Summary
כאן אנו מציגים שיטה פשוטה ויעילה לבודד תאי חיידקים מיוטיים ופוסט-מיוטיים חיים מערכי עכבר בוגרים. באמצעות ציטוקסיות נמוכה, צבע מחייב DNA סגול-נרגש ומיון תאים המופעלים על-ידי פלואורסצנה, ניתן לבודד אוכלוסיות תאי זרע מועשרים מאוד עבור יישומים רבים במורד הזרם.
Abstract
בידוד של spermatocytes מיוטי חיוני כדי לחקור מנגנונים מולקולריים הבסיסיים מיוזיס ו spermatogenesis. למרות שיש פרוטוקולי בידוד תאים הוקמה באמצעות ההכתמה Hoechst 33342 בשילוב עם מיון תאים המופעלים על-ידי פלואורסצנה, זה דורש סדרנים תא מצויד לייזר אולטרה סגול. כאן אנו מתארים פרוטוקול בידוד תאים באמצעות כתם סיגלית DyeCycle (DCV), צבע מחייב DNA cytotoxicity נמוך דומה מבנית Hoechst 33342. DCV יכול להתרגש הן על ידי לייזרים אולטרה סגולים והן סגול, אשר משפר את הגמישות של בחירת ציוד, כולל סדרן תאים לא מצויד בלייזר אולטרה סגול. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לבודד שלוש תת-אוכלוסיות של תאים חיים ב-prophase meiotic I, כולל לפטוטן/זיגוטן, פאצ'יטים, וזרעונים דיפלוטן, כמו גם זרעונים עגולים פוסט מיוטיים. אנו גם מתארים פרוטוקול להכנת השעיה חד-תאית מכיסכי עכבר. בסך הכל, ההליך דורש זמן קצר כדי להשלים (4-5 שעות בהתאם למספר התאים הדרושים), אשר מקל על יישומים רבים במורד הזרם.
Introduction
Spermatogenesis הוא תהליך מורכב שבו אוכלוסייה קטנה של תאי גזע spermatogonial לקיים ייצור רציף של מספר גדול של זרעלאורך החיים הבוגרים 1,2. במהלך spermatogenesis, שיפוץ כרומטין דינמי מתרחש כאשר תאי זרע עוברים meiosis לייצר זרעונים haploid3,4,5. בידוד זרעונים מיוטיים חיוני לחקירה מולקולרית, ונקבעו מספר גישות שונות לבידוד זרעון מיוטי, כולל הפרדה מבוססת מום6,7 ומיון תאים המופעל על-ידי פלואורסצנטיות (FACS)8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. עם זאת, שיטות אלה כוללות מגבלות טכניות. בעוד שהפרדה מבוססת מום מניבה מספר גדול של תאים5,6,7, היא דורשת עבודה אינטנסיבית. השיטה מבוססת FACS הוקמה משתמשת Hoechst 33342 (Ho342) כדי להפריד spermatocytes meiotic מבוסס על תוכן DNA ומאפייני פיזור אור ודורש סדרני תאים FACS מצויד אולטרה סגול (UV)לייזר 8,9,10,11. שיטות חלופיות מבוססות FACS דורשות קווי עכבר טרנסגניים המבטאים חלבוני פלורסנט, סנכרון של spermatogenesis12, או קיבעון תאים ותווית נוגדנים שאינם תואמים לבידוד של תאיםחיים 13. אמנם יש שיטה חלופית אחרת באמצעות צבע מחייב DNA חרוש תא, DyeCycle גריןכתם 14,15,16,17, שיטה זו מומלצת לבידוד של תאי זרע מאסכים צעירים. לכן, יש צורך קריטי לפתח שיטת בידוד פשוטה וחזקה עבור spermatocytes meiotic חי שניתן להחיל על כל זן העכבר בכל גיל, כי ניתן לבצע באמצעות כל סדרן תאים FACS.
כאן אנו מתארים פרוטוקול כזה ארוך זמן בידוד תאים באמצעות כתם סיגלית DyeCycle (DCV). DCV הוא cytotoxicity נמוך, תא חיר DNA מחייב צבע דומה מבנית Ho342 אבל עם ספקטרום עירור נע לכיוון טווח סגול18. בנוסף, DCV יש ספקטרום פליטה רחב יותר בהשוואה DCG. לכן, זה יכול להיות נרגש על ידי לייזרים UV וסגול, אשר משפר את הגמישות של ציוד, המאפשר את השימוש של סדרן תאים FACS לא מצויד בלייזר UV. פרוטוקול DCV המוצג כאן משתמש בהפרדה דו-ממדית עם כחול DCV ואדום DCV, המחקה את היתרון של פרוטוקול Ho342. עם יתרון זה, פרוטוקול DCV שלנו מאפשר לנו לבודד תאי נבט מועשר מאוד מן האשכים למבוגרים. אנו מספקים פרוטוקול גתור מפורט כדי לבודד תאי זרע חיים מאסחי עכבר בוגרים של עכבר אחד (משני אשכים). כמו כן, אנו מתארים פרוטוקול יעיל ומהיר להכנת השעיה חד-תאית מכיסכי עכבר שניתן להשתמש בהם לבידוד תא זה. ההליך דורש זמן קצר כדי להשלים (הכנה של מתלה תא יחיד - 1 שעה, כתמי צבע - 30 דקות, ומיון תאים - 2-3 שעות: סה"כ - 4-5 שעות בהתאם למספר התאים הדרושים; איור 1). לאחר בידוד תאים, ניתן להשלים מגוון רחב של יישומים במורד הזרם, כולל RNA-seq, ATAC-seq, ChIP-seq ותרבות תאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול זה פועל בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ולשימוש (פרוטוקול מס'. IACUC2018-0040) במרכז הרפואי של בית החולים לילדים בסינסינטי.
1. ציוד והגדרת רייגנט להכנת מתלי תא האשכים
- להכין כל מלאי אנזים 1x תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS) ולאחסן ב -20 ° C.(Table1).
הערה: הכן בכל עת לפני הניסוי. - יום אחד לפני הניסוי: צינורות איסוף מעילים (1.5 מ"ל צינורות) עם סרום של צופר עוברי (FBS) ב-4 מעלות צלזיוס בלילה.
- ביום הניסוי: הגדר את אמבט המים ל-37 מעלות צלזיוס.
- טרום חם של Dulbecco שונה נשר בינוני (DMEM) ב 37 ° C ולהכין 2 מ"ל של 1x מאגר דיסוציאציה עבור כל דגימה ממש לפני השימוש (טבלה 1) ב 15 מ"ל צנטריפוגה צינור.
הערה: מאגר דיסוציאציה של 2 מ"ל מוכן עבור שני אשכים. למתכון מאגר הדיסוציאציה, עיין בטבלה 1.
2. פירוק בעלי חיים והכנה של מתלי תאי האשכים
- להקריב עכבר זכר בן 8 שבועות על ידי השארת בתא פחמן דו חמצני לפחות 10 דקות.
- הסר את שני האשכים והירח על צלחת פטרי 60 מ"מ המכילה 2 מ"ל של תמיסת מלח קרה כקרח עם פוספט (PBS).
- הסר את אלבוג'ינה הטוניקה מהאקסטרים. פיזור קל את הצינורות סמיניפרוס על ידי הפרדת בעדינות עם מגרסה.
- מעבירים את הצינורות החצי-ניפריים לצלחת פטרי ב-100 מ"מ עם טיפת PBS קרה כקרח וצינורות סמי-ניפריים מתירים בעדינות עם מגרסה. חזור על שטיפה זו 3 פעמים כדי להסיר תאים interstitial ככל האפשר.
- דגירה צינורים סמיניפרים ללא חריטה בצינור 15 מ"ל המכיל 2 מ"ל של מאגר דיסוציאציה ב 37 °C במשך 20 דקות.
- בעדינות פיפטה את הצינורות 20 פעמים באמצעות 1000 μL micropipette.
- דגירה במשך 6 דקות. חזור על ההתפתלות העדינה 20 פעמים.
- דגירה במשך 3 דקות. חזור על צנרת עדינה 10 פעמים עד שלא יישארו גושים נראים לעין.
- הוסף מאגר FACS של 10 מ"ל להשעיה. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר ולזרוק את supernatant.
- חזור על שלב 2.9 פעמיים כדי להסיר את הזרעון ופסולת רבה ככל האפשר.
3. כתמי תאים
- תוסתרו מחדש את גלולת התא עם 3 מ"ל של מאגר FACS(טבלה 1) וסינוןאת מתלי התא באמצעות מסננת תאי ניילון של 70 μm לתוך צינור 50 מ"ל.
הערה: תפוקת התא הצפויה היא כ-100 מיליון תאים לכל שני אשכים (מעכבר פראי בן 8 שבועות מסוג B6). - ספור את מספר התא ותחלק 10% מהתאים לצינור חדש כשליטה שלילית לא מוכתמת והעזוב על קרח.
- להוסיף 6 μL של כתם DCV (הריכוז המקורי הוא 5 mM) מתלה התא הנותרים ולערבב היטב. הריכוז הסופי הוא 10 μM, ואת הקיבולת היא כ 100 מיליון תאים.
- דגירה ב 37 ° C במשך 30 דקות בחושך. לנער בעדינות את מתלה התא כל 10 דקות.
- לאחר הדגירה, ללא שלב לשטוף, ישירות להוסיף 5 μL של DNase I (ריכוז המלאי הוא 10 מ"ג / מ"ל) להשעיית התא ולסנן את התאים לתוך צינור FACS 5 מ"ל דרך מכסה רשת ניילון 35 μm. שמור את הדגימות על קרח עד למיון.
4. ציתום זרימה ושערים ניסיוניים
- הכן את סדרן התאים של FACS. ודא כי סדרן התאים FACS מצויד אופטיקה Excitation: סגול (405-nm) לייזר; זיהוי אופטיקה: שילוב מסנן של 450/50 bandpass [אותו סט מסנן של 4′,6-diamidino-2-פניליינדול (DAPI) לזיהוי DCV-כחול] ו 665/30 bandpass [אותו סט מסנן של Allophycocyanin (APC) לזיהוי DCV אדום]. כאן אנו משתמשים במיון התאים Sony SH800S כדוגמה.
- צור ניסוי חדש והגדר את קווי העבודה הבאים המציגים פרמטרים למיטוב: לחץ על "צפיפותחדשה " בשורת התפריטים "כליגליון עבודה " כדי ליצור פיזור קדימה - אזור (FSC-A) לעומת פיזור אחורי - אזור (BSC-A) מתווה צפיפות בקנה מידה ליניארי. לחץ על "היסטוגרמהחדשה " כדי ליצור עלילת היסטוגרמה כחולה DCV בקנה מידה לוגריתמי.
- מערבולת קצרה של השליטה השלילית הלא מוכתמת (ממדרגה 3.2) ועמיס את הדגימה.
- לחץעל" התחל "ו" רשומה " כדי להתחיל לעבד את הדוגמה הלא מוכתמת. כאשר המדגם פועל, לחץ על "גלאי & הגדרות סף" כדי למטב את מתחי FSC ו- BSC על-ידי התאמת שני מתחי צינור photomultiplier (PMT) למעלה או למטה כדי למקם את התאים הלא מושתקים בקנה מידה של העלילה FSC / BSC.
- כוונן את מתח PMT למעלה ו למטה על "FL1: DAPI" בעוד המדגם פועל כדי לאתר את המיקום של האוכלוסייה DCV שלילי בעשור הראשון של העלילה הלוגאריתמית היסטוגרמה DCV כחול(איור 2A). לאחר השלמת התאמת מתח PMT, לחץ על " עצור "כדילבטל את טעינת המדגם הלא מוכתם.
- מערבולת קצרה של הדגימה (ממדרגה 3.5) ולטעון את המדגם.
- לחץ על "הצינורהבא " כדי ליצור גליון עבודה חדש עבור הדוגמה המוכתמת ב- DCV; ולחץ על "התחל" ו "רשומה" כדי לרכוש את המדגם מוכתם DCV, להקליט ≥ 1 x 106 אירועים. הוסף את קווי העבודה הבאים: לחץ על "צפיפות חדשה" בשורת התפריטים "כליגליון עבודה " כדי ליצור מתווה צפיפות FSC-H (גובה) לעומת FSC-W (רוחב) בקנה מידה ליניארי; לחץ על "צפיפותחדשה " כדי ליצור מתווה צפיפות DCV-כחול לעומת DCV-אדום בקנה מידה ליניארי. לאחר הקלטת ≥ 1 x 106, לחץ על " עצור "ובטלאת טעינת הדגימה.
- על העלילה FSC-A לעומת BSC-A צפיפות, לחץ על "מצולע"בשורתהתפריטים " כלי התוויה " לצייר שער גדול "תאים" כדי לכלול את רוב התאים ולא לכלול פסולת קטנה (איור 2B). החל את השער "תאים" על FSC-H לעומת FSC-W צפיפות התוויית. לחץ על "מלבן" כדי לצייר שער "תאים בודדים" כדי לא לכלול תאים שאינם בודדים (איור 2C).
- החל "תאים בודדים" שער על מתווה צפיפות DCV-כחול לעומת DCV אדום ולהתאים את קנה המידה כדי ללכוד פרופיל מורחב כפי המוצג איור 2D. לחץ על "מצולע"בשורתהתפריטים " כלי התוויה " כדי לצייר שער "DCV" כדי לא לכלול את התאים הלא מוכתמים ואת האוכלוסייה הצדדית (איור 2D).
- החל "DCV" שער על העלילה היסטוגרמה DCV כחול בקנה מידה ליניארי. שלוש הפסגות העיקריות מתייחסות לתכני DNA שונים: 1C, 2C ו- 4C (איור 2E).
- לחץ על "צפיפותחדשה " כדי ליצור DCV-כחול לעומת DCV-אדום צפיפות מתווה בקנה מידה ליניארי ולהחיל "DCV" שער כדי לבצע gating בחזרה מאיור 2E כדי לאתר את האוכלוסיות 1C ו 4C (איור 2F). לחץ על "אליפסה" כדי לצייר שער על אוכלוסיית 1C, שנמצא בתוך אזור מרוכז (שער 1C). לחץ על "מצולע" כדי לצייר שער על אוכלוסיית 4C שהוא עקומה רציפה (שער 4C).
- לחץ על "צפיפותחדשה " כדי ליצור חלקת צפיפות DCV-כחול לעומת DCV-אדום בקנה מידה ליניארי ולהחיל שער "4C"; להתאים את קנה המידה כדי להגדיל ולחץ על "מצולע" כדי לצייר שער "4C_1" לבחירה מדויקת יותר (איור 2G).
- לחץ על "צפיפותחדשה " כדי ליצור מתווה צפיפות FSC-A חדש לעומת BSC-A בקנה מידה ליניארי ולהחיל שער "4C_1"; יהיו שלוש אוכלוסיות מועשר מופרדות על ידי גודל המתאים לפטטן (L) / zygotene (Z), pachytene (P) ו דיפלוטן (D) spermatocytes. לחץ על "מצולע" או "אליפסה" כדי לצייר 3 שערים: "L/Z", "P" ו- "D" בהתבסס על גודל גדל(איור 2H).
- לחץ על "התוויית נקודהחדשה " כדי ליצור מתווה נקודה בצבע DCV-כחול לעומת DCV-אדום בקנה מידה ליניארי כדי להחיל שער ולהבטיח ששלוש האוכלוסיות נמצאות בסדר רציף בתוך השער "4C_1"(איור 2I).
- באופן דומה, עבור אוכלוסיית 1C, לחץ על "צפיפותחדשה " כדי ליצור מתווה צפיפות חדש FSC-A לעומת BSC-A בקנה מידה ליניארי ולהחיל שער "1C", בחר את הגודל המאוחד של תאים כאוכלוסיית זרע עגול טהור, ולחץ על "אליפסה" כדי לצייר שער "RS" (איור 2J).
5. מיון אוכלוסיות משנה של תאי נבט זכר
- להכין 1.5 מ"ל צינורות המכילים 500 μL 50% FBS עבור איסוף תאים ולטעון את צינור האוסף לתוך אספן ולחץ על "אוסף עומס".
- לחץ על "הצינורהבא ", "התחל", "רשומה" ו - "מיון להתחיל". לשימוש במערכת דו--דרךית המאפשרת למיין שתי אוכלוסיות של עניין בו-זמנית לתוך התקן האיסוף, עקבו אחר שילובים של pairwise: לפטוטן (L) /zygotene (Z) ו-pachytene (P) spermatocytes המבוססים על שערים אחוריים של L/Z ו-P; זרעונים עגולים (RS) ודיפלוטן (D) spermatocytes המבוססים על שערים אחוריים RS ו-D.
- בזמן שהדגימה פועלת, התאם את קצב הזרימה ל- ~ 3000 אירועים/s כדי לקבל את המיון היעיל ביותר.
6. ניתוח טוהר של תאים ממוינות
- לאסוף ≥ 10,000 תאים / כל אוכלוסייה. בצע חיסון תאי כדי לאשר את תת-שלמה.
- צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות ב 4 מעלות C ולזרוק בזהירות את supernatant, שמירה על סביב 110 μL של הנוזל בתחתית הצינור.
- קח טיפה 10 μL של מתלה תא כדי להתבונן תחת מיקרוסקופ ולהעריך את מורפולוגיה תא סקירה ומספר.
- החל 100 μL של מתלי תא על כל אחת מהשקופית של התא לדוגמה (ראה טבלת חומרים),ולטעון את התאים על Cytospin.
- סובבו את הדגימות ב-30 x g למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. צייר עיגול סביב התא עם עט הידרופובי. שקופיות יבשות על ספסל המעבדה במשך כמה דקות בטמפרטורת החדר.
- שחרר 50 μL של PBS במעגל של השקופית והקש כבוי.
- הוסף פתרון נוגדנים ראשי (דילו את הנוגדנים הראשיים עם סרום חמור 5% ב-PBS עם 0.02% פוליסרבט 20) במעגל השקופית וגידור ב-4°C בין לילה.
הערה: כדי לשפוט את תת הבמה של spermatocytes meiotic, SYCP3 זוהה, שהוא סמן של צירי כרומוזום מיוטי, ו ơH2AX, שהוא סמן של תגובת נזק DNA. (לריכוז העבודה של הנוגדנים, אנא עיינו בטבלת החומרים). - הקש על פתרון הנוגדנים הראשי מהשקופיות.
- שחרר 50 μL של PBS במעגל של השקופית והקש כבוי. חזור על זה פעם אחת.
- הוסף פתרון נוגדנים משני (לדלל נוגדנים משניים PBS עם 0.02% Polysorbate 20) במעגל של השקופית דגירה בטמפרטורת החדר עבור 1 שעה בחושך.
- שחרר 50 μL של PBS במעגל של השקופית והקש כבוי. חזור על זה פעם אחת.
- להוסיף 50 μL של DAPI (ריכוז המניות הוא 0.1 μg / מ"ל) כתם במשך 5 דקות והקש את.
- הוסף 1-2 טיפות של מדיה טעינה על השקופיות. מכסים בזהירות את אמצעי ההרכבה בזכוכית כיסוי ולחץ בעדינות על זכוכית הכיסוי כדי להסיר מדיה הרכבה נוספת ובועת אוויר. השקופיות מוכנות להערכת מיקרוסקופיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תוצאה מייצגת של פרוטוקול מיון זה מוצגת באיון 3. זמן המיון הכולל של שני אשכים (עכבר אחד) הוא בדרך כלל סביב 3 שעות, אשר תלוי בריכוז של מתלי תא ומהירות המיון. לאחר מיון, הטוהר של spermatocytes מאושר על ידי immunostaining של SYCP3 ו ơH2AX (איור 3A). הטוהר המייצג של שברים של L/Z, P, D spermatocyte הוא סביב 80.4%, 90.6%, ו- 87.6%, בהתאמה(איור 3C). קבענו את שלבי המשנה בהתבסס על הקריטריונים שפרסמנו בעבר19. בקצרה, בשלב לפטוטן וzygotene, סינפסה בין כרומוזומים הומולוגיים אינה שלמה, אשר מצוין על ידי חוטים דקים של כתמי SYCP3. תחומים רחבים של 5H2AX נצפים ברחבי הכרומטין הגרעיני בשל הפסקות דו-גדיליות של דנ"א מתוכנתות. בשלב pachytene, כרומוזומים הומולוגיים יש synapsed לחלוטין, ו ơH2AX מצטבר במיוחד על כרומוזומים המין. בשלב diplotene, כרומוזומים הומולוגיים בהדרגה לעבור desynapsis. הטוהר של RS מאושר על ידי כתמים גרעין עם DCV (איור 3B). ניתן לשפוט במדויק את RS עם כתמי DNA: מרכז כרומוזו-אינטנסיבי ייחודי של DAPI המוקף בוכרומטין; או לשלב עם סמנים ספציפיים, כגון Sp56 המתבטא בתוך גרגיר אקרוזומלי מתפתח של spermatid ו המשתנה histone H1T המתבטא מאוד בגרעין לאחר שלב אמצע pachytene(איור 3B).
טוהר RS הוא סביב 90.1% לאחר מיון(איור 3C). גודל המדגם של ניתוח טוהר הוא מעל 1,000 תאים עבור כל ניסוי; הטוהר של אוכלוסיות L/P ו-D הוא בממוצע מ-6 ניסויים עצמאיים; הטוהר של אוכלוסיות P ו-RS הוא בממוצע מ-3 ניסויים עצמאיים. הכדאיות של תאים מבודדים אלה היא בדרך כלל מעל 95%(איור S1). התפוקה הכוללת של כל שבר מעכבר מבוגר יחיד מוערכת ומפורטת בתאג 3C, המספקת מספיק תאים לניתוחים שונים במורד הזרם. לאחרונה, השתמשנו בפרוטוקול זה כדי לבודד זרעון pachytene מסוג פראי עבור ניתוח ChIP-seq20,21.
| מגיב | המרכיב | ריכוז מלאי | אמצעי אחסון |
| (בסיס HBSS) | |||
| מאגר דיסוציאציה | DMEM (100) | - | 2 מ"ל |
| (בסיס DMEM) | FBS (אף.בי. | - | 40 μl |
| היאלורונידאז (הואלורונידס) | 100 מ"ג/מ"ל | 30 μl | |
| ת.ד. | 10 מ"ג/מ"ל | 50 μl | |
| קולגנאז סוג I | 100 מ"ג/מ"ל | 40 μl | |
| קולגנאז רקומביננטי | 14000 יחידות/מ"ל | 100 μl | |
| מאגר FACS | Pbs | - | 980 מ"ל |
| (בסיס PBS) | FBS (אף.בי. | - | 20 מ"ל |
שולחן 1: מתכון לריגנט. יש להכין את מאגר הדיסוציאציה ממש לפני השימוש. DMEM לפני המלחמה לפני תחילת הניתור. ניתן להכין את מלאי האנזימים בכל עת לפני הניסוי ולאחסן אותם במאגר FACS של -20°C. יש לסנן ולאחסן אותו ב-4°C; לפני חום לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
איור 1: זרימת עבודה של בידוד תאי זרע ממורין במיון מבוסס DCV. תמונה זו ממחישה את ההליך הכללי, החל מניתוק רקמות ועד למיון FACS, ועד לקצירת תאי זרע מבודדים בתוך יום אחד. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: ניתוח FACS של תאי אשכים מורין למבוגרים המבוסס על פלואורסצנס DCV ופיזור אור. (א)תאים לא מושגים בעשור הראשון של עלילת היסטוגרמה כחולה DCV (צד שמאל של הרף האדום). (ב) מה אתה עושה? (ג)פסולת ותא לא יחיד לא נכללים לפיזור אור. (ד)אי-הכללת תאים ואוכלוסייה צדדית שאינם מוכתמים בהתבסס על פלואורסץ DCV. (ה)קביעת תוכן DNA המבוססת על פלואורססנס DCV-כחול. הפסגה השמאלית (ירוקה) והשיא הימני (ורוד) תואמת לאוכלוסיות 1C ו-4C. (F)Gating על אוכלוסיות אשכים 1C ו 4C המבוסס על פלואורסצנציה DCV-כחול / DCV אדום. (ז)גטה מדויקת על אוכלוסיות אשכים 4C. (H)back-gating של שער 4C מתוך העלילה DCV על מגרש FSC / BSC. בהתבסס על אזורים של חפיפה מינימלית על העלילה FSC /BSC, השערים L/Z, P ו- D נוצרים כדי להעשיר את אוכלוסיות הזרע שלהם בהתאמה. (I)עלילת נקודה צבעונית המציגה את האוכלוסיות L/Z, P ו- D נמצאות בסדר רציף בתוך שער 4C. (J)back-gating של שער 1C מתוך העלילה DCV על מגרש FSC /BSC. שער RS נוצר כדי להעשיר אוכלוסיית זרע עגולה עם גודל אחיד, וכתוצאה מכך טוהר גדול יותר של אוכלוסיות במהלך מיון. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: תמונות תוצאה מייצגות וסטטיסטיקות של תאי זרע המתקבלים ממיון. (א)אפיון חיסון של זרעונים ממוינות. פאנל עליון: כתמי DCV מראה דפוס גרעין של spermatocytes חי מיד לאחר מיון; L/Z (לפטוטן/זיגוטן), P (פאצ'יתן) ו-D (דיפלוטן). פאנל תחתון: אישור של תת-שלמות מיוטיות עבור כל אוכלוסייה על-ידי חיסון עבור SYCP3 (ירוק) ו- ωH2AX (אדום). (ב)תמונת DCV מייצגת המציגה תבנית גרעין של RS. פסים בקנה מידה: 50 μm (לוחות עליונות) ו 10 μm (לוחות מוגדלים נמוכים). לוחות ימניים: אישור אימונו-לודרשים של זרעונים עגולים מוכתמים ב-Sp56 ו-H1T. (ג)הטוהר של L/Z, P ו-D אושרו על ידי immunostaining, גודל המדגם היה מעל 1,000 תאים עבור כל ניסוי עצמאי, בסך הכל 6 ניסויים עצמאיים. טוהר RS אושר על ידי כתם גרעין עם סך של 3 ניסויים עצמאיים. מספר התא הכולל של מתלי תא האשכים מעכבר WT B6 אחד בן 8 שבועות היה סביב 100 מיליון תאים לפני המיון. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור S1: הכדאיות של זרעון pachytene מבודד. תמונה מייצגת מציגה את הכדאיות של תאי הזרע המבודדים (אדום: PI; כחול: DCV). לא היתה דרך פעולה עם PI עם DCV במהלך המיון. עם זאת, תחת מיקרוסקופ, האות האדום DCV היה נמוך למדי; לכן, תאים מתים חיוביים PI היו נבדלים בקלות מתאי חיים אחרים. הכדאיות היא בדרך כלל מעל 95%. סולם ברים: 10 μm. אנא לחץ כאן כדי להוריד דמות זו.
איור S2: ניתקה לא שלמה או פסולת מפריעה לתקעה. האוכלוסייה A (עיגול אדום) מכילה פסולת ופולימר של spermatids (המצוין על ידי חץ). האוכלוסייה הגדולה יותר תחצה עם אוכלוסיית B (עיגול צהוב) ובסופו של דבר לזהם את אוכלוסיית 4C. סולם ברים: 200 μm. אנא לחץ כאן כדי להוריד דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן אנו מציגים פרוטוקול מעשי ופשוט לבודד תת-אוכלוסיות של spermatocytes וזרעון מעכבר זכר בוגר אחד. כדי להבטיח את האפשרות לשחזור של פרוטוקול זה, קיימים מספר שלבים קריטיים הזקוקים לתשומת לב. לפני עיכול אנזימים, שלב לשטוף שואף להסיר תאים interstitial; לאחר העיכול, שלב זה מסייע להסיר spermatozoa ופסולת. כביסה / צנטריפוגה 3 פעמים חשוב. במתכון מאגר הדיסוציאציה שלנו, השילוב של מספר אנזימים שונים מקל על ניתוק האשכים לתוך המתלה של תא יחיד ללא נזק מוגזם לתא. צנרת בעדינות כדי למנוע גרימת בועות אוויר גם עוזר להגן על שלמות התא. נא בדוק את מתלה התא תחת מיקרוסקופ לאחר ניתוק כדי לוודא המתלים מגיע לרמה של תא יחיד. ניתקה לא שלמה או זיהום פסולת מעיכול מוגזם ישפיע על הטוהר של תאים ממוין; כפי שהראה ב- איור S2, האוכלוסייה הזקופה מכילה פסולת וטרמר של זרעונים. כתמי DCV דורשים דגירה בחושך ולא כביסה לאחר מכן.
כדי לפתור קשיים פוטנציאליים על gating ו- back-gating של אוכלוסיות זרע, כאפשרות אופטימיזציה, אנו ממליצים להשתמש בעכבר מסוג פראי מסונכרן כדי לסייע באיתור שלב מסוים של spermatocytes22,23,24. כמו כן, ראוי לציין כי כמה זנים עכבר נוקאאוט עם פנוטיפים מעצר spermatogenesis עשויים להיות פרופילי DCV נדירים כי הם חסרים כמה תת אוכלוסיות. בקרת wildtype נכונה מומלצת מאוד במקרה זה. בנוסף, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם באופן פוטנציאלי על עכברים בוגרים בכל גיל. עם זאת, הגיל של העכבר הניסיוני יכול להיות גורם מבלבל בשל השיעור המשתנה של תאי נבט.
במהלך השנים פותחו מספר פרוטוקולים לטיהור תאי הנבט. בתור אחת השיטות הפופולריות ביותר, מקע מהירות STA-PUT מפריד תאי נבט על ידי מעבר הצבע BSA ומספק תשואה טובה של תאי נבט שלמים6,7. עם זאת, STA-PUT לא רק דורש מכשירים מיוחדים כי לא יכול להיות זמין למעבדות רבות, אבל הוא גם זמן רב ועבודה אינטנסיבית לנהל בחדר קר ב 4 מעלות צלזיוס. שלא כמו STA-PUT, המתאימה להפרדה בקנה מידה גדול, שיטה מבוססת FACS זו יכולה לספק טוהר גבוה ושבר מדויק לניסוי בקנה מידה קטן. מיון בקנה מידה גדול באמצעות הפרוטוקול שלנו אפשרי, אבל יאריך את זמן המיון באופן משמעותי עלול לסכן את הכדאיות של התא. לכן, STA-PUT היא עדיין אפשרות מעשית כאשר יש צורך במספר גדול של תאים5,25,26.
בהשוואה לשיטת FACS הקודמת המבוססת על הכתמים בצבע Ho3428,9,10,11, הפרוטוקול שלנו משתמש DCV, אשר יש ספקטרום ריסוק רחב יותר, ניתן להחיל על רוב סדרני FACS הנוכחי מצויד UV או 405 נה"מ לייזר סגול18. למרות שיש פרוטוקול אחר באמצעות DCG14,15,16,17, ההבדל בין הפרוטוקול שלנו פרוטוקול DCG הוא פרוטוקול DCV שלנו משתמש בהפרדה דו-ממדית עם DCV כחול DCV אדום, מחקה את היתרון של פרוטוקול Ho342. עם יתרון זה, פרוטוקול DCV שלנו מאפשר לנו לבודד תאי נבט מועשר מאוד מאבחנים למבוגרים. פרוטוקול DCG אינו משתמש בהפרדה דו-ממדית ומומלץ לבידוד תאי נבט מעכברים צעירים. ההפרדה הדו-ממדית יכולה להיות בעלת רזולוציה טובה יותר כדי להפריד בין תת-שלבי הזרע. עם זאת, השיטה שלנו עדיין אינה מסוגלת לבודד לפטוטן וזרעון zygotene בנפרד, כמו גם "2C" סוגי תאים כולל spermatocytes, spermatocytes preleptotene, spermatocytes משני.
מאז ספקטרום הפליטה הרחב של כתם DCV גורם דליפה לערוצים אחרים, רוב צבעי הכדאיות של התא כמו PI ו 7AAD לא ניתן לשלב בשל אותות חיוביים כוזבים. צבעי כדאיות תאים אחרים עם פליטה בערוצים הרבה אדום או כמעט אינפרא אדום עשוי להיות שווה לנסות בעתיד. אבל מניסיוני, תאים ממוינות בדרך כלל מראים ≥ 95% קיימות לאחר 2 שעות של מיון FACS (איור S1), אשר מספיק לניתוח במורד הזרם.
תאים ממוינות המתקבלים מההליך שלנו יכולים לשמש לניסויים שונים במורד הזרם, כולל ניתוח רצף הדור הבא (RNA-seq, ATAC-seq ו- ChIP-seq). ניתן להשתמש בתאים המתקבלים כאן גם לתרבות קצרת טווח27. לסיכום, אנו מספקים פרוטוקול פשוט אך יעיל הכולל הליך הכנה של שעה אחת להשעיה חד-תאית ואסטרטגיית גתור מפורטת עבור FACS המבוססת על כתמי צבע DCV, המתאימה לבידוד תאים זרע בקנה מידה קטן וניתן לאמץ אותה במהירות על ידי חוקרים רבים, אפילו למתחילים בזרימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.
Acknowledgments
אנו מודים לחברי מעבדות נמקאווה, יושידה ומזאווה על עזרתם; קייטי גרהרט לעריכת כתב היד; מרי אן הנדל לשיתוף הנוגדן H1T, המרכז הרפואי לילדים בסינסינטי (CCHMC) מחקר זרימה Cytometry Core לשיתוף ציוד FACS נתמך על ידי NIH S10OD023410; מענק בסיוע למחקר מדעי (KAKENHI; 17K07424) ל-T.N.; מלגת פוסט-ת'ורי של קרן ללור לא.ס.; AMED-CREST (JP17gm110005h0001) עד ס.י.; מענק פרויקט המחקר על ידי חטיבת שירותי המחקר של אוניברסיטת אזבו, משרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע והטכנולוגיה (MEXT)-נתמך בתוכנית עבור פרויקט המיתוג של האוניברסיטה הפרטית למחקר (2016-2019), מענק-בסיוע לסטארט-אפ פעילות מחקרית (19K21196), קרן המדע טוקדה (2019) ומענק תמריץ המחקר של קרן אוהרה (2018) ל-S.M.; המכון הלאומי לבריאות R01 GM122776 ל S.H.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml tube | Watson | 131-7155C | |
| 100 mm Petri dish | Corning, Falcon | 351029 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Watson | 1332-015S | |
| 5 ml polystyrene tube with cell strainer snap cap (35 µm nylon mesh) | Corning, Falcon | 352235 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Watson | 1342-050S | |
| 60 mm Petri dish | Corning, Falcon | 351007 | |
| 70 µm nylon mesh | Corning, Falcon | 352350 | |
| Cell sorter | Sony | SH800S | |
| Centrifuge | |||
| Collagenase, recombinant, Animal-derived-free | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 036-23141 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington | LS004196 | |
| Cover glass | Fisher | 12-544-G | |
| Cytospin 3 | Shandon | ||
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Fisher | D1306 | working concentration: 0.1 μg/mL |
| Dnase I | Sigma | D5025-150KU | |
| Donkey serum | Sigma | S30-M | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11885076 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| Histone H1t antibody | gift from Mary Ann Handel | 1/2000 diluted | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Gibco | 14175095 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H3506-1G | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P5493-4L | |
| Pipettemen | |||
| ProLong Gold Antifade Mountant | Fisher | P36930 | |
| rH2AX antibody | Millipore | 05-635 | working concentration: 2 μg/mL |
| Sperm Fertilization Protein 56 (Sp56) antibody | QED Bioscience | 55101 | working concentration: 0.5 μg/mL |
| Sterilized forceps and scissors | |||
| Superfrost /Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | |
| SYCP3 antibody | Abcam | ab205846 | working concentration: 5 μg/mL |
| TWEEN 20 (Polysorbate 20) | Sigma | P9416 | |
| Vybrant DyeCycle Violet Stain (DCV) | Invitrogen | V35003 | |
| Water bath |
References
- Griswold, M. D. Spermatogenesis: The Commitment to Meiosis. Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).
- Yoshida, S. Mouse Spermatogenesis Reflects the Unity and Diversity of Tissue Stem Cell Niche Systems. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 036186 (2020).
- Rathke, C., Baarends, W. M., Awe, S., Renkawitz-Pohl, R.
- Maezawa, S., et al. SCML2 promotes heterochromatin organization in late spermatogenesis. Journal of Cell Science. 131 (17), 217125 (2018).
- Maezawa, S., Yukawa, M., Alavattam, K. G., Barski, A., Namekawa, S. H. Dynamic reorganization of open chromatin underlies diverse transcriptomes during spermatogenesis. Nucleic Acids Research. 46 (2), 593-608 (2018).
- Bellve, A. R. Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods in Enzymology. 225, 84-113 (1993).
- Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation. Journal of Visualized Experiments. (80), e50648 (2013).
- Gaysinskaya, V., Bortvin, A.
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry Part A. 65 (1), 40-49 (2005).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. Journal of Visualized Experimments. (50), e2602 (2011).
- Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes. Cytometry Part A. 85 (6), 556-565 (2014).
- Romer, K. A., de Rooiji, D. G., Kojima, M. L., Page, D. C. Isolating mitotic and meiotic germ cells from male mice by developmental synchronization, staging, and sorting. Developmental Biology. 443 (1), 19-34 (2018).
- Lam, K. G., Brick, K., Cheng, G., Pratto, F., Camerini-Otero, R. D. Cell-type-specific genomics reveals histone modification dynamics in mammalian meiosis. Nature Communications. 10 (1), 3821 (2019).
- Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. Flow Cytometry for the Isolation and Characterization of Rodent Meiocytes. Methods in Molecular Biology. 1471, 217-230 (2017).
- da Cruz, I., et al. Transcriptome analysis of highly purified mouse spermatogenic cell populations: gene expression signatures switch from meiotic-to postmeiotic-related processes at pachytene stage. BMC Genomics. 17, 294 (2016).
- Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye. MethodsX. 1, 239-243 (2014).
- Trovero, M. F., et al. Revealing stage-specific expression patterns of long noncoding RNAs along mouse spermatogenesis. RNA Biology. 17 (3), 350-365 (2020).
- Telford, W. G., Bradford, J., Godfrey, W., Robey, R. W., Bates, S. E. Side population analysis using a violet-excited cell-permeable DNA binding dye. Stem Cells. 25 (4), 1029-1036 (2007).
- Alavattam, K. G., Abe, H., Sakashita, A., Namekawa, S. H. Chromosome Spread Analyses of Meiotic Sex Chromosome Inactivation. Methods in Molecular Biology. 1861, 113-129 (2018).
- Maezawa, S., et al. Super-enhancer switching drives a burst in gene expression at the mitosis-to-meiosis transition. Nature Structural & Molecular Biology. , (2020).
- Sakashita, A., et al. Endogenous retroviruses drive species-specific germline transcriptomes in mammals. Nature Structural & Molecular Biology. , (2020).
- Agrimson, K. S., et al. Characterizing the Spermatogonial Response to Retinoic Acid During the Onset of Spermatogenesis and Following Synchronization in the Neonatal Mouse Testis. Biology of Reproduction. 95 (4), 81 (2016).
- Hogarth, C. A., et al. Turning a spermatogenic wave into a tsunami: synchronizing murine spermatogenesis using WIN 18,446. Biology of Reproduction. 88 (2), 40 (2013).
- Patel, L., et al. Dynamic reorganization of the genome shapes the recombination landscape in meiotic prophase. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (3), 164-174 (2019).
- Alavattam, K. G., et al. Attenuated chromatin compartmentalization in meiosis and its maturation in sperm development. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (3), 175-184 (2019).
- Adams, S. R., et al. RNF8 and SCML2 cooperate to regulate ubiquitination and H3K27 acetylation for escape gene activation on the sex chromosomes. PLoS Genetics. 14 (2), 1007233 (2018).
- Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis. Developmental Biology. 169 (2), 557-567 (1995).
