er oppsummert i figur 1 og figur 2. Figur 1 gir et sammendrag av protokollene for sputumbehandling og sputumclearing. Sputumbehandling og clearing kan ta opptil 17 dager. Selv om protokollen kan stoppes, og prøver kan lagres etter fiksering med PFA (dag 2) eller etter vevsrydding (dag 5-17 avhengig av clearingtid). I figur 2 er FISH- og antistoffbindingsprotokollene oppsummert. FISH- og antistofffargeprotokollene tar 4 dager å fullføre, men bør fullføres og konfokale bilder tas når de er startet. Ved hjelp av protokollene ovenfor kan høyoppløselige 3D-bilder av P. aeruginosa-celler oppnås med deres in-situ-struktur i sputumvisualisert.
Clearing av sputum og påfølgende påføring av fluorescerende flekker som brukes i denne protokollen muliggjør detaljert visualisering av P. aeruginosa i prøvene. Sputumprøvene vist i figur 3 og figur 4 ble tatt fra en pediatrisk CF-pasient (17 år) med nyoppstått P. aeruginosa-infeksjon. I figur 3A ble det sett et aggregat av celler i en sputumprøve; Utseendet til gulgrønne stenger skyldtes overlappingen av alle tre fluoroforene. Selv om vi ikke har celletall for denne sputumprøven, fant vi sondeteksjonsgrensen til å være 104 celler/ml (se tilleggsfigur 1). I figur 3B ble individuelle stavformer sett i grønt fra den artsspesifikke bindingen av PseaerA-488-sonden til P. aeruginosa-celler. Psl0096-Texas Red antistoff sett i rødt illustrerer hvor pseudomonalt eksopolysakkarid var lokalisert i sputumet; i dette tilfellet syntes Psl0096-antistoffet å overlappe mest med P. aeruginosa-cellene (figur 3C). Denne metoden tillot også visualisering av pseudomonale celler i sputumet i forhold til andre bakterieceller og vertsstrukturer. I figur 4 ble det sett en klynge av P. aeruginosa-celler fagocytosert i en eukaryot celle, og andre små kokoscelleklynger ble observert i nærheten. Det er vist at Psl0096-antistoffet også kan binde seg til P. aeruginosa, produsert av P . aeruginosa (se tilleggsfigur 2).
Figur 1: Flytskjema som illustrerer sputumprosessering og MiPACT-protokoller.
Oppsummert er sputum fast før det blir innebygd i en polyakrylamidoppløsning. Når hydrogelen er fjernet, kan den enten lagres ved 4 °C eller brukes sammen med FISH- og antistoffbindingsprotokollen. Dette bildet ble opprettet med BioRender.com. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Flytskjema som angir fluorescens in situ hybridisering og antistofffargingsprotokoller.
Når sputumet er fullstendig ryddet innenfor hydrogelmatrisen, kan fargemetoder påføres. Dette bildet ble opprettet med BioRender.com. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 Immunfluorescensbilde av en sputumprøve tatt fra en pasient med tidlig P. aeruginosa-infeksjon innebygd i en hydrogelmatriks.
Hydrogelprøven ble hybridisert med en PsearA-Alexa488-sonde (grønn), et Psl0096-Texas rødt antistoff (rødt) og DAPI (blått). (A) sputumprøve sett under alle 3 kanaler, (B) sputum under bare den grønne kanalen som indikerer hvor PseaerA-488-sonden bundet, og (C) sputum under bare den røde kanalen der Psl0096-Texas rød binding skjedde. Bildene ble tatt med 100x forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4 Immunfluorescensbilde av en sputumprøve tatt fra en pasient med tidlig P. aeruginosa-infeksjon innebygd i en hydrogelmatriks.
Hydrogelprøven ble hybridisert med en PsearA-Alexa488-sonde (grønn), et Psl0096-Texas rødt antistoff (rødt) og DAPI (blått). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfigur 1: Fluorescens in situ-hybridisering av en planktonisk kultur av PAO1 med PseaerA-488-sonden. Klikk her for å laste ned dette tallet.
Tilleggsfigur 2: P. aeruginosa farget med DAPI og Psl0096-Texas Red antistoff. (A) Stamme PAO1-Δpsl, og (B) stamme PAO1. Klikk her for å laste ned dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hensikten med denne protokollen er å gi et glimt inn i in-situ organiseringen av P. aeruginosa-celler i sputum fra CF-pasienter. Sputumprøver bør oppbevares ved 4 °C til de behandles hvis de ikke kan fikses umiddelbart. Det har vist seg at P. aeruginosa-celleantallet i sputum ikke endres signifikant hvis det behandles ved 1 time, 24 timer eller 48 timer når det oppbevares ved 4 °C, men hvis det blir stående ved 25 °C i 24 eller 48 timer, vil bakteriecelletallet øke betydelig som følge av bakterievekst14. For denne studien ble sputumprøver lagret ved 4 °C opp til maksimalt 24 timer etter ekspektorering. Det bør bemerkes at inflammatoriske celletall har vist seg å avta i sputum hvis venstre ved 4 ° C og behandlet mer enn 9 timer senere15. Derfor er det viktig å vurdere de spesifikke cellene og markørene man ønsker å visualisere i sputum når man bestemmer seg for en grenseverdi for prøvebehandling.
Prøvebehandling i denne metoden begynner med fiksering av sputumprøver i 4 % PFA. Paraformaldehyd vil kryssbinde bakterieceller og deres ekstracellulære matrise, bevare deres strukturer for mikroskopisk visualisering og analyse11,16. Dessverre, hvis målet er å få totalt celletall på visse inflammatoriske celler i sputum, har PFA vist seg å redusere antallet av disse cellene, og dermed bør andre fikseringsmidler betraktessom 17. En annen begrensning ved denne studien er at det kan være tidkrevende og kan ta over to uker å utføre. Dermed kan det ikke være egnet for utvikling til en diagnostisk metode som krever tidsfølsomme behandlingsbeslutninger. Videre, for å forstå det totale mikrobielle mangfoldet i sputumprøver, ville denne metoden ikke være egnet, men kunne kobles sammen med andre mikrobielle deteksjonsmetoder med høy gjennomstrømning, for eksempel qPCR.
Sammensetningen av akrylamidhydrogelen kan endres avhengig av vevstype og applikasjon11. For ustabile prøver som CF-sputum, er det nødvendig å gi strukturell støtte med en 29: 1 akrylamid: bis-akrylamidblanding (i stedet for bare akrylamid). Inkludert paraformaldehyd i hydrogelen kan stabilisere strukturen ytterligere, med avveining av lengre inkubasjonstider for å tillate diffusjon av sonder og antistoffer9. Tilsetning av formaldehyd til hydrogelen kan også forhindre vevshevelse under ryddeprosessen hvis den effekten er uønsket11.
Den nåværende metoden retter seg spesifikt mot P. aeruginosa-celler i sputum hos CF-pasienter. Alternative metoder og modifikasjoner av denne protokollen kan vurderes for å veilede optimalisering av visualisering av andre bakterier. Ved å bruke arts- og slektsspesifikke FISH- og hybridiseringskjedereaksjonssonder (HCR), kan andre CF-patogener som Staphylococcus aureus, Streptococcus sp. og Achromobacter xylosoxidans identifiseres12. I vår studie målrettet vi det pseudomonale eksopolysakkarid Psl. Andre mål, inkludert alginat eller Pel, kan undersøkes med fluorescerende antistoffer som er spesifikke for disse eksopolysakkaridene i fremtidige eksperimenter. Bruk av MiPACT-metoden sammen med FISH og antistofffarging for CLSM tar et par uker å fullføre. Hvis forskningsspørsmålet ikke gjelder den 3-dimensjonale romlige visualiseringen av sputumet, er det raskere metoder for å visualisere bakterier tilstede. Tidligere metoder som brukes til å visualisere bakterier i sputumprøver benytter tynn snitting eller smøring og inkluderer: FISH18, Gram flekk og immunhistokjemi teknikker som bruker primære antistoffer og motflekker for å tillate visualisering av biofilm eksopolysakkarider og bakterieceller 19,20.
Det er flere potensielle fremtidige anvendelser av disse typer bildebehandlingsteknikker. Evnen til å visualisere forskjellige bakterielle organismer og deres interaksjon med vertsceller, som fagocytter, kan fremme vår forståelse av hvorfor noen P. aeruginosa-stammer effektivt fjernes fra CF-luftveier, mens andre stammer ikke er det. Bildebakterier i luftveisprøver kan også brukes som et mål på antimikrobiell effekt og som studieresultat for nye anti-biofilmmedisiner21. I tillegg kan visualisering av det romlige forholdet mellom P. aeruginosa og andre organismer i CF-lungemikrobiomet, som Staphylococcus aureus, bidra til å belyse rollen som co-infeksjon / kolonisering i patogenesen av lungeeksacerbasjoner, og deres respons på antibiotikabehandling. In vivo avbildning av bakterier kan også brukes på andre infeksjoner, inkludert de med ventilatorassosierte lungebetennelser eller kroniske sårinfeksjoner22. Innsikten som oppnås kan dermed brukes til å veilede fremtidig terapeutisk utvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å anerkjenne Cystic Fibrosis Foundation som ga finansiering til denne forskningen og MedImmune for deres sjenerøse donasjon av anti-Psl0096 antistoffer. For denne studien ble avbildning utført på CAMiLoD-bildebehandlingsanlegget ved University of Toronto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 29:1 acrylamide bisacrylamide, 30 % solution | BioRad | 161-0146 | |
| 8-Chambered Coverglass Nunc Lab-Tek | ThermoFischer Scientific | 155411 | |
| Anaerogen2.5L | Oxid Inc. | 35108 | |
| Coverwell perfusion chambers | Electron Microscopry Sciences | 70326 -12/-14 | |
| HistoDenz | Sigma | D2158 | |
| Protect RNA Rnase Inhibitor | Sigma | R7387 | |
| PseaerA - GGTAACCGTCCCCCTTGC | Eurofins | Order Details: Product: Modified DNA Oligo; Name: PseaerA; Sequence: [Alexa488]GGTAACCGTCCCCCTTGC; Synthesis: 50 nmol; Purification: HPLC; Ship state: Full yield (dry) | |
| Psl0096-Texas Red | Medimmune | The Psl0096-Texas red antibodies were a gift kindly provided by Medimmune and the company should be contacted for order inquiries. | |
| VA-044 Hardener | Wako | 27776-21-21 |
References
- Banerjee, D., Stableforth, D. The treatment of respiratory pseudomonas infection in cystic fibrosis: What drug and which way. Drugs. 60 (5), 1053-1064 (2000).
- Rosenfeld, M., Ramsey, B. W., Gibson, R. L. Pseudomonas acquisition in young patients with cystic fibrosis: Pathophysiology, diagnosis, and management. Current Opinion in Pulmonary Medicine. 9 (6), 492-497 (2003).
- Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T. Tolerance and Resistance of Pseudomonas aeruginosa Biofilms to Antimicrobial Agents-How P. aeruginosa Can Escape Antibiotics. Frontiers in Microbiology. 10, 913 (2019).
- Billings, N., et al. The Extracellular Matrix Component Psl Provides Fast-Acting Antibiotic Defense in Pseudomonas aeruginosa Biofilms. PLoS Pathogens. 9 (8), 1003526 (2013).
- Franklin, M. J., Nivens, D. E., Weadge, J. T., Lynne Howell, P. Biosynthesis of the Pseudomonas aeruginosa extracellular polysaccharides, alginate, Pel, and Psl. Frontiers in Microbiology. 2, 167 (2011).
- Yang, L., et al. Polysaccharides serve as scaffold of biofilms formed by mucoid Pseudomonas aeruginosa. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 65 (2), 366-376 (2012).
- Wozniak, D. J., et al. Alginate is not a significant component of the extracellular polysaccharide matrix of PA14 and PAO1 Pseudomonas aeruginosa biofilms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7907-7912 (2003).
- Baker, P., et al. Exopolysaccharide biosynthetic glycoside hydrolases can be utilized to disrupt and prevent Pseudomonas aeruginosa biofilms. Science Advances. 2 (5), 1-9 (2016).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nature Protocols. 10 (11), 1860-1896 (2015).
- DePas, W. H., et al. Exposing the three-dimensional biogeography and metabolic states of pathogens in cystic fibrosis sputum via hydrogel embedding, clearing, and rRNA labeling. mBio. 7 (5), 1-11 (2016).
- Molecular Instruments HCR v3.0 protocol for bacteria in suspension. , Available from: www.molecularinstruments.com 1-6 (2019).
- Murray, M. P., Doherty, C. J., Govan, J. R. W., Hill, A. T. Do processing time and storage of sputum influence quantitative bacteriology in bronchiectasis. Journal of Medical Microbiology. 59 (7), 829-833 (2010).
- Efthimiadis, A., Jayaram, L., Weston, S., Carruthers, S., Hargreave, F. E. Induced sputum: Time from expectoration to processing. European Respiratory Journal. 19 (4), 706-708 (2002).
- Chao, Y., Zhang, T. Optimization of fixation methods for observation of bacterial cell morphology and surface ultrastructures by atomic force microscopy. Applied Microbiology and Biotechnology. 92 (2), 381-392 (2011).
- St-Laurent, J., Boulay, M. E., Prince, P., Bissonnette, E., Boulet, L. P. Comparison of cell fixation methods of induced sputum specimens: An immunocytochemical analysis. Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 36-42 (2006).
- Hogardt, M., et al. Specific and rapid detection by fluorescent situ hybridization of bacteria in clinical samples obtained from cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Microbiology. 38 (2), 818-825 (2000).
- Hoffmann, N., et al. Erratum: Novel mouse model of chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection mimicking cystic fibrosis. Infection and Immunity. 73 (8), 5290 (2005).
- Nair, B., et al. Utility of Gram staining for evaluation of the quality of cystic fibrosis sputum samples. Journal of Clinical Microbiology. 40 (8), 2791-2794 (2002).
- Howlin, R. P., et al. Low-Dose Nitric Oxide as Targeted Anti-biofilm Adjunctive Therapy to Treat Chronic Pseudomonas aeruginosa Infection in Cystic Fibrosis. Molecular Therapy. 25 (9), 2104-2116 (2017).
- Pestrak, M. J., et al. Treatment with the Pseudomonas aeruginosa glycoside hydrolase PslG combats wound infection by improving antibiotic efficacy and host innate immune activity. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (6), 00234 (2019).
