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Chemistry

सीटू एक्स-रे विवर्तन अध्ययन में माइक्रोडायलिसिस द्वारा चिप पर प्रोटीन का क्रिस्टलीकरण

Published: April 11, 2021 doi: 10.3791/61660
Automatic Translation
1, 1,3, 1, 1, 2, 1
1Université Grenoble Alpes, CEA, CNRS, IBS, 2CNRS, Solvay LOF, UMR 5258, Université Bordeaux, 3ELVESYS SAS

Summary

यह पेपर डायलिसिस विधि के साथ और सीटू एक्स-रे विवर्तन प्रयोगों में ऑन-चिप प्रोटीन क्रिस्टलीकरण के लिए विकसित माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स के निर्माण प्रोटोकॉल का विवरण देता है। माइक्रोफैब्रिकेशन प्रक्रिया चिप की दो परतों के बीच किसी भी आणविक वजन कट-ऑफ के साथ एक अर्धप्रेमीजनित सेल्यूलोज डायलिसिस झिल्ली को एकीकृत करना संभव बनाती है।

Abstract

यह प्रोटोकॉल डायलिसिस विधि के साथ प्रोटीन ऑन-चिप को क्रिस्टलाइज करने और कमरे के तापमान पर सीटू सिंगल-क्रिस्टल या सीरियल क्रिस्टलोग्राफी प्रयोगों में अनुमति देने के लिए पूरी पाइपलाइन को कवर करने वाले प्रजनन योग्य और सस्ती माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों के निर्माण का वर्णन करता है। प्रोटोकॉल में माइक्रोचिप्स की निर्माण प्रक्रिया, ऑन-चिप क्रिस्टलीकरण प्रयोगों में हेरफेर और सीटू में के उपचार ने प्रोटीन नमूने के संरचनात्मक स्पष्टीकरण के लिए एक्स-रे विवर्तन डेटा एकत्र किया है। इस माइक्रोफैब्रिकेशन प्रक्रिया की मुख्य विशेषता चिप की दो परतों के बीच में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध, अर्धप्रतिमेणित पुनर्जनित सेल्यूलोज डायलिसिस झिल्ली के एकीकरण पर निहित है। एम्बेडेड झिल्ली का आणविक वजन कट-ऑफ मैक्रोमॉल्यूल और प्रीसिपिटेंट्स के आणविक वजन के आधार पर भिन्न होता है। डिवाइस माइक्रोफ्लुइडिक तकनीक के फायदों का फायदा उठाता है, जैसे नमूनों की मिनट वॉल्यूम (<1 माइक्रोल) का इस्तेमाल और ट्रांसपोर्ट की घटनाओं पर फाइन ट्यूनिंग । चिप ने उन्हें डायलिसिस विधि के साथ जोड़ा, क्रिस्टलीकरण प्रक्रिया पर सटीक और रिवर्सिबल नियंत्रण प्रदान किया और माइक्रोलिटर पैमाने पर प्रोटीन के चरण आरेखों की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। डिवाइस को ऑप्टिकली पारदर्शी पॉलीमेरिक सब्सट्रेट पर नरम छाप लिथोग्राफी के साथ फोटोकरेबल थिओलीन आधारित राल का उपयोग करके पैटर्न किया गया है। इसके अलावा, माइक्रोचिप्स रचना और पृष्ठभूमि शोर पैदा करने वाली सामग्रियों की पृष्ठभूमि बिखरने का मूल्यांकन सीटू एक्स-रे विवर्तन प्रयोगों के लिए चिप संगत प्रदान करने के लिए किया गया था। एक बार प्रोटीन क्रिस्टल एक पर्याप्त आकार और जनसंख्या एकरूपता तक चिप पर बड़े हो रहे हैं, माइक्रोचिप्स सीधे एक्स-रे बीम के सामने एक 3 डी मुद्रित धारक की सहायता से मुहिम शुरू की जा सकती है । यह दृष्टिकोण एक आसान और सस्ती तरीके से पारंपरिक प्रोटीन क्रिस्टलोग्राफी प्रयोगों में क्रायोप्रोटेक्टेंट और मैनुअल हार्वेस्टिंग के उपयोग से बढ़ती चुनौतियों का समाधान करता है। संरचना निर्धारण के लिए कमरे के तापमान पर विकसित कई, आइसोमॉर्फोस lysozyme क्रिस्टल से पूर्ण एक्स-रे विवर्तन डेटा सेट एकत्र किए गए थे।

Introduction

जैविक मैक्रोमॉलिक्यूल्स की त्रि-आयामी (3 डी) संरचना को स्पष्ट करना संरचनात्मक जीव विज्ञान में एक निरंतर खोज है जहां एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी प्रमुख जांच तकनीक बनी हुई है। प्रोटीन जैसे जटिल मैक्रोमॉलिक्यूल्स के संरचनात्मक विवरणों को जानने के लिए लागू, इसका उद्देश्य उनके कार्यों के तंत्र और विभिन्न जैविक कार्यों में उनकी भागीदारी की समझ को सुगम बनाने के लिए है । सिंक्रोट्रॉन और एक्स-रे फ्री-इलेक्ट्रॉन लेजर (एक्सएफईएलएस) में शक्तिशाली एक्स-रे स्रोत निकट परमाणु संकल्प पर प्रोटीन की संरचना में गहरी अंतर्दृष्टि के लिए आवश्यक सभी उपकरण प्रदान करते हैं। संरचनात्मक अध्ययन के लिए एक्स-रे के उपयोग के साथ आने वाले फायदों के बावजूद, एक्स-रे विकिरण और क्रिस्टलीकरण प्रक्रिया के लिए आंतरिक सीमाएं हैं। एक्स-रे बीम के सामने प्रोटीन क्रिस्टल के उच्च एक्स-रे प्रवाह और लंबे एक्सपोजर समय से उत्तेजित विकिरण क्षति प्रतिबंधात्मक पैरामीटर हैं जिन्हें क्रिस्टलोग्राफर को क्रायोजेनिक कूलिंग1का उपयोग करके पार करना पड़ता है। हालांकि , इष्टतम क्रायोकोलिंग स्थितियों को ढूंढना श्रमसाध्य हो सकता है क्योंकि देशी प्रोटीन संरचना या कलाकृतियों से अनुरूप परिवर्तन2,3छुपाए जा सकते हैं। इसके अलावा, हाल के अध्ययनों से संकेत मिलता है कि कमरे के तापमान पर विवर्तन प्रयोगों को अंजाम देने से विशिष्ट विकिरण क्षति4कम हो जाती है । संरचनात्मक जीव विज्ञान में एक और अड़चन पर्याप्त आकार5के साथ अच्छी तरह से विवर्तन क्रिस्टल का अधिग्रहण है। छोटे क्रिस्टल का उत्पादन करना आसान होता है, विशेष रूप से झिल्ली प्रोटीन के मामले में, लेकिन क्रायोकोलिंग स्थितियों के तहत भी विकिरण क्षति के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं क्योंकि बड़े प्रोटीन क्रिस्टल6के मामले की तुलना में एक उच्च विकिरण खुराक को छोटी मात्रा में निर्देशित किया जाना चाहिए। सिंक्रोट्रॉन और एक्सएफईएल में धारावाहिक क्रिस्टलोग्राफी7,8 का उपन्यास दृष्टिकोण विकिरण क्षति के नियंत्रित को दरकिनार कर सकता है और साथ ही कई से डेटा सेट को मिलाकर छोटे क्रिस्टल (200 एनएम से 2 माइक्रोन)का फायदा उठा सकता है, आइसोमॉर्फस और बेतरतीब ढंग से उन्मुख प्रोटीन क्रिस्टल और संबंधित तकनीकी प्रगति जैसे फेमटोसेकंड दालें, छोटे एक्सपोजर समय और माइक्रो-केंद्रित एक्स-रे बीम5, 7,9,10से profiting ।

माइक्रोफ्लुइडिक तकनीक एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी के लिए मूल्यवान है, जो जैविक मैक्रोमॉलिक्यूल्स के क्रिस्टलीकरण और उनकी संरचनात्मक जांच के लिए कई गुना लाभ प्रदर्शित करती है। माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में क्रिस्टलीकरण प्रयोगों का आयोजन करने के लिए प्रोटीन नमूने की छोटी मात्रा की आवश्यकता होती है, इसलिए इन उच्च मूल्यवान जैव मैक्रोमॉलिक्यूल्स की उत्पादन लागत को बाधित करता है और उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग और कई क्रिस्टलीकरण स्थितियों के अनुकूलन को सुविधाजनक बनाता है। इसके अलावा, माइक्रोफ्लुइडिक पैमाने पर अंतर्निहित बड़े सतह क्षेत्र-से-मात्रा अनुपात और प्रसार-सीमित परिवहन घटना प्रवाह और तापमान या एकाग्रता ढाल पर ठीक नियंत्रण सक्षम करते हैं11,12,13,14,समान रूप से आकार के क्रिस्टल उगाने और चरण आरेख15,16,17,18, 19की खोज के लिए उपयुक्त माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों को प्रतिपादित करते हैं। इसके अलावा, माइक्रोफ्लुइडिक उपकरण प्रोटीन क्रिस्टलोग्राफी में एक और बाधा को संबोधित करने के लिए एक विशिष्ट क्षमता प्रदर्शित करते हैं, जो नमूना वितरण है, और एक्स-रे विवर्तन प्रयोगों के लिए उनके उपयोग से पहले प्रोटीन क्रिस्टल को संभालने और फसल करने की आवश्यकता है। ऑन-चिप की विधि और सीटू एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी में क्रिस्टल हेरफेर और डेटा संग्रह से पहले क्रिस्टल गुणवत्ता की संभावित गिरावट को समाप्त करता है। सीटू एक्स-रे प्रोटीन क्रिस्टलोग्राफी में संगत माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स की एक विस्तृत श्रृंखला को माइक्रोफैब्रिकेशनसामग्री की प्रकृति से उत्पन्न संबंधित प्रतिबंधों और एक्स-रे14, 19,20, 22, 22,23के साथ उनकी बातचीत से संबंधित प्रतिबंधों से भिड़ने वाले कई शोध समूहों द्वाराडिजाइन,विकसित और परीक्षण किया गया है। निर्माण सामग्री ऑप्टिकल रूप से पारदर्शी, जैविक रूप से निष्क्रिय होनी चाहिए और एक्स-रे विकिरण और डेटा संग्रह के दौरान एक इष्टतम सिग्नल-टू-शोर अनुपात के लिए उच्च पारदर्शिता प्रदर्शित करती है।

पारंपरिक प्रोटीन क्रिस्टलोग्राफी24, 25 में लागू अधिकांश क्रिस्टलीकरण विधियों को माइक्रोफ्लुइडिक स्केल11, 14 पर चिप क्रिस्टलीकरण और सीटू एक्स-रे विवर्तन विश्लेषण में भी लागू किया गया है । वाष्प प्रसार26, वाष्पीकरण 27,मुफ्त इंटरफ़ेस प्रसार (एफआईडी) 28, माइक्रोबैच26,या यहां तक कि सीडिंग29 को शामिल करतेहुएसरल, हाइब्रिड, या बहुस्तरीय माइक्रोफ्लुइडिक उपकरण का उपयोग घुलनशील और झिल्ली प्रोटीन को क्रिस्टलाइज करने के लिए किया गया है। क्रिस्टलीकरण की स्थिति के उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग और अनुकूलनको अच्छी तरहसे आधारित 32, बूंद-आधारित33, या वाल्व-एक्ट्यूएटेड34उपकरणों में30, 31प्राप्त किया जा सकता है। सीटू में कमरे के तापमान पर चुनौतीपूर्ण प्रोटीन लक्ष्यों के एक्स-रे विवर्तन प्रयोग पीडीएमएस (पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन), सीओसी (चक्रीय ओलेफिन कोपॉलिमर), पीएमएमए (पॉली (मेथिल मेथाक्रिलेट))21,जैसी विभिन्न सामग्रियों से निर्मित माइक्रोचिप्स में किए गएहैं।22,26,28,29,ग्राफीन फिल्में23,कप्टन35,एपॉक्सी गोंद6,या एनओए (नॉर्लैंड ऑप्टिकल चिपकने वाला)19 और एक्स-रे विकिरण में सामग्री की पारदर्शिता और पृष्ठभूमि शोर में उनके योगदान का मूल्यांकन किया गया है। इसके अलावा, माइक्रोचिप्स को सिंक्ट्रोट्रॉन स्रोतों23, 35, 36और एक्सएफईएलएस7में एक्स-रे प्रोटीन क्रिस्टलोग्राफी प्रयोगों के लिए एक ही उपकरण में सीटू और धारावाहिक डेटा संग्रह रणनीतियों को जोड़े करने के लिए डिजाइन किया गया है।

सीटू डेटा संग्रह में कमरे का तापमान भी विभिन्न वितरण विधियों और उपकरणों में लागू किया गया है। उदाहरण के लिए, नोग्लि एट अल54 ने XFEL स्रोत का उपयोग करके धारावाहिक फेम्टोसेकंड क्रिस्टलोग्राफी (एसएफएक्स) द्वारा प्रकाश-चालित फोटॉन पंप बैक्टीरियोडोप्सिन (बीआर) की संरचना का अध्ययन करने के लिए लिपिडिक क्यूबिक चरण (एलसीपी) इंजेक्टर का उपयोग किया। बीआर की क्रिस्टल संरचना को 2.3 Å संकल्प तक हल किया गया था, जो समय-हल किए गए धारावाहिक फेम्टोसेकंड क्रिस्टलोग्राफी (टीआर-एसएफएक्स) के साथ एलसीपी इंजेक्टर की अनुकूलता का प्रदर्शन करता था। बैक्सटर एट अल55 ने एक उच्च घनत्व वाले बहु-क्रिस्टल ग्रिड को डिजाइन किया, जो विभिन्न आकारों के लेजर-कट छेद के साथ 100 या 200 माइक्रोन मोटी पॉली कार्बोनेट प्लास्टिक द्वारा निर्मित है। बैठे-बैठे या हैंगिंग-ड्रॉप क्रिस्टलाइजेशन प्रयोगों के लिए डिवाइस का उपयोग करते समय ग्रिड के एक तरफ अतिरिक्त 5 माइक्रोन मोटी पॉलीकार्बोनेट फिल्म तय की जा सकती है। इस उच्च घनत्व ग्रिड का उपयोग कई तरीकों से किया जा सकता है क्योंकि क्रिस्टल को सीधे डिवाइस के बंदरगाहों पर लोड किया जा सकता है या क्रिस्टल को वाष्प प्रसार या एलसीपी विधि द्वारा डिवाइस पर उगाया जा सकता है। इसके अलावा, ग्रिड को एक मानक चुंबकीय आधार में समायोजित किया जा सकता है और क्रायोजेनिक या कमरे के तापमान की स्थिति में सीटू एक्स-रे डेटा संग्रह में उपयोग किया जा सकता है। हाल ही में, फेलर एट अल56 ने न्यूनतम पृष्ठभूमि शोर योगदान के साथ क्रायोजेनिक और परिवेश के तापमान पर सीटू एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी में मैक्रोमॉलिक्यूलर के लिए एक नमूना धारक विकसित किया। विशेष रूप से, धारक एक प्लास्टिक का समर्थन, एक पारदर्शी COC पन्नी और एक माइक्रोपोरस संरचित पॉलीइमाइड पन्नी शामिल हैं । इसे क्रिस्टलीकरण बूंदों को स्थापित करने के लिए आमतौर पर उपयोग की जाने वाली कवर स्लाइड को बदलने के लिए डिज़ाइन किया गया था, जबकि क्रिस्टलीकरण ड्रॉप खोलने या क्रिस्टल को मैन्युअल रूप से संभालने के बिना लिगांड भिगोने, जटिल गठन और क्रायोजेनिक सुरक्षा जैसे इन-प्लेस हेरफेर की अनुमति दी गई थी। इसके अलावा, नमूना धारक को क्रिस्टलीकरण प्लेट से हटाया जा सकता है और मानक गोनियोमीटर-आधारित बीमलाइंस पर सीटू डेटा संग्रह में चुंबकीय आधार पर रखा जा सकता है। परिवेश तापमान डेटा संग्रह के लिए, सीओसी पन्नी प्रयोग से पहले हटा दिया जाता है और केवल 21 माइक्रोन मोटी पॉलीमाइड पन्नी पृष्ठभूमि बिखरने में योगदान देती है, जो इस मामले में न्यूनतम है। ये उदाहरण चल रहे शोध का केवल एक छोटा सा अंश और एक्स-रे प्रोटीन क्रिस्टलोग्राफी के लिए विकसित बहुमुखी माइक्रोचिप्स की भीड़ की रचना करते हैं।

हालांकि, डायलिसिस प्रोटीन क्रिस्टलीकरण विधि को माइक्रोफ्लुइडिक्स के भीतर व्यापक रूप से शामिल नहीं किया गया है। डायलिसिस एक प्रसार आधारित विधि है जिसका उद्देश्य प्रोटीन क्रिस्टलीकरण के लिए नाममात्र एकाग्रता से संपर्क करने के लिए अर्ध-पारगम्य झिल्ली के माध्यम से तेज़ एकाग्रता के संतुलन के लिए है और क्रिस्टलीकरण की स्थितियों पर सटीक और प्रतिवर्ती नियंत्रण सक्षम बनाता है24। अर्ध-पारगम्य डायलिसिस झिल्ली के आणविक वजन कट-ऑफ (MWCO) को मैक्रोमॉल्यूल के आणविक वजन और पूर्वसिपिटेंट के आधार पर चुना जा सकता है ताकि ब्याज के मैक्रोमॉल्यूल्यूल को बनाए रखते हुए छोटे तेज़ अणुओं के प्रसार की अनुमति दी जा सके। डायलिसिस प्रक्रिया की प्रतिवर्तीता के कारण, इसका उपयोग तापमान नियंत्रण के संयोजन में एक ही प्रोटीन नमूने का उपयोग करते हुए तेज़ एकाग्रता में फेरबदल करके चरण आरेखों की जांचके लिए स्वतंत्र रूप से नाभिक और क्रिस्टल विकास को अलग करने और अनुकूलित करने के लिए किया जा सकता है। माइक्रोफ्लुइडिक्स में झिल्ली के एकीकरण की समीक्षा डी जोंग एट अल द्वारा की जाती है।38 और जीव विज्ञान में डायलिसिस को माइक्रोचिप्स में प्रत्यारोपित करने वाले केस स्टडीज को मुख्य रूप से नमूना तैयारी, एकाग्रता या निस्पंदन अनुप्रयोगों39,40, 41,42या सेल से संबंधित अध्ययनों में सूचीबद्ध किया जा सकता है43,44। पीडीएमएस के माध्यम से पर्वापेशन का उपयोग शिम एट अलद्वारा विभिन्न स्थितियों में जाइलानेज़ के नाभिक और विकास का अध्ययन करने के लिए किया गया था। पानी माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के प्रोटीन जलाशय में 15 माइक्रोन मोटी पीडीएमएस झिल्ली के माध्यम से रिस चुका है, बाद में प्रोटीन और तेज़ एकाग्रता में फेरबदल ।

जुनियस एट अल द्वारा विकसित प्रोटोकॉल19,45 माइक्रोडायलिसिस के माध्यम से ऑन-चिप प्रोटीन क्रिस्टलीकरण और कमरे के तापमान पर सीटू एक्स-रे विवर्तन प्रयोगों में संगत माइक्रोफ्लुइडिक चिप के निर्माण के लिए प्रस्तुत किया जाता है। डिवाइस निर्माण के लिए प्रोटोकॉल सीधे नरम छाप लिथोग्राफी का उपयोग करके, फोटो-क्यूरेबल थिओलीन-आधारित राल एनओए81 एम्बेडिंग व्यावसायिक रूप से उपलब्ध झिल्ली के सूक्ष्म पैटर्न वाले स्टिकर के लिए स्टडर औरसहकर्मियोंद्वारा पूरा किए गए अग्रणी काम से प्रेरित है। विधि के एक अभिनव संशोधन के परिणामस्वरूप माइक्रोडायलिसिस के उपयोग को प्रोटीन क्रिस्टल के ऑन-चिप विकास के लिए प्रयोगात्मक मापदंडों की सटीक निगरानी और नियंत्रण करने में सक्षम बनाया गया और साथ ही माइक्रोफ्लुइडिक्स के फायदों का फायदा उठाते हुए, जैसे प्रति प्रयोग प्रोटीन नमूनों की कम खपत (<1 माइक्रोल)। पिछले काम में, तापमान-तेज़ एकाग्रता चरण आरेखों को मैप करके क्रिस्टलीकरण की स्थिति को स्क्रीनिंग और अनुकूलित करने के लिए मैक्रो-स्केल सिस्टम (विशिष्ट मात्रा >20 माइक्रोन) पर लागू डायलिसिस के सिद्धांतों का प्रदर्शनकियागया था। इस काम में, विभिन्न एमडब्ल्यूसीओ के पुनर्जीवित सेल्यूलोज (आर सी) डायलिसिस झिल्ली को शामिल करते हुए डायलिसिस माइक्रोचिप्स के उत्पादन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है ताकि क्रिस्टलीकरण पर-चिप और सीटू एक्स-रे विवर्तन डेटा संग्रह में किया जा सके। माइक्रोचिप्स को शामिल सामग्री एक्स-रे19 के लिए उनकी पारदर्शिता के लिए मूल्यांकन किया गया है और उपकरणों को सीधे एक्स-रे बीम के सामने सीटू विवर्तन प्रयोगों में कमरे के तापमान के लिए सेट किया जा सकता है, मैनुअल हैंडलिंग को छोड़कर और नाजुक प्रोटीन क्रिस्टल के क्षरण को कम करने । एक मामले के अध्ययन में, मुर्गी अंडे सफेद lysozyme क्रिस्टल माइक्रोडायलिसिस के माध्यम से चिप पर एक समान आकार की आबादी पैदा हो गए थे । माइक्रोचिप को तब एक्स-रे बीम के सामने 3 डी-मुद्रित समर्थन19 के साथ रखा गया था और सीटू विवर्तन डेटा सेट में पूरा किया गया था, जो चुनौतीपूर्ण मैक्रोमॉलिकुलर लक्ष्यों के सिंक्रोट्रॉन धारावाहिक क्रिस्टलोग्राफी अध्ययन के लिए चिप्स की उच्च क्षमता और प्रासंगिकता का प्रदर्शन करते हुए कई, आइसोमॉर्फस क्रिस्टल से कमरे के तापमान पर एकत्र किए गए थे।

Protocol

1. मुखौटा डिजाइन और मास्टर निर्माण

  1. किसी भी वेक्टेरियल ड्राइंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस की वांछित ज्यामिति ड्रा। फोटोलिथोग्राफी के अगले चरण के लिए उपयोग की जाने वाली फोटोरेसिस्ट की प्रत्येक परत के लिए, एक व्यक्तिगत मुखौटा तैयार करें: चैनलों और खंभों के साथ उल्लिखित एक मुखौटा और केवल खंभे युक्त एक मुखौटा।
  2. ड्राइंग सॉफ्टवेयर द्वारा उत्पन्न सीआईएफ फाइलों को फिल्म फोटोमास्क में अनुवाद करें। यह कामिक सेवाओं के माध्यम से किया जा सकता है। फोटोलिथोग्राफी के दौरान उपयोग किए जाने वाले फोटोरेसिस्ट की पसंद के आधार पर उपयुक्त फोटोमास्क की आवश्यकता होती है।
    नोट: एसयू-8 फोटोरेसिस्ट के लिए, पारदर्शी पृष्ठभूमि पर काले फीचर्स के साथ मास्क ऑर्डर करें। एसयू-8 एक एपॉक्सी-आधारित नकारात्मक फोटोरेसिस्ट है, जिसका अर्थ है कि यूवी लाइट (365 एनएम) के संपर्क में आने के दौरान यूवी के संपर्क में आने वाले हिस्से क्रॉसलिंक होते हैं जबकि बाकी घुलनशील रहता है। इसलिए, फोटोलिथोग्राफी के दौरान मास्क पर सभी काले पैटर्न यूवी लाइट से क्रॉस-लिंक नहीं होंगे। आकाओं पर चैनल और खंभे उत्कीर्ण किए जाएंगे।
  3. एसयू-8 निगेटिव फोटोरेसिस्ट का उपयोग करके फोटोलिथोग्राफी द्वारा प्रत्येक चिप के डिजाइन के लिए सिलिकॉन वेफर्स पर दो मास्टर्स तैयार करें।
    नोट: चरण 1.3.1-1.3.7 एक साफ कमरे में किया जाता है। नीचे वर्णित कदम फोटोलिथोग्राफी के पारंपरिक चरण हैं जिसके बाद पीडीएमएस सॉफ्ट लिथोग्राफी है, जो कई पाठ्यपुस्तकों में वर्णित हैं। प्रयोगात्मक मापदंडों (फोटोरेसिस्ट, समय अवधि, तापमान, आदि) के सभी मूल्य कई सूक्ष्म मापदंडों पर निर्भर करते हैं और उपयोग किए गए विभिन्न तंत्र के आधार पर अनुकूलित किया जाना चाहिए।
    1. 3 इंच के सिलिकॉन वेफर का उपयोग करें और एसयू-8 फोटोरेसिस्ट के बयान और लगाव को सुविधाजनक बनाने के लिए 90 एस के लिए प्लाज्मा के साथ सतह का इलाज करें।
    2. एसयू-8 के लगभग 3 एमएल डालो वेफर के बीच पर विरोध और स्पिन कोट एसयू-8 वांछित मोटाई(चित्रा 1A) के लिए नीचे । 50 माइक्रोन नाममात्र मोटाई के लिए, 500 आरपीएम पर 10 एस के लिए एसयू-8 3050 और स्पिन कोट का उपयोग करें और 3500 आरपीएम पर 30 एस के लिए क्रमिक रूप से करें। सॉफ्ट 368 K पर 15 मिनट के लिए एक गर्म प्लेट पर फोटोरेसिस्ट सेंकना क्रम में आंशिक रूप से राल में निहित विलायक वाष्पित करने के लिए और यह photomask पर चिपके हुए से रोकने की अनुमति देकर जम सकता है। बाद में, 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर वेफर छोड़ दें।
    3. यूवी लाइट(चित्रा 1B)के लिए फोटोरेसिस्ट का पर्दाफाश करें। 35 एमडब्ल्यू सेमी-2 और 8 एस एक्सपोजर समय की शक्ति के साथ एक मास्क एलाइनर का उपयोग करें।
    4. पोस्ट-एक्सपोजर बेकिंग के साथ आगे बढ़ें। यूवी एक्सपोजर द्वारा लागू फोटोरक्शन को पूरा करने के लिए 368 K पर 5 मिनट के लिए गर्म प्लेट पर वेफर रखें।
    5. सभी एसयू-8 विरोध है कि एक स्नान में वेफर रखने से क्रॉसलिंक नहीं था निकालें प्रोपलीन ग्लाइकोल मिथाइल ईथर एसीटेट (PGMEA) युक्त और 15 मिनट के लिए हलचल । आइसोप्रोपैनॉल के साथ वेफर कुल्ला जब तक कोई धुंधला वर्षा नहीं देखी जा सकती है। नाइट्रोजन गैस के साथ वेफर को सुखाएं और इसे पेट्री डिश (100 मिमी x 15 मिमी मानक आकार) में स्टोर करें।
    6. पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) की टुकड़ी को सुविधाजनक बनाने के लिए एक सिलेन के साथ वेफर की सतह का इलाज करें जिसका उपयोग 2 टिकटों को बनाने के लिए किया जाएगा। हेक्सामेथिलडिसिल्ज़न (एचएमडीएस) के वाष्प वातावरण के तहत 10 मिनट के लिए 368 K पर एक टेप गर्म प्लेट पर वेफर जमा करें।
      नोट: यदि वेफर से पीडीएमएस छीलने से कई उपयोगों के बाद मुश्किल हो जाता है, वेफर की सतह को एचएमडीएस वाष्प के साथ फिर से इलाज किया जाना चाहिए।
    7. चैनलों और खंभों वाले पहले मास्टर तैयार होते हैं। इन चरणों को दोहराएं और दूसरा मास्टर पैटर्निंग केवल खंभे तैयार करें।
      नोट: फोटोलिथोग्राफी के दौरान, उद्देश्य 50 माइक्रोन की ऊंचाई के साथ एसयू-8 मास्टर्स पर डिवाइस की ज्यामिति प्राप्त करना है। हालांकि, एक बार दो एसयू-8 स्वामी गढ़े जाते हैं, प्रयोगात्मक मूल्य प्राप्त करने के लिए प्रोफिलोमीटर के साथ स्वामी पर उत्कीर्ण ज्यामिति की ऊंचाई को मापते हैं। इस प्रोटोकॉल के लिए गढ़े गए दोनों एसयू-8 मास्टर्स के लिए मापा गया मूल्य लगभग 45 माइक्रोन है।

2. पीडीएमएस मोल्ड्स निर्माण

नोट: प्रोटोकॉल के निम्नलिखित चरणों को किसी भी प्रयोगशाला में तब तक किया जा सकता है जब तक कि लैमिनार फ्लो हुड का उपयोग किया जाता है, कमरे में पीले रंग की रोशनी का उपयोग एनओए 81 राल (चरण 3.6-3.11) के साथ काम करते समय किया जाता है और यूवी प्रकाश का स्रोत एनओए 81 रेसिन (चरण 3.7 और 3.11) को बहुलक बनाने के लिए उपलब्ध है।

  1. 50 ग्राम पीडीएमएस सिलिकॉन बेस और इसके इलाज एजेंट को 10:1 द्रव्यमान अनुपात में तैयार करें।
  2. दोनों सामग्री को एक स्पैटुला के साथ एक बीकर में मिलाएं और मिश्रण को एक वैक्यूम कक्ष में रखें ताकि सभी हवा के बुलबुले को हटा दिया जा सके।
  3. एसयू-8 मास्टर (एक पेट्री डिश में संग्रहीत) में पूर्व मिश्रित पीडीएमएस के 25 ग्राम डालो चैनलों और लगभग 5 मिमी की ऊंचाई तक खंभे पैटर्निंग । पीडीएमएस के शेष 25 ग्राम को दूसरे एसयू-8 मास्टर पैटर्निंग में डालें, जो केवल लगभग 5 मिमी(चित्रा 1C)की ऊंचाई तक खंभे हैं।
  4. दोनों पेट्री व्यंजनों को ओवन में रखें और 1 घंटे के लिए 338 K पर पीडीएमएस परतों का इलाज करें।
  5. एक स्केलपेल के साथ एसयू-8 मास्टर्स के पैटर्न के चारों ओर ठीक पीडीएमएस परत को काटें और धीरे से स्वामी(चित्रा 1D)से पीडीएमएस मोल्डों को छील दें।
    नोट: ऊपर वर्णित प्रक्रिया, प्रतिकृति मोल्डिंग कहा जाता है, अक्सर पीडीएमएस के मोल्ड तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है जो कांच की सतहों से जुड़ा होगा और एक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस53का हिस्सा होगा। इस प्रोटोकॉल में पीडीएमएस मोल्ड चिप का हिस्सा नहीं होते, बल्कि चिप फैब्रिकेशन के लिए इंटरमीडिएट के तौर पर इनका इस्तेमाल किया जाता है। प्रत्येक डिजाइन के लिए, 2 पीडीएमएस मोल्ड संबंधित एसयू-8 मास्टर्स(आंकड़े 1D और 1E)से तैयार किए जाते हैं और माइक्रोचिप के निर्माण के लिए तदनुसार (जैसा कि नीचे वर्णित है) का उपयोग किया जाएगा।

3. डायलिसिस चिप निर्माण

  1. पीडीएमएस मोल्ड को एक कठोर माइक्रोस्कोप ग्लास स्लाइड (3 x 1 इन मानक आकार) पर चैनलों और खंभे दोनों पैटर्नदार रखें, जिसमें पैटर्न ऊपर की ओर(चित्रा 1F)का सामना करना पड़ रहा है। केंद्रीय स्तंभ जो प्रोटीन जलाशय से मेल खाता है, पीडीएमएस मोल्ड की क्षैतिज सतह से 45 माइक्रोन से लंबवत से अधिक है।
  2. पुनर्जनित सेल्यूलोज (आर सी) डायलिसिस झिल्ली के एक सूखे टुकड़े को काटें और अलग करें और इसे पीडीएमएस मोल्ड के केंद्रीय स्तंभ पर जमा करें, जिसे ग्लास स्लाइड(चित्रा 1F)पर समर्थित किया जाता है।
    नोट: आर सी डायलिसिस झिल्ली व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है, और आणविक वजन कट-ऑफ (MWCO) अध्ययन के तहत प्रोटीन के आणविक वजन और इस्तेमाल किया उपजी के साथ तदनुसार चुना जाता है । आरसी डायलिसिस झिल्ली के टुकड़े का आकार चिप के डिजाइन पर निर्भर करता है। इस प्रोटोकॉल में, 2 प्रोटोटाइप डिजाइन किए गए हैं जहां प्रोटीन जलाशय की मात्रा 0.1 या 0.3 माइक्रोन है। इन मामलों में, डायलिसिस झिल्ली टुकड़ा का आकार क्रमशः 2 x 2मिमी 2 या 4 x4 मिमी 2है।
  3. दूसरा पीडीएमएस मोल्ड पैटर्निंग केवल पीडीएमएस मोल्ड के शीर्ष पर नीचे की ओर आ रहे खंभे ग्लास स्लाइड(चित्रा 1F)पर समर्थित है। इस मोल्ड का केंद्रीय स्तंभ प्रोटीन जलाशय से मेल खाता है और क्षैतिज सतह से 45 माइक्रोन तक खड़ी (नीचे की ओर सामना करना) से अधिक है।
  4. 2 पीडीएमएस मोल्डों के केंद्रीय स्तंभों को संरेखित करें। आर सी डायलिसिस झिल्ली 2 पीडीएमएस मोल्ड्स(चित्रा 1G)के बीच में "सैंडविच" है।
    नोट: 2 पीडीएमएस मोल्डों के माइक्रोस्ट्रक्चर के बीच संरेखण को बिना किसी अतिरिक्त उपकरण के नेत्रहीन पूरा किया जा सकता है। अन्यथा, यह हेरफेर माइक्रोस्कोप के तहत प्राप्त किया जा सकता है। जलाशयों के बीच एक छोटा सा बदलाव समस्याग्रस्त नहीं है, जब तक कि तरल चैनल और इनपुट या आउटपुट पॉइंट पूरी तरह से कवर नहीं होते हैं।
  5. पीडीएमएस मोल्ड्स में सभी फंसे हुए हवा के बुलबुले को हटाने और निर्माण के अगले चरण के दौरान राल के सम्मिलन को बढ़ावा देने के लिए एक वैक्यूम कक्ष में 30 मिनट के लिए असेंबली को स्थापित करें।
    नोट: पीडीएमएस-पीडीएमएस आसंजन द्वारा 2 पीडीएमएस मोल्ड ों को रखा जाता है और किसी अतिरिक्त दबाव या अस्थायी संबंध के अन्य तरीके की आवश्यकता नहीं होती है।
  6. केशिका आत्मसात(चित्रा 1H और 1I)द्वारा फोटोकरेबल, थिओलीन आधारित राल NOA 81 के साथ 2 पीडीएमएस मोल्डों के बीच खाली जगह भरें।
  7. एक कोलिमेटेड यूवी लैंप (पावर 35 एमडब्ल्यू सेमी-2)का उपयोग करके 8 एस के लिए यूवी लाइट (365 एनएम) के संपर्क में आने से राल का इलाज करें।
    नोट: यह पहला एक्सपोजर एनओए 81 राल को आंशिक रूप से क्रॉसलिंक करने की अनुमति देता है क्योंकि दोनों पक्षों पर पीडीएमएस मोल्डों के संपर्क में एनओए 81 की पतली परत ठीक नहीं रहती है।
  8. पीडीएमएस मोल्डों के बाहरी किनारों से एनओए 81 की अधिकता को स्केलपेल के साथ काटें।
  9. ऊपरी पीडीएमएस मोल्ड को आंशिक रूप से क्रॉसलिंक किए गए एनओए 81 के साथ हटा दें जो नीचे पीडीएमएस मोल्ड और ग्लास स्लाइड से उस पर अटक गया है।
  10. एक माइक्रोस्कोप ग्लास स्लाइड (3 x 1 इंच) के मानक आयामों में एक 175 माइक्रोन मोटी पीएमएमए शीट काटें और पीएमएमए टुकड़े के प्रत्येक पक्ष से प्लास्टिक सुरक्षा शीट को छील दें। धीरे ऊपरी PDMS मोल्ड की विधानसभा प्रेस और आंशिक रूप से ठीक NOA 81 PMMAटुकड़ा (चित्रा 1J)पर।
  11. 60 एस के लिए यूवी लाइट के संपर्क में आने से फिर से एनओए 81 का इलाज करें और ऊपरी पीडीएमएस मोल्ड(चित्रा 1K)को हटा दें। राल बिना किसी और उपचार के पीएमएमए सब्सट्रेट का पालन करता है।
    नोट: पीडीएमएस मोल्डों को आइसोप्रोपैनॉल और एसीटोन से धोने के बाद लगभग 5 बार पुन: उपयोग किया जा सकता है, जब तक कि मोल्ड झुके नहीं जाते हैं। आर सी डायलिसिस झिल्ली एनओए 81 स्टीकर में शामिल है और आगे कोई हेरफेर या यांत्रिक क्लैंपिंग की आवश्यकता है।

4. फ्लूइड कनेक्टर

नोट: माइक्रोफ्लुइडिक चिप के डिजाइन में क्रिस्टलीकरण समाधान के लिए एक रैखिक तरल चैनल और प्रोटीन नमूना (प्रोटीन जलाशय) के लिए एक केंद्रीय जलाशय शामिल है, दोनों चित्रा 2Aमें दो माइक्रोचिप्स के शीर्ष दृश्य से दिखाया गया है। एक आर सी डायलिसिस झिल्ली इन दो माइक्रोस्ट्रक्चर(चित्रा 2 डी) केबीच एम्बेडेड है और क्रिस्टलीकरण प्रक्रिया विकसित होती है जबकि क्रिस्टलीकरण समाधान से उपजी चिप के दो डिब्बों के बीच एकाग्रता ढाल के कारण झिल्ली भर में फैलती है जो झिल्ली से अलग होती है। माइक्रोफ्लुइडिक चैनल नीचे पीडीएमएस मोल्ड(चित्रा 1F)पर अंकित है। एक बार चिप्स के लिए निर्माण प्रोटोकॉल पूरा हो जाने के बाद, रैखिक चैनल पीएमएमए सब्सट्रेट के संपर्क में एनओए 81 स्टीकर की निचली परत पर स्थित है, जैसा कि चित्र 1Kमें दिखाया गया है। क्रिस्टलीकरण समाधान के लिए एक इनलेट और एक आउटलेट एक्सेस पॉइंट रैखिक चैनल के प्रत्येक छोर पर स्थित है और चित्र 2 ए में देखा जा सकता हैकि छेद (कुल ऊंचाई 90 माइक्रोन) की तरह दिखते हैं। क्रिस्टलीकरण समाधान की हैंडलिंग के लिए, कनेक्टर को एक्सेस पॉइंट्स पर जोड़ा जाना चाहिए।

  1. बॉन्ड कनेक्टर जो फास्ट एपॉक्सी ग्लू(चित्रा 2सी)के साथ माइक्रोफ्लुइडिक चैनल के इनलेट और आउटलेट पर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं (नैनोपोर्ट)।
  2. कनेक्टर्स के आकार के आधार पर पीएफई ट्यूबों का उपयुक्त व्यास चुनें। चिप के फ्लूइड चैनल में क्रिस्टलाइजेशन सॉल्यूशन की शुरुआत के लिए पीएफई ट्यूब्स का इस्तेमाल किया जाएगा।
    नोट: व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट प्रवाह दर पर आसान और सटीक नियंत्रण के लिए अनुशंसित हैं और आमतौर पर मिश्रण और तरल पदार्थ से निपटने के लिए स्वचालित दबाव-चालित या प्रवाह नियंत्रित (सिरिंज पंप) प्रणालियों के साथ संयुक्त होते हैं। हालांकि, क्रिस्टलीकरण समाधान को डिस्पोजेबल प्लास्टिक सिरिंज के साथ रैखिक चैनल में मैन्युअल रूप से पेश किया जा सकता है। इस मामले में, चरण 4.3 से 4.5 का सुझाव दिया जाता है।
  3. क्रिस्टलीकरण समाधान के साथ एक 1 एमएल डिस्पोजेबल सिरिंज भरें। इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत चिप्स के लिए, पूरे तरल चैनल को भरने के लिए 400 माइक्रोन पर्याप्त है।
  4. दो पिपेट टिप्स काटें ताकि एक तरफ टिप का व्यास पीएफई ट्यूब के आंतरिक व्यास के बराबर हो जिसका उपयोग समाधान हैंडलिंग के लिए किया जाएगा। तेजी से एपॉक्सी गोंद(चित्रा 2B)के साथ चैनल के एक्सेस पॉइंट्स पर फसली युक्तियों को गोंद करें।
  5. उचित आकार के PTFE ट्यूब के एक टुकड़े के साथ फसली युक्तियों के साथ सिरिंज कनेक्ट और लगातार सिरिंज प्लंजर धीरे धक्का द्वारा चैनल के भीतर समाधान शुरू करते हैं ।

5. प्रोटीन एनकैप्सुलेशन

नोट: प्रोटीन जलाशय के रूप में इस्तेमाल किया जा रहा करने के लिए समर्पित चिप का पैटर्न अब तक वातावरण के लिए खुला रहता है । निम्नलिखित प्रोटोकॉल को सावधानीपूर्वक माइक्रोफ्लुइडिक चिप के भीतर प्रोटीन नमूने को सीमित करने का प्रस्ताव है।

  1. मैन्युअल रूप से प्रोटीन जलाशय के अंदर प्रोटीन नमूने की एक बूंद, आर सी डायलिसिस झिल्ली पर सही स्थित है, जैसा कि चित्र 2Eमें दर्शाया गया है। प्रोटीन नमूने की मात्रा चिप के डिजाइन के अनुसार भिन्न होती है और 0.1 या 0.3 माइक्रोन हो सकती है।
  2. प्रोटीन जलाशय के चारों ओर उच्च वैक्यूम सिलिकॉन तेल की एक पतली परत लागू करें।
  3. एक 175 μm मोटी पीएमएमए शीट का एक छोटा सा टुकड़ा काटें और धीरे से इसे सिलिकॉन तेल की पतली परत के ऊपर रखें। पीएमएमए टुकड़ा प्रोटीन जलाशय की पूरी सतह को कवर करना चाहिए जहां प्रोटीन समाधान जमा किया जाता है।
    नोट: सिलिकॉन तेल का उपयोग हवा की जकड़न को बढ़ाने और प्रोटीन की बूंद के प्रसार को रोकने के लिए किया जाता है। प्रोटीन जलाशय और एनओए ८१ स्टीकर को कवर करने के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले पीएमएमए पीस के बीच कोई बॉन्डिंग या सीलिंग नहीं है । उनके बीच संपर्क एक ठोस/ठोस इंटरफेस है । प्रोटीन नमूने के समग्र सीलिंग और एयर-टाइट एनकैप्सुलेशन का उत्पादन करने के लिए, कप्टन टेप का एक टुकड़ा चरण 5.4 में वर्णित के रूप में उपयोग किया जाता है।
    नोट: कभी-कभी डिवाइस (प्रोटीन जलाशय) के समर्पित गुहा के भीतर प्रोटीन नमूने को सीमित करना मुश्किल होता है जब तरल चैनल (चरण 6.4) के भीतर क्रिस्टलीकरण समाधान की शुरूआत के लिए दबाव-चालित प्रणाली का उपयोग किया जाता है। ऊपर उल्लिखित समस्या से बचने के लिए, क्रिस्टलीकरण समाधान को प्रसारित करते समय अपेक्षाकृत कम दबाव मूल्यों को बनाए रखा जाना चाहिए। जलीय समाधानों के लिए 20-60 मीटर या अधिक चिपचिपा समाधान (पीईजी, ग्लिसरोल) के लिए 50-150 मीटर का इंजेक्शन दबाव19का सुझाव दिया जाता है।
  4. प्रोटीन जलाशय के ऊपर सेट पीएमएमए टुकड़ा को कवर करने और सभी किनारों के चारों ओर एनओए चिप पर चिपके रहने के लिए काफी बड़ा काप्टन टेप (20 माइक्रोन मोटी) का एक टुकड़ा काटें। प्रोटीन नमूना जलाशय के भीतर समझाया जाता है और चिप क्रिस्टलीकरण प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार है, जैसा कि चित्र 2Cमें दिखाया गया है ।
    नोट: चिप्स को कई बार तब तक पुन: इस प्रकार पुन: इस् तेमाल किया जा सकता है जब तक कि पीएमएमए सब्सट्रेट पर डायलिसिस झिल्ली और एनओए का आसंजन खराब न हो। यदि चिप के इन हिस्सों को क्षतिग्रस्त कर रहे हैं, लीक सत्यापित है कि डिवाइस अब इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है मनाया जाता है । चिप्स धोना क्रिस्टलीकरण समाधान पर निर्भर करता है। कम चिपचिपाहट समाधान (लवण, बफ़र्स) के मामले में, तरल चैनल को केवल आसुत पानी शुरू करके धोया जा सकता है और इसे कुछ मिनटों के लिए प्रवाहित होने दें। 400 माइक्रोन एक अन्य समाधान के साथ चैनल के भीतर एक समाधान का पूरी तरह से आदान-प्रदान करने के लिए आवश्यक मात्रा है। अधिक चिपचिपा समाधान (पीईजी, ग्लाइसेरोल) के मामले में, चिप्स को पुन: इस् तेमित करने की सिफारिश नहीं की जाती है क्योंकि चैनल को केवल पानी से धोना पर्याप्त नहीं है। चिप का ऊपरी हिस्सा, जहां प्रोटीन जलाशय स्थित है, को आसुत पानी से भी धोया जा सकता है और दबाव वाली हवा के साथ सूख सकता है।

6. ऑन-चिप प्रोटीन क्रिस्टलीकरण

  1. lyophilized मुर्गी अंडे सफेद lysozyme पाउडर वजन और आसुत पानी में भंग करने के लिए 30 मिलीग्राम एमएल-1की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए ।
  2. सभी ठोस कणों को हटाने के लिए 293 K पर उच्चतम गति से 5 मिनट के लिए 0.22 माइक्रोन फिल्टर और अपकेंद्रित्र के माध्यम से प्रोटीन समाधान को फ़िल्टर करें। क्रिस्टलीकरण प्रयोग के लिए सुपरनिटेंट का उपयोग करें।
  3. बफर युक्त क्रिस्टलीकरण समाधान के 500 μL तैयार करें और तालिका 1में प्रदान की गई सांद्रता में तेज़ी से तैयार करें। 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से समाधान को फ़िल्टर करें।
  4. एक सिरिंज या एक स्वचालित दबाव संचालित तरल प्रणाली या एक सिरिंज पंप के साथ चिप के इनलेट बिंदु में समाधान इंजेक्ट, के रूप में कदम 4.1-4.5 में वर्णित है ।
    नोट: क्रिस्टलीकरण प्रयोग या तो स्थिर स्थिति में हो सकता है, यदि माइक्रोफ्लुइडिक चैनल क्रिस्टलीकरण समाधान से भरा हुआ है और अलग सेट करता है, या बहती स्थितियों के तहत, यदि इसे लगातार प्रवाह दर पर चैनल के अंदर लगातार इंजेक्ट किया जाता है। बाद के मामले के लिए, बाहरी दबाव-चालित प्रणाली या सिरिंज पंप के उपयोग की सिफारिश की जाती है। बहती परिस्थितियों में प्रयोग की प्राप्ति भी तरल चैनल के भीतर गतिशील रूप से क्रिस्टलीकरण समाधानों का आदान-प्रदान करने की संभावना प्रदान करती है। इस प्रकार, एक ही प्रोटीन नमूने का उपयोग करते समय कई प्रयोग किए जा सकते हैं।
  5. एक बार तरल चैनल क्रिस्टलीकरण समाधान से भर जाता है, पैराफिल्म टेप के साथ चिप के इनलेट और आउटलेट बंदरगाहों को सील करें।
  6. प्रोटीन जलाशय के भीतर प्रोटीन समाधान की उचित मात्रा को पिपेट करें और प्रोटीन नमूने को समझाएं जैसा कि चरण 5.1-5.4 में वर्णित है।
  7. 293 K पर चिप स्टोर करें।
    नोट: डायलिसिस के माध्यम से क्रिस्टलीकरण वाष्प प्रसार विधि या बैच क्रिस्टलीकरण के साथ आयोजित प्रयोगों से एक अलग गतिज प्रक्षेपवक्र का पालन करता है और प्रसार प्रक्रिया में शामिल तेज़ अणुओं की प्रकृति पर गहराई से निर्भर करता है, मापा डेटा५१के अनुसार, और यह नाभिक शुरू करने के लिए और अधिक समय लग सकता है । वाष्पीकरण को रोकने के लिए, यदि कोई हो, इस अवधि के दौरान, चिप को आर्द्रता संतृप्त वातावरण में 293 K पर रखें।

7. सीटू और ऑन-चिप एक्स-रे विवर्तन में

  1. बीमलाइन के लिए 3डी मुद्रित समर्थन
    1. समर्थन है कि एक साथ तीन चिप्स तक ले जा सकते हैं प्रिंट। समर्थन के आयाम प्लेट एक्स-रे विवर्तन प्रयोगों के साथ संगत वाणिज्यिक क्रिस्टलीकरण प्लेटों (96 वेल/एसबीएस मानक) के आयामों के समान हैं।
      नोट: समर्थन की छपाई वाणिज्यिक सेवाओं को सौंपा जा सकता है । समर्थन एक 3 डी-सीएडी डिजाइनिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डिजाइन किया गया था और पर चिप प्रोटीन क्रिस्टलीकरण प्रयोगों के दौरान और चित्रा 3 बी में BM30A-FIP (ESRF) में सीटू एक्स-रे विवर्तन डेटा संग्रह के दौरान चित्रा 3A में दिखाया गया है ।
    2. एक या दो तरफा टेप के साथ समर्थन पर डायलिसिस चिप्स को स्थिर करें।
  2. सीटू में एक्स-रे विवर्तन
    1. प्रोटीन जलाशय में उगाए गए क्रिस्टल से कमरे के तापमान पर एक्स-रे विवर्तन डेटा एकत्र करें। उदाहरण के लिए, 12.656 केवी की ऊर्जा के साथ एक्स-रे का उपयोग करें, 3.32 x 1010 फोटॉन एस-1 का प्रवाह और 250 x 250 माइक्रोन2का बीम आकार। 315 x 315 मिमी2 और 9.4 मेगा पिक्सल रेजोल्यूशन की सक्रिय सतह के लिए 3 x 3 सीसीडी के मैट्रिक्स के साथ एडीडीसी क्वांटम 315आर डिटेक्टर के साथ विवर्तन छवियों को रिकॉर्ड करें।
      नोट: डायलिसिस चिप्स पर उगाए गए lysozyme क्रिस्टल के लिए विवर्तन डेटा यूरोपीय सिंक्रोट्रॉन विकिरण सुविधा (ESRF) में BM30A-FIP बीमलाइन पर एकत्र किए गए थे । हालांकि, बीम का आकार, फ्लक्स और डिटेक्टर प्रकार अन्य एक्स-रे विकिरण स्रोतों में अलग हो सकता है। 3 डी मुद्रित समर्थन क्रिस्टल के चारों ओर -40 डिग्री से +40 डिग्री की कोणीय रेंज के साथ डेटा संग्रह को सक्षम बनाता है। सीटू डेटा संग्रह में उजागर किए गए lysozyme क्रिस्टल की संख्या, प्रत्येक क्रिस्टल के लिए एकत्र किए गए विवर्तन पैटर्न की संख्या, एक्सपोजर प्रति दोलन कोण सीमा और एक्सपोजर समय तालिका 2में संक्षेप में प्रस्तुत किया जाता है।
  3. डेटा उपचार
    1. एक्सडीएस प्रोग्राम48के साथ lysozyme क्रिस्टल के लिए विवर्तन पैटर्न के साथ पूर्ण या आंशिक डेटा सेट की प्रक्रिया करें।
    2. प्रत्येक डेटा सेट के लिए एचकेएल फाइल जेनरेट करें और एक्सस्केल सॉफ्टवेयर48का उपयोग करके उन्हें स्केल करें।
    3. सीपीपी 4 सुइट49 के प्रोग्राम फेजर के साथ आणविक प्रतिस्थापन का उपयोग करें और मॉडल निर्माण के चरणों का निर्धारण करें। इस चरण के लिए, प्रोटीन डेटा बैंक (पीडीबी) प्रविष्टि 193L से lysozyme के ज्ञात 3डी निर्देशांक का उपयोग करें।
    4. फेनिक्स52 का उपयोग करके संरचना को परिष्कृत करें और कूट50का उपयोग करके अंतिम प्रोटीन मॉडल का निरीक्षण करें।

Representative Results

जुनियस एट अल द्वारा विकसित माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स19,45 माइक्रोडायलिसिस विधि के साथ और कमरे के तापमान पर सीटू एक्स-रे विवर्तन डेटा संग्रह में ऑन-चिप प्रोटीन क्रिस्टलीकरण दोनों के लिए संगत हैं। माइक्रोचिप्स के चित्र, उनके विस्तृत डिजाइन, तरल कनेक्टर, और आर सी डायलिसिस झिल्ली चित्र 2में सचित्र हैं । क्रिस्टलीकरण प्रयोगों को प्रोटीन के नमूने को सीधे प्रोटीन जलाशय में मैन्युअल रूप से पाइपिंग करके और एक स्वचालित दबाव-चालित प्रणाली या सिरिंज पंप के साथ रैखिक तरल चैनल में क्रिस्टलीकरण समाधान शुरू करके या मैन्युअल रूप से सिरिंज की सहायता से स्थापित किया जाता है। प्रोटीन जलाशय और फ्लूइडिक चैनल को चित्र 2 एमें प्रतिष्ठित किया जा सकता है । प्रोटीन जलाशय की 0.1 माइक्रोन या 0.3 माइक्रोन अधिकतम मात्रा के साथ चिप्स बनाने के लिए डिजाइन क्रमशः बाईं और दाईं ओर चित्रा 2A में दिखाए गए हैं। प्रोटीन के नमूने के लिए 0.2 माइक्रोन या 0.7 माइक्रोन अधिकतम क्षमता वाले चिप्स19अन्य जगह दिखाए जाते हैं। डिवाइस निर्माण के लिए प्रोटोकॉल के मुख्य आकर्षण को विभिन्न एमडब्ल्यूसीओ के व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आरसी डायलिसिस झिल्ली को एम्बेड करने वाले फोटोकरेबल थिओलीन आधारित राल एनओए 81 के उपयोग पर संकुचित किया जा सकता है। माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों के निर्माण के दौरान, रैखिक द्रव चैनल नीचे पीडीएमएस मोल्ड(चित्रा 1F)पर अंकित किया जाता है, जबकि ऊपरी पीडीएमएस मोल्ड में प्रोटीन जलाशय और इनलेट और आउटलेट बंदरगाहों(चित्रा 1F)के लिए पैटर्न वाले खंभे होते हैं। एक बार एनओए 81 क्रॉसलिंक हो जाने के बाद पीडीएमएस मोल्ड्स को असेंबली(चित्रा 1K)से हटा दिया जाता है, तो फ्लूइडिक चैनल माइक्रोचिप की निचली परत पर स्थित होता है और प्रोटीन चैनल और इनलेट/आउटलेट पोर्ट दोनों परतों पर स्थित होते हैं। चित्रा 1L डायलिसिस चिप के एक साइड व्यू योजनाबद्ध दिखाता है जहां डिवाइस की सभी परतें और उनकी संबंधित मोटाई इंगित की जाती है। चिप्स (तरल चैनल) की निचली परत पर अंकित पैटर्न की ऊंचाई लगभग 45 माइक्रोन है, जबकि इनलेट और आउटलेट बंदरगाहों की कुल ऊंचाई लगभग 90 माइक्रोन है। प्रोटीन जलाशय (45 माइक्रोन ऊंचाई) को चित्र 2डी और 2E में भी दर्शाया गया है। एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत दोनों परतों के संरेखण की जांच की गई और माइक्रोचिप के भीतर शामिल आरसी डायलिसिस झिल्ली के टुकड़े को चित्र 2 डीमें स्पष्ट रूप से प्रतिष्ठित किया जा सकता है । इसी आंकड़े में, क्रिस्टलीकरण समाधान के इंजेक्शन के दौरान तरल चैनल के भीतर हवा को फंसा दिया गया है, जैसा कि प्रोटीन जलाशय के ऊपरी-बाएं हिस्से में देखा जा सकता है। चित्रा 2E एक पिपेट के साथ प्रोटीन बूंद के मैनुअल जमाव के बाद प्रोटीन जलाशय की एक क्लोज-अप तस्वीर है और पीएमएमए और काप्टन टेप के एक टुकड़े के साथ बूंद के अनुकैप्सुलेशन से पहले, जैसा कि प्रोटोकॉल के चरण 5.2 और 5.3 में वर्णित है। प्रोटीन नमूने के एनकैप्सुलेशन और फ्लूइड कनेक्टर्स की ग्लूइंग के बाद क्रिस्टलीकरण प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले माइक्रोफ्लुइडिक चिप को चित्र 2 सीमें दर्शाया गया है। एयर टाइट असेंबली यह सुनिश्चित करती है कि लीकेज नहीं हो सकता । माइक्रोफ्लुइडिक चैनल के इनलेट और आउटलेट बंदरगाहों के लिए तरल कनेक्टर या तो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हो सकते हैं जैसा कि प्रोटोकॉल के चरण 4.1 में वर्णित है और चित्रा 2 सीमें दिखाया गया है, या डिस्पोजेबल प्रयोगशाला पिपेट युक्तियों का उपयोग उसी उद्देश्य के लिए किया जा सकता है(चित्रा 2 बी,प्रोटोकॉल चरण 4.4)।

माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स के निर्माण के लिए, ऑप्टिकल रूप से पारदर्शी और जैविक रूप से निष्क्रिय सामग्री चुनी गई थी, जो कमरे के तापमान पर सीटू एक्स-रे विवर्तन प्रयोगों में उच्च अनुकूलता का प्रदर्शन करती थी। माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस और आसपास के वातावरण (हवा) की रचना करने वाली सामग्रियों के साथ एक्स-रे, अवशोषण और बिखरने की बातचीत पृष्ठभूमि शोर के रूप में जाना जाने वाला संकेत उत्पन्न करती है। यह शोर डिटेक्टर द्वारा दर्ज प्रोटीन क्रिस्टल के विवर्तन संकेत तक मिलता है, सिग्नल-टू-शोर अनुपात को क्षय करता है और एक्स-रे विवर्तन डेटा संग्रह के दौरान जितना संभव हो उतना कम बनाए रखा जाना चाहिए। हमने प्रोटीन जलाशय से युक्त सामग्रियों द्वारा उत्पन्न पृष्ठभूमि शोर का मूल्यांकन किया है, जो एक्स-रे बीम के प्रत्यक्ष मार्ग में है । प्रोटीन जलाशय में आरसी डायलिसिस झिल्ली, काप्टन टेप और दो पीएमएमए टुकड़े होते हैं, जिनमें से एक माइक्रोचिप के लिए सब्सट्रेट के रूप में इस्तेमाल किया जाता है और एक प्रोटीन नमूने के एनकैप्सुलेशन के लिए इस्तेमाल किया जाता है । पीएमएमए की मोटाई 2 x 175 माइक्रोन है, काप्टन टेप 20 माइक्रोन की, और आर सी डायलिसिस झिल्ली लगभग 40 माइक्रोन मोटी(चित्रा 1L)है। इन परतों की कुल मोटाई लगभग 410 माइक्रोन है और एनओए 81 लेयर सीधे एक्स-रे पथ में नहीं है। निर्माण सामग्री की मोटाई के अलावा, उनका घनत्व पृष्ठभूमि बिखरने वाले शोर को मापने के लिए भी महत्वपूर्ण है, क्योंकि एक्स-रे बिखरने से मौलिक परमाणु संख्या बढ़ जाती है। इस कारण से, हीलियम फ्लक्स (ईएसआरएफ में BM30A-FIP पर प्रदान की गई एक सुविधा) का उपयोग सामग्री लक्षण वर्णन के लिए डेटा संग्रह के दौरान हवा के बजाय और प्रोटीन विवर्तन प्रयोगों के लिए किया गया था। चित्रा 3 सी काप्टन टेप, आर सी डायलिसिस झिल्ली, पीएमएमए शीट, और हीलियम वातावरण में उनकी विधानसभा द्वारा उत्पन्न पृष्ठभूमि शोर दिखाता है। प्रत्येक सामग्री 0.98 Å तरंगदैर्ध्य के एक्स-रे के लिए 20 एस के लिए उजागर किया गया था और नमूना डिटेक्टर दूरी 200 मिमी थी। यह प्रयोग ईएसआरएफ में BM30A-FIP बीमलाइन पर किया गया था, जैसा कि प्रोटोकॉल के चरण 7 में समझाया गया था । सामग्री के साथ एक्स-रे बीम की बातचीत के लिए जिम्मेदार फैलाना छल्ले 4 Å से कम एक संकल्प पर Kapton टेप के लिए प्रतिष्ठित किया जा सकता है, 4-8 Å के बीच पीएमएमए शीट, और 4-5 Å संकल्प के बीच डायलिसिस झिल्ली। डायलिसिस चिप द्वारा उत्पन्न पृष्ठभूमि शोर मुख्य रूप से 6 Å से कम एक संकल्प पर मनाया जाता है जो बड़े lysozyme क्रिस्टल के उच्च-रिज़ॉल्यूशन विवर्तन डेटा के उपचार को प्रभावित नहीं करता है। माइक्रोचिप के लिए संकल्प के एक समारोह के रूप में पृष्ठभूमि बिखरने तीव्रता और अलग सामग्री कहीं और दिखाया गया है19कहीं । चित्रा 3 सीमें प्रस्तुत माप में, डायलिसिस चिप किसी भी समाधान (प्रोटीन या तेज़ समाधान) से खाली था और पृष्ठभूमि शोर के समाधान की उपस्थिति के योगदान को मापा नहीं गया है। चिप्स एक्स-रे बीम के सामने एक 3 डी मुद्रित समर्थन(चित्रा 3B)के साथ घुड़सवार थे, जो सीटू विवर्तनप्रयोगों 19में डिजाइन किया गया था। हालांकि, एक ९६-अच्छी तरह से/एसबीएस मानक क्रिस्टलीकरण प्लेट के आयामों के बराबर आयामों के साथ एक ही समर्थन, 1 से 3 क्रिस्टलीकरण प्रयोगों के प्रदर्शन के लिए समवर्ती इस्तेमाल किया जा सकता है, क्योंकि यह एक साथ 3 चिप्स(चित्रा 3A)को पकड़ सकता है ।

माइक्रोडायलिसिस विधि के साथ मॉडल घुलनशील प्रोटीन के ऑन-चिप क्रिस्टलीकरण के लिए माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों की दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए प्रयोग किए गए थे। तरल चैनल के रूप में प्रोटोकॉल के चरण 4 में वर्णित भरा गया था, जबकि कदम 5 और 6 कैसे समर्पित प्रोटीन जलाशय के भीतर प्रोटीन नमूना समझाना और कैसे क्रिस्टलीकरण प्रयोगों को स्थापित करने के लिए वर्णित है । चित्रा 4 1.5 एम सोडियम क्लोराइड (एनएसीएल) के तहत 293 के दशक में उगाए गए lysozyme क्रिस्टल से पता चलता है 0.1 मीटर सोडियम एसीटेट (सीएच3COONA) पीएच 4.0(ए)और अंडर 1 एम NaCl, 0.1 एम सीएच3सीओओएना पीएच 4.5 30% पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) 400(बी)के साथ। Lyophilized lysozyme पाउडर को पानी में ~30 मिलीग्राम एमएल-1 या 20 m CH3COONA pH 4.2 बफर की अंतिम एकाग्रता के लिए ~20 मिलीग्राम एमएल-1 की अंतिम एकाग्रता के लिए क्रमशः आंकड़े 4A और 4Bमें सचित्र प्रयोगों के लिए भंग कर दिया गया था। दोनों प्रयोगों में प्रोटीन नमूने की मात्रा लगभग 0.3 माइक्रोन थी और माइक्रोचिप्स के भीतर एम्बेडेड आरसी डायलिसिस झिल्ली का एमडब्ल्यूसीओ 6-8 केडीए की सीमा में स्थित है। चित्रा 3A में दिखाए गए lysozyme क्रिस्टल 1 घंटे के भीतर बढ़ी और चित्रा 3B में क्रिस्टल प्रयोग की शुरुआत से 30 मिनट के भीतर बढ़ी । क्रिस्टलीकरण प्रयोग स्थिर परिस्थितियों में किए गए थे। हालांकि, यह19 दिखाया गया है कि बहती परिस्थितियों में प्रयोगों का आयोजन गतिशील रूप से क्रिस्टलीकरण की स्थिति का आदान-प्रदान करने और चरण आरेखों का अध्ययन करने, माइक्रोडायलिसिस विधि की प्रतिक्रमण की पुष्टि करने की संभावना प्रदान करता है।

सीटू में चित्रा 4 ए में दिखाए गए lysozyme क्रिस्टल से एक्स-रे विवर्तन डेटा ऐसे प्रयोगों के लिए डायलिसिस चिप्स की उपयुक्तता प्रदर्शित करने के लिए एकत्र किए गए थे । डेटा संग्रह कमरे के तापमान पर BM30A-FIP बीमलाइन (ESRF) पर किया गया था, जैसा कि प्रोटोकॉल के चरण 7.2.1 में वर्णित है। माइक्रोचिप्स को 3डी-प्रिंटेड सपोर्ट(चित्रा 3 बी)की सहायता से बीमलाइन पर रखा गया था और टेबल 1की दूसरी पंक्ति में दी गई शर्तों के तहत ऑन-चिप उगाए गए दो सिंगल लिसोजाइम क्रिस्टल से पूर्ण एक्स-रे विवर्तन डेटा सेट एकत्र किए गए थे । डेटा सेट के अवलोकन प्रतिबिंबों को एक्सडीएस48 का उपयोग करके संसाधित, अनुक्रमित और एकीकृत किया गया था और क्रमशः चरण49 और फेनिक्स52का उपयोग करके आणविक प्रतिस्थापन और परिष्करण को पूरा किया गया था। प्रत्येक lysozyme क्रिस्टल के पूर्ण डेटा सेट के लिए क्रिस्टलीय आंकड़े और दो डेटा सेट के विलय के लिए तालिका 2में प्रदान की जाती हैं । आणविक प्रतिस्थापन के लिए, पीडीबी प्रविष्टि 193L का उपयोग किया गया था।

एक ही lysozyme क्रिस्टल से इलेक्ट्रॉन घनत्व नक्शे और दो क्रिस्टल के विलय डेटा सेट क्रमशः १.९५ Å और १.८५ Å पर प्राप्त किया गया है, और आंकड़े 5A और 5Bमें सचित्र हैं । दोनों इलेक्ट्रॉन घनत्व मानचित्र विस्तृत संरचनात्मक जानकारी दिखाते हैं जो एक क्रिस्टल से या कई क्रिस्टल से कमरे के तापमान पर डायलिसिस माइक्रोचिप पर सीधे आयोजित सीटू एक्स-रे विवर्तन प्रयोगों में प्राप्त किया जा सकता है, जो सीटू एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी अध्ययनों में चिप्स के लिए संगत प्रदान करता है।

Figure 1
चित्र 1:डायलिसिस चिप निर्माण का योजनाबद्ध चित्रण। (ए)एसयू-8 राल दो सिलिकॉन वेफर्स और स्पिन कोटेड पर जमा किया जाता है । (ख)फोटोमास्क के माध्यम से यूवी लाइट के साथ फोटोरेसिस्ट को विकिरणित करने और अनएक्सपोज्ड पार्ट्स विकसित करने के बाद एसयू-8 मास्टर का अधिग्रहण किया जाता है । (ग)पीडीएमएस को एसयू-8 मास्टर्स पर तिरस्कृत किया जाता है और 1 एच के लिए 338 K पर ठीक होने के बाद,(घ)माइक्रो-पैटर्न को प्रतिकृति और छापकर उत्पादित 2 पीडीएमएस मोल्ड्स को स्वामी से छील दिया जाता है और(ई)उचित आकार में काट दिया जाता है । (च)पीडीएमएस मोल्डों को दो केंद्रीय स्तंभों के बीच में आरसी डायलिसिस झिल्ली को शामिल करते हुए एक ग्लास स्लाइड पर समर्थित किया जाता है। (जी)2 पीडीएमएस मोल्डों को फिर एक वैक्यूम कक्ष में ~ 30 मिनट के लिए गठबंधन और डिसिकेटेड किया जाता है। (ज)एनओए 81 राल को दो मोल्डों के बीच में डाला जाता है और(I)केशिका द्वारा अंतरिक्ष भरता है। (जम्मू)यूवी लाइट के पहले एक्सपोजर के बाद बॉटम पीडीएमएस मोल्ड को हटा दिया जाता है और असेंबली को पीएमएमए शीट पर जमा किया जाता है । (K)दूसरा यूवी एक्सपोजर एनओए 81 राल को पूरी तरह से पॉलीमराइज करने के लिए इस प्रकार है और शेष ऊपरी पीडीएमएस मोल्ड को हटाने के बाद डायलिसिस चिप तैयार है। (L)डायलिसिस चिप का साइड व्यू योजनाबद्ध जहां डिवाइस की सभी परतें और उनकी संबंधित मोटाई बताई जाती है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:डायलिसिस चिप्स ऑन-चिप प्रोटीन क्रिस्टलीकरण के लिए और सीटू एक्स-रे विवर्तन प्रयोगों में एक आरसी डायलिसिस झिल्ली एम्बेड। (ए)एनओए 81 माइक्रोचिप्स पर 175 माइक्रोन मोटी पीएमएमए सब्सट्रेट 0.1 माइक्रोल (बाएं) और 0.3 माइक्रोल (दाएं) नाममात्र की मात्रा के प्रोटीन जलाशय के साथ। (ख)तरल चैनल के इनलेट और आउटलेट बंदरगाहों पर चिपके हुए द्रवित कनेक्टर के रूप में पिपेट टिप्स के साथ माइक्रोचिप्स। (ग)क्रिस्टलीकरण प्रयोग के दौरान माइक्रोचिप की तस्वीर । प्रोटीन नमूना १७५ μm मोटी पीएमएमए शीट और Kapton टेप के एक टुकड़े के साथ समझाया है । तिरछी नज़र नैनोपोर्ट कनेक्टर्स का उपयोग तरल चैनल के इनलेट और आउटलेट बंदरगाहों के लिए किया जाता है। (घ)तरल चैनल के भीतर क्रिस्टलीकरण समाधान के परिसंचरण के दौरान प्रोटीन जलाशय का शीर्ष दृश्य। आरईआर डायलिसिस झिल्ली के ठीक नीचे जलाशय के ऊपरी हिस्से में हवा फंसी हुई है, जिसका स्पष्ट रूप से पता लगाया जा सकता है। (ई)प्रोटीन नमूने के जमाव के दौरान ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के माध्यम से डायलिसिस जलाशय का शीर्ष दृश्य। प्रोटीन ड्रॉपलेट एम्बेडेड आर सी डायलिसिस झिल्ली के ठीक ऊपर जमा है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:क्रिस्टलीकरण प्रयोगों के दौरान उपयोग किए जाने वाले माइक्रोचिप्स के लिए3डी-मुद्रित समर्थन (ए)और(बी) सीटू एक्स-रे विवर्तन प्रयोगों के लिए ईएसआरएफ में BM30A-FIP बीमलाइन पर एक्स-रे बीम के सामने घुड़सवार । (ग)कप्टन, आरसी डायलिसिस झिल्ली, पीएमएमए, और डायलिसिस चिप (बाएं से दाएं) के साथ एक्स-रे की बातचीत से उत्पन्न पृष्ठभूमि शोर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:माइक्रोडायलिसिस विधि के साथ लाइसोजाइम का ऑन-चिप क्रिस्टलीकरण। (A)Lysozyme (~30 मिलीग्राम एमएल-1) क्रिस्टल 1.5 एम NaCl और 0.1 एम CH3COONA pH 4.0 और(B)lysozyme (~ 20 मिलीग्राम एमसीएल-1) क्रिस्टलीकरण शर्तों के तहत उगाए गए क्रिस्टल 1 एम एनएसीएल, 0.1 एम सीएच3सीओओएनए पीएच 4.5, और 30% खूंटी 400. दोनों प्रयोग २९३ K पर आयोजित किए गए थे । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5:परिष्कृत लाइसोजाइम संरचना के इलेक्ट्रॉन घनत्व नक्शे (ए) एक एकल क्रिस्टल और (बी) माइक्रोडायलिसिस के माध्यम से ऑन-चिप उगाए गए दो क्रिस्टल के विलय किए गए डेटा सेट। नक्शे क्रमशः 1.95 Å और 1.84 Å पर प्राप्त किए गए थे, 1σ पर समोच्च। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

प्रोटीन प्रोटीन एकाग्रता
(मिलीग्राम एमएल-1)		 प्रोटीन बफर की प्रारंभिक एकाग्रता
तेज समाधान		 आरसी के MWCO
डायलिसिस झिल्ली
(केडीए)		 तापमान
(कश्मीर)
Lysozyme ~ 30 पानी 1.5 एम एनएसीएल
0.1 एम सीएच3सीओएनए पीएच 4.0		 6 - 8 293
Lysozyme ~ 20 20 एमएमएम सीएच3सीओएनए पीएच 4.2 1 एम एनएसीएल
0.1 एम सीएच3सीओएनए पीएच 4.5
30% खूंटी 400		 6 - 8 293

तालिका 1: प्रोटीन बफर की संरचना और माइक्रोडायलिसिस विधि के साथ लाइसोजाइम के ऑन-चिप क्रिस्टलीकरण के लिए तेज़ समाधान। दूसरी पंक्ति में प्रदान की गई शर्तों के साथ ऑन-चिप उगाए गए लिसोज़िमे क्रिस्टल का उपयोग सीटू एक्स-रे विवर्तन डेटा संग्रह में किया गया था।

प्रोटीन Lysozyme Lysozyme Lysozyme
क्रिस्टल की संख्या 1 1 2
विवर्तन फ्रेम की संख्या 40 30 70
प्रति एक्सपोजर दोलन (°) 1 1
एक्सपोजर समय (एस) 30 30
तापमान (कश्मीर) 293 293 293
अंतरिक्ष समूह पी 43212 पी 43212 पी 43212
यूनिट सेल पैरामीटर 78.86 78.86 37.87
90.0 90.0 90.0		 79.17 79.17 37.95
90.0 90.0 90.0		 78.47 78.47 37.65
90.0 90.0 90.0
संकल्प रेंज (Å) 27.31 - 1.95
(2.02 - 1.95)		 27.39 - 1.96
(2.03 - 1.96)		 27.17 - 1.85
(1.91 - 1.85)
मोज़ेकिटी (°) 0.319 0.121
कुल प्रतिबिंब (मनाया) 25127 (3552) 19991 (3001)
अद्वितीय प्रतिबिंब (मनाया गया) 8641 (1357) 8295 (1321) 10404 (975)
रेडुडेंसी 2.90 (2.61) 2.41 (2.27)
पूर्णता (%) 95.0 (94.8) 91.9 (93.3) 98.23 (93.15)
मतलब मैं/σ 6.83 (1.16) 7.09 (1.66) 3.7
सीसी(1/2) 99.1 (42.4) 97.9 (37.0) 97.0
आर-मर्ज 0.184
आर-मीस 0.139 0.221 0.219
आर-पीआईएम 0.116
परिष्करण में उपयोग किए जाने वाले प्रतिबिंब 8645 (787) 8451 (857) 10391 (965)
आर-मुक्त के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रतिबिंब 864 (78) 846 (85) 1039 (96)
आर-वर्क 0.1988 (0.2968) 0.1853 (0.2872) 0.1839 (0.3102)
आर-फ्री 0.2430 (0.3437) 0.2297 (0.3622) 0.2207 (0.3703)
गैर-हाइड्रोजन परमाणुओं की संख्या 1069 1071 1096
अणुओं 1012 1012 1012
पानी 55 57 82
लिगांड 2 2 2
प्रोटीन अवशेष 131 131 131
आरएमएस (बांड, Å) 0.008 0.009 0.005
आरएमएस (कोण, डिग्री) 1.17 1.26 1.05
रामचंद्रन इष्ट (%) 98.43 97.64 99.21
रामचंद्रन की अनुमति (%) 1.57 2.36 0.79
रामचंद्रन आउटलियर्स (%) 0.00 0.00 0.00
एवेगरे बी-फैक्टर 34.26 28.54 24.34
प्रोटीन 33.94 28.14 23.62
पानी 40.23 35.57 33.16
लिगांड्स 33.23 29.63 24.77

तालिका 2: डेटा संग्रह पैरामीटर, क्रिस्टलोग्राफिक और लाइसोजाइम क्रिस्टल के परिशोधन आंकड़े माइक्रोडायलिसिस विधि के माध्यम से चिप पर उगाए जाते हैं। कोष्ठक में प्रदान किए गए मूल्य उच्चतम संकल्प खोल के अनुरूप होते हैं। चौथा कॉलम दूसरे और तीसरे कॉलम के डेटा सेट को मर्ज करने के बाद प्राप्त मूल्यों से मेल खाता है ।

Discussion

माइक्रोडायलिसिस विधि के साथ और कमरे के तापमान पर सीटू एक्स-रे विवर्तन प्रयोगों में ऑन-चिप प्रोटीन क्रिस्टलीकरण के लिए एक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस विकसित किया गया है। एनओए 81 चिप्स किसी भी एमडब्ल्यूसीओ के आर सी डायलिसिस झिल्ली को एकीकृत करने के लिए ऑन-चिप प्रोटीन क्रिस्टलीकरण के लिए माइक्रोडायलिसिस का उपयोग करने के लिए निर्मित किया जा सकता है। अपेक्षाकृत उच्च एक्स-रे पारदर्शिता के साथ निर्माण सामग्री का उपयोग किया गया था, जो चिप्स को सीटू प्रोटीन क्रिस्टलोग्राफी में संगत प्रदान करता था। डिवाइस (पीएमएमए, काप्टन, आरसी डायलिसिस झिल्ली) के प्रोटीन क्रिस्टलीकरण के लिए डिब्बे की रचना करने वाली निर्माण सामग्री का मूल्यांकन कम पृष्ठभूमि शोर उत्पन्न करने के लिए किया गया था। विशेष रूप से, डायलिसिस चिप द्वारा उत्पन्न पृष्ठभूमि शोर मुख्य रूप से कम रिज़ॉल्यूशन (> 6 Å) पर मनाया जाता है और प्रोटीन संरचना निर्धारण के लिए आवश्यक बड़े lysozyme क्रिस्टल के उच्च-रिज़ॉल्यूशन विवर्तन डेटा के उपचार को प्रभावित नहीं करता है। डेटा संग्रह का स्वचालन 3 डी मुद्रित समर्थन का उपयोग करके परिलक्षित होता है जिसे सीधे मैक्रोमॉलिकुलर क्रिस्टलोग्राफी बीमलाइंस में रखा जा सकता है और एक साथ तीन माइक्रोचिप्स तक ले जा सकता है। इस तरह, मैन्युअल कटाई और नाजुक प्रोटीन क्रिस्टल के हेरफेर से बचा जाता है। इसके अलावा, डेटा संग्रह कमरे के तापमान पर होता है, क्रायोप्रोटेक्शन की आवश्यकता से बचता है जो देशी प्रोटीन संरचना2,3से अनुरूप परिवर्तन से संबंधित हो सकता है।

क्रिस्टल ऑन-चिप विकसित करने की विधि के रूप में माइक्रोडायलिसिस का उपयोग क्रिस्टलीकरण प्रक्रिया की सटीक निगरानी और नियंत्रण करने की अनुमति देता है। जैसा कि परिचय में चर्चा की गई है, अधिकांश पारंपरिक प्रोटीन क्रिस्टलीकरण विधियों को माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों11, 14का उपयोग करके लागू किया गया है। हालांकि, प्रोटीन क्रिस्टलीकरण के लिए डायलिसिस के फायदों का अभी तक माइक्रोस्केल पर पूरी तरह से दोहन नहीं किया गया था । ऑन-चिप माइक्रोडायलिसिस चरण आरेखों का अध्ययन करने और एक ही प्रोटीन नमूना19के साथ क्रिस्टलीकरण की स्थिति की स्क्रीनिंग और अनुकूलन करने की संभावना प्रदान करता है। इस काम में प्रस्तुत प्रोटोटाइप के लिए, प्रति चिप प्रोटीन की खपत ०.१ या ०.३ μL तक सीमित है । अब तक के प्रायोगिक कार्य के आधार पर, प्रोटोकॉल के सबसे महत्वपूर्ण कदम चिप्स के निर्माण प्रक्रिया से नहीं बल्कि क्रिस्टलीकरण प्रक्रिया से प्राप्त होते हैं । निर्माण प्रोटोकॉल में कई कदम शामिल हैं लेकिन यह सीधा है और अपेक्षाकृत सस्ती सामग्रियों के साथ, स्वच्छ कमरे में एक ही दिन में कई उपकरणों (20 से 30 चिप्स) के निर्माण को सक्षम बनाता है। हालांकि, प्रोटीन का ऑन-चिप क्रिस्टलीकरण विशेष रूप से माइक्रोस्केल में नाभिक और क्रिस्टल विकास की आंतरिक स्टोचस्टिक प्रकृति के कारण एक नाजुक प्रक्रिया हो सकती है। एक केस स्टडी का वर्णन किया गया है, जहां lysozyme के क्रिस्टलीकरण के लिए अच्छी तरह से स्थापित स्थितियों का उपयोग किया गया था जो सीटू एक्स-रे विवर्तन डेटा संग्रह में उपयुक्त मजबूत, अच्छी तरह से परिभाषित क्रिस्टल मिले थे। फिर भी, झिल्ली प्रोटीन जैसे अधिक चुनौतीपूर्ण प्रोटीन लक्ष्यों के उपयोग से कठिनाइयां उत्पन्न हो सकती हैं, जहां क्रिस्टलीकरण माध्यम बहुत अधिक जटिल है, चरण आरेख ज्ञात नहीं हैं और अच्छी तरह से काम करने वाली क्रिस्टलीकरण की स्थिति अभी तक अच्छी तरह से स्थापित नहीं है। डायलिसिस चिप केवल माइक्रोफ्लुइडिक चैनल के भीतर क्रिस्टलीकरण समाधान का आदान-प्रदान करके मूल्यवान और अक्सर महंगे प्रोटीन नमूने को निपटाने के बिना, इन कठिनाइयों को पार करने और चरण आरेखों को पार करने की संभावना प्रदान करती है।

माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों की बहुमुखी प्रतिभा कम प्रोटीन की मात्रा का उपयोग करके क्रिस्टलीकरण की स्थितियों और मानचित्र एकाग्रता और तापमान को अलग-अलग चरण आरेखों को नियंत्रित करने के लिए ऑन-चिप प्रोटीन क्रिस्टलीकरण के लिए माइक्रोडायलिसिस का शोषण करने से उपजी है। इसके अलावा, डिवाइस सीटू एक्स-रे विवर्तन प्रयोगों में संगत है और उपकरणों की प्रोटोटाइप सस्ती और तेजी से है। घुलनशील और झिल्ली प्रोटीन (तैयारी में) के कई, आइसोमॉर्फस क्रिस्टल को ऑन-चिप उगाया जा सकता है और यह उम्मीद की जाती है कि इन सभी सुविधाओं का उपयोग सिंक्रोट्रॉन और एक्सफेल सुविधाओं पर चुनौतीपूर्ण प्रोटीन लक्ष्यों के धारावाहिक एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी अध्ययनों के लिए किया जा सकता है। अंत में, ऑन-चिप और सीटू समय-हल किए गए अध्ययनों में प्रदर्शन करना भविष्य की संभावना है जो क्रिस्टलीय समुदाय के लिए महत्वपूर्ण रुचि हो सकती है। इसलिए, डायलिसिस चिप पर क्रिस्टल बढ़ रहा है और माइक्रोफ्लुइडिक चैनल में अभिवात शुरू करके, या तो मैन्युअल रूप से (एक सिरिंज का उपयोग कर) या स्वचालित रूप से (एक दबाव नियंत्रण तरल पदार्थ प्रणाली या एक सिरिंज पंप के साथ), भविष्य के प्रयासों को साबित करने पर ध्यान केंद्रित करेंगे कि माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स सफलतापूर्वक सिंक्रोट्रॉन बीमलाइन पर समय का समाधान प्रयोगों को ट्रिगर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

एमबीएस 2014-2015 की सीमा पर अनुबंध इंस्ट्रूमेंटेशन के तहत एमआई/सीएनआरएस के समर्थन को स्वीकार करता है । एनजे पीएचडी फैलोशिप के लिए सीईए के इंटरनेशनल डॉक्टोरल रिसर्च प्रोग्राम (Irtelis) को स्वीकार करता है । एमबीएस और एसजे मैरी Skłodowska-क्यूरी अनुदान समझौते संख्या ७२२६८७ के तहत यूरोपीय संघ के क्षितिज २०२० अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम से धन स्वीकार करते हैं । एमबीएस, एसजे, और एनजे माइक्रोफैब्रिकेशन प्रयोगों के लिए स्वच्छ कमरे स्थापना के लिए LIPHY (UGA) धन्यवाद। आईबीएस ग्रेनोबल के अंतःविषय अनुसंधान संस्थान (IRIG, सीईए) में एकीकरण को स्वीकार करता है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3 in wafer Silicon Materials Inc. Silicon wafer
Centrifuge Eppendorf Minispin Bench-top centrifuge
CleWin 3.0 WieWeb software Designing software
Epoxy glue Devcon 5 minutes epoxy glue
Fluidic connectors Cluzeau Info Lab N-333 NanoPort kit for 1/16" OD tubing
Hen egg-white lysozyme Roche 10 837 059 001 Lyophilized protein powder
High-vacuum silicone grease Sigma-Aldrich Z273554 Dow Corning high-vacuum silicone grease
HMDS Sigma-Aldrich 440191 Silane, chemical
Hot plate Sawatec HP-200-Z-HMDS BM Hot plate
Isopropyl alcohol Sigma-Aldrich Solvent
Kapton tape DuPont Polyimide tape
Mask aligner SUSS MicroTec MJB4 Mask aligner, UV source
Membrane filter Millipore GSWP04700 0.22 μm pore size filter
Microscope glass slide Fisher Scientific 12164682 3 x 1 in glass slides
NOA81 Norland Products Inc.  NOA81 Photocurable resin
Oven Memmert Oven
Parafilm Sigma-Aldrich P6543 Parafilm M roll size 20 in. × 50 ft
PDMS Dow Corning Sylgard 184 Silicone
PEG 400 Hampton Research HR2-603 Chemical
Petri dish Sigma-Aldrich P5731 100 x 15 mm
PGMEA Sigma-Aldrich 484431 Developer
Plasma equipment Diener Electronic ZEPTO Plasma treatment
PMMA Goodfellow 137-745-63 PMMA sheets 150x150 mm, 0.175 mm thickness
Pressure driven system Elveflow OB1 MK3+ Pressure/vacuum controller
PTFE tubing Elveflow/Darwin microfluidics LVF-KTU-15 PTFE tubing roll 1/16" OD X 1/32" ID
RC dialysis membrane Spectra/Por Various MWCOs
Scalpel Swann-Morton Carbon steel surgical blades
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889 Chemical
Sodium chloride Sigma-Aldrich 746398 Chemical
Solidworks Dassault Systemes 3D-CAD designing software
Spin coater SPS Spin150 Wafer spinner
SU-8 3000 series MicroChem Corp. SU-8 3050 Photoresist
Syringe BD 309628 1 mL Luer-Lok syringe
UV crosslinker Uvitec CL-508 UV crosslinker

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केमिस्ट्री अंक 170 माइक्रोफ्लूइडिक्स ऑन-चिप प्रोटीन क्रिस्टलाइजेशन सीटू एक्स-रे डिफेक्शन माइक्रोडायलिसिस क्रिस्टलाइजेशन सीरियल क्रिस्टलोग्राफी फेज डायग्राम डायलिसिस चिप में
<i>सीटू</i> एक्स-रे विवर्तन अध्ययन में माइक्रोडायलिसिस द्वारा चिप पर प्रोटीन का क्रिस्टलीकरण
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Jaho, S., Junius, N., Borel, F.,… More

Jaho, S., Junius, N., Borel, F., Sallaz-Damaz, Y., Salmon, J. B., Budayova-Spano, M. Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies. J. Vis. Exp. (170), e61660, doi:10.3791/61660 (2021).

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