Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Krystallisering af proteiner på chip af mikrodialyse til In Situ X-ray Diffraktion Studies

Published: April 11, 2021 doi: 10.3791/61660
Automatic Translation
1, 1,3, 1, 1, 2, 1
1Université Grenoble Alpes, CEA, CNRS, IBS, 2CNRS, Solvay LOF, UMR 5258, Université Bordeaux, 3ELVESYS SAS

Summary

Dette papir beskriver fabrikationsprotokollen for mikrofluidiske chips udviklet til on-chip protein krystallisering med dialysemetoden og in situ X-ray diffraktionseksperimenter. Mikrofabrikationsprocessen gør det muligt at integrere en semipermeable regenereret cellulosedialysemembran med enhver molekylær vægtafskæring mellem to lag af chippen.

Abstract

Denne protokol beskriver fremstillingen af reproducerbare og billige mikrofluidiske anordninger, der dækker hele rørledningen til krystallisering af proteiner på chippen med dialysemetoden og tillader in situ enkeltkrystal- eller serielle krystallografieksperimenter ved stuetemperatur. Protokollen beskriver mikrochips fabrikationsprocessen, manipulationen af on-chip krystalliseringsforsøgene og behandlingen af in situ indsamlede røntgendiffraktionsdata til strukturel belysning af proteinprøven. Hovedtræk ved denne mikrofabrikationsprocedure ligger i integrationen af en kommercielt tilgængelig, semipermeable regenereret cellulosedialysemembran mellem to lag af chippen. Den molekylære vægtskæring af den indlejrede membran varierer afhængigt af makromolekylets og præcipitanternes molekylvægt. Enheden udnytter fordelene ved mikrofluidisk teknologi, såsom brugen af små mængder prøver (<1 μL) og finjustering over transportfænomener. Chippen koblede dem med dialysemetoden, hvilket giver præcis og reversibel kontrol over krystalliseringsprocessen og kan bruges til at undersøge fasediagrammer af proteiner på mikroliterskalaen. Enheden er mønstret ved hjælp af en fotocurable thiolene-baseret harpiks med blød aftryk litografi på et optisk gennemsigtigt polymer substrat. Desuden blev baggrundsspredningen af de materialer, der udgør mikrochips og genererer baggrundsstøj, evalueret, hvilket gjorde chippen kompatibel for in situ X-ray diffraktionseksperimenter. Når proteinkrystallerne er vokset på chippen op til en passende størrelse og befolkning ensartethed, kan mikrochips monteres direkte foran røntgenstrålen ved hjælp af en 3D-printet holder. Denne tilgang tager fat på de udfordringer, der stiger fra brugen af kryoprotectiva og manuel høst i konventionelle proteinkrystallografieksperimenter gennem en nem og billig måde. Komplet X-ray diffraktion datasæt fra flere, isomorfe lysozym krystaller dyrket on-chip blev indsamlet ved stuetemperatur for struktur bestemmelse.

Introduction

At belyse den tredimensionelle (3D) struktur af biologiske makromolekyler er en uophørlig forfølgelse i strukturel biologi, hvor røntgenkrystallografi fortsat er den vigtigste undersøgelsesteknik. Den anvendes til at optrævle de strukturelle detaljer i komplekse makromolekyler, såsom proteiner, og har til formål at lette forståelsen af deres virkningsmekanismer og deres involvering i forskellige biologiske funktioner. Kraftige røntgenkilder ved synkrotroner og røntgenfri elektronlasere (XFELs) giver alle de værktøjer, der kræves for en dybere indsigt i proteinernes struktur ved næsten atomopløsning. På trods af de fordele, der følger med brugen af røntgenstråler til strukturelle undersøgelser, er der iboende begrænsninger for røntgenstråling og selve krystalliseringsprocessen. Strålingsskader fremkaldt af høj røntgenflux og lange eksponeringstider for proteinkrystallen foran røntgenstrålen er restriktive parametre, som krystallografer skal overgå ved hjælp af kryogen køling1. Det kan dog være besværligt at finde de optimale kryotypeforhold, da kropsbygningsændringer fra den oprindelige proteinstruktur eller artefakter kan skjules2,3. Desuden viser nylige undersøgelser, at udførelse af diffraktionseksperimenter ved stuetemperatur fører til lavere specifikke strålingsskader4. En anden flaskehals i strukturel biologi er erhvervelsen af godt spredende krystaller med en tilstrækkelig størrelse5. Små krystaller er lettere at producere, især i tilfælde af membranproteiner, men er mere modtagelige for strålingsskader selv under kryocoolingforhold, fordi en høj strålingsdosis skal rettes i et mindre volumen sammenlignet med tilfældet med større proteinkrystaller6. Den nye tilgang til seriel krystallografi7,8 ved synkrotroner og XFELs kan omgå fastholdelsesbegrænsende af strålingsskader og samtidig udnytte mindre krystaller (200 nm til 2 μm)7 ved at fusionere datasæt fra flere, isomorfe og tilfældigt orienterede proteinkrystaller og drage fordel af de tilknyttede teknologiske fremskridt såsom femtosekundsimpulser, kortere eksponeringstider og mikrofokuserede røntgenstråler5,7,9,10.

Mikrofluidisk teknologi er værdifuld for røntgenkrystallografi og udviser mangfoldige fordele for krystalliseringen af biologiske makromolekyler og deres strukturelle undersøgelse. Udførelse af krystalliseringseksperimenter i mikrofluidiske enheder kræver små mængder proteinprøve, hvilket begrænser produktionsomkostningerne for disse højt værdsatte biobiobiomolekyler og letter screening og optimering af mange krystalliseringsbetingelser. Desuden muliggør det iboende store forhold mellem overflade og volumen ved den mikrofluidiske skala og diffusionsbegrænsede transportfænomener fin kontrol over strømme og temperatur- eller koncentrationsgradienter11,12,13,14, hvilket gør mikrofluidiske anordninger egnede til dyrkning af krystaller i ensartet størrelse og udforskning af fasediagrammer15,16,17,18,19. Desuden udviser mikrofluidiske værktøjer et særligt potentiale til at tackle en anden forhindring i proteinkrystallografi, som er prøvelevering, og nødvendigheden af at håndtere og høste proteinkrystaller, før de anvendes til røntgendiffraktionseksperimenter. Metoden til on-chip og in situ røntgenkrystallografi eliminerer krystalmanipulationen og den potentielle forringelse af krystalkvaliteten inden dataindsamlingen. En bred vifte af mikrofluidic chips kompatibel for in situ X-ray protein krystallografi er blevet designet, udviklet og testet af mange forskergrupper konfrontere de relaterede begrænsninger som følge af arten af mikrofabrikation materialer og deres interaktioner med X-stråler14,19,20,21,22,23. Fremstillingsmaterialerne skal være optisk gennemsigtige, biologisk inerte og udvise stor gennemsigtighed over for røntgenstråling og et optimalt signal-til-støj-forhold under dataindsamlingen.

De fleste af de krystalliseringsmetoder, der anvendes i konventionel proteinkrystallografi24,25 er også blevet implementeret på den mikrofluidiske skala11,14 for på chipkrystallisering og in situ X-ray diffraktionsanalyse. Simpelt, hybrid- eller flerlags mikrofluidisk apparat, der indeholder dampdiffusion26, fordampning27, gratis grænsefladediffusion (FID)28, mikrobatch26eller endda såning29 er blevet brugt til at krystallisere opløselige og membranproteiner. Høj gennemløbsscreening og optimering af krystalliseringsforhold kan opnås30,31 i velbaserede32, dråbebaserede33eller ventilaktiverede34 enheder. På stedet X-ray diffraktionseksperimenter af udfordrende proteinmål ved stuetemperatur er blevet udført i mikrochips fremstillet af forskellige materialer såsom PDMS (polydimethylsiloxan), COC (cyklisk olefin copolymer), PMMA (poly(methyl methacrylat))21,22,26,28,29, grafenfilm23, Kapton35, epoxylim6eller NOA (Norland Optical Adhesive)19 og materialernes gennemsigtighed i røntgenstrålingen og deres bidrag til baggrundsstøj er blevet evalueret. Desuden er mikrochips designet til at parre in situ og de serielle dataindsamlingsstrategier i et enkelt værktøj til røntgenproteinkrystallografieksperimenter ved synkrotronkilder23,35,36 og XFELs7.

Rumtemperatur in situ dataindsamling er også blevet implementeret i forskellige leveringsmetoder og enheder. For eksempel brugte Nogly et al.54 en lipidisk kubikfase (LCP) injektor til at studere strukturen af den lysdrevne fotonpumpe bacteriorhodopsin (bR) ved seriel femtosekund krystallografi (SFX) ved hjælp af en XFEL-kilde. Krystalstrukturen i bR blev løst til 2,3 Å-opløsning, hvilket viser kompatibiliteten af en LCP-injektor med tidsløst seriel femtosekund krystallografi (TR-SFX). Baxter et al.55 designede et flerkrystalgitter med høj densitet, fremstillet af en 100 eller 200 μm tyk polycarbonatplast med laserskårne huller i forskellige størrelser. En yderligere 5 μm tyk polycarbonatfilm kan fastgøres til den ene side af gitteret, når enheden bruges til siddende eller hængende drop krystalliseringseksperimenter. Dette net med høj densitet kan bruges på flere måder, da krystaller kan indlæses direkte på enhedens porte, eller krystaller kan dyrkes på enheden ved dampspredning eller LCP-metoden. Desuden kan nettet justeres i en standard magnetisk base og bruges til in situ røntgen dataindsamling ved kryogene eller stuetemperatur betingelser. For nylig udviklede Feiler et al.56 en prøveholder til makromolekylær in situ røntgenkrystallografi ved kryogen og omgivelsestemperatur med minimal baggrundsstøjbidrag. Specifikt består holderen af en plaststøtte, en gennemsigtig COC-folie og en mikroporous struktureret polyimidfolie. Det var designet til at erstatte de almindeligt anvendte dækslet dias til opsætning af krystallisering dråber, samtidig med at in-place manipulation såsom ligand iblødsætning, komplekse dannelse, og kryogene beskyttelse uden at åbne krystallisering drop eller manuelt håndtering af krystaller. Desuden kan prøveholderen fjernes fra krystalliseringspladen og placeres på en magnetisk base til in situ-dataindsamling ved standard goniometerbaserede strålelinjer. Til dataindsamling ved omgivelsestemperatur fjernes COC-folien før forsøget, og kun den 21 μm tykke polyimidfolie bidrager til baggrundsspredning, som i dette tilfælde er minimal. Disse eksempler udgør kun en lille brøkdel af den igangværende forskning og de mange alsidige mikrochips udviklet til røntgenprotein krystallografi.

Dialyseproteinkrystalliseringsmetoden er imidlertid ikke i vid udstrækning blevet indarbejdet i mikrofluidics. Dialyse er en diffusionsbaseret metode, der sigter mod ekvilibrering af præcipitantkoncentrationen gennem en halvgennemtrængelig membran for at nærme sig den nominelle koncentration for proteinkrystallisering og muliggør præcis og reversibel kontrol over krystalliseringsbetingelserne24. Den molekylære vægtskæring (MWCO) af den semi-gennemtrængelige dialysemembran kan vælges afhængigt af makromolekylets og præcipitanternes molekylvægt for at muliggøre spredning af små afgrundsmolekyler, samtidig med at makromolekylet bevares af interesse. På grund af dialyseprocessens reversibilitet kan den bruges i kombination med temperaturkontrol til at afkoble og optimere kerne- og krystalvækst uafhængigt37 til at undersøge fasediagrammer ved at ændre præcipitantkoncentrationen, mens du bruger den samme proteinprøve. Integreringen af membraner i mikrofluidics gennemgås af de Jong et al.38, og casestudierne i biologi, der implanterer dialyse i mikrochips, kan hovedsagelig nævnes i prøvepræparater, koncentrations- eller filtreringsapplikationer39,40,41,42 eller cellerelaterede undersøgelser43,44. Pervaporation gennem PDMS blev brugt af Shim et al.37 til at studere nukleation og vækst af xylanase under forskellige forhold. Vand gennemtrænges gennem den 15 μm tykke PDMS-membran ind i proteinbeholderen på den mikrofluidiske enhed og ændrer efterfølgende protein- og præcipitantkoncentrationen.

Protokollen udviklet af Junius et al.19,45 til fremstilling af en mikrofluidic chip kompatibel for både on-chip protein krystallisering via mikrodialyse og in situ X-ray diffraktion eksperimenter ved stuetemperatur præsenteres. Protokollen for enheden fabrikation er direkte inspireret af det banebrydende arbejde udført af Studer og kolleger12,46 for mikro-mønstrede klistermærker af foto-helbredes thiolene-baserede harpiks NOA 81 indlejring kommercielt tilgængelige membraner, ved hjælp af bløde aftryk litografi. En innovativ ændring af metoden resulterede i mikrochips, der gjorde det muligt at anvende mikroanalyse til nøjagtigt at overvåge og kontrollere forsøgsparametrene for on-chip vækst af proteinkrystaller og samtidig udnytte fordelene ved mikrofluidics, såsom reduceret forbrug af proteinprøver pr. forsøg (<1 μL). I et tidligere værk blev de dialyseprincipper, der blev anvendt på et makroskalasystem (typisk volumen >20 μL) til screening og optimering af krystalliseringsforhold ved kortlægning af temperatur-præcipitantkoncentrationsfasediagrammer, påvist47. I dette arbejde beskrives en protokol til fremstilling af dialysemikrochips, der indeholder regenererede cellulose (RC) dialysemembraner af forskellige MWCO for at udføre krystalliseringsanalyseanalyser på chippen og in situ X-ray diffraktion dataindsamling. De materialer, der består af mikrochips er blevet evalueret for deres gennemsigtighed tilX-stråler 19 og enhederne kan indstilles direkte foran røntgenstrålen for stuetemperatur in situ diffraktion eksperimenter, bortset fra manuel håndtering og minimere nedbrydningen af skrøbelige proteinkrystaller. I et casestudie blev høneæghvide lysozymkrystaller dyrket på chippen via mikrodialyse, der genererede en ensartet størrelse befolkning. Mikrochippen blev derefter monteret foran røntgenstrålen med en 3D-printet understøttelse19, og komplette in situ diffraktionsdatasæt blev indsamlet ved stuetemperatur fra flere, isomorfe krystaller, hvilket demonstrerede det store potentiale og relevansen af chipsene til synkrotron serielle krystallografiundersøgelser af udfordrende makromolekylære mål.

Protocol

1. Maske design og master fabrikation

  1. Tegn de ønskede geometrier af den mikrofluidiske enhed ved hjælp af vektorisk tegningssoftware. For hvert lag af fotoresisten, der vil blive brugt til det næste trin i fotolitografi, skal du forberede en individuel maske: en maske skitseret med kanaler og søjler og en maske, der kun indeholder søjlerne.
  2. Oversæt de CIF-filer, der genereres af tegnesoftwaren, til filmfotomasker. Dette kan gøres gennem kommercielle tjenester. Kræv den relevante fotomaske afhængigt af valget af fotoresist, der anvendes under fotolitografi.
    BEMÆRK: For SU-8 fotoresist, bestil masker med sorte funktioner på en gennemsigtig baggrund. SU-8 er en epoxybaseret negativ fotoresist, hvilket betyder, at de dele, der udsættes for UV, under udsættelsen for UV-lys (365 nm) er krydsbøjet, mens resten forbliver opløselige. Derfor vil alle sorte mønstre på masken ikke blive krydsbundet af UV-lys under fotolitografien. Kanaler og søjler vil blive indgraveret på mestrene.
  3. Forbered to mestre på siliciumskiver til hver chips design ved fotolitografi ved hjælp af SU-8 negativ fotoresist.
    BEMÆRK: Trin 1.3.1-1.3.7 udføres i et rent rum. De trin, der er beskrevet nedenfor, er de traditionelle trin i fotolitografi efterfulgt af PDMS blød litografi, som er beskrevet i mange lærebøger. Alle værdierne af de eksperimentelle parametre (fotoresist, tidsvarighed, temperatur osv.) afhænger af mange subtile parametre og skal optimeres afhængigt af de forskellige anvendte apparater.
    1. Brug en 3-tommer silicium wafer og behandle overfladen med plasma i 90 s, for at lette deposition og fastgørelse af SU-8 fotoresist.
    2. Hæld ca. 3 mL SU-8 modstå på midten af wafer og spin pels SU-8 ned til den ønskede tykkelse(Figur 1A). For 50 μm nominel tykkelse skal du bruge SU-8 3050 og spincoat i 10 s ved 500 omdrejninger i minuttet og successivt i 30 s ved 3500 omdrejninger i minuttet. Blød bag fotoresisten på en kogeplade i 15 minutter ved 368 K for at blive delvist størknet ved at lade opløsningsmidlet i harpiksen fordampe og forhindre det i at klæbe på fotomasken. Lad derefter waferen stå ved stuetemperatur i 2 minutter.
    3. Fotoresisten udsættes for UV-lys (Figur 1B). Brug en maske aligner med en effekt på 35 mW cm-2 og 8 s eksponeringstid.
    4. Fortsæt med bagningen efter eksponeringen. Placer wafer på en kogeplade i 5 min ved 368 K for at fuldføre photoreaction påberåbes af UV-eksponering.
    5. Fjern alle su-8 modstå, der ikke var crosslinked ved at placere wafer i et bad, der indeholder propylenglycol methyl ether acetat (PGMEA) og rør i 15 min. Skyl waferen med isopropanol, indtil der ikke kan observeres sløret nedbør. Waferen tørres med nitrogengas og opbevares i petriskål (100 mm x 15 mm standardstørrelse).
    6. Fyld overfladen af waferen med en silan for at lette løsrivelsen af polydimethylsiloxan (PDMS), der vil blive brugt til at fremstille 2 frimærker. Sæt waferen på en tappet kogeplade ved 368 K i 10 minutter under dampatmosfæren i hexamethyldisilazane (HMDS).
      BEMÆRK: Hvis det bliver vanskeligt at skrælle PDMS af waferen efter flere anvendelser, skal overfladen af waferen behandles igen med HMDS-damp.
    7. Den første mester, der indeholder kanalerne og søjlerne, er klar. Gentag disse trin, og forbered kun den anden master, der mønstrer søjlerne.
      BEMÆRK: Under fotolitografien er målet at opnå enhedens geometrier på SU-8-masterne med en højde på 50 μm. Men når de to SU-8 mestre er fremstillet, måle højden af geometrier indgraveret på mestre med et profilometer for at erhverve den eksperimentelle værdi. Den målte værdi for begge SU-8 mastere fremstillet til denne protokol er ca. 45 μm.

2. PDMS forme fabrikation

BEMÆRK: Følgende trin i protokollen kan udføres i ethvert laboratorium, så længe der anvendes en laminarflowhætte, der anvendes gult lys i rummet, når der arbejdes med NOA 81-harpiksen (trin 3.6-3.11), og der er en kilde til UV-lys til rådighed til polymerisering af NOA 81-harpiksen (trin 3.7 og 3.11).

  1. Forbered 50 g PDMS silikonebase og dens hærdningsmiddel i et 10:1-masseforhold.
  2. Bland begge ingredienserne i et bægerglas med en spatel og læg blandingen i et vakuumkammer for at fjerne alle luftboblerne.
  3. Hæld 25 g af det forblandet PDMS i SU-8 masteren (opbevaret i en petriskål), der mønstrer kanalerne og søjlerne op til en højde på ca. 5 mm. Hæld de resterende 25 g af PDMS i den anden SU-8 master mønstre kun søjlerne op til en højde på ca 5 mm(Figur 1C).
  4. Læg både petriskålene i en ovn og hærde PDMS-lagene ved 338 K i 1 time.
  5. Skær det hærdede PDMS-lag rundt om SU-8-mestrenes mønstre med en skalpel, og skræl forsigtigt PDMS-formene af fra mestrene(Figur 1D).
    BEMÆRK: Den procedure, der er beskrevet ovenfor, kaldet replika støbning, er ofte bruges til at forberede forme af PDMS, der vil blive knyttet til glasoverflader og være en del af en mikrofluidic enhed53. I denne protokol er PDMS-forme ikke en del af chippen, men de bruges som mellemprodukter til spånfremstilling. For hvert design fremstilles 2 PDMS-forme af de respektive SU-8-mastere(Figur 1D og 1E)og vil blive brugt i overensstemmelse hermed (som beskrevet nedenfor) til fremstilling af mikrochippen.

3. Dialyse chip fabrikation

  1. Placer PDMS skimmel mønstre både kanaler og søjler på en stiv mikroskop glas dias (3 x 1 i. standard størrelse) med mønstre opad(Figur 1F). Den centrale søjle, der svarer til proteinbeholderen, overstiger lodret med 45 μm fra den vandrette overflade af PDMS-formen.
  2. Skær og adskil et tørt stykke af den regenererede cellulose (RC) dialysemembran og deponere den på den centrale søjle i PDMS-formen, som understøttes på glasrutschebanen (Figur 1F).
    BEMÆRK: RC-dialysemembranen er kommercielt tilgængelig, og molekylevægtafskæringen (MWCO) vælges i overensstemmelse hermed med den molekylære vægt af det undersøgte protein og de anvendte præcipitanter. Størrelsen af stykket af RC dialysemembranen afhænger af chippens design. I denne protokol er 2 prototyper designet, hvor proteinbeholderens volumen er 0,1 eller 0,3 μL. I disse tilfælde er størrelsen af dialysemembranstykket henholdsvis 2 x 2 mm2 eller 4 x 4 mm2.
  3. Placer den anden PDMS skimmel mønstre kun søjlerne vender nedad på toppen af PDMS skimmel understøttes på glasset dias(Figur 1F). Den centrale søjle i denne form svarer til proteinbeholderen og overstiger lodret (nedadvendt) med 45 μm fra den vandrette overflade.
  4. Juster de centrale søjler i de 2 PDMS forme. RC dialysemembranen er "klemt inde" i mellem de 2 PDMS forme (Figur 1G).
    BEMÆRK: Tilpasningen mellem mikrostrukturerne i de 2 PDMS-forme kan udføres visuelt uden ekstra udstyr. Ellers kan denne manipulation opnås under et mikroskop. Et lille skift mellem reservoirerne er ikke problematisk, så længe den flydende kanal og indgangs- eller udgangspunkterne ikke er helt dækket.
  5. Udtørrer samlingen i 30 minutter i et vakuumkammer for at fjerne alle fanget luftbobler i PDMS-forme og for at fremme indsættelsen af harpiksen under det næste trin i fremstillingen.
    BEMÆRK: De 2 PDMS-forme opbevares på plads af PDMS-PDMS-vedhæftning, og der kræves ikke ekstra tryk eller anden form for midlertidig limning.
  6. Fyld det tomme rum mellem de 2 PDMS forme med den fotocurable, thiolene-baserede harpiks NOA 81 ved kapillær imbibition (Figur 1H og 1I).
  7. Harpiksen hærdes ved udsættelse for UV-lys (365 nm) i 8 s ved hjælp af en kollimeret UV-lampe (effekt 35 mW cm-2).
    BEMÆRK: Denne første eksponering gør det muligt delvist at krydse NOA 81-harpiksen, da et tyndt lag NOA 81 i kontakt med PDMS-formene på begge sider forbliver uhærdet.
  8. Skær overskuddet af NOA 81 fra de ydre sider af PDMS forme med en skalpel.
  9. Fjern den øverste PDMS skimmel med delvist crosslinked NOA 81 fast på det fra bunden PDMS skimmel og glasrutschebane.
  10. Skær et 175 μm tykt PMMA-ark i standarddimensionerne på en mikroskopglasrutsjebane (3 x 1 tommer) og skræl plastbeskyttelsespladerne fra hver side af PMMA-stykket af. Tryk forsigtigt på samlingen af den øvre PDMS-form og den delvist hærdede NOA 81 på PMMA-stykket (Figur 1J).
  11. Cure igen NOA 81 ved udsættelse for UV-lys i 60 s og fjerne den øvre PDMS skimmel(Figur 1K). Harpiksen klæber til PMMA-substratet uden yderligere behandling.
    BEMÆRK: PDMS forme kan genbruges ca op til 5 gange efter vask dem med isopropanol og acetone, så længe forme ikke er bøjet. RC-dialysemembranen er indarbejdet i NOA 81-klistermærket, og der kræves ingen yderligere manipulation eller mekanisk fastspænding.

4. Flydende stik

BEMÆRK: Designet af den mikrofluidiske chip består af en lineær fluidic kanal til krystalliseringsopløsningen og et centralt reservoir til proteinprøven (proteinbeholder), begge vist fra et topbillede af to mikrochips i figur 2A. En RC dialysemembran er indlejret mellem disse to mikrostrukturer (Figur 2D), og krystalliseringsprocessen udvikler sig, mens præcipitanter fra krystalliseringsopløsningen spredes over membranen på grund af en koncentrationsgradient mellem de to rum i chippen, der er adskilt af membranen. Den mikrofluidiske kanal er præget på den nederste PDMS-form(Figur 1F). Når fabrikationsprotokollen for chipsene er afsluttet, er den lineære kanal placeret på det nederste lag af NOA 81-klistermærket i kontakt med PMMA-substratet, som vist i figur 1K. Et indløb og et udløbsadgangspunkt til krystalliseringsopløsningen er placeret i hver ende af den lineære kanal og ligner huller (samlet højde 90 μm), som det kan ses i figur 2A. Til håndtering af krystalliseringsopløsningen skal der tilføjes stik på adgangspunkterne.

  1. Bindingsstik, der er kommercielt tilgængelige (NanoPort) på indløb og udløb af den mikrofluidiske kanal med hurtig epoxylim (Figur 2C).
  2. Vælg den passende diameter af PTFE-rørene baseret på størrelsen af stikkene. PTFE-rørene vil blive brugt til indførelse af krystalliseringsopløsningen i chippens fluidiske kanal.
    BEMÆRK: Kommercielt tilgængelige kits anbefales for nem og præcis kontrol over strømningshastigheden og kombineres normalt med automatiserede tryk- eller flowstyrede (sprøjtepumper) systemer til blanding og væskehåndtering. Krystalliseringsopløsningen kan dog introduceres manuelt i den lineære kanal med en engangsplastsprøjte. I dette tilfælde foreslås trin 4.3 til 4.5.
  3. Fyld en 1 ml engangssprøjte med krystalliseringsopløsningen. For de chips, der præsenteres i denne protokol, er 400 μL tilstrækkelig til at fylde hele den flydende kanal.
  4. Skær to pipettespidser, så diameteren af spidsen på den ene side er lig med den indvendige diameter af PTFE-røret, der skal bruges til løsningshåndtering. Lim de beskårne spidser på kanalens adgangspunkter med hurtig epoxylim (Figur 2B).
  5. Tilslut sprøjten med de beskårne spidser med et stykke PTFE-rør af passende størrelse, og indfør opløsningen i kanalen ved konstant at skubbe sprøjtestemplet langsomt.

5. Proteinindkapsling

BEMÆRK: Mønsteret af chippen dedikeret til at blive brugt som protein reservoir forbliver så langt åben for atmosfæren. Følgende protokol foreslås omhyggeligt at begrænse proteinprøven inden for den mikrofluidiske chip.

  1. Pipetter manuelt en dråbe proteinprøve inde i proteinbeholderen, der er placeret lige ved RC-dialysemembranen, som illustreret i figur 2E. Proteinprøvens volumen varierer alt efter chippens design og kan være 0,1 eller 0,3 μL.
  2. Påfør et tyndt lag silikonefedt med højt vakuum rundt om proteinbeholderen.
  3. Skær et lille stykke af en 175 μm tyk PMMA ark og forsigtigt placere den over det tynde lag af silikone fedt. PMMA-stykket skal dække hele overfladen af proteinbeholderen, hvor proteinopløsningen deponeres.
    BEMÆRK: Silikonefedtet bruges til at øge lufttætheden og forhindre spredning af proteindråben. Der er ingen limning eller forsegling mellem PMMA-stykket, der bruges til at dække proteinbeholderen og NOA 81-klistermærket. Kontakten mellem dem er en solid / solid grænseflade. For at producere en samlet forsegling og en lufttæt indkapsling af proteinprøven anvendes et stykke Kapton-tape som beskrevet i trin 5.4.
    BEMÆRK: Det er undertiden vanskeligt at begrænse proteinprøven inden for enhedens dedikerede hulrum (proteinbeholder), når der anvendes et trykdrevet system til indførelse af krystalliseringsopløsningen i den fluidiske kanal (trin 6.4). For at undgå ovennævnte problem bør der opretholdes relativt lave trykværdier, mens krystalliseringsopløsningen cirkulerer. Et injektionstryk på 20-60 mbar for vandige opløsninger eller 50-150 mbar for mere tyktflydende opløsninger (PEGs, glycerol) foreslås19.
  4. Skær et stykke Kapton tape (20 μm tyk) stor nok til at dække PMMA stykke sæt over protein reservoir og til at holde på NOA chip omkring alle kanter. Proteinprøven indkapsles i beholderen, og chippen er klar til brug til krystalliseringseksperimentet, som vist i figur 2C.
    BEMÆRK: Spånerne kan genbruges flere gange, så længe dialysemembranen og vedhæftning af NOA på PMMA-substratet ikke forringes. Hvis disse dele af chippen er beskadiget, observeres lækager, der kontrollerer, at enheden ikke længere kan bruges. Vask af spånerne afhænger af krystalliseringsopløsningen. I tilfælde af lave viskositetsopløsninger (salte, buffere) kan den fluidiske kanal vaskes ved blot at indføre destilleret vand og lade det flyde i et par minutter. 400 μL er den mængde, der kræves for helt at kunne udskifte en opløsning i kanalen med en anden løsning. I tilfælde af mere viskøse opløsninger (PEGs, glycerol) anbefales det ikke at genbruge chipsene, da det ikke er tilstrækkeligt at vaske kanalen kun med vand. Den øverste del af chippen, hvor proteinbeholderen er placeret, kan også vaskes med destilleret vand og tørres med trykluft.

6. On-chip protein krystallisering

  1. Lyofiliseret høneæghvid lysozympulver vejes og opløses i destilleret vand for at opnå en endelig koncentration på 30 mg mL-1.
  2. Proteinopløsningen filtreres gennem et 0,22 μm filter og centrifuge i 5 min ved den højeste hastighed ved 293 K for at fjerne alle faste partikler. Brug supernatanten til krystalliseringseksperimentet.
  3. Der fremstilles 500 μL krystalliseringsopløsning, der indeholder bufferen og præcipitanten i koncentrationerne i tabel 1. Opløsningen filtreres gennem et filter på 0,22 μm.
  4. Opløsningen injiceres i chippens indløbspunkt med en sprøjte eller et automatiseret trykdrevet fluidisk system eller en sprøjtepumpe som beskrevet i trin 4.1-4.5.
    BEMÆRK: Krystalliseringseksperimentet kan forekomme enten under statisk tilstand, hvis den mikrofluidiske kanal er fyldt med krystalliseringsopløsningen og sat til side eller under flydende forhold, hvis den kontinuerligt injiceres inde i kanalen med en konstant strømningshastighed. I sidstnævnte tilfælde anbefales det at anvende et eksternt trykdrevet system eller sprøjtepumpe. Realiseringen af eksperimentet under flydende forhold giver også mulighed for dynamisk at udveksle krystalliseringsløsninger inden for den fluidiske kanal. Således kan flere eksperimenter udføres, mens du bruger den samme proteinprøve.
  5. Når den flydende kanal er fyldt med krystalliseringsopløsningen, forsegles chippens indløbs- og udløbsporte med parafilmtape.
  6. Proteinopløsningens passende volumen i proteinbeholderen pipettes, og proteinprøven indkapsles som beskrevet i trin 5.1-5.4.
  7. Opbevar chippen ved 293 K.
    BEMÆRK: Krystallisering via dialyse følger en anden kinetisk bane fra forsøg udført med dampspredningsmetoden eller batchkrystallisering og afhænger dybt af arten af præcipitantmolekyler, der er involveret i diffusionsprocessen, ifølge målte data51, og det kan tage længere tid for nukleationen at starte. For at forhindre fordampning, hvis nogen, i denne periode, skal du placere chippen i en fugtighed mættet atmosfære ved 293 K.

7. In situ og on-chip X-ray diffraktion

  1. 3D-printet understøttelse af bjælkelinjer
    1. Udskriv den understøttelse, der kan bære op til tre chips samtidigt. Dimensionerne af støtten er de samme som dimensionerne af kommercielle krystalliseringsplader (96 well/SBS-standard), der er kompatible med i røntgendiffraktionseksperimenter.
      BEMÆRK: Udskrivningen af supporten kan tildeles kommercielle tjenester. Støtten er udviklet ved hjælp af en 3D-CAD-designsoftware og er vist i Figur 3A under forsøg med krystallisering af on-chipprotein og i figur 3B under in situ-dataindsamling af røntgendiffraktionsdata hos BM30A-FIP (ESRF).
    2. Stabilisere dialysechips på støtte med en enkelt- eller dobbeltsidet tape.
  2. På stedet X-ray diffraktion
    1. Indsamle røntgen diffraktionsdata ved stuetemperatur fra krystaller dyrket i proteinbeholderen. Brug for eksempel røntgenstråler med en energi på 12,656 keV, en flux på 3,32 x 1010 fotoner s-1 og en strålestørrelse på 250 x 250 μm2. Optag diffraktionsbillederne med en ADSC Quantum 315r-detektor med en matrix på 3 x 3 CCD for en aktiv overflade på 315 x 315 mm2 og 9,4 mega pixels opløsning.
      BEMÆRK: Diffraktionsdataene for lysozymekrystallerne, der dyrkes på dialysechips, blev indsamlet ved BM30A-FIP-strålelinjen på European Synchrotron Radiation Facility (ESRF). Strålestørrelsen, fluxen og detektortypen kan dog være forskellige i andre røntgenstrålingskilder. Den 3D-printede understøttelse gør det muligt at indsamle data med et vinkelområde på -40° til +40° rundt om krystallen. Antallet af lysozymkrystaller, der eksponeres for in situ-dataindsamling, antallet af diffraktionsmønstre, der indsamles for hver krystal, svingningsvinkelområdet pr. eksponering og eksponeringstiden er opsummeret i tabel 2.
  3. Databehandling
    1. Behandl de komplette eller delvise datasæt med diffraktionsmønstrene for lysozymekrystallerne med XDS-programmet48.
    2. Generer HKL-filen for hvert datasæt, og skaler dem ved hjælp af XSCALE-software48.
    3. Brug molekylær udskiftning med programmet Phaser af CPP4 suite49 og bestemme faser for model bygning. Til dette trin skal du bruge de kendte 3D-koordinater for lysozym fra Protein Data Bank (PDB) post 193L.
    4. Forfine strukturen ved hjælp af Phenix52 og inspicere den endelige protein model ved hjælp af COOT50.

Representative Results

De mikrofluidiske chips udviklet af Junius et al.19,45 er kompatible med både on-chip protein krystallisering med mikrodialysemetoden og in situ X-ray diffraktion dataindsamling ved stuetemperatur. Billeder af mikrochips, deres detaljerede design, de flydende stik og RC-dialysemembranen er illustreret i figur 2. Krystalliseringsforsøgene sættes op ved manuelt at pipette proteinprøven direkte ind i proteinbeholderen og indføre krystalliseringsopløsningen i den lineære fluidiske kanal med et automatiseret trykdrevet system eller sprøjtepumpe eller manuelt ved hjælp af en sprøjte. Proteinbeholderen og den flydende kanal kan skelnes i figur 2A. Design til fremstilling af chips med 0,1 μL eller 0,3 μL det maksimale volumen af proteinbeholderen er vist i henholdsvis figur 2A til venstre og højre. Spåner med en maksimal kapacitet på 0,2 μL eller 0,7 μL for proteinprøven er vist andetsteds19. Højdepunktet i protokollen for enheden fabrikation kan indsnævres på brugen af den fotocurable thiolene-baserede harpiks NOA 81 indlejring kommercielt tilgængelige RC dialyse membraner af forskellige MWCOs. Under fremstillingen af de mikrofluidiske enheder præges den lineære fluidic channel på bunden af PDMS-formen (Figur 1F), mens den øvre PDMS-form kun består af de mønstrede søjler til proteinreservoiret og indløbs- og udløbsportene (Figur 1F). Når NOA 81 er krydslinket, og PDMS-forme fjernes fra samlingen (Figur 1K), er den fluidiske kanal placeret i det nederste lag af mikrochippen, og proteinkanalen og indløbs- / udløbsportene er placeret på begge lag. Figur 1L illustrerer en sidevisning, der er skematisk over dialysechippen, hvor alle lag af enheden og deres respektive tykkelse er angivet. Højden af de mønstre, der er præget på det nederste lag af spånerne (fluidic channel), er ca. 45 μm, mens den samlede højde af indløbs- og udløbsportene er ca. 90 μm. Proteinbeholderen (45 μm højde) er også illustreret i figur 2D og 2E. Tilpasningen af de to lag blev undersøgt under et optisk mikroskop, og det stykke af RC-dialysemembranen, der er indarbejdet i mikrochippen, kan tydeligt skelnes i figur 2D. I samme figur er luften blevet fanget i den flydende kanal under injektionen af krystalliseringsopløsningen, som det kan ses i den øverste venstre del af proteinbeholderen. Figur 2E er et nærbillede af proteinbeholderen efter den manuelle aflejring af proteindråben med en pipette og før indkapslingen af dråben med et stykke PMMA- og Kapton-bånd som beskrevet i trin 5.2 og 5.3 i protokollen. Den mikrofluidiske chip, der er klar til at blive brugt til krystalliseringsforsøg, efter indkapslingen af proteinprøven og limningen af de fluidiske stik, er afbildet i figur 2C. Den lufttætte samling sikrer, at lækager ikke kan forekomme. De flydende stik til den mikrofluidiske kanals indløbs- og udløbsporte kan enten være de kommercielt tilgængelige som beskrevet i trin 4.1 i protokollen og vist i figur 2C, eller engangslaboratoriepipettespidser kan bruges til samme formål (Figur 2B, protokoltrin 4.4).

Til fremstilling af mikrofluidiske chips blev der valgt optisk gennemsigtige og biologisk inerte materialer, hvilket demonstrerer høj kompatibilitet for in situ røntgendiffraktionseksperimenter ved stuetemperatur. Samspillet mellem røntgenstråler, absorption og spredning, med de materialer, der udgør den mikrofluidiske enhed og den omgivende atmosfære (luft) genererer et signal kendt som baggrundsstøj. Denne støj opsummerer diffraktionssignalet for de proteinkrystaller, der registreres af detektoren, hvilket forfalder signal-til-støj-forholdet og bør opretholdes så lavt som muligt under indsamling af røntgendiffraktionsdata. Vi har evalueret baggrundsstøj genereret af materialerne bestående af proteinbeholderen, som er i røntgenstrålens direkte vej. Proteinbeholderen består af RC-dialysemembranen, Kapton-båndet og to PMMA-stykker, et, der bruges som substrat til mikrochippen, og et, der bruges til indkapsling af proteinprøven. PMMA's tykkelse er 2 x 175 μm, kaptonbåndet 20 μm, og RC-dialysemembranen er ca. 40 μm tyk (Figur 1L). Den samlede tykkelse af disse lag er ca. 410 μm, og NOA 81-laget er ikke i den direkte røntgensti. Bortset fra tykkelsen af fremstillingsmaterialerne er deres tæthed også afgørende for måling af baggrundsspredningsstøjen, da røntgenspredning øges med det elementære atomnummer. Af denne grund blev heliumflux (en funktion, der leveres på BM30A-FIP ved ESRF) brugt i stedet for luft under dataindsamlingen til materialekarakterisering og til proteindiffraktionseksperimenter. Figur 3C illustrerer baggrundsstøjen fra Kapton-båndet, RC-dialysemembranen, PMMA-arket og deres samling i heliumatmosfære. Hvert materiale blev i 20 s udsat for røntgenstråler på 0,98 Å-bølgelængde, og prøvedetektorafstanden var 200 mm. Forsøgene blev udført på BM30A-FIP-strålelinjen ved ESRF, som forklaret i trin 7 i protokollen. Diffuse ringe, der tilskrives røntgenstrålens interaktioner med materialerne, kan skelnes mellem Kapton-båndet ved en opløsning på under 4 Å, PMMA-arket mellem 4-8 Å og dialysemembranen mellem 4-5 Å opløsning. Baggrundsstøjen fra dialysechippen observeres hovedsageligt ved en opløsning, der er lavere end 6 Å, og som ikke påvirker behandlingen af diffraktionsdata med høj opløsning for de store lysozymkrystaller. Baggrundsspredningsintensiteten som funktion af opløsningen for mikrochippen og de separate materialer er vist andetsteds19. Ved målingen i figur 3Cvar dialysechippen tom for enhver opløsning (protein eller foregribende opløsning), og bidraget fra tilstedeværelsen af opløsning til baggrundsstøjen er ikke blevet målt. Chipsene blev monteret foran røntgenstrålen med en 3D-printet støtte (Figur 3B) designet til in situ diffraktionseksperimenter19. Den samme understøttelse med dimensioner, der svarer til dimensionerne på en 96-brønds/SBS-standardkrystalliseringsplade, kan dog bruges til at udføre 1 til 3 krystalliseringseksperimenter samtidigt, da den kan rumme op til 3 chips samtidigt (Figur 3A).

Der blev udført forsøg for at evaluere effektiviteten af de mikrofluidiske enheder til on-chip krystallisering af modelopløselige proteiner med mikrodialysemetoden. Den flydende kanal blev fyldt som beskrevet i trin 4 i protokollen, mens trin 5 og 6 beskrev, hvordan man indkapsler proteinprøven i det dedikerede proteinreservoir, og hvordan man opsætter krystalliseringseksperimenterne. Figur 4 viser lysozymkrystaller dyrket ved 293 K under 1,5 M natriumchlorid (NaCl) med 0,1 M natriumacetat (CH3COONa) pH 4,0 (A) og under 1 M NaCl 0,1 M CH3COONa pH 4,5 med 30% polyethylen glycol (PEG) 400 (B). Det lyofile lysozympulver blev opløst i vand til en endelig koncentration på ~30 mg mL-1 eller i 20 mM CH3COONa pH 4.2 buffer til en endelig koncentration på ~20 mg mL-1 for de forsøg, der er illustreret i henholdsvis figur 4A og 4B. Volumenet af proteinprøven i begge forsøg var ca. 0,3 μL, og MWCO for RC-dialysemembranen, der er indlejret i mikrochips, ligger i området 6-8 kDa. Lysozymkrystallerne i figur 3A voksede inden for 1 time, og krystallerne i figur 3B voksede inden for 30 minutter fra eksperimentets indsætning. Krystalliseringsforsøgene blev udført under statiske forhold. Det er imidlertid blevet påvist19, at udførelsen af forsøgene under flydende forhold giver mulighed for dynamisk at udveksle krystalliseringsbetingelserne og undersøgelsesfasediagrammerne og kontrollere mikroanalysemetodens reversibilitet.

På stedet Der blev indsamlet røntgendiffraktionsdata fra lysozymkrystallerne i figur 4A for at påvise dialysechipsenes egnethed til sådanne forsøg. Dataindsamlingen blev udført ved BM30A-FIP beamline (ESRF) ved stuetemperatur som beskrevet i trin 7.2.1 i protokollen. Mikrochipsene blev monteret ved bjælkelinjen ved hjælp af den 3D-printede støtte (Figur 3B), og komplette røntgendiffraktionsdatasæt blev indsamlet fra to enkelt lysozymkrystaller dyrket på chippen under de betingelser, der er angivet i anden linje i tabel 1. De observerede refleksioner af datasættene blev behandlet, indekseret og integreret ved hjælp af XDS48, og den molekylære udskiftning og raffinement blev udført ved hjælp af henholdsvis Phaser49 og Phenix52. De krystallografiske statistikker for det komplette datasæt for hver lysozymkrystal og for sammenlægningen af de to datasæt findes i tabel 2. Til molekylær udskiftning blev PDB-posten 193L brugt.

Elektrontæthedskort fra en enkelt lysozymkrystal og det fusionerede datasæt for de to krystaller er opnået ved henholdsvis 1,95 Å og 1,85 Å og er illustreret i figur 5A og 5B. Begge elektrontæthedskort viser detaljerede strukturelle oplysninger, der kan opnås ved in situ X-ray diffraktionseksperimenter udført direkte på dialysemikrochippen ved stuetemperatur fra en enkelt krystal eller fra flere krystaller, hvilket gør chipsene kompatible til in situ X-ray krystallografiundersøgelser.

Figure 1
Figur 1: Skematisk illustration af dialysechipfremstillingen. (B) En SU-8 mester erhverves efter bestråling af fotoresisten med UV-lys gennem en fotomaske og udvikling af de ueksponerede dele. (C) PDMS udleveres på SU-8 mestre og efter at være blevet helbredt ved 338 K i 1 time, (D) de 2 PDMS forme produceret ved replika støbning og prægning mikro-mønstre er skrællet af mestre og (E) skåret til den rette størrelse. (F) PDMS-formene understøttes på et glasrutsjebane, der indeholder RC-dialysemembranen mellem de to centrale søjler. (G) De 2 PDMS forme derefter justeres og udtørres i ~ 30 min i et vakuumkammer. (H) NOA 81 harpiks hældes i mellem de to forme og (I) fylder rummet ved kapillaritet. (J) Efter den første udsættelse for UV-lys fjernes den nederste PDMS-form, og samlingen deponeres på et PMMA-ark. (K) Den anden UV-eksponering følger for fuldt ud at polymerisere NOA 81 harpiks og dialyse chip er klar til brug efter fjernelse af de resterende øvre PDMS skimmel. (L) Dialysechippens sidevisningsskema, hvor alle lag af enheden og deres respektive tykkelse er angivet. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Dialysechips, der integrerer en RC-dialysemembran til krystallisering af on-chip-protein og in situ-røntgendiffraktionsforsøg. (B) Mikrochips med pipettespidser som flydende stik limet på indløbs- og udløbsportene på den flydende kanal. (C) Billede af en mikrochip under et krystalliseringseksperiment. Proteinprøven indkapsles med et stykke 175 μm tykt PMMA-ark og Kapton-bånd. Peek Nanoport-stik bruges til indløbs- og udløbsportene på den fluidiske kanal. (D) Topvisning af proteinbeholderen under cirkulationen af krystalliseringsopløsningen i den flydende kanal. Luft er fanget i den øverste del af reservoiret lige under RC dialysemembranen, som tydeligt kan detekteres. (E) Dialysebeholderens topbillede gennem et optisk mikroskop under aflejringen af proteinprøven. Proteindråben deponeres lige over den indlejrede RC-dialysemembran. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Den 3D-printede støtte (A) til de mikrochips, der anvendes under krystalliseringsforsøg, og (B) monteret foran røntgenstrålen ved BM30A-FIP-strålelinjen ved ESRF til in situ-røntgendiffraktionseksperimenter. (C) Baggrundsstøj fra røntgenstrålers interaktion med Kapton, RC-dialysemembranen, PMMA og dialysechippen (fra venstre mod højre). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Krystallisering af lysozym på chippen med mikrodialysemetoden. (A) Lysozym (~30 mg mL-1) krystaller dyrket på chippen under 1,5 M NaCl og 0,1 M CH3COONa pH 4,0 og (B) lysozym (~20 mg mL-1) krystaller dyrket under krystalliseringsbetingelser, der indeholder 1 M NaCl, 0,1 M CH3COONa pH 4,5 og 30% PEG 400. Begge eksperimenter blev udført på 293 K. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Elektrontæthedskort over den raffinerede lysozymstruktur fra (A) en enkelt krystal og (B) det fusionerede datasæt af to krystaller dyrket på chippen via mikrodialyse. Kortene blev opnået ved henholdsvis 1,95 Å og 1,84 Å, med en konturering ved 1σ. Klik her for at se en større version af dette tal.

Protein Proteinkoncentration
(mg mL-1)		 Protein bufffer Indledende koncentration af
begyndende løsning		 MWCO af RC
dialysemembran
(kDa)		 Temperatur
(Afsnit K)
Lysozym ~ 30 Vand 1,5 M NaCl
0,1 M CH3COONa pH 4,0		 6 - 8 293
Lysozym ~ 20 20 mM CH3COONa pH 4,2 1 M NaCl
0,1 M CH3COONa pH 4,5
30% PEG 400		 6 - 8 293

Tabel 1: Proteinbufferens sammensætning og den begyndende opløsning til on-chip krystallisering af lysozym med mikrodialysemetoden. Lysozymkrystallerne, der dyrkes på chippen med betingelserne i den anden linje, blev brugt til in situ X-ray diffraktion dataindsamling.

Protein Lysozym Lysozym Lysozym
Antal krystaller 1 1 2
Antal diffraktionsrammer 40 30 70
Svingning (°) pr. eksponering 1 1
Eksponeringstid(er) 30 30
Temperatur (K) 293 293 293
Områdegruppe P43212 P43212 P43212
Enhedscelleparametre 78.86 78.86 37.87
90.0 90.0 90.0		 79.17 79.17 37.95
90.0 90.0 90.0		 78.47 78.47 37.65
90.0 90.0 90.0
Opløsningsområde (Å) 27.31 - 1.95
(2.02 - 1.95)		 27.39 - 1.96
(2.03 - 1.96)		 27.17 - 1.85
(1.91 - 1.85)
Mosaik (°) 0.319 0.121
Samlede refleksioner (observeret) 25127 (3552) 19991 (3001)
Unikke refleksioner (observeret) 8641 (1357) 8295 (1321) 10404 (975)
Redudancy 2.90 (2.61) 2.41 (2.27)
Fuldstændighed (%) 95.0 (94.8) 91.9 (93.3) 98.23 (93.15)
Mener I/σ 6.83 (1.16) 7.09 (1.66) 3.7
CC(1/2) 99.1 (42.4) 97.9 (37.0) 97.0
R-fletning 0.184
R-meas 0.139 0.221 0.219
R-pim 0.116
Refleksioner, der bruges i finjustering 8645 (787) 8451 (857) 10391 (965)
Refleksioner, der bruges til R-fri 864 (78) 846 (85) 1039 (96)
R-arbejde 0.1988 (0.2968) 0.1853 (0.2872) 0.1839 (0.3102)
R-fri 0.2430 (0.3437) 0.2297 (0.3622) 0.2207 (0.3703)
Antal ikke-hydrogenatomer 1069 1071 1096
Makromolekyler 1012 1012 1012
Vand 55 57 82
Ligand 2 2 2
Proteinrester 131 131 131
Rms (obligationer, Å) 0.008 0.009 0.005
Rms (vinkler, °) 1.17 1.26 1.05
Ramachandran begunstiget (%) 98.43 97.64 99.21
Ramachandran tilladt (%) 1.57 2.36 0.79
Ramachandran outliers (%) 0.00 0.00 0.00
Avegare B-faktor 34.26 28.54 24.34
Protein 33.94 28.14 23.62
Vand 40.23 35.57 33.16
Ligander 33.23 29.63 24.77

Tabel 2: Dataindsamlingsparametre, krystallografiske statistikker og raffinementsstatistikker over lysozymekrystaller dyrket på chippen via mikrodialysemetoden. De værdier, der er angivet i parentes, svarer til shell'en med den højeste opløsning. Den fjerde kolonne svarer til de værdier, der er opnået efter fletningen af datasættene i anden og tredje kolonne.

Discussion

En mikrofluidisk enhed er udviklet til on-chip protein krystallisering med mikrodialyse metode og in situ X-ray diffraktion eksperimenter ved stuetemperatur. NOA 81-chips, der integrerer RC-dialysemembraner i enhver MWCO for at bruge mikrodialyse til on-chip proteinkrystallisering, kan fremstilles. Der blev anvendt fremstillingsmaterialer med en relativt høj røntgengennemsigtighed, hvilket gjorde chipsene kompatible for in situ-proteinkrystallografi. De fremstillingsmaterialer, der udgør rummet til proteinkrystallisering af enheden (PMMA, Kapton, RC-dialysemembran) blev evalueret for at generere lav baggrundsstøj. Specifikt observeres baggrundsstøjen fra dialysechippen hovedsageligt ved lav opløsning (> 6 Å) og påvirker ikke behandlingen af diffraktionsdata med høj opløsning af de store lysozymkrystaller, der kræves til bestemmelse af proteinstruktur. Automatiseringen af dataindsamlingen forstærkes ved hjælp af en 3D-printet understøttelse, der kan monteres direkte i makromolekylære krystallografistrålelinjer og bære op til tre mikrochips samtidigt. På denne måde undgås manuel høst og manipulation af de skrøbelige proteinkrystaller. Desuden finder dataindsamlingen sted ved stuetemperatur og undgår behovet for kryoprotektion, som kan relateres til kropsbygningsændringer fra den oprindelige proteinstruktur2,3.

Brugen af mikrodialyse som en metode til at dyrke krystaller på chippen gør det muligt at nøjagtigt overvåge og kontrollere krystalliseringsprocessen. Som diskuteret i indledningen er de fleste af de konventionelle proteinkrystalliseringsmetoder blevet implementeret ved hjælp af mikrofluidiske enheder11,14. Fordelene ved dialyse for proteinkrystallisering var imidlertid endnu ikke blevet udnyttet fuldt ud på mikroskala. Mikrodialyse på chippen giver mulighed for at studere fasediagrammer og udføre screening og optimering af krystalliseringsforhold med samme proteinprøve19. For de prototyper, der præsenteres i dette arbejde, er proteinforbruget pr. chip begrænset til 0,1 eller 0,3 μL. Baseret på det eksperimentelle arbejde indtil videre stammer de mest kritiske trin i protokollen ikke fra chipsenes fremstillingsprocedure, men fra krystalliseringsprocessen. Fabrikationsprotokollen indeholder mange trin, men den er ligetil og gør det muligt at fremstille adskillige enheder (20 til 30 chips) på en enkelt dag i det rene rum med relativt billige materialer. Men on-chip krystallisering af proteiner kan være en delikat procedure på grund af den iboende stokastiske karakter af kernedannelse og krystalvækst, især i mikroskalaen. Et casestudie er blevet beskrevet, hvor veletablerede forhold blev brugt til krystallisering af lysozym, der gav robuste, veldefinerede krystaller egnet til in situ X-ray diffraktion dataindsamling. Ikke desto mindre kan der opstå vanskeligheder ved brug af mere udfordrende proteinmål, såsom membranproteiner, hvor krystalliseringsmediet er meget mere kompliceret, fasediagrammer er ikke kendt, og velarbejdende krystalliseringsforhold er endnu ikke veletablerede. Dialysechippen giver mulighed for at overgå disse vanskeligheder og undersøgelsesfasediagrammer på chippen uden at bortskaffe den værdifulde og ofte dyre proteinprøve ved blot at udskifte krystalliseringsopløsningen inden for den mikrofluidiske kanal.

Alsidigheden af de mikrofluidiske enheder stammer fra at udnytte mikrodialyse til on-chip protein krystallisering for at reversibilt kontrollere krystalliseringsforhold og kortlægge koncentration og temperatur varierede fasediagrammer ved hjælp af lavt proteinvolumen. Desuden er enheden kompatibel med in situ X-ray diffraktionseksperimenter, og prototyping af enhederne er billig og hurtig. Talrige, isomorfe krystaller af opløselige og membranproteiner (under forberedelse) kan dyrkes på chippen, og det forventes, at alle disse funktioner kan bruges til serielle røntgenkrystallografiundersøgelser af udfordrende proteinmål på synkrotron- og XFEL-faciliteter. Endelig er det at udføre time-resolved-studier på chippen og in situ en fremtidig mulighed, der kan være af væsentlig interesse for det krystallografiske samfund. Derfor vil fremtidige bestræbelser ved at dyrke krystaller på dialysechippen og indføre reagenserne i den mikrofluidiske kanal, enten manuelt (ved hjælp af en sprøjte) eller automatisk (med et trykkontrolvæskesystem eller en sprøjtepumpe), fokusere på at bevise, at de mikrofluidiske chips med succes kan bruges til at udløse tidsløste eksperimenter på synkrotronstrålelinjer.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

MBS anerkender støtten fra MI / CNRS i henhold til kontrakten Instrumentation på grænserne 2014-2015. NJ anerkender CEA's International Ph.d.-forskningsprogram (Irtelis) for ph.d.-stipendiet. MBS og SJ anerkender finansieringen fra EU's Horizon 2020-forsknings- og innovationsprogram under Marie Skłodowska-Curie-tilskudsaftale nr. 722687. MBS, SJ, og NJ takke LIPhy (UGA) for det rene rum etablering for mikrofabrikation eksperimenter. IBS anerkender integration i Grenobles tværfaglige forskningsinstitut (IRIG, CEA).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3 in wafer Silicon Materials Inc. Silicon wafer
Centrifuge Eppendorf Minispin Bench-top centrifuge
CleWin 3.0 WieWeb software Designing software
Epoxy glue Devcon 5 minutes epoxy glue
Fluidic connectors Cluzeau Info Lab N-333 NanoPort kit for 1/16" OD tubing
Hen egg-white lysozyme Roche 10 837 059 001 Lyophilized protein powder
High-vacuum silicone grease Sigma-Aldrich Z273554 Dow Corning high-vacuum silicone grease
HMDS Sigma-Aldrich 440191 Silane, chemical
Hot plate Sawatec HP-200-Z-HMDS BM Hot plate
Isopropyl alcohol Sigma-Aldrich Solvent
Kapton tape DuPont Polyimide tape
Mask aligner SUSS MicroTec MJB4 Mask aligner, UV source
Membrane filter Millipore GSWP04700 0.22 μm pore size filter
Microscope glass slide Fisher Scientific 12164682 3 x 1 in glass slides
NOA81 Norland Products Inc.  NOA81 Photocurable resin
Oven Memmert Oven
Parafilm Sigma-Aldrich P6543 Parafilm M roll size 20 in. × 50 ft
PDMS Dow Corning Sylgard 184 Silicone
PEG 400 Hampton Research HR2-603 Chemical
Petri dish Sigma-Aldrich P5731 100 x 15 mm
PGMEA Sigma-Aldrich 484431 Developer
Plasma equipment Diener Electronic ZEPTO Plasma treatment
PMMA Goodfellow 137-745-63 PMMA sheets 150x150 mm, 0.175 mm thickness
Pressure driven system Elveflow OB1 MK3+ Pressure/vacuum controller
PTFE tubing Elveflow/Darwin microfluidics LVF-KTU-15 PTFE tubing roll 1/16" OD X 1/32" ID
RC dialysis membrane Spectra/Por Various MWCOs
Scalpel Swann-Morton Carbon steel surgical blades
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889 Chemical
Sodium chloride Sigma-Aldrich 746398 Chemical
Solidworks Dassault Systemes 3D-CAD designing software
Spin coater SPS Spin150 Wafer spinner
SU-8 3000 series MicroChem Corp. SU-8 3050 Photoresist
Syringe BD 309628 1 mL Luer-Lok syringe
UV crosslinker Uvitec CL-508 UV crosslinker

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Garman, E. F. Radiation damage in macromolecular crystallography: what is it and why should we care. Acta Crystallographica, Section D: Biological Crystallography. 66, 339-351 (2010).
  2. Henderson, R. The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules. Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).
  3. Fraser, J. S., et al. Accessing protein conformational ensembles using room-temperature X-ray crystallography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (39), 16247-16252 (2011).
  4. Gotthard, G., et al. Specific radiation damage is a lesser concern at room temperature. IUCrJ. 6 (4), 665-680 (2019).
  5. Martin-Garcia, J. M., Conrad, C. E., Coe, J., Roy-Chowdhury, S., Fromme, P. Serial femtosecond crystallography: A revolution in structural biology. Archives of Biochemistry and Biophysics. 602, 32-47 (2016).
  6. Gicquel, Y., et al. Microfluidic chips for in situ crystal X-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57133 (2018).
  7. Chapman, H. N., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470, 73-78 (2011).
  8. Hunter, M. S., et al. Fixed-target protein serial microcrystallography with an x-ray free electron laser. Science Reports. 4, 6026 (2014).
  9. Pawate, A. S., et al. Towards time-resolved serial crystallography in a microfluidic device. Acta Crystallographica, Section F: Structural Biology Communications. 71, 823-830 (2015).
  10. Owen, R. L., et al. Low-dose fixed-target serial synchrotron crystallography. Acta Crystallographica, Section D: Structural Biology. 73, 373-378 (2017).
  11. Leng, J., Salmon, J. -B. Microfluidic crystallization. Lab on a Chip. 9, 24-34 (2009).
  12. Morel, M., Galas, J. -C., Dahan, M., Studer, V. Concentration landscape generators for shear free dynamic chemical stimulation. Lab on a Chip. 12, 1340-1346 (2012).
  13. Miralles, V., Huerre, A., Malloggi, F., Jullien, M. -C. A review of heating and temperature control in microfluidic systems: techniques and applications. Diagnostics. 3, 33-67 (2013).
  14. Sui, S., Perry, S. L. Microfluidics: from crystallization to serial time-resolved crystallography. Structural Dynamics. 4, 032202 (2017).
  15. Hansen, C. L., Sommer, M. O. A., Quake, S. R. Systematic investigation of protein phase behavior with a microfluidic formulator. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (40), 14431-14436 (2004).
  16. Laval, P., Lisai, N., Salmon, J. -B., Joanicot, M. A microfluidic device based on droplet storage for screening solubility diagrams. Lab on a Chip. 7, 829-834 (2007).
  17. Shim, J. -U., et al. Control and measurement of the phase behavior of aqueous solutions using microfluidics. Journal of the American Chemical Society. 129, 8825-8835 (2007).
  18. Selimovic, S., Gobeaux, F., Fraden, S. Mapping and manipulating temperature-concentration phase diagrams using microfluidics. Lab on a Chip. 10, 1696-1699 (2010).
  19. Junius, N., et al. A microfluidic device for both on-chip dialysis protein crystallization and in situ X-ray diffraction. Lab on a Chip. 20, 296-310 (2020).
  20. Greaves, E. D., Manz, A. Towards on-chip X-ray analysis. Lab on a Chip. 5, 382-391 (2005).
  21. Dhouib, K., et al. Microfluidic chips for the crystallization of biomacromolecules by counter-diffusion and on-chip crystal X-ray analysis. Lab on a Chip. 9, 1412-1421 (2009).
  22. Guha, S., Perry, S. L., Pawate, A. S., Kenis, P. J. A. Fabrication of X-ray compatible microfluidic platforms for protein crystallization. Sensors and Actuators B. Chemical. 174, 1-9 (2012).
  23. Sui, S., et al. Graphene-based microfluidics for serial crystallography. Lab on a Chip. 16, 3082-3096 (2016).
  24. Russo Krauss, I., Merlino, A., Vergara, A., Sica, F. An overview of biological macromolecule crystallization. International Journal of Molecular Science. 14, 11643-11691 (2013).
  25. McPherson, A., Gavira, J. A. Introduction to protein crystallization. Acta Crystallographica, Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 70, 2-20 (2014).
  26. Zheng, B., Tice, J. D., Roach, L. S., Ismagilov, R. F. A droplet-based, composite PDMS/Glass capillary microfluidic system for evaluating protein crystallization conditions by microbatch and vapor-diffusion methods with on-chip X-ray diffraction. Angewandte Chemie. 43, International Edition in English 2508-2511 (2004).
  27. Talreja, S., Kim, D. Y., Mirarefi, A. Y., Zukoski, C. F., Kenis, P. J. A. Screening and optimization of protein crystallization conditions through gradual evaporation using anovel crystallization platform. Journal of Applied Crystallography. 38, 988-995 (2005).
  28. Hansen, C. L., Classen, S., Berger, J. M., Quake, S. R. A microfluidic device for kinetic optimization of protein crystallization and in situ structure determination. Journal of American Chemical Society. 128, 3142-3143 (2006).
  29. Schieferstein, J. M., et al. X-ray Transparent microfluidic platforms for membrane protein crystallization with microseeds. Lab on a Chip. 18, 944-954 (2018).
  30. Ghazal, A., et al. Recent advances in X-ray compatible microfluidics for applications in soft materials and life sciences. Lab on a Chip. 16, 4263-4295 (2016).
  31. Li, L., Ismagilov, R. F. Protein crystallization using microfluidic technologies based on valves, droplets, and SlipChip. Annual Review of Biophysics. 39, 139-158 (2010).
  32. Du, W., Li, L., Nichols, K. P., Ismagilov, R. F. SlipChip. Lab on a Chip. 9, 2286-2292 (2009).
  33. Zhang, S., et al. Microfluidic platform for optimization of crystallization conditions. Journal of Crystal Growth. 472, 18-28 (2017).
  34. Abdallah, B. G., et al. Protein crystallization in an actuated microfluidic nanowell device. Crystal Growth & Design. 16, 2074-2082 (2016).
  35. Monteiro, D. C. F., et al. A microfluidic flow-focusing device for low sample consumption serial synchrotron crystallography experiments in liquid flow. Journal of Synchrotron Radiation. 26, 406-412 (2019).
  36. de Wijn, R., et al. A simple and versatile microfluidic device for efficient biomacromolecule crystallization and structural analysis by serial crystallography. IUCrJ. 6, 454-464 (2019).
  37. Shim, J. -U., Cristobal, G., Link, D. R., Thorsen, T., Fraden, S. Using microfluidics to decouple nucleation and growth of protein crystals. Crystal Growth & Design. 7, 2192-2194 (2007).
  38. de Jong, J., Lammertink, R. G. H., Wessling, M. Membranes and microfluidics: a review. Lab on a Chip. 6, 1125-1139 (2006).
  39. Paustian, J. S., Nery Azevedo, R., Lundin, S. T. B., Gilkey, M. J., Squires, T. M. Microfluidic microdialysis: spatiotemporal control over solution microenvironments using integrated hydrogel membrane microwindows. Physical Review X. 3, 041010 (2013).
  40. Kornreich, M., Heymann, M., Fraden, S., Beck, R. Cross polarization compatible dialysis chip. Lab on a Chip. 14, 3700-3704 (2014).
  41. Song, S., Singh, A. K., Shepodd, T. J., Kirby, B. J. Microchip dialysis of proteins using in situ photopatterned nanoporous polymer membranes. Analytical Chemistry. 76, 2367-2373 (2004).
  42. Skou, M., Skou, S., Jensen, T. G., Vestergaard, B., Gillilan, R. E. In situ microfluidic dialysis for biological small-angle X-ray scattering. Journal of Applied Crystallography. 47, 1355-1366 (2014).
  43. Zou, L., et al. A multistage dialysis microdevice for extraction of cryoprotectants. Biomedical Microdevices. 19, 30 (2017).
  44. Satya Eswari, J., Naik, S. A critical analysis on various technologies and functionalized materials for manufacturing dialysis membranes. Materials Science for Energy Technologies. 3, 116-126 (2020).
  45. Spano, M., Salmon, J. -B., Junius, N. FR3044685A1. UJF. , (2015).
  46. Bartolo, D., Degre, G., Nghe, P., Studer, V. Microfluidic stickers. Lab on a Chip. 8, 274-279 (2008).
  47. Junius, N., et al. A crystallization apparatus for temperature controlled flow-cell dialysis with real-time visualization. Journal of Applied Crystallography. 49, 806-813 (2016).
  48. Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica, Section D: Biological Crystallography. 66, 125-132 (2010).
  49. Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallographica, Section D: Biological Crystallography. 67, 235-242 (2011).
  50. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and developments of COOT. Acta Crystallographica, Section D: Biological Crystallography. 66, 486-501 (2010).
  51. Apostolopoulou, V., Junius, N., Sear, R. P., Budayova-Spano, M. Mixing salts and polyethylene glycol into protein solutions: The effects of diffusion across semipermeable membranes and of convection. Crystal Growth & Design. 20, 3927-3936 (2020).
  52. Liebschner, D., et al. Macromolecular structure determination using X-rays, neutrons and electrons: recent developments in Phenix. Acta Crystallographica, Section D: Structural Biology. 75, 861-877 (2019).
  53. Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Annual Review of Materials Science. 28, 153-184 (1998).
  54. Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase injector is a viable crystal delivery system for time-resolved serial crystallography. Nature Communications. 7, 12314 (2016).
  55. Baxter, E. L., et al. High-density grids for efficient data collection from multiple crystals. Acta Crystallographica, Section D: Structural Biology. 72, 2-11 (2016).
  56. Feiler, C. G., Wallacher, D., Weiss, M. S. An all-in-one sample holder for macromolecular X-ray crystallography with minimal background scattering. Journal of Visualized Experiments. (149), e59722 (2019).

Tags

Kemi Problem 170 mikrofluidics on-chip protein krystallisering in situ X-ray diffraktion mikrodialyse krystallisering seriel krystallografi fase diagrammer dialyse chip
Krystallisering af proteiner på chip af mikrodialyse til <i>In Situ</i> X-ray Diffraktion Studies
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jaho, S., Junius, N., Borel, F.,… More

Jaho, S., Junius, N., Borel, F., Sallaz-Damaz, Y., Salmon, J. B., Budayova-Spano, M. Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies. J. Vis. Exp. (170), e61660, doi:10.3791/61660 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter