Summary
In vivo mikroskopisk kalsiumavbildning er et uvurderlig verktøy som muliggjør sanntidsovervåking av nevronale aktiviteter hos fritt oppfører seg dyr. Det har imidlertid vært vanskelig å bruke denne teknikken på amygdala. Denne protokollen tar sikte på å gi en nyttig retningslinje for vellykket målretting av amygdala celler med et miniatyrisert mikroskop hos mus.
Abstract
In vivo sanntidsovervåking av nevronale aktiviteter hos fritt bevegelige dyr er en av viktige tilnærminger for å knytte nevronal aktivitet til atferd. For dette formålet har en in vivo imaging teknikk som oppdager kalsiumtransienter i nevroner ved hjelp av genetisk kodede kalsiumindikatorer (GECIer), et miniatyrisert fluorescensmikroskop og en gradient brytningsindeks (GRIN) linse blitt utviklet og vellykket brukt på mange hjernestrukturer1,2,3,4,5,6. Denne bildeteknikken er spesielt kraftig fordi den muliggjør kronisk samtidig avbildning av genetisk definerte cellepopulasjoner i en langsiktig periode opptil flere uker. Selv om det er nyttig, har denne bildeteknikken ikke lett blitt brukt på hjernestrukturer som finner dypt inne i hjernen som amygdala, en viktig hjernestruktur for emosjonell behandling og assosiativ fryktminne7. Det er flere faktorer som gjør det vanskelig å bruke bildeteknikken til amygdala. For eksempel forekommer bevegelsesartefakter vanligvis oftere under avbildningen utført i de dypere hjerneområdene fordi et hodemontert mikroskop implantert dypt i hjernen er relativt ustabil. Et annet problem er at sideartikkelen er plassert nær den implanterte GRIN-linsen, og bevegelsen under åndedrett kan forårsake svært uregelmessige bevegelsesartefakter som ikke lett kan korrigeres, noe som gjør det vanskelig å danne en stabil bildevisning. Videre, fordi celler i amygdala vanligvis er stille i hvile eller bedøvet tilstand, er det vanskelig å finne og fokusere målcellene som uttrykker GECI i amygdala under baseplating prosedyre for senere avbildning. Denne protokollen gir en nyttig retningslinje for hvordan du effektivt målretter celler som uttrykker GECI i amygdala med hodemontert miniatyrisert mikroskop for vellykket in vivo kalsiumavbildning i et så dypere hjerneområde. Det bemerkes at denne protokollen er basert på et bestemt system (f.eks. Inscopix), men ikke begrenset til den.
Introduction
Kalsium er en allestedsnærværende andre budbringer, spiller en avgjørende rolle i nesten alle cellulærefunksjoner 8. I nevroner forårsaker virkningspotensial avfyring og synaptisk input rask endring av intracellulær fri [Ca2+]9,10. Derfor gir sporing av kalsiumtransienter en mulighet til å overvåke nevronal aktivitet. GECIer er kraftige verktøy som tillater overvåking [Ca2 +] i definerte cellepopulasjoner og intracellulærerom 11,12. Blant mange forskjellige typer proteinbasert kalsiumindikator er GCaMP, en Ca2 + sonde basert på et enkelt GFP-molekyl13,det mest optimaliserte og dermed mye brukte GECI. Gjennom flere runder med engineering, en rekke varianter av GCaMP har blitt utviklet12,14,15,16. Vi bruker en av de nylig utviklede GCaMPs, GCaMP7b, i denne protokollen16. GCaMP sensorer har i stor grad bidratt til studiet av nevrale kretsfunksjoner i en rekke modellorganismer som avbildning av Ca2 + transienter under utvikling17, in vivo imaging i et bestemt kortikalelag 18, måling av kretsdynamikk i motoroppgavelæring19 og avbildning av celleensembleaktivitet relatert til assosiativ fryktminne i hippocampus og amygdala20,21.
Optisk avbildning av GECIer har flere fordeler22. Genetisk koding gjør det mulig for GECIer å bli stabilt uttrykt i en langsiktig periode i en bestemt undergruppe av celler som er definert av genetisk profil eller spesifikke mønstre av anatomisk tilkobling. Optisk avbildning muliggjør in vivo kronisk samtidig overvåking av hundrevis til tusenvis av nevroner hos levende dyr. Noen optiske bildesystemer er utviklet for in vivo avbildning og analyse av GECIer i hjernen til fritt oppfører seg mus med hode-mount miniatyrisert fluorescensmikroskoper 21,23,24,25. Til tross for in vivo optisk bildeteknikk basert på GECIer, GRIN linse, og en head-mount miniatyr mikroskop som et kraftig verktøy for å studere koblingen mellom neural krets aktivitet og atferd, bruke denne teknologien til amygdala har vært vanskelig på grunn av flere tekniske problemer knyttet til målretting GRIN linsen til celler som uttrykker GECIer i amygdala uten å forårsake bevegelsesartefakter som sterkt redusere kvaliteten på bilde oppkjøp og finne celler uttrykker GECIer. Denne protokollen tar sikte på å gi en nyttig retningslinje for kirurgiske prosedyrer for baseplate vedlegg og GRIN linse implantasjon som er kritiske skritt for vellykket in vivo optisk kalsiumavbildning i amygdala. Selv om denne protokollen retter seg mot amygdala, gjelder de fleste prosedyrene som er beskrevet her, ofte for andre dypere hjerneregioner. Selv om denne protokollen er basert på et bestemt system (f.eks. Inscopix), kan det samme formålet enkelt oppnås med andre alternative systemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer ble godkjent av Dyreetikkkomiteen ved Korea Advanced Institute of Science and Technology. Alle forsøk ble utført i samsvar med retningslinjene for institusjonell dyrepleie- og brukskomité.
MERK: Denne protokollen består av seks hovedtrinn: virusinjeksjonskirurgi, GRIN-linseimplantatkirurgi, validering av GRIN-objektivimplantasjon, baseplatevedlegg, optisk opptak av GCaMP-signal under en atferdstest og databehandling (figur 1A). Med unntak av kirurgi brukes den kommersielle programvarepakken (Inscopix).
1. Stereotoksisk kirurgi – AAV Virus injeksjon
MERK: Musestammen som brukes i denne kirurgiske prosedyren er C57BL6/J. Dyrets kropp er dekket med en steril drapering under operasjonen, og alle trinnene i protokollen utføres med sterile hansker. Flere operasjoner utføres vanligvis ikke på samme dag. Men hvis flere mus må ha samme operasjon på samme dag, bruk et eget sett med autoklaver kirurgiske verktøy for hver mus og 70% etanol for å desinfisere de kirurgiske instrumentene mellom mus. For å holde musen varm under den kirurgiske prosedyren, er musen dekket med et skreddersydd kirurgisk teppe etter festet til stereotoksisk rammen.
- Desinfiser alle nødvendige kirurgiske verktøy med 70% etanol, og lag en Hamilton sprøyte og en glasspipette. Fyll glasspipetten med destillert vann.
MERK: Alle kirurgiske verktøy som brukes i protokollen er autoklavet. Fordi GRIN-linsen og skalleskruene ikke kan autoklaveres for sterilisering, brukes 70 % etanol som desinfeksjonsmiddel for å forhindre betennelse. Selv om det ikke er prøvd, kan andre former for sterilisering brukes f.eks. - Bedøve musen med pentobarbital (83 mg∙ kg-1 av kroppsvekt) ved intraperitoneal injeksjon. Etter at musen blir bevisstløs, barber pelsen på skallen.
- Rengjør huden over skallen med 70% etanol og fest musen til stereotoksisk ramme. Fjern forsiktig huden og tørk skallenoverflaten med en 35% hydrogenperoksidløsning ved hjelp av en bomullsspissapplikator. Påfør smøremiddel øye salve for å hindre hornhinnen tørking under operasjonen.
MERK: Selv om det vanligvis ikke er noe problem med å bruke 70% etanol bare for aseptisk hudpreparat, anbefales det å bruke 3 vekslende runder desinfeksjonsmiddel, for eksempel iodophors eller klorhexidinoppløsning, og 70% etanol. Høyere konsentrasjon av hydrogenperoksid brukes i denne protokollen for å sikre at bindevev på museskallen fjernes så fullstendig som mulig, noe som er avgjørende for å redusere bevegelsesartefakt under senere avbildning fordi bindevevet på skallen forstyrrer en fast feste av bunnplaten til skallen. Det bør bemerkes at 35% hydrogenperoksid er mye høyere enn det som vanligvis brukes (3 %). - Fest pinnen med en stereotaksisk probeholder. Juster høyden på bregma og lambda med pinnen.
- Finn den spesifikke plasseringen på museskallen for kraniotomi.
MERK: Koordinatene til lateral amygdala (LA) for virusinjeksjon er (AP, ML, DV) = (-1,6 mm, -3,5 mm, -4,3 mm) fra bregma i denne protokollen (AP; Fremre-Bakre, ML; Mediale-lateral, DV; Dorsal-Ventral, hver forkortelse indikerer relativ aksial avstand fra bregma)26. Koordinatene skal optimaliseres for hver eksperimentelle tilstand. - Bor skallenoverflaten (figur 1B). Vask skallen fraksjoner med fosfat bufret saltvann (PBS). Fjern det gjenværende laget ved hjelp av tang eller en 27 G kanyle.
- Når du borer skallen, prøv å ikke berøre det siste duralaget for å unngå skade på hjernevevsoverflaten. En skadet hjerneoverflate forårsaker betennelse rundt linsen, noe som induserer alvorlige bevegelsesartefakter og høy autofluorescence under opptak. Størrelsen på kraniotomien er 1, 6 mm. Borehastigheten er 18 000 o/min, og bitstørrelsen er 0,6 mm.
- For å senke GRIN-linsen fra hjernevevsoverflaten på det borede stedet til målet amygdala området, beregne avstanden navngitt som "Verdi A" ved å trekke DV forskjellen mellom bregma og eksponert hjerneoverflaten fra DV koordinat av linsen implantasjon, som er satt basert på bregma (4,2 mm i dette tilfellet, Figur 1C).
- Legg 3 μL mineralolje og 0,7 μL av AAV-virusløsningen i glasspipetten.
MERK: Mineralolje bidrar til å skille virusløsning og vann. 0,7 μL er et optimalisert volum for LA-virusinjeksjonen som fullt ut kan dekke LA. - Fjern pinnen fra stereotaksisk probeholder og fest glasspipetten til den.
- Finn glasspipetten på injeksjonsstedet nevnt i trinn 1.5. Sett glasspipetten inn i hjernevevet etter at blødningen er helt stoppet.
- Lever viruset gjennom en glasspipette ved hjelp av en injeksjonspumpe.
MERK: Titeren av viruset bør være høyere enn 1 x 1013 vg/ml for å oppnå et tilstrekkelig antall GCaMP som uttrykker celler. Injeksjonshastigheten er 0,1 μL/min og diffus i 10 min. Hvis det er blødning, vask hjerneoverflaten med PBS. Hold hjerneoverflaten våt i dette trinnet. - Etter endt injeksjon, fjern glasspipetten sakte.
2. Stereotoksisk kirurgi – GRIN linseimplantasjon
MERK: GRIN linseimplantatkirurgi er det mest kritiske trinnet i denne protokollen. Siden en konsekvent langsom hastighet på GRIN-linsebevegelsen er avgjørende for vellykket GRIN-linseimplantasjon, kan en motorisert operasjonsarm være nyttig. Den motoriserte kirurgi armen er en stereotoksisk manipulator som styres av dataprogramvare. Selv om den motoriserte armen brukes i denne protokollen, kan andre måter også brukes så lenge linsen beveger seg konsekvent og sakte under implantasjon. Detaljert informasjon om enheten er i Materials tabell.
- Bor skallen for å implantere to skalleskruer. Vask alle skallen brøkdeler med PBS.
MERK: For å redusere bevegelsesartefaktene i senere optisk bildebehandling er det nødvendig med minst to skruer. De to skalleskruene og GRIN-linseimplantatposisjonen danner en likesidetrekant (figur 1B). Størrelsen på kraniotomien skal passe tett med skruens diameter. Hvis det er blødning, vask blødningsoverflaten med PBS. Borehastigheten er 18 000 o/min, og bitstørrelsen er 0,6 mm. - Desinfiser skruene med 70% etanol for å forhindre betennelse. Implanter skruene så dypt som mulig.
MERK: Skruene skal festes tett uten ytterligere vedheft, for eksempel sement. - Installer en motorisert operasjonsarm på stereotoksisk ramme. Koble den nødvendige maskinvaren til den bærbare datamaskinen der kontrollprogramvaren er installert (Table of Materials).
- Før du senker GRIN-linsen, forbered deg på å lage et nålespor med en 26 G nål.
MERK: Nålesporet er et slags føringsspor som bidrar til å implantere den relativt tykke GRIN-linsen i dype hjerneområder som amygdala uten å forårsake alvorlig forvrengning av hjernestrukturen langs injeksjonsbanen. Dette føringssporet kalles et nålespor fordi det er laget av en senking og forhøyet prosedyre på relativt tynn 26 G nål. - Fest kanyleholderen for å holde nålen på den stereotaktiske rammen.
- Ta tak i kanylen på 26 G med kanyleholderen og beregn koordinatene til nåleinnsettingsstedet.
MERK: I denne protokollen er koordinatene til nåleinnsettingsstedet 50 μm lateral fra virusinjeksjonsstedet (AP, ML, DV) = (-1,6 mm, -3,55 mm, -3,7 mm). - Få tilgang til kontrollerende programvare og fullstendig forberedelse for manipulering av nålposisjon.
- Kjør kontrollprogramvaren, og velg Start nytt prosjekt-knappen for å begynne å kontrollere økten.
MERK: I kontrolløkten er det flere tomme bokser og menyknapper. De tomme boksene er inndataplass for koordinater. Når du har angitt koordinater i de tomme boksene, beveger den motoriserte stereotoksiske armen seg ved å klikke på Gå til-knappen. Gå til-knappen endres til en STOP-knapp når den stereotoksiske armen beveger seg. Blant flere menyknapper er det bare Verktøy-knappen som kreves i denne protokollen. - Klikk verktøyknappen. Kalibrer kontrollprogramvaren ved å klikke på kalibrer rammemenyknappen. Kalibrering er prosessen der den faktiske posisjonen til manipulator er satt som verdier på Stereodrive-programvaren.
- Kjør kontrollprogramvaren, og velg Start nytt prosjekt-knappen for å begynne å kontrollere økten.
- Finn spissen av nålen på den eksponerte hjerneoverflaten på skallen overflaten ved hjelp av stereotoksisk manipulator.
MERK: Nålens hastighet stilles inn ved hjelp av mikrostasjonshastighetsmenyen i Verktøy-menyen. Standardhastigheten er 3,0 mm/s. En hastighet på 0,5 mm/s anbefales imidlertid i dette trinnet. Bevegelsen av nålen styres av piltastene. - Tilsett 2-3 dråper PBS for å holde hjerneoverflaten våt. Fyll ut den tomme boksen på dataskjermen med passende DV-koordinater til LA. Hvis hjerneoverflaten er tørr, hindrer den penetrasjon av nålen i hjernevevet.
- Senk 26 G-nålen ved å klikke gå til-knappen. Den stopper automatisk når nålen når målstedet satt av DV-koordinater. Nålens hastighet er 100 μm/min. Hvis det er blødning, stopp nålen ved å klikke på STOP-knappen og vask hjerneoverflaten med PBS. Hold hjerneoverflaten våt i dette trinnet. Etter at blødningen er stoppet, begynn å senke igjen.
- Når nålen er helt slutter å bevege seg, skriver du inn 45,00 mm i den tomme boksen på dataskjermen.
MERK: 45,00 mm er en verdi av DV-koordinat som gjør at nålen går tilbake til startposisjonen. - Løft nålen ved å klikke gå til-knappen. Hastigheten på nålebevegelsen er 100-200 μm/min.
- Når nålen slutter å bevege seg, fjerner du PBS på hjerneoverflaten. Avinstaller nålen og kanyleholderen fra stereotaksisk ramme. Eksperimentereren kan stoppe nålen manuelt ved å klikke på STOP-knappen når det er nødvendig.
- Utstyr stereotoksisk stang med linseholderen. Sett GRIN-objektivet på linseholderen.
MERK: GRIN-objektivet som er optimalisert for målretting av LA (0,6 mm i diameter, 7,3 mm lang) brukes i denne protokollen. Hvis linseholderen ikke er klargjort, er en alternativ måte å bruke en bulldogklemme til å gripe GRIN-linsen. - Desinfiser linsen med 70% etanol og fest stereotaksisk stang til stereotaksiske rammer.
- Finn spissen av GRIN-linsen på det angitte stedet på skallens overflate (samme metode som er beskrevet i trinn 2.8).
MERK: Koordinaten til GRIN-objektivet er (AP, ML, DV) = (-1,6 mm, -3,55 mm, -4,2 mm) (figur 1C). Linsen bør ikke berøre skallen for å unngå skade på spissen. - Beregn DV-koordinaten ved å trekke den absolutte verdien av "Verdi A" fra DV-koordinaten til objektivimplantasjonen som er beskrevet i trinn 2.16.
- Slipp 2-3 dråper PBS på hjerneoverflaten. Skriv inn 1000 μm for senking og 300 μm for å heve objektivet i den tomme boksen på dataskjermen.
- Gjenta senkingen (1000 μm nedover) og heving (300 μm oppover) av GRIN-objektivet til den når målstedet. Denne opp og ned prosedyren brukes til å frigjøre trykket som genereres inne i hjernevevet på grunn av senking prosedyren for linsen som ellers kan forårsake forvrengning av hjernestrukturer langs implantasjonsbanen.
MERK: Hastigheten på GRIN-objektivbevegelsen er 100 μm/min. Selv om det er blødning, ikke slutte å flytte GRIN linsen og vaske hjerneoverflaten med PBS. Hold hjerneoverflaten våt i dette trinnet. Hvis hjerneoverflaten er tørr, holder hjernevevet seg til GRIN-linseoverflaten, og det forårsaker forvrengning av hjernestrukturen. - Hvis GRIN-linsen når målstedet, fjerner du PBS og bruker forsiktig harpikstannsementen rundt GRIN-linsen, skruene og deres sidevegg (figur 1D).
MERK: Påføring av harpikssement over hele skallen kan redusere bevegelsesartefakter. Tvert imot, hvis harpikssementen ved et uhell dekker musklene festet til skallen, øker det bevegelsesartefakter. - Etter at harpiksssementen er herdet, demonterer du GRIN-linsen fra linseholderen og påfør akrylmalingssement over hele skallen (figur 1D).
- For å feste hodeplaten, demonter linseholderen fra stereotaksisk stang og fest hodeplaten på spissen av stangen ved hjelp av bånd. Kontroller om hodeplaten er horisontal.
MERK: En skråhodet plate forårsaker en skrå visning. En hodeplate er nødvendig for å feste musehodet i det mobile hjemmebursystemet (i bunnplatetilbehørsdelen). Hvis eksperimentereren ikke bruker systemet, hopper du over dette trinnet (trinn 2.22) og følgende trinn 2.23. - Senk stangen langsomt til hodeplaten finner på toppen av linsemansjetten. Senk hodeplaten 1000 μm mer. Flytt hodeplaten for det implanterte GRIN-objektivet for å finne på høyre kant av den indre ringen på hodeplaten.
MERK: Hodeplaten skal plasseres lavere enn den implanterte GRIN-linseoverflaten; Ellers kan ikke mikroskopet nærme seg nær nok til den implanterte GRIN-linsen for justering av fokalplanet på grunn av akrylsementen. - Påfør akrylsement for å feste hodeplaten til sementlagene (figur 1D).
- Fest parafinfilm på den implanterte GRIN-linseoverflaten for å beskytte linseoverflaten mot støv. Deretter påfør avtagbar epoksybinding på parafinfilmen for å holde parafinfilmen forblir på linseoverflaten.
- Injiser Carprofen, et smertestillende (0,5 mg/ml i PBS) og Deksametason, et antiinflammatorisk legemiddel (0,02 mg/ml i PBS) oppløsning, i musens bukhinnen.
MERK: Dosen av legemidlet er avhengig av kroppsvekten: Carprofen (5 mg∙kg-1 kroppsvekt) og Deksametason (0,2 mg∙kg-1 kroppsvekt). Både Carprofen og Deksametason administreres etter operasjonen og en gang daglig i 7 dager etter operasjonen. - Bland 0,3 mg/ml amoxicillin, et antibiotikum, i burvann for å administrere legemidlet i 1 uke.
- Returner musen til hjemmet buret og la 5-8 uker for utvinning og virustransduksjon.
MERK: Musen gjenvinnes i et forvarmet bur på et elektrisk teppe til musen våkner fra bedøvelsen.
3. Validering av GRIN-objektivimplantasjonen
MERK: Validering av GRIN-objektivimplantasjonen gir informasjon om hvorvidt det implanterte GRIN-objektivet er på mål mot GCaMP som uttrykker celler. Basert på denne informasjonen sparer eksperimentereren tiden sin fra tidkrevende prosesser som atferdstesten og databehandling ved å ekskludere dyr med off-målrettet GRIN-objektivimplantasjon. Under valideringsprosedyren bør celler med GCaMP-uttrykk være fokusert i opptaksfeltet. Et huskassede brukes i dette trinnet. Et mobilt hjem bur er et spesialisert rundformet apparat som gjør at hodefestede mus fritt kan bevege beina under validering av GRIN-objektivimplantasjonen og baseplatetilbehøret. Et luftløftbord i dette apparatet der beina på hode faste mus er plassert muliggjør en slik fri bevegelse av ben selv om hodet er fast. Cellene i den laterale kjernen i amygdala er vanligvis stille i en hvilende eller bedøvet tilstand, slik at GCaMP fluorescenssignaler sjelden oppdages under disse forholdene, noe som gjør det svært vanskelig, noen ganger umulig, å finne celler som uttrykker GCaMP under validering av GRIN-objektivimplantasjon og baseplatetilbehør. Imidlertid produserer bevegelsen av ben ofte GCaMP fluorescens signaler i cellene i lateral kjerne av amygdala og dermed kan bidra til å lokalisere mikroskopet. Dermed brukes bobilburet i denne protokollen.
- Sett sammen den stereotoksiske manipulatoren til det mobile hjemmebursystemet.
- Bedøve musen med 1,5% isoflurangass. Etter at musen er helt bevisstløs, plasser musen på hodelinjen i det mobile hjemmebursystemet.
- Finn karbonburet under musen. Lukk karbonburet og slå på luftstrømmen for å få buret fritt til å bevege seg uten friksjon. Vent noen minutter til musen blir aktiv.
MERK: Luftstrømmens hastighet skal optimaliseres for hver eksperimentelle tilstand (her, 100 L/min). - Fjern parafinfilm og epoksybinding på overflaten av det implanterte GRIN-objektivet og tørk av linseoverflaten med 70 % etanol ved hjelp av linsepapir.
- Klargjør datainnsamlingsprogramvaren (DAQ) (f.eks. Inscopix). Angi bildeforholdene.
MERK: DAQ-programvaren brukes til å kontrollere mikroskopet (LED-strøm, objektivfokusosv.)og datalagring.- Slå på DAQ-boksen og koble et mikroskop til den. Deretter kobler du den til en bærbar datamaskin enten direkte ved hjelp av en kabel eller via trådløst internett.
MERK: DAQ-programvaren er installert i den ekstra maskinvaren kalt DAQ-boksen (f.eks. Inscopix). Ved å koble DAQ-boksen til den bærbare datamaskinen, blir DAQ-programvaren tilgjengelig i en bærbar datamaskin. - Få tilgang til DAQ-programvaren via en nettleser (Firefox anbefales).
- Angi alle nødvendige detaljer (Dato, muse-IDosv.)i den definerte økten. Klikk deretter Lagre og fortsett. Når du har lagret, åpner du Kjør-økten.
- I Kjør-økten angirdu bildeforholdene, for eksempel eksponeringstid, forsterkning, elektronisk fokus og eksponerings-LED-strøm.
MERK: Forsterkning og eksponerings-LED-effekt kan skiftes avhengig av laboratorieforholdene. Den anbefalte verdien for elektrisk fokus er 500 og eksponeringstiden er 50 ms. Det er ingen begrensning for å endre LED-kraft og gevinst. En høyere intensitet av lys kan imidlertid føre til mer bleking. Eksponeringstiden for opptaket bestemmer en bildefrekvens for videoopptak. Høyere bildefrekvens vil redusere signalintensiteten. Bildefrekvenser bør optimaliseres for GECIer som brukes til avbildningen.
- Slå på DAQ-boksen og koble et mikroskop til den. Deretter kobler du den til en bærbar datamaskin enten direkte ved hjelp av en kabel eller via trådløst internett.
- For å holde mikroskopet på en stereotaksisk manipulator, fest stereotaksisk stang med mikroskopgriper til stereotaksisk manipulator.
MERK: Griperen er et lite tilbehør som kan festes til det stereotoksiske apparatet for å holde et mikroskop for å plassere den til målet hjernens plassering. - Ta tak i mikroskopet med mikroskopgriperen. Slå på LED-lyset som er koblet til mikroskopet, og juster mikroskopet vertikalt. Senk mikroskopet mens du observerer bildet til overflaten av implantert GRIN-linse vises.
- Juster midten av det implanterte GRIN-objektivet etter midten av visningen.
MERK: Validering av GRIN-objektivimplantasjonen kan utføres i dette trinnet (nevnt i resultatseksjonen, figur 2B, figur 2D, figur 2F). - Ta bilde av den implanterte GRIN-linseoverflaten (Klikk på Prt Sc-knappen på tastaturet). Bildet av den implanterte GRIN-linseoverflaten er nødvendig for å fjerne merkingen av ikke-nevronale komponenter under senere databehandling (trinn 6.8).
- Finn riktig posisjon av mikroskopet. Løft langsomt objektivet av mikroskop mens du observerer bildet for å søke etter celler med GCaMP7b-uttrykk.
MERK: Det kan være nødvendig å justere forsterkningen av bildeinnhentelsen eller eksponerings-LED-kraften. Validering av GRIN-objektivimplantasjonen kan utføres i dette trinnet (nevnt i resultatseksjonen, figur 2A, figur 2C, figur 2E).
4. Feste av bunnplate
MERK: Festetrinnet på bunnplaten følger valideringen av GRIN-objektivimplantasjon. Bunnplaten er en plattform for montering av mikroskopet til hodet av mus. Som nevnt i forrige avsnitt, brukes et huskassed i denne protokollen.
- Etter validering av GRIN-objektivimplantasjon, demonter et miniatyrmikroskop fra mikroskopgriperen.
- Fest bunnplaten til mikroskopet. Stram skruen med sekskantnøkkel for stabilt feste av bunnplaten til mikroskopet.
- Ta tak i mikroskopet med mikroskopgriperen. Slå på LED-lyset som er koblet til mikroskopet, og juster mikroskopet vertikalt. Senk mikroskopet til overflaten av implantert GRIN-linse observeres. Juster midten av det implanterte GRIN-objektivet etter midten av visningen.
- Finn riktig posisjon av mikroskopet. Løft mikroskopets objektive langsomt til du finner et fokalplan som gir best bilder av celler med GCaMP7b-uttrykk (figur 2A).
MERK: Det kan være nødvendig å justere forsterkningen av bildeanskaffelse eller eksponerings-LED-effekt i løpet av dette trinnet. - Påfør akrylsement for å feste bunnplaten til hodeplaten (figur 2G). Bygg opp sideveggene med akrylmalingssement mellom bunnplaten og hodeplaten.
MERK: Akrylsement krymper når den stivner. Av denne grunn må du ikke fjerne mikroskopet før sementen stivner helt (dette trinnet tar minst 30 min). Sementering bør gjøres svært nøye for å unngå uønsket sementering av mikroskopet og dens objektive linse med akrylmalingssement. - Etter at akrylsement stivner helt, løsner du skruen og løfter mikroskopkroppen sakte.
- Hvis det er et gap på sideveggen, gjør om ekstra sementering for å beskytte den implanterte GRIN-linsen mot støv.
- Dekk bunnplaten for å beskytte det implanterte GRIN-objektivet mot støv og stram skruen på bunnplaten.
- Slipp hodeplaten fra hodestangen. Returner musen til hjem bur til fremtidig optisk bildebehandling.
5. Optisk opptak av GCaMP-signal under en atferdstest
MERK: Prosedyren for GCaMP-signalopptak under atferd kan være svært forskjellig avhengig av systemene som brukes til optisk avbildning, eksperimentell design og laboratoriemiljø. Derfor er det beskrevet på en enkel måte i denne delen.
- Utuk noen dager med håndtering før atferdstesten.
- Forbered atferdsapparatet (f.eks. fryktkondisjoneringskammer, atferdsprogramvare og Coulbourn Instrument) og bærbar datamaskin.
- Koble mikroskopet til DAQ-boksen og slå på DAQ-boksen.
- Koble DAQ-boksen til bærbar datamaskin via trådløs Internett-tilkobling.
- Start DAQ-programvaren (Firefox-nettleseren anbefales) på den bærbare datamaskinen. Klikk Filbehandling-knappen, og kontroller gjenværende lagringskapasitet for DAQ-boksen for lagring av registrerte data.
MERK: Datastørrelsen er ca. 80 GB i 30 min opptak. - Angi den nødvendige informasjonen (Dato, muse-IDosv.)i den definerte økten, og skriv inn Kjør-økten.
- Ta forsiktig musen og fjern bunnplatedekselet på hodet. Plassere mikroskopet på baseplateplattformen.
- Stram bunnplateskruen og plasser dyret med et hodemontert mikroskop i atferdskammeret.
MERK: Musen prøver å unnslippe i dette trinnet hvis håndteringen ikke er nok. - Koble NI-kortet til TRIG-porten på DAQ-boksen ved hjelp av en BNC-kabel. NI-kortet mottar TTL-signaler fra atferdsprogramvare (f.eks. FreezeFrame) og koordinerer samtidig registreringsprosedyre for GCaMP-signal og dyrets oppførsel.
- Juster brennvidet.
MERK: Fokalplanet bestemmes av avstanden mellom objektivobjektiven av mikroskop og GRIN-linsen implantert i hjernen. For å justere fokalplanet manipuleres objektivposisjonen mens du observerer bilder. Avstanden mellom de to linsene som viser klar morfologi av celler og blodkar er satt som fokalplan for avbildning. I denne protokollen brukes DAQ-programvaren til å kontrollere bevegelsen av objektivobjektivet under justering. - Angi optimalisert eksponeringstid, forsterkning, LED-strøm i Kjør-økten.
MERK: Vanligvis brukes 50 ms til eksponeringstid. Gevinst og LED-kraft er satt basert på bilde histogrammer. Histogrammer indikerer fordelingen av fluorescensintensiteten til pikslene. Basert på visuell inspeksjon, bør høyre kant av histogrammet ha en verdi mellom 40% og 60% i tilfelle av GCaMP7b. Det endres avhengig av GECIer som brukes til avbildning. - Endre opptaksalternativet til Utløst opptak. Klikk Registrer, og start virkemåten.
MERK: Alternativet for utløst opptak gir en samsvarende tidslinje for opptaksøkten og atferdsøkten. Hvis TTL-signalet mottas, slås et rødt lys over TRIG-porten seg på. - Etter endt atferdstest, ta av mikroskopet og fest bunnplatedekselet.
- Returner musen til hjemmeburet. Velg deretter Filbehandling og eksporter data fra DAQ-boksen.
- Etter atferdstesten, ofre musen for postmortem histologisk verifisering.
6. Databehandling
MERK: Databehandlingsprosedyren er svært forskjellig avhengig av databehandlingsprogramvaren og GECIene som brukes til bildeeksperimentet. Derfor er det beskrevet på en enkel måte i denne delen. Denne protokollen bruker kommersiell databehandlingsprogramvare (se Materials tabell). Alternativt kan annen åpen kildekode-programvare som er nevnt i diskusjonsdelen, også brukes uten problem. Variablene som brukes i denne protokollen, er oppført i tabell 1.
- Importer videodatafilen for opptak (1280 piksler x 800 piksler) fra DAQ-boksen til stasjonær datamaskin for databehandling. Start databehandlingsprogramvaren.
MERK: Databehandlingsprogramvaren er forskjellig fra DAQ-programvare i tidligere trinn. I databehandlingsprogramvare er det 6 trinn: nedprøvetaking, beskjæring, romlig filter, bevegelseskorrigering, ΔF / F-beregning, hendelsesdeteksjon som er nødvendige for å trekke ut encellede kalsiumtransientdata fra innspilt video. - Downsample og beskjære videoen.
MERK: Nedsampling og beskjæring er nødvendig for å øke databehandlingshastigheten. Beskjær området unntatt interesseområde der GCaMP-signalet observeres. - Påfør avstandsfilter. Når du har brukt romlig filter, oppretter du et projeksjonsbilde med gjennomsnittsintensitet.
MERK: Romlig filter skiller hver piksel i innspilt videobilde og gir et bilde med høy kontrast. Det finnes to typer cut-off filter, lav og høy cut-off filter. Den høyere verdien av lave cut-off filtre øker kontrasten til bildet, men samtidig øker den generelle grå støyen også. Den lavere verdien av høyt avskåret filter gjør at bildet blir uskarpt. - Påfør bevegelseskorrigering. Bruk bildet av anslag for gjennomsnittsintensitet som referansebilde for bevegelseskorrigering.
- Bruk bevegelseskorrigering på nytt ved hjelp av bildet av første bilde som referansebilde.
MERK: To trinn med bevegelseskorrigering reduserer bevegelsesartefakten betydelig. - Bruk ΔF/F-beregning for å visualisere piksler som viser en endring i lysstyrken.
MERK: Lysstyrkeendringen av piksler skyldes fluorescensintensitetsendring av GCaMP, og det indikerer kalsiumtransienter. - Påfør PCA/ICA-algoritmen til å visualisere kalsiumtransient kurve i hver celle.
MERK: PCA/ICA er en algoritme for sortering av en gruppe data i et sett med enkeltkomponentdata. Variablene bør optimaliseres for hver laboratorietilstand. I denne protokollen er alle variabler standard unntatt ICA temporal vekt (0,4 brukes i denne protokollen)27. - Fjern merket for manuelt ikke-nevronale komponenter blant identifiserte komponenter basert på kriteriene som er beskrevet i følgende merknad.
MERK: To hovedkriterier brukes til dette formålet. Først ser GCaMP-signalet ut fra en nevron som en klar sfærisk form. Dermed er bare signalet med en klar sfærisk form valgt som en nevron. For det andre, gitt diameteren på cellekroppen av amygdala pyramidecelle er kjent for å være ca 20 μm28,29,30, bare signalet omtrent samsvarer med denne størrelsen er valgt som et nevron. For å bestemme størrelsen på GCaMP-signalet beregnes den faktiske størrelsen på en enkelt piksel basert på det tatt bildet av objektivoverflaten (trinn 3.9), og den maksimale bredden på enkelt sfærisk form beregnes. For eksempel, i denne protokollen, er diameteren på den implanterte GRIN linsen 600 μm. Derfor, hvis diameteren på objektivet er 800 piksler, er den faktiske størrelsen på enkeltpikselen 1,5 μm (20 μm ca. 7 piksler). - Påfør hendelsesdeteksjonsfunksjonen for å oppdage en betydelig økning av kalsiumtransient (kalsiumhendelse).
MERK: I dette trinnet kreves variabelen kalt hendelsens minste forfallstid (τ). I denne protokollen brukes 1.18s som en optimalisert variabel for GCaMP7b. Gjennomsnittlig halvforfallstid (t1/2=0,82s) beregnes basert på ΔF/F-kurve under spontan celleaktivitet. Siden GCaMP følger eksponentiell forfall, τ =
.
.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Validering av GRIN-objektivimplantasjon
Før du kronisk fester bunnplaten til hjernen ved å sementere, må GRIN-objektivimplantasjonen valideres. Hos dyr med vellykket linseimplantasjon ble både GCaMP som uttrykte celler og blodkar tydelig observert innenfor et brennviddeområde bestemt av avstanden mellom objektiv linse av mikroskop og implantert GRIN-linse (figur 2A og B). I motsetning, hos dyr med off-target implantasjon, ble et klart bilde av GCaMP som uttrykker celler ikke observert innenfor fokusplanområdet (enten ute av fokus eller ute av syne). Når det gjelder ute av fokus, kan godt fokuserte blodkar observeres, men bare uklare bilder for celler innenfor fokalplanområdet (figur 2C og D). Ved utsyn ble blodårene ikke observert i de fleste tilfeller, og det ble ikke påvist fluorescenssignal innenfor området for fokalplan (figur 2E). Videre, i motsetning til andre tilfeller, viste den implanterte GRIN linsen en lys kant (Figur 2F). Bunnplatetilbehøret utføres kun på validerte dyr med på målMILSe-objektivimplantasjon.
Registrering av GCaMP-signaler i LA-nevronen som svar på auditive stimuli
I denne protokollen ble 4 forekomster av pseudorandomisert tone (2,8 kHz, 200 ms varighet, 25 pulser) presentert for en mus, og GCaMP-signaler ble optisk registrert i LA-cellene til mus med hodemontert mikroskop. Mus injisert med AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE i den ensidige laterale amygdala ble brukt til avbildningen. Hos dyr med vellykket GRIN-linseimplantasjon ble virus som uttrykker celler og blodkar tydelig observert innenfor fokusplanområdet (figur 3A). I atferdstilstanden viste ca. 50-150 celler vanligvis en betydelig fluorescensendring i synsfeltet i LA selv uten tone som vist i ΔF/F-bilde, sannsynligvis spontant aktive celler (figur 3B). Ved tonepresentasjon viste bare noen få celler en tonedesifikk endring av GCaMP-signalet som bestemmes av ΔF/F-bildeanalyse (6 celler i figur 3C og figur 3D). De samme prosedyrene ble utført på mus injisert med AAV2/1-CaMKIIα-GFP som en kontroll. Selv om GFP-uttrykksceller ble oppdaget innenfor området for fokalplan, viste ingen celler en signifikant fluorescensendring med eller uten tone som bestemt av ΔF/F-bildeanalyse (figur 3E og figur 3F).
For histologisk verifisering av GCaMP-uttrykk og målretting av GRIN-objektiv, undersøkes koronardeler av postmortemhjernen under fluorescensmikroskopet (figur 4A og figur 4B). DAPI farging brukes til å bekrefte intakte celler og ingen tegn på vevsskade på grunn av betennelse i hjernevevet rundt GRIN linsen (Figur 4C).
Figur 1: Skjematisk arbeidsflyt og diagrammer for stereotaksisk kirurgi for in vivo mikroskopisk kalsiumavbildning i LA. (A) En skjematisk arbeidsflyt av in vivo mikroskopisk kalsiumavbildning i LA. (B) Et mikroskopisk bilde som viser todimensjonale koordinater av kraniotomisteder for virusinjeksjonen og GRIN-linseimplantatoperasjonen. To hodeskalleskruer og linsen danner en likesidet trekant. (C) Et diagram for den relative posisjonen mellom virusinjeksjonsstedet og det implanterte GRIN-objektivet, og skjematisk forklaring for beregning av "Verdi A". (D) Tverrsnitt av sementlaget fra skallen overflaten til hodeplaten i de siste trinnene av operasjonen. Harpiks tannsement bør dekke veggen av skruene og implantert GRIN linsen. Akryl sement påføres på harpiks dental sement. Hodeplaten er festet på sementlaget. Parafinfilm dekker den implanterte GRIN-linseoverflaten og beskytter den mot støv. Flyttbar epoksybinding forhindrer fraløsning av parafinfilm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Validering av GRIN-objektivimplantasjon og konfigurasjon av sementlag etter bunnplatetilbehør. (A) Et representativt endoskopisk øyeblikksbilde bilde fra dyr med vellykket GRIN linseimplantasjon. Både GCaMP som uttrykker celler og blodårer er tydelig observert. (B) Snapshot bilde av implantert GRIN linse overflaten fra dyr med vellykket GRIN linse implantasjon. (C) Et representativt endoskopisk øyeblikksbilde bilde fra dyr med out-of-focus GRIN linse implantasjon. (D) Øyeblikksbilde av den implanterte GRIN-linseoverflaten fra dyr med ut-av-fokus GRIN-objektivimplantasjon. Når det gjelder ute av fokus, blir blodkar noen ganger tydelig observert, men bare uklare bilder for celler innenfor fokalplanområdet. (E) Et representativt endoskopisk øyeblikksbilde bilde fra dyr med out-of-view GRIN linse implantasjon. I tilfelle av ut-av-syn, blodkar er ikke observert i de fleste tilfeller og ingen fluorescens signal oppdages innenfor fokalplanområdet. (F) Et øyeblikksbilde av den implanterte GRIN-linseoverflaten fra dyr med out-of-view GRIN-objektivimplantasjon. I motsetning til andre tilfeller observeres den lyse kanten i dette tilfellet. (G) Konfigurasjonen av sementlag for bunnplatetilbehør. Bunnplate og hodeplate er festet med akrylmalingssement. Det bør være et rom ufylt med akrylmalingssement mellom bunnplaten og GRIN-linsen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Registrering av GCaMP-signaler i LA-nevronene. (A til C) Data hentet fra en mus injisert med AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE. (A) Et representativt endoskopisk øyeblikksbildebilde under en atferdstest. GCaMP7b som uttrykker celler og blodårer ble tydelig observert innenfor området for fokalplan. (B) Et representativt øyeblikksbilde som viser ΔF/F-signal. Hvit linje angir celler som viste en betydelig fluorescensendring i interesseområdet under atferdstesten. Vektlinje = 50 μm. (C) Bilde av maksimal intensitetsprojeksjon. Totalt 6 celler viste en tonedespesifikk endring av GCaMP-signalet. Vektstangen = 50 μm. (D) Representant ΔF/F-spor av toneresponsive celler. Hver farge tilsvarer hver enkelt celle med samme farge i panelet (C). (E og F) Data hentet fra en mus injisert med AAV2/1-CaMKIIα-GFP. (E) Et representativt endoskopisk øyeblikksbildebilde under en atferdstest. GFP-uttrykksceller ble tydelig oppdaget innenfor området for fokalplan. (F) Et representativt øyeblikksbilde som viser ΔF/F-signal. Scale bar = 50μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Histologisk verifisering av GRIN-objektivposisjonen og GCaMP7b-uttrykket. (A) Et representativt koronarseksjonsbilde som viser GCaMP7b-uttrykk i LA. Skalalinje = 200μm.(B) Forstørret bilde. Vektlinje = 50 μm. (C) Fluorescens mikroskopisk bilde som viser DAPI fargingssignal. Skala bar = 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Faktor | Verdi |
| Romlig ned samplingsfaktor | 2 |
| Temporal ned samplingsfaktor | 2 |
| Romlig filter: Høy cut-off | 0.5 |
| Romlig filter: Lav cut-off | 0.005 |
| Bevegelseskorrigering: Høy cut-off | 0.016 |
| Bevegelseskorrigering: Lav cut-off | 0.004 |
| Bevegelseskorrigering: Maksoversettelse | 20 |
| ΔF/F referanseramme | Gjennomsnittlig ramme |
| PCA/ICA: blockSize | 1000 |
| PCA/ICA: konvergensTregelse | 1x10^-5 |
| PCA/ICA: icaTemporalWeight | 0.4 |
| PCA/ICA: num-cer | 120 |
| PCA/ICA: numPCer | 150 |
| PCA/ICA: unmixType | Timelige |
| Hendelsesdeteksjon: Forfall Konstant | 1.18 |
| Hendelsesregistrering: Terskel | 4 |
Tabell 1: Liste over variabler for databehandling
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dyktige kirurgi teknikker er avgjørende for å oppnå vellykket in vivo optisk kalsiumavbildning med head-mount miniatyr mikroskopi i dypere hjerneregioner som amygdala som vi beskrev her. Derfor, selv om denne protokollen gir en retningslinje for optimaliserte kirurgiske prosesser av baseplate vedlegg og GRIN linse implantasjon, kan ytterligere optimaliseringsprosesser være nødvendig for kritiske trinn. Som nevnt i protokolldelen koordinerer amygdala i kirurgi, luftstrømhastighet i baseplatevedleggstrinn, bildeanskaffelsesinnstillinger (bildefrekvens, LED-effekt, etc.) i kalsiumopptak og variabler (ICA temporal vekt, hendelses minste forfallstid, etc.) i databehandling må optimaliseres.
Baseplatetilbehørstrinnet kan endres. Hodeplaten er nødvendig fordi det bidrar til å fikse hodet på våkne mus under baseplatetilbehøret som utføres i mobilboligbur. Men hvis bobilburet ikke er forberedt i laboratoriet, er isoflurangassanestesisystemet et alternativ. For denne alternative måten kan konsentrasjonen av isoflurangass være kritisk. Vi observerte at GCaMP-signal sjelden oppdages i amygdala hos mus under 1,5 % isofluran. Tvert imot oppdages GCaMP-signalet under en 0,8% isoflurantilstand og mus forblir i en nesten våken tilstand, men uten betydelig hodebevegelse i denne tilstanden. Denne bedøvelsestilstanden gjør det dermed mulig å utføre bunnplatetilbehøret uten å bruke flere enheter som hodeplate og huskasse.
Ustabilt feste av skallen skrue, sement, bunnplate, og mikroskop kan føre til bevegelsesartefakter som kan korrigeres ved hjelp av bevegelseskorrigering programvarealgoritme. Bevegelsen av sideartikkelen antas å forårsake en uregelmessig type bevegelsesartefakter som ikke lett kan korrigeres med tilgjengelig bevegelseskorrigeringsprogramvare. Slike uregelmessige bevegelsesartefakter er minimale i de fleste overfladiske hjerneregioner som hippocampus og cortex. Det oppdages imidlertid ofte under optisk avbildning i amygdala. For å overvinne dette problemet foreslår denne protokollen implantering av GRIN-linsen 50 μm bort fra viral injeksjonsstedet til sidesiden (figur 1C), noe som i stor grad forbedrer bildeanskaffelsesprosessen ved å redusere de potensielle bevegelsesartefaktene som stammer fra sideartikkelen. Selv om vi setter 50 μm i forhold til det virale injeksjonsstedet, kan målkoordinaten for linseimplantasjon også stilles inn i forhold til sideåpningen. I denne protokollen begrunnet vi at det er mer kritisk å målrette nøyaktig det virale uttrykksstedet for vellykket ytelse av bildebehandling. Dermed brukte vi en viral injeksjonskoordinat som referanse for å angi målkoordinaten for linseimplantasjon. Gjennom gjentatte studier etablerte vi en optimal tilstand som tillot GRIN-objektivet effektivt å målrette viralt uttrykkende sted samtidig som vi unngår bevegelsesartefakter forårsaket av sidesideell ventrikkelbevegelse. Til slutt vil metoden som effektivt og nøyaktig kan korrigere eventuelle bevegelsesartefakter være til stor hjelp for å få tilgang til optisk avbildning til dypere hjerneregioner i fremtiden.
Selv om in vivo optisk kalsiumavbildning med hodemontert miniatyrmikroskop er et kraftig verktøy og har blitt optimalisert, er det fortsatt rom for forbedring i mange aspekter. Denne protokollen vil legge til rette for studier som tar sikte på å undersøke sanntids nevrale aktivitet i amygdala av fritt oppfører seg dyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren har ingenting å avsløre
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Samsung Science and Technology Foundation (Prosjektnummer SSTF-BA1801-10).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 26G needle | BD | 302002 | Surgery |
| AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE | Addgene | 104493-AAV1 | Surgery |
| AAV2/1-CaMKiiα-GFP | custom made | Surgery | |
| Acrylic-Dental cement (Ortho-jet Acrylic Pink) | Lang | 1334-pink | Surgery & Baseplate Attachment |
| Air flow manipulator | Neurotar | NTR000253-04 | Baseplate Attachment |
| Amoxicillin | SIGMA | A8523-5G | Surgery |
| Baseplate | INSCOPIX | 1050-002192 | Baseplate Attachment |
| Baseplate cover | INSCOPIX | 1050-002193 | Baseplate Attachment |
| Behavioral apparatus (chamber) | Coulbourn Instrument | Testcage | Behavior test |
| Behavioral apparatus (software) | Coulbourn Instrument | Freeze Frame | Behavior test |
| Carbon cage | Neurotar | 180mm x 70mm | Baseplate Attachment |
| Carprofen | SIGMA | PHR1452-1G | Surgery |
| Data processing software | INSCOPIX | INSCOPIX Data Processing Software | Baseplate Attachment & Behavior test |
| Dexamethasone | SIGMA | D1756-500MG | Surgery |
| Drill | Seyang | marathon-4 | Surgery |
| Drill bur | ELA | US1/2, Shank104 | Surgery |
| Glass needle | WPI | PG10165-4 | Surgery |
| GRIN lens (INSCOPIX Proview Lens Probe) | INSCOPIX | 1050-002208 | Surgery |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 84875 | Surgery |
| Head plate | Neurotar | Model 5 | Surgery |
| Hex-key | INSCOPIX | 1050-004195 | Baseplate Attachment |
| Laptop computer | Samsung | NT950XBV | Surgery & Baseplate Attachment |
| Lens holder, Stereotaxic rod (INSCOPIX proview implant kit) | INSCOPIX | 1050-004223 | Surgery |
| Microscope gripper | INSCOPIX | 1050-002199 | Baseplate Attachment |
| Microscope, DAQ software, hardware | INSCOPIX | nVista 3.0 | Baseplate Attachment & Behavior test |
| Mobile homecage | Neurotar | MHC V5 | Baseplate Attachment |
| Moterized arm | Neurostar | Customized | Surgery |
| Moterized arm software | Neurostar | Customized | Surgery |
| NI board | National instrument | Behavior test | |
| Removable epoxy bond | WPI | Kwik-Cast | Surgery |
| Resin cement (Super-bond) | Sun medical | Super bond C&B | Surgery |
| Skull screw | Stoelting | 51457 | Surgery |
| Stereotaxic electrode holder | ASI | EH-600 | Surgery |
| Stereotaxic frame | Stoelting | 51600 | Surgery |
| Stereotaxic manipulator | Stoelting | 51600 | Baseplate Attachment |
References
- Gonzalez, W. G., Zhang, H., Harutyunyan, A., Lois, C. Persistence of neuronal representations through time and damage in the hippocampus. Science. 365 (6455), 821-825 (2019).
- Ghandour, K., et al. Orchestrated ensemble activities constitute a hippocampal memory engram. Nature Communications. 10 (1), 2637 (2019).
- Grundemann, J., et al. Amygdala ensembles encode behavioral states. Science. 364 (6437), (2019).
- Krabbe, S., et al. Adaptive disinhibitory gating by VIP interneurons permits associative learning. Nature Neuroscience. 22 (11), 1834-1843 (2019).
- Betley, J. N., et al. Neurons for hunger and thirst transmit a negative-valence teaching signal. Nature. 521 (7551), 180-185 (2015).
- Jennings, J. H., et al. Visualizing hypothalamic network dynamics for appetitive and consummatory behaviors. Cell. 160 (3), 516-527 (2015).
- LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annual Review of Neuroscience. 23, 155-184 (2000).
- Burgoyne, R. D. Neuronal calcium sensor proteins: generating diversity in neuronal Ca2+ signalling. Nature Reviews Neuroscience. 8 (3), 182-193 (2007).
- Miyakawa, H., et al. Synaptically activated increases in Ca2+ concentration in hippocampal CA1 pyramidal cells are primarily due to voltage-gated Ca2+ channels. Neuron. 9 (6), 1163-1173 (1992).
- Denk, W., Yuste, R., Svoboda, K., Tank, D. W. Imaging calcium dynamics in dendritic spines. Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 372-378 (1996).
- Mank, M., et al. A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging. Nature Methods. 5 (9), 805-811 (2008).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2 (2013).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Zariwala, H. A., et al. A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo. Journal of Neuroscience. 32 (9), 3131-3141 (2012).
- Mittmann, W., et al. Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo. Nature Neuroscience. 14 (8), 1089-1093 (2011).
- Huber, D., et al. Multiple dynamic representations in the motor cortex during sensorimotor learning. Nature. 484 (7395), 473-478 (2012).
- Grewe, B. F., et al. Neural ensemble dynamics underlying a long-term associative memory. Nature. 543 (7647), 670-675 (2017).
- Cai, D. J., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).
- Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
- Zhang, L., et al. Miniscope GRIN Lens System for Calcium Imaging of Neuronal Activity from Deep Brain Structures in Behaving Animals. Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56 (2019).
- Jacob, A. D., et al. A Compact Head-Mounted Endoscope for In vivo Calcium Imaging in Freely Behaving Mice. Current Protocols in Neuroscience. 84 (1), 51 (2018).
- Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
- Xiong, B., et al. Precise Cerebral Vascular Atlas in Stereotaxic Coordinates of Whole Mouse Brain. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 128 (2017).
- Mukamel, E. A., Nimmerjahn, A., Schnitzer, M. J. Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data. Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).
- Millhouse, O. E., DeOlmos, J. Neuronal configurations in lateral and basolateral amygdala. Neuroscience. 10 (4), 1269-1300 (1983).
- McDonald, A. J. Neuronal organization of the lateral and basolateral amygdaloid nuclei in the rat. Journal of Comparative Neurology. 222 (4), 589-606 (1984).
- McDonald, A. J. Neurons of the lateral and basolateral amygdaloid nuclei: a Golgi study in the rat. Journal of Comparative Neurology. 212 (3), 293-312 (1982).
