Summary
वीवो माइक्रोएंडोस्कोपिक कैल्शियम इमेजिंग में एक अमूल्य उपकरण है जो स्वतंत्र रूप से व्यवहार करने वाले जानवरों में न्यूरोनल गतिविधियों की वास्तविक समय की निगरानी में सक्षम बनाता है। हालांकि इस तकनीक को एमिग्डाला में लगाना मुश्किल रहा है। इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य चूहों में एक लघुकृत माइक्रोस्कोप के साथ एमिग्डाला कोशिकाओं को सफलतापूर्वक लक्षित करने के लिए एक उपयोगी दिशानिर्देश प्रदान करना है।
Abstract
वीवो में स्वतंत्र रूप से चलती जानवरों में न्यूरोनल गतिविधियों की वास्तविक समय निगरानी व्यवहार के लिए न्यूरोनल गतिविधि को जोड़ने के लिए प्रमुख दृष्टिकोणों में से एक है। इस उद्देश्य के लिए, एक वीवो इमेजिंग तकनीक जो आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक (जीईसीआई), एक लघुकृत फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप, और एक ढाल अपवर्तक सूचकांक (जीआरआई) लेंस का उपयोग करके न्यूरॉन्स में कैल्शियम यात्रियों का पता लगाती है, विकसित किया गया है और कई मस्तिष्क संरचनाओं1,2,3,4,5,6पर सफलतापूर्वक लागू किया गया है। यह इमेजिंग तकनीक विशेष रूप से शक्तिशाली है क्योंकि यह कई हफ्तों तक दीर्घकालिक अवधि के लिए आनुवंशिक रूप से परिभाषित सेल आबादी की पुरानी एक साथ इमेजिंग को सक्षम बनाता है। हालांकि उपयोगी, इस इमेजिंग तकनीक को आसानी से मस्तिष्क संरचनाओं पर लागू नहीं किया गया है जो मस्तिष्क के भीतर गहरे का पता लगाते हैं जैसे कि एमिग्डाला, भावनात्मक प्रसंस्करण और साहचर्य भय स्मृति7के लिए एक आवश्यक मस्तिष्क संरचना। ऐसे कई कारक हैं जो इमेजिंग तकनीक को एमिग्डाला पर लागू करना मुश्किल बनाते हैं। उदाहरण के लिए, गति कलाकृतियों आमतौर पर गहरे मस्तिष्क क्षेत्रों में आयोजित इमेजिंग के दौरान अधिक बार होते हैं क्योंकि मस्तिष्क में गहरे प्रत्यारोपित एक सिर-माउंट माइक्रोस्कोप अपेक्षाकृत अस्थिर होता है। एक और समस्या यह है कि पार्श्व वेंट्रिकल प्रत्यारोपित ग्रिन लेंस के करीब तैनात है और श्वसन के दौरान इसके आंदोलन अत्यधिक अनियमित गति कलाकृतियों है कि आसानी से सही नहीं किया जा सकता है, जो यह मुश्किल एक स्थिर इमेजिंग दृश्य बनाने के लिए बनाता है पैदा हो सकता है । इसके अलावा, क्योंकि एमिग्डाला में कोशिकाएं आमतौर पर आराम या एनेस्थेटाइज्ड राज्य में शांत होती हैं, इसलिए बाद में इमेजिंग के लिए बेसप्लेटिंग प्रक्रिया के दौरान एमिग्डाला में जीईसीआई व्यक्त करने वाले लक्ष्य कोशिकाओं को ढूंढना और ध्यान केंद्रित करना मुश्किल है। यह प्रोटोकॉल इस तरह के गहरे मस्तिष्क क्षेत्र में वीवो कैल्शियम इमेजिंग में सफल होने के लिए सिर-माउंट लघुकृत माइक्रोस्कोप के साथ एमिग्डाला में जीईसीआई व्यक्त करने वाली कोशिकाओं को कुशलतापूर्वक लक्षित करने के लिए एक उपयोगी दिशानिर्देश प्रदान करता है। यह ध्यान दिया जाता है कि यह प्रोटोकॉल एक विशेष प्रणाली (जैसे, इनस्कोपिक्स) पर आधारित है लेकिन यह करने के लिए प्रतिबंधित नहीं है।
Introduction
कैल्शियम एक सर्वव्यापी दूसरा दूत है, जो लगभग हर सेलुलर कार्यों में महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहा है8। न्यूरॉन्स में, एक्शन संभावित फायरिंग और सिनैप्टिक इनपुट के कारण इंट्रासेल्युलर फ्री [सीए2+]9, 10में तेजी से बदलावहोताहै । इसलिए, कैल्शियम यात्रियों को ट्रैक करना न्यूरोनल गतिविधि की निगरानी करने का अवसर प्रदान करता है। जीईसीआई शक्तिशाली उपकरण हैं जो परिभाषित कोशिका आबादी और अंतर-सेलुलर डिब्बों में निगरानी [सीए2 +]की अनुमति देते हैं11,12। प्रोटीन आधारित कैल्शियम संकेतक के कई विभिन्न प्रकार के बीच, GCaMP, एक सीए2 + एक जीएफपी अणु13के आधार पर जांच, सबसे अनुकूलित है और इस तरह व्यापक रूप से इस्तेमाल किया GECI । इंजीनियरिंग के कई दौरों के माध्यम से, जीसीएएमपी के कई वेरिएंट12,14, 15,16विकसित किए गए हैं। हम इस प्रोटोकॉल16में हाल ही में विकसित GCaMPs, GCaMP7b में से एक का उपयोग करें । जीसीएएमपी सेंसर ने कई मॉडल जीवों जैसे विकास17में सीए2 + यात्रियों की इमेजिंग, एक विशिष्ट कॉर्टिकल लेयर 18 में वीवो इमेजिंग में, मोटर टास्क लर्निंग19में सर्किट गतिशीलता की माप और हिप्पोकैम्पस और एमियागला 20मेंअसोसिएटिव डर मेमोरी से संबंधित सेल पहनावा गतिविधि की इमेजिंग जैसे कई मॉडल जीवों में तंत्रिका सर्किट कार्यों के अध्ययन में बहुत योगदान दिया है।
जीईसीआई की ऑप्टिकल इमेजिंग के कई फायदे हैं22. जेनेटिक एन्कोडिंग जीईसीआई को कोशिकाओं के एक विशिष्ट सबसेट में दीर्घकालिक अवधि के लिए स्थिर रूप से व्यक्त करने में सक्षम बनाता है जिसे आनुवंशिक प्रोफ़ाइल या शारीरिक कनेक्टिविटी के विशिष्ट पैटर्न द्वारा परिभाषित किया जाता है। ऑप्टिकल इमेजिंग जीवित जानवरों में सैकड़ों से हजारों न्यूरॉन्स की वीवो क्रोनिक एक साथ निगरानी में सक्षम बनाता है। वीवो इमेजिंग और जीईसीआई के मस्तिष्क के भीतर जीईसीआई के विश्लेषण में कुछ ऑप्टिकल इमेजिंग सिस्टम विकसित किए गए हैं, जिनमें सिर-माउंट लघुकृत फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप 21,23,24,25केसाथ चूहों का स्वतंत्र रूप से व्यवहार किया जाता है । GECIs, GRIN लेंस पर आधारित वीवो ऑप्टिकल इमेजिंग तकनीक में होने के बावजूद, और एक सिर माउंट लघु माइक्रोस्कोप तंत्रिका सर्किट गतिविधि और व्यवहार के बीच लिंक का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण जा रहा है, एमिग्डाला के लिए इस तकनीक को लागू करने के कई तकनीकी गति कलाकृतियों के कारण बिना amygdala में GECIs व्यक्त कोशिकाओं को जीईसी को लक्षित करने से संबंधित मुद्दों के कारण मुश्किल हो गया है कि छवि अधिग्रहण और खोजने सेल इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य बेसप्लेट अटैचमेंट और ग्रिन लेंस प्रत्यारोपण की शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं के लिए एक उपयोगी दिशानिर्देश प्रदान करना है जो एमिग्डाला में वीवो ऑप्टिकल कैल्शियम इमेजिंग में सफल के लिए महत्वपूर्ण कदम हैं। यद्यपि यह प्रोटोकॉल एमिग्डाला को लक्षित करता है, यहां वर्णित अधिकांश प्रक्रियाएं आमतौर पर अन्य गहरे मस्तिष्क क्षेत्रों पर लागू होती हैं। यद्यपि यह प्रोटोकॉल किसी विशेष प्रणाली (जैसे, इनस्कोपिक्स) पर आधारित है, लेकिन अन्य वैकल्पिक प्रणालियों के साथ एक ही उद्देश्य आसानी से प्राप्त किया जा सकता है।
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Protocol
कोरिया एडवांस्ड इंस्टीट्यूट ऑफ साइंस एंड टेक्नोलॉजी में एनिमल एथिक्स कमेटी द्वारा सभी प्रक्रियाओं को मंजूरी दी गई । सभी प्रयोग संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति की गाइडलाइन के अनुसार किए गए।
नोट: इस प्रोटोकॉल में छह प्रमुख कदम होते हैं: वायरस इंजेक्शन सर्जरी, ग्रिन लेंस प्रत्यारोपण सर्जरी, ग्रिन लेंस प्रत्यारोपण का सत्यापन, बेसप्लेट अटैचमेंट, व्यवहार परीक्षण के दौरान जीएएमपी सिग्नल की ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग, और डेटा प्रोसेसिंग(चित्रा 1A)। सर्जरी के अलावा, वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर पैकेज (Inscopix) का उपयोग किया जाता है।
1. स्टीरियोटैक्सिक सर्जरी - एएवी वायरस इंजेक्शन
नोट: इस शल्य प्रक्रिया में इस्तेमाल माउस तनाव C57BL6/J है । जानवर के शरीर को सर्जरी के दौरान बाँझ कपड़े से ढका जाता है और प्रोटोकॉल में सभी चरण बाँझ दस्ताने पहनने के साथ किए जाते हैं। कई सर्जरी आमतौर पर एक ही दिन में नहीं किया जाता है। हालांकि, यदि एक ही दिन में कई चूहों को एक ही सर्जरी करनी होती है, तो चूहों के बीच सर्जिकल उपकरणों को कीटाणुरहित करने के लिए प्रत्येक माउस और 70% इथेनॉल के लिए ऑटोक्लेव किए गए सर्जिकल उपकरणों का एक अलग सेट का उपयोग करें। सर्जिकल प्रक्रिया के दौरान माउस को गर्म रखने के लिए, माउस को स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम में तय करने के बाद कस्टम-निर्मित सर्जिकल कंबल से ढका जाता है।
- 70% इथेनॉल के साथ सभी आवश्यक सर्जिकल उपकरणों को कीटाणुरहित करें, और एक हैमिल्टन सिरिंज और एक ग्लास पिपेट तैयार करें। आसुत पानी के साथ ग्लास पिपेट भरें।
नोट: प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले सभी सर्जिकल उपकरण ऑटोक्लेव किए जाते हैं। क्योंकि ग्रिन लेंस और खोपड़ी शिकंजा नसबंदी के लिए ऑटोक्लेव नहीं किया जा सकता है, ७०% इथेनॉल सूजन को रोकने के लिए एक कीटाणुनाशक के रूप में प्रयोग किया जाता है । हालांकि कोशिश नहीं की, नसबंदी के अन्य रूपों जैसे गैस या रासायनिक नसबंदी का इस्तेमाल किया जा सकता है। - इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा पेंटोबार्बिटल (शरीर के वजन के 83 मिलीग्राम∙kg-1) के साथ माउस को एनेस्थेटाइज करें। माउस के बेहोश होने के बाद, खोपड़ी पर फर को शेव करें।
- खोपड़ी के ऊपर की त्वचा को 70% इथेनॉल से साफ करें और माउस को स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम में ठीक करें। सावधानी से त्वचा को हटा दें और कपास-टिप एप्लिकेटर का उपयोग करके 35% हाइड्रोजन पेरोक्साइड समाधान के साथ खोपड़ी की सतह को मिटा दें। सर्जरी के दौरान कॉर्नियल सुखाने को रोकने के लिए स्नेहक आंख मरहम लगाएं।
नोट: हालांकि आमतौर पर केवल एस्पेप्टिक त्वचा की तैयारी के लिए 70% इथेनॉल का उपयोग करने में कोई समस्या नहीं होती है, लेकिन कीटाणुनाशक जैसे इओडोफर्स या क्लोरहेक्सिकीन समाधान, और 70% इथेनॉल के 3 वैकल्पिक दौर का उपयोग करके इसकी सिफारिश की जाती है। हाइड्रोजन पेरोक्साइड की उच्च एकाग्रता का उपयोग इस प्रोटोकॉल में यह सुनिश्चित करने के लिए किया जाता है कि माउस खोपड़ी पर संयोजी ऊतक को पूरी तरह से हटा दिया जाता है, जो बाद में इमेजिंग के दौरान गति विरूपण साक्ष्य को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि खोपड़ी पर कनेक्टिव ऊतक खोपड़ी में बेसप्लेट के दृढ़ लगाव में हस्तक्षेप करता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि 35% हाइड्रोजन पेरोक्साइड सामान्य रूप से उपयोग की जाने वाली (3%) की तुलना में बहुत अधिक है। - स्टीरियोटैक्सिक जांच धारक के साथ पिन को ठीक करें। पिन के साथ ब्रेग्मा और लैम्ब्डा की ऊंचाई को संरेखित करें।
- क्रैनिओटॉमी के लिए माउस खोपड़ी पर विशिष्ट स्थान का पता लगाएं।
नोट: वायरस इंजेक्शन के लिए पार्श्व एमिग्डाला (एलए) के निर्देशांक (एपी, एमएल, डीवी) = (-1.6 मिमी, -3.5 मिमी, -4.3 मिमी) इस प्रोटोकॉल (एपी) में ब्रेग्मा से हैं; पूर्वकाल-पीछे, एमएल; मध्यकालीन-पार्श्व, डीवी; पृष्ठीय-वेंट्रल, प्रत्येक संक्षिप्त नाम ब्रेग्मा से सापेक्ष अक्षीय दूरी को इंगित करता है)26। प्रत्येक प्रायोगिक स्थिति के लिए निर्देशांक को अनुकूलित किया जाना चाहिए। - खोपड़ी की सतह(चित्रा 1B)ड्रिल करें। फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) के साथ खोपड़ी के अंशों को धोएं। फोर्सप्स या 27 जी सुई का उपयोग करके शेष परत को हटा दें।
- खोपड़ी की ड्रिलिंग करते समय, मस्तिष्क के ऊतकों की सतह को नुकसान से बचने के लिए अंतिम ड्यूरा परत को छूने की कोशिश न करें। एक क्षतिग्रस्त मस्तिष्क सतह लेंस के चारों ओर सूजन का कारण बनती है, जो रिकॉर्डिंग के दौरान गंभीर गति कलाकृतियों और उच्च ऑटोफ्लोरेसेंस को प्रेरित करती है। क्रैनियोटॉमी का आकार 1.6 मिमी है। ड्रिल की गति 18,000 आरपीएम है, और बिट का आकार 0.6 मिमी है।
- ड्रिल साइट के मस्तिष्क ऊतक सतह से लक्ष्य amygdala साइट के लिए जीईएनएन लेंस को कम करने के लिए, ब्रेग्मा और लेंस प्रत्यारोपण के डीवी समन्वय से उजागर मस्तिष्क की सतह के बीच डीवी अंतर को घटाकर "वैल्यू ए" नाम की दूरी की गणना करें, जो ब्रेग्मा (इस मामले में 4.2 मिमी, चित्रा 1C)के आधार पर सेट किया गया है।
- ग्लास पिपेट में खनिज तेल के 3 माइक्रोन और एएवी वायरस समाधान का 0.7 माइक्रोन लोड करें।
नोट: मिनरल ऑयल वायरस के घोल और पानी को अलग करने में मदद करता है। 0.7 माइक्रोन ला वायरस इंजेक्शन के लिए एक अनुकूलित मात्रा है जो पूरी तरह से ला को कवर कर सकता है। - स्टीरियोटैक्सिक प्रोब होल्डर से पिन निकालें और उसमें ग्लास पिपेट को ठीक करें।
- चरण 1.5 में उल्लिखित इंजेक्शन साइट पर ग्लास पिपेट का पता लगाएं। रक्तस्राव पूरी तरह से बंद होने के बाद मस्तिष्क के ऊतकों में ग्लास पिपेट डालें।
- एक इंजेक्शन पंप का उपयोग कर एक गिलास पिपेट के माध्यम से वायरस वितरित करें।
नोट: वायरस के टाइटर को पर्याप्त संख्या में GCaMP व्यक्त करने वाली कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए 1 x10 13 vg/mL से अधिक होना चाहिए । इंजेक्शन की गति 0.1 μL/मिनट है और 10 मिनट के लिए फैलाना। अगर खून बह रहा है तो दिमाग की सतह को पीबीएस से धो लें। इस स्टेप में दिमाग की सतह गीली रखें। - इंजेक्शन खत्म करने के बाद, ग्लास पिपेट को धीरे-धीरे हटा दें।
2. स्टीरियोटैक्सिक सर्जरी - ग्रिन लेंस प्रत्यारोपण
नोट: ग्रिन लेंस प्रत्यारोपण सर्जरी इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम है। चूंकि ग्रिन लेंस आंदोलन की लगातार धीमी गति सफल ग्रिन लेंस प्रत्यारोपण के लिए महत्वपूर्ण है, इसलिए एक मोटराइज्ड सर्जरी आर्म उपयोगी हो सकता है। मोटराइज्ड सर्जरी आर्म एक स्टीरियोटैक्सिक मैनिपुलेटर है जिसे कंप्यूटर सॉफ्टवेयर द्वारा नियंत्रित किया जाता है। हालांकि इस प्रोटोकॉल में मोटरचालित हाथ का उपयोग किया जाता है, अन्य तरीकों का उपयोग तब तक किया जा सकता है जब तक कि लेंस प्रत्यारोपण के दौरान लगातार और धीरे-धीरे चलता है। डिवाइस के बारे में विस्तृत जानकारी सामग्री की तालिकामें है ।
- खोपड़ी ड्रिल दो खोपड़ी शिकंजा प्रत्यारोपण करने के लिए। पीबीएस के साथ सभी खोपड़ी अंशों को धोएं।
नोट: बाद में ऑप्टिकल इमेजिंग में गति कलाकृतियों को कम करने के लिए, कम से कम दो शिकंजा की आवश्यकता होती है। दो खोपड़ी शिकंजा और ग्रिन लेंस प्रत्यारोपण की स्थिति एक समभुज त्रिकोण(चित्रा 1B) केरूप में । क्रैनिओटॉमी का आकार पेंच के व्यास के साथ कसकर फिट होना चाहिए। यदि रक्तस्राव हो रहा है, तो रक्तस्राव की सतह को पीबीएस से धोएं। ड्रिल की गति 18,000 आरपीएम है, और बिट का आकार 0.6 मिमी है। - सूजन को रोकने के लिए 70% इथेनॉल के साथ शिकंजा को कीटाणुरहित करें। शिकंजा को जितना संभव हो उतना गहरा प्रत्यारोपित करें।
नोट: शिकंजा कसकर इस तरह के सीमेंट के रूप में अतिरिक्त आसंजन के बिना तय किया जाना चाहिए । - स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम पर एक मोटराइज्ड सर्जरी आर्म स्थापित करें। आवश्यक हार्डवेयर को लैपटॉप कंप्यूटर से कनेक्ट करें जिसमें नियंत्रित सॉफ्टवेयर(सामग्री की तालिका)स्थापित किया गया है।
- ग्रिन लेंस को कम करने से पहले, 26 जी सुई के साथ सुई ट्रैक बनाने के लिए तैयार करें।
नोट: सुई ट्रैक गाइड ट्रैक का एक प्रकार है कि इस तरह के इंजेक्शन पथ के साथ मस्तिष्क संरचना की एक गंभीर विरूपण के कारण के बिना amygdala के रूप में गहरे मस्तिष्क क्षेत्रों में अपेक्षाकृत मोटी मुस्कराहट लेंस प्रत्यारोपित करने में मदद करता है । इस गाइड ट्रैक को सुई ट्रैक कहा जाता है क्योंकि यह अपेक्षाकृत पतली 26 जी सुई की कम और उत्थान प्रक्रिया द्वारा बनाया जाता है। - स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम पर सुई को स्थिर रखने के लिए कैनुला धारक को संलग्न करें।
- कैनुला धारक के साथ 26 जी सुई पकड़ और सुई प्रविष्टि साइट के निर्देशांक की गणना।
नोट: इस प्रोटोकॉल में, सुई प्रविष्टि साइट के निर्देशांक वायरस इंजेक्शन साइट (एपी, एमएल, डीवी) = (-1.6 मिमी, -3.55 मिमी, -3.7 मिमी) से 50 माइक्रोन पार्श्व हैं। - नियंत्रित सॉफ्टवेयर और सुई की स्थिति में हेरफेर के लिए पूरी तैयारी का उपयोग करें।
- कंट्रोलिंग सॉफ्टवेयर चलाएं और कंट्रोलिंग सेशन शुरू करने के लिए स्टार्ट न्यू प्रोजेक्ट बटन का चयन करें।
नोट: नियंत्रण सत्र में, कई खाली बक्से और मेनू बटन हैं। ब्लैंक बॉक्स निर्देशांक के लिए इनपुट स्पेस हैं। खाली बक्से में निर्देशांक दर्ज करने के बाद, मोटर चालित स्टीरियोटैक्सिक आर्म गो टू बटन पर क्लिक करके चलता है। जब स्टीरियोटैक्सिक आर्म चल रहा होता है तो गो टू बटन स्टॉप बटन में बदल जाता है। कई मेनू बटन के बीच, इस प्रोटोकॉल में केवल टूल बटन की आवश्यकता होती है। - टूल बटन पर क्लिक करें। फ्रेम मेनू बटन कैलिब्रेट पर क्लिक करके कंट्रोलिंग सॉफ्टवेयर को कैलिब्रेट करें। अंशांकन वह प्रक्रिया है जिसके द्वारा जोड़तोड़ की वास्तविक स्थिति स्टीरियोड्राइव सॉफ्टवेयर पर मूल्यों के रूप में निर्धारित की जाती है।
- कंट्रोलिंग सॉफ्टवेयर चलाएं और कंट्रोलिंग सेशन शुरू करने के लिए स्टार्ट न्यू प्रोजेक्ट बटन का चयन करें।
- स्टीरियोटैक्सिक जोड़तोड़ का उपयोग कर खोपड़ी की सतह पर उजागर मस्तिष्क की सतह पर सुई की नोक का पता लगाएं।
नोट: सुई की गति उपकरण मेनू में माइक्रोड्राइव गति मेनू का उपयोग करके सेट की गई है। डिफॉल्ट स्पीड 3.0 एमएम/एस है। हालांकि, इस चरण में 0.5 मिमी/एस की गति की सिफारिश की जाती है। सुई की गति तीर चाबियों द्वारा नियंत्रित किया जाता है। - मस्तिष्क की सतह को गीला रखने के लिए पीबीएस की 2-3 बूंदें डालें। ला के उपयुक्त डीवी निर्देशांक के साथ कंप्यूटर स्क्रीन पर खाली बॉक्स में भरें। यदि मस्तिष्क की सतह शुष्क है, तो यह मस्तिष्क के ऊतकों में सुई के प्रवेश में बाधा डालती है।
- गो टू बटन पर क्लिक करके 26 जी सुई को कम करें। जब सुई डीवी निर्देशांक द्वारा निर्धारित लक्ष्य साइट तक पहुंचती है तो यह स्वचालित रूप से बंद हो जाती है। सुई की गति 100 माइक्रोन/मिनट है। अगर खून बह रहा है तो स्टॉप बटन पर क्लिक कर सुई को रोक लें और दिमाग की सतह को पीबीएस से धो लें। इस स्टेप में दिमाग की सतह गीली रखें। रक्तस्राव बंद होने के बाद, फिर से कम करना शुरू करें।
- सुई पूरी तरह से आगे बढ़ना बंद हो जाने के बाद, कंप्यूटर स्क्रीन पर खाली बॉक्स में 45.00 मिमी दर्ज करें।
नोट: 45.00 मिमी डीवी समन्वय का एक मूल्य है जो सुई को शुरुआत की स्थिति में वापसी करता है। - गो टू बटन पर क्लिक करके सुई को ऊंचा करें। सुई आंदोलन की गति 100-200 माइक्रोन/मिनट है।
- सुई बढ़ने बंद होने के बाद, मस्तिष्क की सतह पर पीबीएस को हटा दें। स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम से सुई और कैनुला धारक को अनइंस्टॉल करें। प्रयोगकर्ता आवश्यक होने पर स्टॉप बटन पर क्लिक करके सुई को मैन्युअल रूप से रोक सकता है।
- लेंस धारक के साथ स्टीरियोटैक्सिक रॉड से लैस करें। लेंस धारक को ग्रिन लेंस स्थापित करें।
नोट: इस प्रोटोकॉल में ला (व्यास में 0.6 मिमी, लंबाई में 7.3 मिमी) को लक्षित करने के लिए अनुकूलित ग्रिन लेंस का उपयोग किया जाता है। यदि लेंस धारक तैयार नहीं है, तो एक वैकल्पिक तरीका ग्रिन लेंस को पकड़ने के लिए बुलडॉग क्लिप का उपयोग करना है। - लेंस को 70% इथेनॉल के साथ कीटाणुरहित करें और स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम में स्टीरियोटैक्सिक रॉड संलग्न करें।
- खोपड़ी की सतह पर निर्धारित साइट पर मुस्कराहट लेंस की नोक का पता लगाएं (एक ही विधि चरण 2.8 में वर्णित है)।
नोट: ग्रिन लेंस का समन्वय (एपी, एमएल, डीवी) = (-1.6 मिमी, -3.55 मिमी, -4.2 मिमी)(चित्रा 1C)है। लेंस को अपनी नोक पर नुकसान से बचने के लिए खोपड़ी को नहीं छूना चाहिए। - चरण 2.16 में वर्णित लेंस प्रत्यारोपण के डीवी समन्वय से "वैल्यू ए" के पूर्ण मूल्य को घटाकर डीवी समन्वय की गणना करें।
- मस्तिष्क की सतह पर पीबीएस की 2-3 बूंदों को छोड़ दें। कंप्यूटर स्क्रीन पर खाली बॉक्स में लेंस को बढ़ाने के लिए कम करने के लिए 1000 माइक्रोन और 300 माइक्रोन दर्ज करें।
- जब तक यह लक्ष्य स्थल तक नहीं पहुंच जाता है तब तक ग्रिन लेंस के कम (1000 माइक्रोन नीचे) और स्थापना (300 माइक्रोन ऊपर) दोहराएं। इस ऊपर और नीचे की प्रक्रिया का उपयोग लेंस की प्रक्रिया को कम करने के कारण मस्तिष्क के ऊतकों के अंदर उत्पन्न दबाव को जारी करने में मदद करने के लिए किया जाता है जो अन्यथा प्रत्यारोपण पथ के साथ मस्तिष्क संरचनाओं की विकृति पैदा कर सकता है।
नोट: ग्रिन लेंस आंदोलन की गति १०० μm/मिनट है । यहां तक कि अगर खून बह रहा है, तो ग्रिन लेंस को स्थानांतरित करना बंद न करें और मस्तिष्क की सतह को पीबीएस से धोएं। इस स्टेप में दिमाग की सतह गीली रखें। यदि मस्तिष्क की सतह शुष्क है, मस्तिष्क ऊतक ग्रिन लेंस सतह से चिपक जाता है और यह मस्तिष्क संरचना की विकृति का कारण बनता है। - यदि ग्रिन लेंस लक्ष्य स्थल तक पहुंचता है, तो पीबीएस को हटा दें और ध्यान से ग्रिन लेंस, शिकंजा, और उनके साइडवॉल(चित्रा 1D)के आसपास राल दंत सीमेंट लागू करें।
नोट: खोपड़ी पर राल सीमेंट लगाने से गति कलाकृतियों को कम किया जा सकता है। इसके विपरीत, यदि राल सीमेंट गलती से खोपड़ी से जुड़ी मांसपेशियों को कवर करता है, तो यह गति कलाकृतियों को बढ़ाता है। - राल दंत सीमेंट कठोर होने के बाद, लेंस धारक से ग्रिन लेंस को अलग करें और खोपड़ी(चित्रा 1D)पर ऐक्रेलिक सीमेंट लागू करें।
- हेड प्लेट को अटैच करने के लिए लेंस होल्डर को स्टीरियोटैक्सिक रॉड से अलग करें और टेप का इस्तेमाल कर रॉड की नोक पर हेड प्लेट अटैच करें। पुष्टि करें कि सिर की प्लेट क्षैतिज है या नहीं।
नोट: एक झुका सिर प्लेट एक झुका देखने का कारण बनता है । मोबाइल होम केज सिस्टम (बेसप्लेट अटैचमेंट सेक्शन में) में माउस हेड को ठीक करने के लिए हेड प्लेट की जरूरत होती है। यदि प्रयोगकर्ता सिस्टम का उपयोग नहीं करता है, तो इस चरण (चरण 2.22) और निम्नलिखित चरण 2.23 को छोड़ दें। - धीरे-धीरे रॉड को तब तक कम करें जब तक कि सिर की प्लेट लेंस कफ के शीर्ष पर न हो। सिर की प्लेट 1000 माइक्रोन अधिक कम करें। हेडप्लेट की आंतरिक अंगूठी के दाहिने किनारे पर पता लगाने के लिए प्रत्यारोपित ग्रिन लेंस के लिए सिर की प्लेट को स्थानांतरित करें।
नोट: सिर की थाली प्रत्यारोपित मुस्कराहट लेंस सतह से कम तैनात किया जाना चाहिए; अन्यथा, माइक्रोएंडोस्कोप एक्रेएल सीमेंट के कारण फोकल प्लेन को समायोजित करने के लिए प्रत्यारोपित ग्रिन लेंस के लिए पर्याप्त दृष्टिकोण नहीं कर सकता है। - सीमेंट की परतों(चित्रा 1D)में हेड प्लेट संलग्न करने के लिए एक्रेलिक सीमेंट लागू करें।
- लेंस की सतह को धूल से बचाने के लिए प्रत्यारोपित ग्रिन लेंस सतह पर पैराफिन फिल्म संलग्न करें। इसके बाद पैराफिन फिल्म को लेंस की सतह पर बने रहने के लिए पैराफिन फिल्म पर रिमूवेबल एपॉक्सी बॉन्ड लगाएं।
- माउस के पेरिटोनियल गुहा में, एक एनाल्जेसिक (पीबीएस में 0.5 मिलीग्राम/एमएल) और डेक्सामेथासोन, एक एंटी-भड़काऊ दवा (पीबीएस में 0.02 मिलीग्राम/एमएल) समाधान का इंजेक्ट करें।
नोट: दवा की खुराक शरीर के वजन पर निर्भर है: कार्प्रोफेन (शरीर के वजन का 5मिलीग्राम∙-1) और डेक्सामेथासोन (शरीर के वजन का 0.2 मिलीग्राम∙kg-1)। कारप्रोफेन और डेक्सामेथासोन दोनों को सर्जरी के बाद और सर्जरी के बाद दिन में एक बार 7 दिनों के लिए प्रशासित किया जाता है। - 1 सप्ताह के लिए दवा प्रशासन के लिए घर पिंजरे के पानी में 0.3 मिलीग्राम/एमएल एमोक्सीसिलिन, एक एंटीबायोटिक मिलाएं।
- घर पिंजरे के लिए माउस वापस और वसूली और वायरस लेनदेन के लिए 5-8 सप्ताह की अनुमति देते हैं ।
नोट: माउस एक बिजली के कंबल पर एक पूर्व गर्म पिंजरे में बरामद किया जाता है जब तक माउस संवेदनाहारी से जागता है ।
3. ग्रिन लेंस प्रत्यारोपण का सत्यापन
नोट: ग्रिन लेंस प्रत्यारोपण के सत्यापन के बारे में जानकारी प्रदान करता है कि प्रत्यारोपित GRIN लेंस पर है GCaMP कोशिकाओं को व्यक्त करने के लिए लक्ष्य । इस जानकारी के आधार पर, प्रयोगकर्ता ऑफ-लक्षित ग्रिन लेंस प्रत्यारोपण के साथ जानवरों को छोड़कर व्यवहार परीक्षण और डेटा प्रसंस्करण जैसी समय लेने वाली प्रक्रियाओं से अपना समय बचाता है। सत्यापन प्रक्रिया के दौरान, GCaMP अभिव्यक्ति के साथ कोशिकाओं को देखने के रिकॉर्डिंग क्षेत्र में ध्यान केंद्रित किया जाना चाहिए । इस स्टेप में मोबाइल होम केज का इस्तेमाल किया जाता है। एक मोबाइल होम पिंजरे एक विशेष गोल आकार का उपकरण है जो सिर-निश्चित चूहों को ग्रिन लेंस प्रत्यारोपण और बेसप्लेट अटैचमेंट के सत्यापन के दौरान अपने पैरों को स्वतंत्र रूप से स्थानांतरित करने की अनुमति देता है। इस उपकरण में एक एयरलिफ्टिंग टेबल जिस पर सिर के पैर तय चूहों रखे जाते हैं, पैरों की ऐसी मुक्त आवाजाही को सक्षम बनाता है, हालांकि सिर तय होता है। एमिग्डाला के पार्श्व नाभिक में कोशिकाएं आमतौर पर आराम या एनेस्थेटाइज्ड राज्य में शांत होती हैं, इसलिए इन स्थितियों में GCaMP फ्लोरेसेंस सिग्नल शायद ही कभी पाए जाते हैं, जो ग्रिन लेंस प्रत्यारोपण और बेसप्लेट अटैचमेंट के सत्यापन के दौरान जीएएमपी को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं को खोजने के लिए बहुत मुश्किल, कभी-कभी असंभव बनाता है। हालांकि, पैरों की आवाजाही अक्सर एमिग्डाला के पार्श्व नाभिक की कोशिकाओं में जीएमपी फ्लोरेसेंस संकेत पैदा करती है और इस तरह माइक्रोस्कोप का पता लगाने में मदद कर सकती है। इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल में मोबाइल होम पिंजरे का उपयोग किया जाता है।
- मोबाइल होम केज सिस्टम में स्टीरियोटैक्सिक मैनिपुलेटर को इकट्ठा करें।
- माउस को 1.5% आइसोफ्लुएंज गैस के साथ एनेस्थेटाइज करें। माउस पूरी तरह से बेहोश होने के बाद, माउस को मोबाइल होम केज सिस्टम के हेड बार पर रखें।
- माउस के नीचे कार्बन पिंजरे का पता लगाएं। कार्बन पिंजरे को बंद करें और घर्षण के बिना पिंजरे को स्वतंत्र रूप से स्थानांतरित करने के लिए एयरफ्लो चालू करें। माउस के सक्रिय होने तक कुछ मिनट इंतजार करें।
नोट: एयरफ्लो की गति प्रत्येक प्रायोगिक स्थिति (यहां, 100 एल/मिनट) के लिए अनुकूलित की जानी चाहिए। - प्रत्यारोपित ग्रिन लेंस की सतह पर पैराफिन फिल्म और एपॉक्सी बॉन्ड निकालें और लेंस पेपर का उपयोग करके 70% इथेनॉल के साथ लेंस की सतह को मिटा दें।
- डेटा अधिग्रहण (डीएक्यू) सॉफ्टवेयर (जैसे, इनस्कोपिक्स) तैयार करें। इमेजिंग की स्थिति निर्धारित करें।
नोट: DAQ सॉफ्टवेयर माइक्रोस्कोप (एलईडी पावर, लेंस फोकस, आदि) और डेटा भंडारण को नियंत्रित करने के लिए प्रयोग कियाजाताहै ।- DAQ बॉक्स चालू करें और इसके लिए एक माइक्रोस्कोप प्लग करें। फिर, इसे सीधे केबल का उपयोग करके या वायरलेस इंटरनेट के माध्यम से लैपटॉप कंप्यूटर से कनेक्ट करें।
नोट: डीएक्यू सॉफ्टवेयर डीएक्यू बॉक्स (जैसे, इनस्कोपिक्स) नामक अतिरिक्त हार्डवेयर में स्थापित किया गया है। डीएक्यू बॉक्स को लैपटॉप कंप्यूटर से कनेक्ट करके, डीएक्यू सॉफ्टवेयर लैपटॉप कंप्यूटर में सुलभ हो जाता है। - इंटरनेट ब्राउज़र के माध्यम से डीएक्यू सॉफ्टवेयर तक पहुंचें (फ़ायरफ़ॉक्स की सिफारिश की जाती है)।
- परिभाषित सत्रमें सभी आवश्यक विवरण (तिथि, माउस आईडी,आदि)सेट करें। फिर सेव एंड जारी रखेंक्लिक करें। बचत के बाद, रन सत्र तक पहुंचें।
- रन सत्रमें, इमेजिंग शर्तों जैसे एक्सपोजर समय, लाभ, इलेक्ट्रॉनिक फोकस और एक्सपोजर-एलईडी पावर सेट करें।
नोट: लाभ और जोखिम-एलईडी शक्ति प्रयोगशाला की स्थिति के आधार पर अस्थिर कर रहे हैं । विद्युत फोकस के लिए अनुशंसित मूल्य 500 है और एक्सपोजर समय 50 एमएस है। एलईडी-पावर और लाभ को बदलने के लिए कोई प्रतिबंध नहीं है। हालांकि, प्रकाश की अधिक तीव्रता अधिक ब्लीडिंग का कारण बन सकती है। रिकॉर्डिंग का एक्सपोजर समय वीडियो रिकॉर्डिंग की फ्रेम दर निर्धारित करता है। अधिक फ्रेम दरों से सिग्नल की तीव्रता कम हो जाएगी। इमेजिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले जीईसीआई के लिए फ्रेम दरों को अनुकूलित किया जाना चाहिए।
- DAQ बॉक्स चालू करें और इसके लिए एक माइक्रोस्कोप प्लग करें। फिर, इसे सीधे केबल का उपयोग करके या वायरलेस इंटरनेट के माध्यम से लैपटॉप कंप्यूटर से कनेक्ट करें।
- माइक्रोस्कोप को स्टीरियोटैक्सिक मैनिपुलेटर पर रखने के लिए, स्टीरियोटैक्सिक जोड़तोड़ के लिए माइक्रोस्कोप तवे के साथ स्टीरियोटैक्सिक रॉड संलग्न करें।
नोट: तवे एक छोटी सी गौण है कि स्टीरियोटैक्सिक उपकरण से जुड़ा जा सकता है इसे लक्ष्य मस्तिष्क स्थान पर रखने के लिए एक माइक्रोस्कोप शरीर पकड़ । - माइक्रोस्कोप तवे के साथ माइक्रोस्कोप पकड़। माइक्रोस्कोप से जुड़े एलईडी लाइट को चालू करें और माइक्रोस्कोप को लंबवत संरेखित करें। प्रत्यारोपित ग्रिन लेंस की सतह से पता चलता है जब तक छवि देख जब तक माइक्रोस्कोप कम ।
- दृश्य के केंद्र के साथ प्रत्यारोपित ग्रिन लेंस के केंद्र संरेखित करें।
नोट: मुस्कराहट लेंस प्रत्यारोपण का सत्यापन इस चरण में आयोजित किया जा सकता है (परिणाम अनुभाग में उल्लेख किया गया है, चित्रा 2बी, चित्रा 2डी, चित्रा 2F)। - प्रत्यारोपित ग्रिन लेंस सतह की छवि कैप्चर करें (कीबोर्ड पर प्रिटी एससी बटन पर क्लिक करें)। बाद में डेटा प्रोसेसिंग (चरण 6.8) के दौरान गैर-न्यूरोनल घटकों का चयन करने के लिए प्रत्यारोपित ग्रिन लेंस सतह की छवि की आवश्यकता होती है।
- माइक्रोस्कोप की उपयुक्त स्थिति का पता लगाएं। GCaMP7b अभिव्यक्ति के साथ कोशिकाओं की खोज करने के लिए छवि को देखते हुए धीरे-धीरे माइक्रोस्कोप के उद्देश्य लेंस को ऊंचा करें।
नोट: छवि अधिग्रहण या एक्सपोजर-एलईडी पावर के लाभ को समायोजित करना आवश्यक हो सकता है। मुस्कराहट लेंस प्रत्यारोपण का सत्यापन इस चरण में आयोजित किया जा सकता है (परिणाम अनुभाग में उल्लेख किया, चित्रा 2ए, चित्रा 2सी, चित्रा 2E)।
4. बेसप्लेट अटैचमेंट
नोट: बेसप्लेट लगाव कदम मुस्कराहट लेंस प्रत्यारोपण के सत्यापन के बाद । बेसप्लेट चूहों के सिर पर माइक्रोस्कोप बढ़ते के लिए एक मंच है। जैसा कि पिछले खंड में उल्लेख किया गया है, इस प्रोटोकॉल में एक मोबाइल होम पिंजरे का उपयोग किया जाता है।
- ग्रिन लेंस प्रत्यारोपण को मान्य करने के बाद, माइक्रोस्कोप तवे से एक लघु माइक्रोस्कोप को अलग करें।
- माइक्रोस्कोप से बेसप्लेट अटैच करें। माइक्रोस्कोप के लिए बेसप्लेट के स्थिर लगाव के लिए हेक्स-कुंजी का उपयोग कर पेंच कस।
- माइक्रोस्कोप तवे के साथ माइक्रोस्कोप पकड़। माइक्रोस्कोप से जुड़े एलईडी लाइट को चालू करें और माइक्रोस्कोप को लंबवत संरेखित करें। प्रत्यारोपित ग्रिन लेंस की सतह देखे जाने तक माइक्रोस्कोप को कम करें। दृश्य के केंद्र के साथ प्रत्यारोपित ग्रिन लेंस के केंद्र संरेखित करें।
- माइक्रोस्कोप की उपयुक्त स्थिति का पता लगाएं। धीरे-धीरे माइक्रोस्कोप के उद्देश्य लेंस को एक फोकल प्लेन खोजने तक ऊंचा करें जो GCaMP7b अभिव्यक्ति(चित्रा 2A)के साथ कोशिकाओं की सर्वोत्तम छवियां देता है।
नोट: इस चरण के दौरान छवि अधिग्रहण या एक्सपोजर-एलईडी पावर के लाभ को समायोजित करना आवश्यक हो सकता है। - बेसप्लेट को हेड प्लेट(चित्रा 2G)से अटैच करने के लिए एक्रेलिक सीमेंट लागू करें। बेसप्लेट और हेड प्लेट के बीच एक्रेलिक सीमेंट के साथ साइडवॉल का निर्माण करें।
नोट: एक्रेलिक सीमेंट सिकुड़ती है जब यह कठोर । इस कारण से, माइक्रोस्कोप को तब तक न हटाएं जब तक कि सीमेंट पूरी तरह से कठोर न हो जाए (यह कदम कम से कम 30 मिनट लेता है)। एक्रेलिक सीमेंट के साथ माइक्रोस्कोप और उसके उद्देश्य लेंस के अवांछित सीमेंटिंग से बचने के लिए सीमेंटिंग बहुत सावधानी से की जानी चाहिए। - एक्रेलिक सीमेंट के बाद पूरी तरह से कठोर हो जाता है, पेंच को ढीला करें और माइक्रोस्कोप शरीर को धीरे-धीरे ऊंचा करें।
- यदि साइडवॉल पर गैप है, तो प्रत्यारोपित ग्रिन लेंस को धूल से बचाने के लिए अतिरिक्त सीमेंटिंग को फिर से करें।
- प्रत्यारोपित ग्रिन लेंस को धूल से बचाने के लिए बेसप्लेट को कवर करें और बेसप्लेट के पेंच को कसें।
- हेड बार से हेड प्लेट रिलीज करें। भविष्य ऑप्टिकल इमेजिंग तक घर पिंजरे के लिए माउस लौटें।
5. एक व्यवहार परीक्षण के दौरान GCaMP संकेत की ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग
नोट: ऑप्टिकल इमेजिंग, प्रयोगात्मक डिजाइन और प्रयोगशाला पर्यावरण के लिए उपयोग की जाने वाली प्रणालियों के आधार पर व्यवहार के दौरान जीएएमपी सिग्नल रिकॉर्डिंग की प्रक्रिया बहुत अलग हो सकती है। इसलिए इस धारा में इसे सरल तरीके से वर्णित किया गया है।
- व्यवहार परीक्षण से पहले हैंडलिंग के कई दिनों का संचालन करें।
- व्यवहार तंत्र (जैसे, डर कंडीशनिंग चैंबर, व्यवहार सॉफ्टवेयर, और Coulbourn साधन) और लैपटॉप कंप्यूटर तैयार करें।
- माइक्रोस्कोप को DAQ बॉक्स में प्लग करें और डीएक्यू बॉक्स चालू करें।
- वायरलेस इंटरनेट कनेक्शन के माध्यम से लैपटॉप कंप्यूटर के लिए DAQ बॉक्स कनेक्ट करें।
- लैपटॉप कंप्यूटर पर डीएक्यू सॉफ्टवेयर (फ़ायरफ़ॉक्स ब्राउज़र की सिफारिश की जाती है) शुरू करें। फाइल मैनेजर बटन पर क्लिक करें और रिकॉर्ड किए गए डेटा को सहेजने के लिए DAQ बॉक्स की शेष भंडारण क्षमता की जांच करें।
नोट: डेटा का आकार 30 मिनट रिकॉर्डिंग के लिए लगभग 80 जीबी है। - परिभाषित सत्र में आवश्यक जानकारी (तिथि, माउस आईडी,आदि)दर्ज करें और रन सत्र में प्रवेश करें।
- धीरे-धीरे माउस को पकड़ें और उसके सिर पर बेसप्लेट कवर हटा दें। माइक्रोस्कोप को बेसप्लेट प्लेटफॉर्म पर रखें।
- बेसप्लेट पेंच को कस लें और जानवर को एक सिर-माउंट माइक्रोएंडोस्कोप के साथ व्यवहार कक्ष में रखें।
नोट: माउस इस कदम में भागने की कोशिश करता है अगर हैंडलिंग पर्याप्त नहीं है। - बीएनसी केबल का उपयोग करके एनआई बोर्ड को डीएक्यू बॉक्स के ट्राईजी पोर्ट से कनेक्ट करें। एनआई बोर्ड व्यवहार सॉफ्टवेयर (जैसे, फ्रीजफ्रेम) से टीटीएल संकेत प्राप्त करता है और GCaMP सिग्नल और जानवर के व्यवहार की एक साथ रिकॉर्डिंग प्रक्रिया का समन्वय करता है।
- फोकल प्लेन को एडजस्ट करें।
नोट: फोकल प्लेन माइक्रोस्कोप के ऑब्जेक्टिव लेंस और मस्तिष्क में प्रत्यारोपित ग्रिन लेंस के बीच की दूरी से निर्धारित होता है। फोकल प्लेन को एडजस्ट करने के लिए इमेजेज को देखते समय ऑब्जेक्टिव लेंस पोजिशन में हेरफेर किया जाता है । उन दो लेंस है कि कोशिकाओं और रक्त वाहिकाओं की स्पष्ट आकृति विज्ञान से पता चलता है के बीच की दूरी इमेजिंग के लिए फोकल विमान के रूप में सेट है । इस प्रोटोकॉल में, डीएक्यू सॉफ्टवेयर का उपयोग समायोजन के दौरान ऑब्जेक्टिव लेंस के आंदोलन को नियंत्रित करने के लिए किया जाता है। - रन सत्रमें अनुकूलित एक्सपोजर समय, लाभ, एलईडी पावर सेट करें।
नोट: आम तौर पर, 50 एमएस जोखिम समय के लिए प्रयोग किया जाता है। लाभ और एलईडी शक्ति छवि हिस्टोग्राम के आधार पर सेट कर रहे हैं। हिस्टोग्राम पिक्सल की फ्लोरेसेंस तीव्रता के वितरण का संकेत देता है। दृश्य निरीक्षण के आधार पर, हिस्टोग्राम के दाहिने किनारे का GCaMP7b के मामले में 40% और 60% के बीच मूल्य होना चाहिए। यह इमेजिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले GECIs के आधार पर बदलता है। - रिकॉर्डिंग शुरूकरने के लिए रिकॉर्डिंग विकल्प बदलें । रिकॉर्ड पर क्लिक करें और व्यवहार शुरू करें।
नोट: ट्रिगर रिकॉर्डिंग विकल्प रिकॉर्डिंग सत्र और व्यवहार सत्र की एक मिलान समय रेखा प्रदान करता है। यदि टीटीएल सिग्नल प्राप्त होता है, तो ट्राइग पोर्ट के ऊपर एक लाल बत्ती चालू हो जाती है। - व्यवहार परीक्षण खत्म करने के बाद, माइक्रोस्कोप को अलग करें और बेसप्लेट कवर संलग्न करें।
- घर पिंजरे के लिए माउस लौटें। इसके बाद डीएक्यू बॉक्स से फाइल मैनेजर और एक्सपोर्ट डेटा का चयन करें।
- व्यवहार परीक्षण के बाद, पोस्टमॉर्टम हिस्टोलॉजिकल सत्यापन के लिए माउस का त्याग करें।
6. डेटा प्रोसेसिंग
नोट: डेटा प्रोसेसिंग प्रक्रिया डेटा प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर और इमेजिंग प्रयोग के लिए उपयोग किए जाने वाले जीईसीआई के आधार पर बहुत अलग है। इसलिए इस धारा में इसे सरल तरीके से वर्णित किया गया है। यह प्रोटोकॉल वाणिज्यिक डेटा प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करता है। वैकल्पिक रूप से, चर्चा अनुभाग में उल्लिखित अन्य ओपन सोर्स सॉफ्टवेयर का उपयोग भी कोई समस्या नहीं के साथ किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले चर तालिका 1में सूचीबद्ध हैं।
- रिकॉर्डिंग वीडियो डेटा फ़ाइल (1280 पिक्सल x 800 पिक्सल) को डेटा प्रोसेसिंग के लिए डेस्कटॉप कंप्यूटर में डीएक्यू बॉक्स से आयात करें। डाटा प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर लॉन्च करें।
नोट: डेटा प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर पिछले चरणों में डीएक्यू सॉफ्टवेयर से अलग है। डेटा प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर में, 6 चरण हैं: डाउन-सैंपलिंग, क्रॉपिंग, स्थानिक फिल्टर, मोशन करेक्शन, एएफ/एफ कैलकुलेशन, इवेंट डिटेक्शन जो रिकॉर्ड किए गए वीडियो से सिंगल सेल कैल्शियम क्षणिक डेटा निकालने के लिए आवश्यक हैं। - डाउनसांपल और फसल वीडियो।
नोट: डेटा प्रोसेसिंग गति को बढ़ावा देने के लिए डाउनसाम्पिंग और क्रॉपिंग आवश्यक है। ब्याज के क्षेत्र को छोड़कर उस क्षेत्र की फसल करें जहां जीएमपी सिग्नल मनाया जाता है। - स्थानिक फिल्टर लागू करें। स्थानिक फिल्टर लागू करने के बाद, एक मतलब तीव्रता प्रक्षेपण छवि बनाएं।
नोट: स्थानिक फ़िल्टर प्रत्येक पिक्सेल को रिकॉर्ड किए गए वीडियो इमेज में अलग करता है और एक उच्च कंट्रास्ट इमेज प्रदान करता है। कट-ऑफ फिल्टर, लो और हाई कट-ऑफ फिल्टर दो प्रकार के होते हैं। कम कट-ऑफ फिल्टर का उच्च मूल्य छवि के विपरीत बढ़ता है लेकिन एक ही समग्र ग्रे शोर में भी बढ़ जाता है। उच्च कट-ऑफ फ़िल्टर का कम मूल्य छवि को धुंधला बना देता है। - मोशन करेक्शन लागू करें। गति सुधार के लिए एक संदर्भ छवि के रूप में मतलब तीव्रता प्रक्षेपण छवि का प्रयोग करें।
- एक संदर्भ छवि के रूप में पहले फ्रेम की छवि का उपयोग कर फिर से गति सुधार लागू करें।
नोट: गति सुधार के दो कदम काफी गति विरूपण साक्ष्य कम । - चमक में बदलाव दिखाने वाले पिक्सल की कल्पना करने के लिए 1F/F कैलकुलेशन लागू करें।
नोट: पिक्सल की चमक परिवर्तन GCaMP के फ्लोरेसेंस तीव्रता परिवर्तन के कारण होता है, और यह कैल्शियम यात्रियों को इंगित करता है । - प्रत्येक कोशिका के कैल्शियम क्षणिक वक्र की कल्पना करने के लिए पीसीए/आईसीए एल्गोरिदम लागू करें।
नोट: पीसीए/आईसीए डेटा के एक समूह को एकल घटक डेटा के सेट में छांटने के लिए एक एल्गोरिदम है । प्रत्येक प्रयोगशाला की स्थिति के लिए चर को अनुकूलित किया जाना चाहिए। इस प्रोटोकॉल में, आईसीए टेम्पोरल वजन (0.4 इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाता है) को छोड़कर सभी चरडिफ़ॉल्टहैं। - निम्नलिखित नोट में वर्णित मानदंडों के आधार पर पहचाने गए घटकों के बीच मैन्युअल रूप से गैर-न्यूरोनल घटकों का चयन करें।
नोट: इस उद्देश्य के लिए दो प्रमुख मानदंडों का उपयोग किया जाता है। सबसे पहले, एक न्यूरॉन से उत्पन्न GCaMP संकेत एक स्पष्ट गोलाकार आकार की तरह दिखता है। इस प्रकार, केवल एक स्पष्ट गोलाकार आकार के साथ संकेत एक न्यूरॉन के रूप में चुना जाता है। दूसरा, एमिग्डाला पिरामिड सेल के सेल शरीर के व्यास को देखते हुए लगभग 20 माइक्रोन28, 29,30के रूप में जाना जाता है, केवल संकेत मोटे तौर पर इस आकार के साथ मेल खाता है एक न्यूरॉन के रूप में चुना जाता है। GCaMP संकेत के आकार का निर्धारण करने के लिए, एक पिक्सेल के वास्तविक आकार की गणना लेंस सतह (चरण 3.9) की कैप्चर की गई छवि के आधार पर की जाती है और एकल गोलाकार आकार की अधिकतम चौड़ाई की गणना की जाती है। उदाहरण के लिए, इस प्रोटोकॉल में, प्रत्यारोपित ग्रिन लेंस का व्यास 600 माइक्रोन है। इसलिए, यदि लेंस का व्यास 800 पिक्सल है, तो एकल पिक्सेल का वास्तविक आकार 1.5 माइक्रोन (20 माइक्रोन लगभग 7 पिक्सल) है। - कैल्शियम क्षणिक (कैल्शियम घटना) की एक महत्वपूर्ण वृद्धि का पता लगाने के लिए घटना का पता लगाने समारोह लागू करें।
नोट: इस चरण में, घटना को सबसे छोटा क्षय समय (τ) नामक चर की आवश्यकता होती है। इस प्रोटोकॉल में, 1.18s GCaMP7b के लिए एक अनुकूलित चर के रूप में प्रयोग किया जाता है। कोशिकाओं की सहज गतिविधि के दौरान औसत आधा क्षय समय (टी1/2= 0.82s) की गणना 1F/F वक्र के आधार पर की जाती है। चूंकि GCaMP घातीय क्षय का पालन करता है, τ =
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Representative Results
ग्रिन लेंस प्रत्यारोपण का सत्यापन
लंबे समय से सीमेंटीकरण द्वारा मस्तिष्क को बेसप्लेट संलग्न करने से पहले, ग्रिन लेंस प्रत्यारोपण को मान्य करने की आवश्यकता है। सफल लेंस प्रत्यारोपण वाले जानवरों में, जीसीएएमपी एक्सप्रेसिंग कोशिकाओं और रक्त वाहिकाओं दोनों को माइक्रोस्कोप के उद्देश्य लेंस और प्रत्यारोपित ग्रिन लेंस(चित्रा 2ए और बी)के बीच की दूरी से निर्धारित फोकल प्लेन रेंज के भीतर स्पष्ट रूप से देखा गया था। इसके विपरीत, ऑफ-टारगेट प्रत्यारोपण वाले जानवरों में, फोकल प्लेन रेंज (या तो आउट-ऑफ-फोकस या आउट-ऑफ-व्यू) के भीतर कोशिकाओं को व्यक्त करने वाली GCaMP की एक स्पष्ट छवि नहीं देखी गई थी। आउट-ऑफ-फोकस के मामले में, अच्छी तरह से केंद्रित रक्त वाहिकाओं को देखा जा सकता है लेकिन फोकल प्लेन रेंज(चित्रा 2सी और डी)के भीतर कोशिकाओं के लिए केवल धुंधली छवियां हैं। आउट-ऑफ-व्यू के मामले में, अधिकांश मामलों में रक्त वाहिकाओं को नहीं देखा गया था और फोकल प्लेन रेंज(चित्रा 2E)के भीतर कोई फ्लोरेसेंस सिग्नल नहीं पाया गया था। इसके अलावा, अन्य मामलों के विपरीत, प्रत्यारोपित ग्रिन लेंस ने एक उज्ज्वल बढ़त(चित्रा 2F) दिखाया। बेसप्लेट लगाव केवल लक्षित ग्रिन लेंस प्रत्यारोपण के साथ मान्य जानवरों पर आयोजित किया जाता है।
श्रवण उत्तेजनाओं के जवाब में ला न्यूरॉन में GCaMP संकेतों की रिकॉर्डिंग
इस प्रोटोकॉल में, छद्मरणयुक्त स्वर (2.8 किलोहर्ट्ज, 200 एमएस अवधि, 25 दालों) के 4 उदाहरण एक माउस को प्रस्तुत किए गए थे, और जीसीएएमपी संकेतों को सिर-माउंट माइक्रोएंडोस्कोप के साथ चूहों की ला कोशिकाओं में ऑप्टिकल रूप से दर्ज किया गया था। एकतरफा पार्श्व एमिग्डाला में AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE के साथ इंजेक्शन चूहों इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया गया । सफल ग्रिन लेंस प्रत्यारोपण वाले जानवरों में, कोशिकाओं और रक्त वाहिकाओं को व्यक्त करने वाले वायरस को फोकल प्लेन रेंज(चित्रा 3 ए)के भीतर स्पष्ट रूप से देखा गया था। व्यवहार की स्थिति में, लगभग 50-150 कोशिकाओं ने आमतौर पर ला में देखने के क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण फ्लोरेसेंस परिवर्तन प्रदर्शित किया, जैसा कि बिना टोन के भी, अनायास सक्रिय कोशिकाओं(चित्रा 3B)में दिखाया गया है। टोन प्रस्तुति पर, केवल कुछ कोशिकाओं ने GCaMP संकेत के एक टोन-विशिष्ट परिवर्तन को प्रदर्शित किया जैसा कि ΤF/F छवि विश्लेषण (चित्रा 3C और चित्रा 3 डीमें 6 कोशिकाएं) द्वारा निर्धारित किया गया था। एक नियंत्रण के रूप में AAV2/1-CaMKIIα-GFP के साथ इंजेक्शन चूहों पर एक ही प्रक्रियाओं का आयोजन किया गया । हालांकि GFP व्यक्त कोशिकाओं फोकल विमान रेंज के भीतर का पता चला, कोई कोशिकाओं के साथ या टोन के बिना एक महत्वपूर्ण फ्लोरेसेंस परिवर्तन प्रदर्शित के रूप में ΤF/F छवि विश्लेषण(चित्रा 3E और चित्रा 3F)द्वारा निर्धारित ) ।
GCaMP अभिव्यक्ति के हिस्टोलॉजिकल सत्यापन और ग्रिन लेंस को लक्षित करने के लिए, पोस्टमॉर्टम मस्तिष्क के कोरोनल वर्गों फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप(चित्रा 4A और चित्रा 4B)के तहत जांच की जाती है । DAPI धुंधला बरकरार कोशिकाओं की पुष्टि करने के लिए प्रयोग किया जाता है और ग्रिन लेंस(चित्रा 4C)के आसपास मस्तिष्क के ऊतकों की सूजन के कारण ऊतक क्षति का कोई संकेत नहीं है ।
चित्रा 1: ला में वीवो माइक्रोएंडोस्कोपिक कैल्शियम इमेजिंग में स्टीरियोटैक्सिक सर्जरी के लिए योजनाबद्ध वर्कफ्लो और आरेख। (ए) ला में वीवो माइक्रोएंडोस्कोपिक कैल्शियम इमेजिंग में एक योजनाबद्ध कार्यप्रवाह। (ख) वायरस इंजेक्शन और ग्रिन लेंस प्रत्यारोपण सर्जरी के लिए क्रैनिओटॉमी साइटों के दो आयामी निर्देशांक दिखाते हुए एक सूक्ष्म चित्र । दो खोपड़ी शिकंजा और लेंस एक समभुज त्रिकोण बनाते हैं। (ग) वायरस इंजेक्शन साइट और प्रत्यारोपित ग्रिन लेंस के बीच सापेक्ष स्थिति के लिए एक आरेख, और "मूल्य एक" की गणना के लिए योजनाबद्ध विवरण । (घ) सर्जरी के अंतिम चरणों में खोपड़ी की सतह से हेडप्लेट तक सीमेंट की परत का क्रॉस-सेक्शन । राल दंत सीमेंट शिकंजा और प्रत्यारोपित मुस्कराहट लेंस की दीवार को कवर करना चाहिए। राल डेंटल सीमेंट पर एक्रेलिक सीमेंट लगाया जाता है। सीमेंट की परत पर हेडप्लेट जुड़ी होती है। पैराफिन फिल्म प्रत्यारोपित ग्रिन लेंस सतह को शामिल किया गया है और यह धूल से बचाने के लिए । हटाने योग्य एपॉक्सी बॉन्ड पैराफिन फिल्म को अलग करने से रोकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: बेसप्लेट अटैचमेंट के बाद ग्रिल लेंस प्रत्यारोपण और सीमेंट परतों के विन्यास का सत्यापन। (क) सफल ग्रिन लेंस प्रत्यारोपण वाले पशुओं से एक प्रतिनिधि एंडोस्कोपिक स्नैपशॉट छवि । कोशिकाओं और रक्त वाहिकाओं को व्यक्त करने वाले जीएएमपी दोनों स्पष्ट रूप से देखे जाते हैं। (ख) सफल ग्रिन लेंस प्रत्यारोपण के साथ जानवरों से प्रत्यारोपित ग्रिन लेंस सतह की स्नैपशॉट छवि । (ग) आउट-ऑफ-फोकस ग्रिन लेंस प्रत्यारोपण वाले पशुओं से एक प्रतिनिधि एंडोस्कोपिक स्नैपशॉट छवि । (घ) आउट-ऑफ-फोकस ग्रिन लेंस प्रत्यारोपण के साथ जानवरों से प्रत्यारोपित ग्रिन लेंस सतह की स्नैपशॉट छवि । आउट-ऑफ-फोकस के मामले में, रक्त वाहिकाओं को कभी-कभी स्पष्ट रूप से देखा जाता है लेकिन फोकल प्लेन रेंज के भीतर कोशिकाओं के लिए केवल धुंधली छवियां होती हैं। (ङ) आउट-ऑफ-व्यू ग्रिन लेंस प्रत्यारोपण वाले पशुओं से एक प्रतिनिधि एंडोस्कोपिक स्नैपशॉट छवि। आउट-ऑफ-व्यू के मामले में, अधिकांश मामलों में रक्त वाहिकाओं को नहीं देखा जाता है और फोकल प्लेन रेंज के भीतर कोई फ्लोरेसेंस सिग्नल नहीं पाया जाता है। (च) आउट-ऑफ-व्यू ग्रिन लेंस प्रत्यारोपण के साथ जानवरों से प्रत्यारोपित ग्रिन लेंस सतह की एक स्नैपशॉट छवि । अन्य मामलों के विपरीत, इस मामले में उज्ज्वल बढ़त देखी जाती है। (जी) बेसप्लेट अटैचमेंट के लिए सीमेंट लेयर्स का इनॉगरेशन । बेसप्लेट और हेडप्लेट एक्रेलिक सीमेंट से जुड़े होते हैं। बेसप्लेट और ग्रिन लेंस के बीच एक्रेलिक सीमेंट से खाली जगह होनी चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: ला न्यूरॉन्स में GCaMP संकेतों की रिकॉर्डिंग। (ए से सी) AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE के साथ इंजेक्शन माउस से प्राप्त डेटा। (क) व्यवहार परीक्षण के दौरान एक प्रतिनिधि एंडोस्कोपिक स्नैपशॉट छवि। GCaMP7b व्यक्त कोशिकाओं और रक्त वाहिकाओं को स्पष्ट रूप से फोकल विमान रेंज के भीतर मनाया गया । (ख) एक प्रतिनिधि स्नैपशॉट छवि जिसमें एफ/एफसिग्नल दिखाया गया है । व्हाइट लाइन उन कोशिकाओं को इंगित करती है जिन्होंने व्यवहार परीक्षण के दौरान ब्याज के क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण फ्लोरेसेंस परिवर्तन प्रदर्शित किया। स्केल बार = 50 माइक्रोन (C) अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण छवि। कुल 6 कोशिकाओं ने GCaMP संकेत के एक टोन-विशिष्ट परिवर्तन प्रदर्शित किया। स्केल बार = 50 माइक्रोन ( डी) प्रतिनिधि टोनउत्तरदायी कोशिकाओं के एफ/एफ निशान। प्रत्येक रंग पैनल (सी) में एक ही रंग के साथ प्रत्येक व्यक्तिगत कोशिका से मेल खाती है। (ई और एफ) AAV2/1-CaMKIIα-GFP के साथ इंजेक्शन माउस से प्राप्त डेटा। (ङ) व्यवहार परीक्षण के दौरान एक प्रतिनिधि एंडोस्कोपिक स्नैपशॉट छवि। GFP व्यक्त कोशिकाओं को स्पष्ट रूप से फोकल विमान रेंज के भीतर पता चला रहे थे । (F) एक प्रतिनिधि स्नैपशॉट छवि जिसमें एफ/एफसिग्नल दिखाया गया है । स्केल बार = 50μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4: ग्रिन लेंस स्थिति और GCaMP7b अभिव्यक्ति का हिस्टोलॉजिकल सत्यापन। (क) ला में GCaMP7b अभिव्यक्ति दिखा एक प्रतिनिधि कोरोनल अनुभाग छवि । स्केल बार = 200μm. (ख) बढ़ाया छवि। स्केल बार = 50 माइक्रोन( सी) फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपिक छवि दापी धुंधला संकेत दिखा। स्केल बार = 200 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| कारक | मान |
| स्थानिक नीचे नमूना कारक | 2 |
| अस्थायी नीचे नमूना कारक | 2 |
| स्थानिक फिल्टर: उच्च कट-ऑफ | 0.5 |
| स्थानिक फिल्टर: कम कट ऑफ | 0.005 |
| मोशन सुधार: हाई कट-ऑफ | 0.016 |
| मोशन सुधार: कम कट ऑफ | 0.004 |
| मोशन सुधार: मैक्सट्रांसलेशन | 20 |
| इसके बाद से एफ रेफरेंस फ्रेम | मतलब फ्रेम |
| पीसीए/आईसीए: ब्लॉकसाइज | 1000 |
| पीसीए/आईसीए: अभिसरण थ्रेसहोल्ड | 1x10 ^-5 |
| पीसीए/आईसीए: आईसीए टेम्पोरलवेट | 0.4 |
| पीसीए/आईसीए: न्यूनिक्स | 120 |
| पीसीए/आईसीए: numPCs | 150 |
| पीसीए/आईसीए: अनमिक्सटाइप | लौकिक |
| घटना का पता लगाने: क्षय स्थिर | 1.18 |
| इवेंट डिटेक्शन: दहलीज | 4 |
तालिका 1: डेटा प्रोसेसिंग के लिए चर की सूची
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Discussion
एमिग्डाला जैसे गहरे मस्तिष्क क्षेत्रों में सिर-माउंट लघु माइक्रोस्कोपी के साथ वीवो ऑप्टिकल कैल्शियम इमेजिंग में सफल प्राप्त करने के लिए कुशल सर्जरी तकनीक आवश्यक है जैसा कि हमने यहां वर्णित किया है। इसलिए, हालांकि यह प्रोटोकॉल बेसप्लेट अटैचमेंट और ग्रिन लेंस प्रत्यारोपण की अनुकूलित शल्य प्रक्रियाओं के लिए एक दिशानिर्देश प्रदान करता है, महत्वपूर्ण चरणों के लिए अतिरिक्त अनुकूलन प्रक्रियाएं आवश्यक हो सकती हैं। जैसा कि प्रोटोकॉल अनुभाग में उल्लेख किया गया है, सर्जरी में एमिग्डाला निर्देशांक, बेसप्लेट अटैचमेंट स्टेप में एयरफ्लो गति, इमेज एक्विजिशन सेटिंग्स (फ्रेम रेट, एलईडीपावर,आदि) कैल्शियम रिकॉर्डिंग और वेरिएबल्स (आईसीए टेम्पोरल वजन, इवेंट सबसे छोटा क्षय समय,आदि)में डेटा प्रोसेसिंग में अनुकूलित करने की आवश्यकता है।
बेसप्लेट अटैचमेंट स्टेप को संशोधित किया जा सकता है। हेड प्लेट आवश्यक है क्योंकि यह मोबाइल होम पिंजरे में आयोजित बेसप्लेट अटैचमेंट के दौरान जागने वाले चूहों के सिर को ठीक करने में मदद करता है। लेकिन अगर प्रयोगशाला में मोबाइल होम केज तैयार नहीं होता है तो आइसोफलुन गैस एनेस्थीसिया सिस्टम एक वैकल्पिक विकल्प है। इस वैकल्पिक तरीके के लिए, आइसोफ्लुरेन गैस की एकाग्रता महत्वपूर्ण हो सकती है। हमने देखा कि 1.5% आइसोफ्लुन के तहत चूहों के एमिग्डाला में जीकेएमपी सिग्नल शायद ही कभी पता लगाया जाता है। इसके विपरीत, जीसीएएमपी सिग्नल 0.8% आइसोफ्लोरैन स्थिति के तहत पता लगाया जाता है और चूहे लगभग जागती स्थिति में रहते हैं लेकिन इस स्थिति में पर्याप्त सिर आंदोलन के बिना। इस प्रकार यह एनेस्थेटाइजेशन स्थिति हेड प्लेट और मोबाइल होम केज जैसे अतिरिक्त उपकरणों का उपयोग किए बिना बेसप्लेट अटैचमेंट आयोजित करने की अनुमति देती है।
खोपड़ी पेंच, सीमेंट, बेसप्लेट और माइक्रोस्कोप का अस्थिर लगाव गति कलाकृतियों का कारण बन सकता है जिसे गति सुधार सॉफ्टवेयर एल्गोरिदम का उपयोग करके ठीक किया जा सकता है। पार्श्व वेंट्रिकल के आंदोलन को एक अनियमित प्रकार की गति कलाकृतियों का कारण माना जाता है जिसे वर्तमान में उपलब्ध गति सुधार सॉफ्टवेयर के साथ आसानी से ठीक नहीं किया जा सकता है। इस तरह की अनियमित गति कलाकृतियों हिप्पोकैम्पस और कॉर्टेक्स जैसे सबसे सतही मस्तिष्क क्षेत्रों में कम से कम हैं। हालांकि, एमिग्डाला में ऑप्टिकल इमेजिंग के दौरान इसका अक्सर पता लगाया जाता है। इस समस्या को दूर करने के लिए, इस प्रोटोकॉल में वायरल इंजेक्शन साइट से पार्श्व पक्ष(चित्रा 1C)तक 50 माइक्रोन को प्रत्यारोपित करने का सुझाव दिया गया है, जो पार्श्व वेंट्रिकल से उत्पन्न संभावित गति कलाकृतियों को कम करके छवि अधिग्रहण प्रक्रिया में काफी सुधार करता है। यद्यपि हम वायरल इंजेक्शन साइट के सापेक्ष 50 माइक्रोन सेट करते हैं, लेंस प्रत्यारोपण के लिए लक्ष्य समन्वय भी पार्श्व वेंट्रिकल के सापेक्ष सेट किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में, हमने तर्क दिया कि इमेजिंग के सफल प्रदर्शन के लिए वायरल एक्सप्रेसिंग साइट को सटीक रूप से लक्षित करना अधिक महत्वपूर्ण है। इस प्रकार, हमने लेंस प्रत्यारोपण के लक्ष्य समन्वय को निर्धारित करने के लिए एक संदर्भ के रूप में एक वायरल इंजेक्शन समन्वय का उपयोग किया। दोहराया परीक्षणों के माध्यम से, हमने एक इष्टतम स्थिति स्थापित की जिसने पार्श्व वेंट्रिकल आंदोलन के कारण गति कलाकृतियों से बचने के दौरान वायरल एक्सप्रेसिंग साइट को कुशलतापूर्वक लक्षित करने के लिए ग्रिन लेंस की अनुमति दी। अंततः, विधि है कि कुशलता से और सही किसी भी गति कलाकृतियों को सही कर सकते है भविष्य में गहरे मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए ऑप्टिकल इमेजिंग तक पहुंचने के लिए बहुत मदद मिलेगी ।
हालांकि सिर माउंट लघु माइक्रोस्कोप के साथ वीवो ऑप्टिकल कैल्शियम इमेजिंग में एक शक्तिशाली उपकरण है और अनुकूलित किया गया है, वहां अभी भी कई पहलुओं में सुधार के लिए जगह है । यह प्रोटोकॉल उन अध्ययनों को सुविधाजनक करेगा जिनका उद्देश्य स्वतंत्र रूप से व्यवहार करने वाले जानवरों के एमिग्डाला में वास्तविक समय की तंत्रिका गतिविधि की जांच करना है।
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Disclosures
लेखक के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है
Acknowledgments
इस काम को सैमसंग साइंस एंड टेक्नोलॉजी फाउंडेशन (प्रोजेक्ट नंबर एसएसटीएफ-BA1801-10) के अनुदानों द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 26G needle | BD | 302002 | Surgery |
| AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE | Addgene | 104493-AAV1 | Surgery |
| AAV2/1-CaMKiiα-GFP | custom made | Surgery | |
| Acrylic-Dental cement (Ortho-jet Acrylic Pink) | Lang | 1334-pink | Surgery & Baseplate Attachment |
| Air flow manipulator | Neurotar | NTR000253-04 | Baseplate Attachment |
| Amoxicillin | SIGMA | A8523-5G | Surgery |
| Baseplate | INSCOPIX | 1050-002192 | Baseplate Attachment |
| Baseplate cover | INSCOPIX | 1050-002193 | Baseplate Attachment |
| Behavioral apparatus (chamber) | Coulbourn Instrument | Testcage | Behavior test |
| Behavioral apparatus (software) | Coulbourn Instrument | Freeze Frame | Behavior test |
| Carbon cage | Neurotar | 180mm x 70mm | Baseplate Attachment |
| Carprofen | SIGMA | PHR1452-1G | Surgery |
| Data processing software | INSCOPIX | INSCOPIX Data Processing Software | Baseplate Attachment & Behavior test |
| Dexamethasone | SIGMA | D1756-500MG | Surgery |
| Drill | Seyang | marathon-4 | Surgery |
| Drill bur | ELA | US1/2, Shank104 | Surgery |
| Glass needle | WPI | PG10165-4 | Surgery |
| GRIN lens (INSCOPIX Proview Lens Probe) | INSCOPIX | 1050-002208 | Surgery |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 84875 | Surgery |
| Head plate | Neurotar | Model 5 | Surgery |
| Hex-key | INSCOPIX | 1050-004195 | Baseplate Attachment |
| Laptop computer | Samsung | NT950XBV | Surgery & Baseplate Attachment |
| Lens holder, Stereotaxic rod (INSCOPIX proview implant kit) | INSCOPIX | 1050-004223 | Surgery |
| Microscope gripper | INSCOPIX | 1050-002199 | Baseplate Attachment |
| Microscope, DAQ software, hardware | INSCOPIX | nVista 3.0 | Baseplate Attachment & Behavior test |
| Mobile homecage | Neurotar | MHC V5 | Baseplate Attachment |
| Moterized arm | Neurostar | Customized | Surgery |
| Moterized arm software | Neurostar | Customized | Surgery |
| NI board | National instrument | Behavior test | |
| Removable epoxy bond | WPI | Kwik-Cast | Surgery |
| Resin cement (Super-bond) | Sun medical | Super bond C&B | Surgery |
| Skull screw | Stoelting | 51457 | Surgery |
| Stereotaxic electrode holder | ASI | EH-600 | Surgery |
| Stereotaxic frame | Stoelting | 51600 | Surgery |
| Stereotaxic manipulator | Stoelting | 51600 | Baseplate Attachment |
References
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