Summary
Aqui apresentamos um método simples e eficiente para isolar células germinativas vivas e pós-meiotic de testículos de camundongos adultos. Usando uma baixa citotoxicidade, corante de DNA com proteção violeta e classificação celular ativada por fluorescência, pode-se isolar populações de células espermatogênicas altamente enriquecidas para muitas aplicações a jusante.
Abstract
O isolamento dos espermatocitotas meioticos é essencial para investigar mecanismos moleculares subjacentes à meiose e espermatogênese. Embora existam protocolos de isolamento celular estabelecidos usando manchas hoechst 33342 em combinação com a classificação celular ativada pela fluorescência, ela requer classificadores celulares equipados com um laser ultravioleta. Aqui descrevemos um protocolo de isolamento celular usando a mancha DyeCycle Violet (DCV), um corante de ligação de DNA de baixa citotoxicidade estruturalmente semelhante ao Hoechst 33342. O DCV pode ser animado por lasers ultravioleta e violeta, o que melhora a flexibilidade da escolha do equipamento, incluindo um classificador de células não equipado com um laser ultravioleta. Usando este protocolo, pode-se isolar três subpopulações de células vivas em prophase I meiotic, incluindo leptoteno/zygotene, paquitene e espermatocitotes diploteno, bem como espermatoides redondos pós-meioticos. Também descrevemos um protocolo para preparar suspensão de célula única de testículos de mouse. No geral, o procedimento requer um curto período de tempo para ser concluído (4-5 horas, dependendo do número de células necessárias), o que facilita muitas aplicações a jusante.
Introduction
A espermatogênese é um processo complexo em que uma pequena população de células-tronco espermatogonial sustenta a produção contínua de um grande número de espermatozoides ao longo da vida adulta1,2. Durante a espermatogênese, a remodelação dinâmica da cromatina ocorre quando as células espermatogênicas sofrem meiose para produzir espermatóides haploides3,4,5. O isolamento dos espermatocitos meioticos é essencial para a investigação molecular, e várias abordagens diferentes para isolados espermatotocitos meioticos foram estabelecidas, incluindo separação baseada em sedimentação6,7 e triagem celular ativada por fluorescência (FACS)8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. No entanto, esses métodos têm limitações técnicas. Enquanto a separação baseada em sedimentação produz um grande número de células5,6,7, é trabalhosa. O método estabelecido baseado em FACS usa hoechst 33342 (Ho342) para separar espermatocitotas meioticos com base no conteúdo de DNA e propriedades de dispersão de luz e requer classificadores de células FACS equipados com um laser ultravioleta (UV)8,9,10,11. Métodos alternativos baseados em FACS requerem linhas de camundongos transgênicos que expressam proteínas florescentes, sincronização da espermatogênese12, ou fixação celular e rotulagem de anticorpos que não são compatíveis com o isolamento das células vivas13. Embora exista outro método alternativo usando um corante de ligação de DNA permeável celular, DyeCycle Mancha verde14,15,16,17, este método é recomendado para o isolamento de células espermatogênicas de testis juvenis. Portanto, há uma necessidade crítica de desenvolver um método de isolamento simples e robusto para espermatos meioticos vivos que podem ser aplicados a qualquer cepa de camundongos de qualquer idade e que pode ser realizado usando qualquer classificador de células FACS.
Aqui descrevemos um protocolo de isolamento celular tão procurado usando a mancha DyeCycle Violet (DCV). DCV é uma baixa citotoxicidade, corante de dna permeável celular estruturalmente semelhante ao Ho342, mas com um espectro de excitação deslocado para a faixa violeta18. Além disso, o DCV tem um espectro de emissões mais amplo em comparação com o DCG. Assim, ele pode ser animado por lasers UV e violeta, o que melhora a flexibilidade do equipamento, permitindo o uso de um classificador de células FACS não equipado com um laser UV. O protocolo DCV apresentado aqui usa separação bidimensional com azul DCV e vermelho DCV, imitando a vantagem do protocolo Ho342. Com essa vantagem, nosso protocolo DCV nos permite isolar células germinativas altamente enriquecidas dos testíis adultos. Fornecemos um protocolo de gating detalhado para isolar células espermatogênicas vivas de testículos de camundongos adultos de um rato (de dois testículos). Também descrevemos um protocolo eficiente e rápido para preparar a suspensão unicelular a partir de testículos de mouse que podem ser usados para este isolamento celular. O procedimento requer um curto período de tempo para ser concluído (preparação de suspensão de célula única - 1 hora, coloração de corante - 30 min, e classificação celular - 2-3 horas: total - 4-5 horas, dependendo do número de células necessárias; Figura 1). Após o isolamento celular, uma ampla gama de aplicações a jusante, incluindo RNA-seq, ATAC-seq, ChIP-seq e cultura celular podem ser concluídas.
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Protocol
Este protocolo segue as diretrizes do Comitê Institucional de Atenção e Uso de Animais (protocolo nº. IACUC2018-0040) no Centro Médico do Hospital Infantil de Cincinnati.
1. Instalação de equipamentos e reagentes para a preparação da suspensão das células testiculares
- Prepare cada estoque de enzimas na Solução de Sal Balanceado (HBSS) da Hanks e armazene a -20 °C.(Tabela1).
NOTA: Prepare-se a qualquer momento antes do experimento. - Um dia antes do experimento: Reveste tubos coletores (tubos de 1,5 mL) com soro bovino fetal (FBS) a 4 °C durante a noite.
- No dia do experimento: Coloque o banho de água para 37 °C.
- Pré-aqueça o DMEM (Modified Eagle Medium, meio de águia modificada) de Dulbecco a 37 °C e prepare 2 mL de tampão de dissociação de 1x para cada amostra antes do uso(Tabela 1) no tubo de centrífugas de 15 mL.
NOTA: O tampão de dissociação de 2 mL está preparado para dois testículos. Para a receita de tampão de dissociação, consulte a Tabela 1.
2. Dissecção animal e preparação de suspensão de células testiculares
- Sacrifique um rato macho de 8 semanas saindo em uma câmara de dióxido de carbono por pelo menos 10 minutos.
- Remova ambos os testículos e coloque em uma placa de Petri de 60 mm contendo 2 mL de soro fisiológico tamponado com fosfato gelado (PBS).
- Remova a tunica albuginea dos testículos. Disperse ligeiramente os túbulos seminiferos separando-se suavemente com fórceps.
- Transfira os túbulos seminiferos para uma placa de Petri de 100 mm com uma nova gota de PBS gelado e untangle túbulos seminiferos suavemente com fórceps. Repita esta lavagem 3 vezes para remover as células intersticiais o máximo possível.
- Incubar túbulos seminiferos desemaranhados em um tubo de 15 mL contendo 2 mL de tampão de dissociação a 37 °C por 20 min.
- Pipeta suavemente os túbulos 20 vezes usando uma micropipette de 1000 μL.
- Incubar por 6 minutos. Repita a pipetação suave 20 vezes.
- Incubar por 3 min. Repita a pipetação suave 10 vezes até que não permaneçam pedaços visíveis.
- Adicione 10 mL de tampão FACS à suspensão. Centrifugar a 300 x g por 5 min à temperatura ambiente e descartar o supernatante.
- Repita o passo 2.9 duas vezes para remover o espermatozoides e o máximo de detritos possível.
3. Coloração celular
- Resuspenda a pelota celular com 3 mL de tampão FACS(Tabela 1) e filtrar a suspensão da célula através de um coador de célula de nylon de 70 μm em um tubo de 50 mL.
NOTA: O rendimento esperado das células é de aproximadamente 100 milhões de células por dois testículos (de um rato b6 de 8 semanas). - Conte o número da célula e divida 10% das células em um novo tubo como o controle negativo não manchado e deixe no gelo.
- Adicione 6 μL de mancha DE DCV (a concentração original é de 5 mM) à suspensão restante da célula e misture bem. A concentração final é de 10 μM, e a capacidade é de aproximadamente 100 milhões de células.
- Incubar a 37 °C por 30 min no escuro. Agite suavemente a suspensão da célula a cada 10 minutos.
- Após a incubação, sem um passo de lavagem, adicione diretamente 5 μL de DNase I (a concentração de estoque é de 10 mg/mL) à suspensão celular e filtre as células em um tubo FACS de 5 mL através da tampa de malha de nylon de 35 μm. Mantenha as amostras no gelo até a triagem.
4. Citometria de fluxo e portões experimentais
- Prepare o classificador de células FACS. Certifique-se de que o classificador de células FACS esteja equipado com óptica de excitação: laser Violet (405-nm); Óptica de detecção: combinação de filtro de 450/50 bandpass [mesmo conjunto de filtro de 4',6-diamidino-2-fenilôdole (DAPI) para detecção azul DCV] e 665/30 bandpass [mesmo conjunto de filtro de Allophycocyanin (APC) para detecção dcv-vermelho]. Aqui usamos o classificador de células Sony SH800S como exemplo.
- Crie um novo experimento e configure os seguintes gráficos de trabalho exibindo parâmetros a serem otimizados: Clique em "Nova Densidade" na barra de menu "Worksheet Tools" para criar uma inclinação de dispersão para a frente - área (FSC-A) vs. dispersão traseira – área (BSC-A) gráfico de densidade em escala linear. Clique em "New Histogram" para criar um gráfico de histograma azul DCV em escala logarítmica.
- Brevemente vórtice do controle negativo não manchado (a partir da etapa 3.2) e carregar a amostra.
- Clique em "Iniciar" e "Gravar" para começar a processar a amostra não manchada. Enquanto a amostra estiver em execução, clique em "Detector & Threshold Settings" para otimizar as tensões FSC e BSC ajustando ambas as tensões do tubo fotomultiplier (PMT) para cima ou para baixo para colocar as células não manchadas na escala do gráfico FSC/BSC.
- Ajuste a tensão PMT para cima e para baixo em "FL1: DAPI" enquanto a amostra está correndo para localizar a posição da população DCV-negativa na primeira década do gráfico logarítmico de histograma azul DCV(Figura 2A). Após concluir o ajuste de tensão pmt, clique em "Stop" para descarregar a amostra não manchada.
- Brevemente vórtice da amostra (a partir da etapa 3.5) e carregar a amostra.
- Clique em "Next Tube" para criar uma nova planilha para a amostra manchada de DCV; e clique em "Start" e "Record" para adquirir a amostra manchada de DCV, gravar ≥ 1 x 106 eventos. Adicione as seguintes parcelas de trabalho: Clique em "Nova Densidade" na barra de menu " Ferramentasde Planilha" para criar um gráfico de densidade FSC-H (altura) vs. FSC-W (largura) em uma escala linear; Clique em "New Density" para criar um gráfico de densidade dcv-azul vs. DCV-vermelho em uma escala linear. Depois de gravar ≥ 1 x 106 eventos, clique em "Stop" e descarregue a amostra.
- No gráfico de densidade FSC-A vs. BSC-A, clique em "Polygon" na barra de menu "Plot Tools" para desenhar um grande portão "Cells" para incluir a maioria das células e excluir pequenos detritos(Figura 2B). Aplique o portão "Cells" ao gráfico de densidade FSC-H vs. FSC-W. Clique em "Retângulo" para desenhar um portão "Células Únicas" para excluir células não-únicas(Figura 2C).
- Aplique o portão "Células Únicas" ao gráfico de densidade dcv-azul vs. DCV-vermelho e ajuste a escala para capturar um perfil estendido, conforme mostrado na Figura 2D. Clique em "Polygon" na barra de menu "Plot Tools" para desenhar um portão "DCV" para excluir as células e população lateral não manchadas(Figura 2D).
- Aplique o portão "DCV" ao gráfico histograma azul DCV em uma escala linear. Os três principais picos referem-se a diferentes conteúdos de DNA: 1C, 2C e 4C(Figura 2E).
- Clique em "New Density" para criar um gráfico de densidade DCV-azul vs. DCV-vermelho em escala linear e aplique o portão "DCV" para executar a volta da Figura 2E para localizar as populações 1C e 4C(Figura 2F). Clique em "Elipse" para desenhar um portão sobre a população 1C, que está dentro de uma área condensada (portão 1C). Clique em "Polygon" para desenhar um portão na população 4C que é uma curva contínua (portão 4C).
- Clique em "New Density" para criar um gráfico de densidade dcv-azul vs. DCV-vermelho em escala linear e aplicar o portão "4C"; ajustar a escala para ampliar e clicar em "Polygon" para desenhar um portão "4C_1" para uma seleção mais precisa(Figura 2G).
- Clique em "Nova Densidade" para criar um novo gráfico de densidade FSC-A vs. BSC-A em escala linear e aplique o portão "4C_1"; haverá três populações enriquecidas separadas por tamanho correspondente aos espermatotozóides leptoteno (L) /zygotene (Z), pachytene (P) e diploteno (D). Clique em "Polygon" ou "Elipse" para desenhar 3 portões: "L/Z", "P" e "D" com base no tamanho crescente(Figura 2H).
- Clique em "New Dot Plot" para criar um gráfico de pontos dcv-azul vs. DCV-vermelho em escala linear para aplicar o portão e garantir que as três populações estejam em uma ordem contínua dentro do portão "4C_1"(Figura 2I).
- Da mesma forma, para a população 1C, clique em "Nova Densidade" para criar um novo gráfico de densidade FSC-A vs. BSC-A em escala linear e aplicar o portão "1C", selecione o tamanho unificado das células como população espermicida redonda pura, e clique em "Ellipse" para desenhar um portão "RS"(Figura 2J).
5. Classificar subpopulações de células germinativas masculinas
- Prepare tubos de 1,5 mL contendo 500 μL 50% FBS para coleta celular e carregue o tubo de coleta no coletor e clique em "Coleta de Carga".
- Clique em "Next Tube", "Start", "Record" e "Sort Start". Para o uso de um sistema bidirecano que permite que duas populações de interesse sejam classificadas ao mesmo tempo no dispositivo de coleta, siga combinações pareiras: leptoteno (L) /zygotene (Z) e espermatos de paquitene (P) à base de portões traseiros L/Z e P; Espermatozoides redondos (RS) e diploteno (D) com base nos back-gates RS e D.
- Enquanto a amostra estiver em execução, ajuste a taxa de fluxo para ~3000 eventos/s para obter a classificação mais eficiente.
6. Análise de pureza de células classificadas
- Coletar ≥ 10.000 células/cada população. Realizar imunostenção celular para confirmar o subestás.
- Centrifugar a 300 x g por 5 min a 4 °C e descartar cuidadosamente o supernasal, mantendo cerca de 110 μL do líquido na parte inferior do tubo.
- Faça uma queda de 10 μL de suspensão celular para observar sob microscópio e avaliar a morfologia e o número da célula de visão geral.
- Aplique 100 μL de suspensão celular em cada um dos slides da câmara de amostra (ver Tabela de Materiais), e carregue as câmaras para o Citospin.
- Gire as amostras a 30 x g por 5 min a temperatura ambiente. Desenhe um círculo ao redor da célula com uma caneta hidrofóbica. Lâminas secas no banco do laboratório por alguns minutos em temperatura ambiente.
- Solte 50 μL de PBS no círculo do slide e toque.
- Adicione solução de anticorpos primários (Diluir anticorpos primários com soro de burro de 5% em PBS com 0,02% Polisorba 20) no círculo do slide e incubar a 4 °C durante a noite.
NOTA: Para julgar a subsuseção de espermatos meioticos, foi detectado SYCP3, que é um marcador de eixos cromossomos médios, e γH2AX, que é um marcador de resposta a danos de DNA. (Para a concentração de trabalho de anticorpos, consulte a Tabela de Materiais). - Toque na solução de anticorpos primária dos slides.
- Solte 50 μL de PBS no círculo do slide e toque. Repita uma vez.
- Adicione solução de anticorpos secundários (diluir anticorpos secundários em PBS com 0,02% Polisorba 20) no círculo do slide e incubar à temperatura ambiente por 1h no escuro.
- Solte 50 μL de PBS no círculo do slide e toque. Repita uma vez.
- Adicione 50 μL de dapi (concentração de estoque é de 0,1 μg/mL) por 5 min e bata fora.
- Adicione 1-2 gotas de mídia de montagem nos slides. Cubra cuidadosamente a mídia de montagem com um copo de cobertura e pressione suavemente o vidro de cobertura para remover mídia extra de montagem e bolha de ar. Os slides estão prontos para avaliação de microscopia.
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Representative Results
Um resultado representativo deste protocolo de classificação é mostrado na Figura 3. O tempo total de triagem de dois testículos (um rato) é geralmente em torno de 3 horas, o que depende da concentração da suspensão celular e da velocidade de classificação. Após a triagem, a pureza dos espermatocitodos é confirmada pela imunossuagem de SYCP3 e γH2AX (Figura 3A). As frações representativas de L/Z, P, D espermatocyte estão em torno de 80,4%, 90,6% e 87,6%, respectivamente(Figura 3C). Determinamos as subestás com base nos critérios que publicamos anteriormente19. Resumidamente, no estágio leptoteno e zigoteno, a sinapse entre cromossomos homólogos é incompleta, que é indicada por fios finos de coloração SYCP3. Amplos domínios γH2AX são observados em toda a cromatina nuclear devido a quebras programadas de DNA de dois fios. No estágio paquiteno, cromossomos homólogos têm completamente sinápsia, e γH2AX se acumula especificamente nos cromossomos sexuais. Na fase diploteno, cromossomos homólogos progressivamente sofrem desynapsis. A pureza do RS é confirmada pelo núcleo de coloração com DCV(Figura 3B). O RS pode ser precisamente julgado com a coloração do DNA: um cromocentro único daPI-intenso cercado por eucromatina; ou combinar com marcadores específicos, como o Sp56 que é expresso dentro do grânulo acrosomal em desenvolvimento da variante espertóide e histona H1T que é altamente expressa no núcleo após o estágio médio de paquiteno(Figura 3B).
A pureza rs é em torno de 90,1% após a classificação (Figura 3C). O tamanho amostral da análise da pureza é de mais de 1.000 células para cada experimento; a pureza das populações de L/P e D é média de 6 experimentos independentes; a pureza das populações de P e RS é média de 3 experimentos independentes. A viabilidade dessas células isoladas é geralmente superior a 95%(Figura S1). O rendimento total de cada fração de um único rato adulto é estimado e listado na Fig 3C, que fornece células suficientes para várias análises a jusante. Recentemente, usamos este protocolo para isolar espermatotocitotas de paquitene de tipo selvagem para análise de ChIP-seq20,21.
| Reagente | Ingrediente | Concentração de estoque | Volume |
| (Base HBSS) | |||
| Tampão de dissociação | DMEM | - | 2 ml |
| (Base DMEM) | Fbs | - | 40 μl |
| Hialuronidase | 100 mg/ml | 30 μl | |
| DNase I | 10 mg/ml | 50 μl | |
| Colagenase Tipo I | 100 mg/ml | 40 μl | |
| Colagenase recombinante | 14000 unidade/ml | 100 μl | |
| Tampão FACS | Pbs | - | 980 ml |
| (base PBS) | Fbs | - | 20 ml |
Tabela 1: Receita de Reagente. O tampão de dissociação deve ser preparado antes do uso. DMEM pré-inaque antes de iniciar a dissecção. Os estoques de enzimas podem ser preparados a qualquer momento antes do experimento e armazenados a -20 °C. O buffer FACS precisa ser filtrado a vácuo e armazenado a 4 °C; pré-aquecimento à temperatura ambiente antes do uso.
Figura 1: Fluxo de trabalho de isolamento de células estogênicas de murina na classificação baseada em DCV. Esta imagem ilustra o procedimento geral, desde a dissociação tecidual até a triagem FACS, até a colheita de células espermatogênicas isoladas dentro de um dia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Análise FACS de células testiculares murinas adultas baseadas na fluorescência dcv e dispersão de luz. (A) Adquiriu células não manchadas na primeira década de uma trama de histograma azul DCV (lado esquerdo da barra vermelha). (B) (C) Detritos e células não únicas excluídas pela dispersão da luz. (D) Exclusão de células e populações laterais sem manutenção com base na fluorescência dcv. (E) determinação de conteúdo de DNA com base na fluorescência azul DCV. O pico esquerdo (verde) e o pico direito (rosa) correspondem a populações de 1C e 4C. (F) Gating em populações testiculares 1C e 4C com base na fluorescência dcv-azul/DCV-vermelho. (G) Gating preciso em populações testiculares 4C. (H) Back-gating do Portão 4C da trama DCV em um gráfico FSC/BSC. Com base em regiões de sobreposição mínima no lote FSC/BSC, os portões L/Z, P e D são criados para enriquecer suas respectivas populações de espermatocytos. (I) Gráfico de pontos coloridos mostrando as populações L/Z, P e D estão em ordem contínua dentro do Portão 4C. (J) Back-gating do Portão 1C do gráfico DCV em um gráfico FSC/BSC. O portão RS foi criado para enriquecer a população espercida redonda com tamanho uniforme, resultando em maior pureza das populações durante a triagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagens de resultados representativos e estatísticas de células espermatogênicas obtidas a partir da triagem. (A) Caracterização da imunofluorescência de espermatocitodos ordenados. Painel superior: Coloração DCV mostrando padrão de núcleo dos espermatocitotas vivos logo após a triagem; L/Z (leptoteno/zygotene), P (pachytene) e D (diploteno). Painel inferior: Confirmação de subestácticos meioticos para cada população por imunosmunagem para SYCP3 (verde) e γH2AX (vermelho). (B) Imagem do REPRESENTANTE DCV mostrando o padrão do núcleo de RS. Barras de escala: 50 μm (painéis superiores) e 10 μm (painéis ampliados inferiores). Painéis certos: Confirmação de imunofluorescência de espermatóides redondos manchados com Sp56 e H1T. (C) A pureza de L/Z, P e D foram confirmadas por imunostaining, o tamanho da amostra foi superior a 1.000 células para cada experimento independente, no total de 6 experimentos independentes. A pureza do RS foi confirmada pela coloração do núcleo com um total de 3 experimentos independentes. O número total de células da suspensão de células testiculares de um rato WT B6 de 8 semanas de idade era de cerca de 100 milhões de células antes da triagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura S1: A viabilidade de espermatodos de paquiteno isolados. Uma imagem representativa mostra a viabilidade celular de espermatos de paquitene isolados (Vermelho: PI; Azul: DCV). Pi não pôde ser combinado com DCV durante a triagem. No entanto, sob microscópio, o sinal vermelho DCV era bastante baixo; portanto, as células mortas pi-positivas foram facilmente distinguidas de outras células vivas. A viabilidade geralmente é superior a 95%. Barras de escala: 10 μm. Clique aqui para baixar este número.
Figura S2: Dissociação incompleta ou detritos perturbam o gating. A população A (círculo vermelho) contém detritos e polímeros de espermatóides (indicados por seta). A população maior de A atravessará com a população B (círculo amarelo) e eventualmente contaminará a população 4C. Barras de escala: 200 μm. Clique aqui para baixar este número.
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Discussion
Aqui apresentamos um protocolo prático e simples para isolar subpopulações de espermatotozóides e espermatóides de um único rato adulto. Para garantir a reprodutibilidade deste protocolo, existem algumas etapas críticas que precisam de atenção. Antes da digestão enzimápica, a etapa de lavagem visa remover células intersticiais; após a digestão, esta etapa ajuda a remover espermatozoides e detritos. Lavar/centrifugar 3 vezes é importante. Em nossa receita tampão de dissociação, a combinação de várias enzimas diferentes facilita a dissociação de testículos na suspensão unicelular sem danos celulares excessivos. A tubulação suave para evitar causar bolhas de ar também ajuda a proteger a integridade celular. Verifique a suspensão da célula sob um microscópio após a dissociação para garantir que a suspensão atinja o nível de célula única. A dissociação incompleta ou a contaminação dos detritos por digestão excessiva afetarão a pureza das células classificadas; como mostrado na Figura S2, a população vertical contém detritos e tetramer de espermatóides. A coloração dcv requer incubação no escuro e sem lavagem depois.
Para solucionar possíveis dificuldades na gating e back-gating de subpopulações de espermatocitocitos, como opção de otimização, recomendamos o uso de um rato tipo selvagem sincronizado para ajudar a localizar um estágio específico de espermatos22,23,24. Também vale a pena notar que algumas cepas de camundongos com fenótipos de prisão de espermatogênese podem ter perfis inusitantes de DCV porque estão perdendo algumas subpopulações. O controle adequado do tipo selvagem é fortemente recomendado neste caso. Além disso, este protocolo pode ser potencialmente aplicado a camundongos adultos de qualquer idade. No entanto, a idade do camundongo experimental pode ser um fator de confusão devido à proporção variável de células germinativas.
Ao longo dos anos, vários protocolos para purificar células germinativas foram desenvolvidos. Como um dos métodos mais populares, a sedimentação de velocidade STA-PUT separa as células germinativas pelo gradiente BSA e proporciona um bom rendimento de células germinativas intactas6,7. No entanto, o STA-PUT não só requer dispositivos especiais que podem não estar prontamente disponíveis para muitos laboratórios, mas também é demorado e trabalhoso para conduzir em uma sala fria a 4 °C. Ao contrário do STA-PUT, que é adequado para a separação em larga escala, este método baseado em FACS poderia fornecer alta pureza e fração precisa para um experimento em pequena escala. Uma classificação em larga escala usando nosso protocolo é possível, mas prolongará significativamente o tempo de triagem e pode comprometer a viabilidade celular. Portanto, o STA-PUT ainda é uma opção prática quando um grande número de células é necessário5,25,26.
Em comparação com o método FACS anterior baseado na coloração de corante Ho3428,9,10,11,nosso protocolo utiliza o DCV, que possui um espectro de excitação mais amplo e pode ser aplicado à maioria dos classificadores FACS atuais equipados com um laser UV ou 405 nm violeta18. Embora exista outro protocolo usando DCG14,15,16,17, a diferença entre nosso protocolo e o protocolo DCG é que nosso protocolo DCV usa separação bidimensional com azul DCV e vermelho DCV, imitando a vantagem do protocolo Ho342. Com essa vantagem, nosso protocolo DCV nos permite isolar células germinativas altamente enriquecidas de testíis adultos. O protocolo DCG não emprega separação bidimensional e é recomendado para o isolamento de células germinativas de camundongos juvenis. A separação bidimensional pode ter melhor resolução para separar os subestácias dos espermatocitotas. No entanto, nosso método ainda é incapaz de isolar os espermatos de leptoteno e zigotina separadamente, bem como tipos de células "2C", incluindo espermatogonia, espermatocitotes pré-lotodona e espermatocitotas secundários.
Uma vez que o amplo espectro de emissões da mancha de DCV causa vazamento para outros canais, a maioria dos corantes de viabilidade celular como PI e 7AAD não podem ser combinados devido a sinais falsos positivos. Outros corantes de viabilidade celular com emissão em canais vermelhos ou quase infravermelhos podem valer a pena tentar no futuro. Mas em nossa experiência, células classificadas geralmente mostram ≥ viabilidade de 95% após 2 horas de classificação FACS(Figura S1),o que é suficiente para análise a jusante.
Células classificadas obtidas a partir de nosso procedimento podem ser usadas para vários experimentos a jusante, incluindo análise de sequenciamento de próxima geração (RNA-seq, ATAC-seq e ChIP-seq). As células obtidas aqui também podem ser usadas para a cultura de curto prazo27. Em conclusão, fornecemos um protocolo simples, mas eficiente, incluindo um procedimento de preparação de suspensão unicelular de uma hora e a estratégia detalhada de gating para FACS com base na coloração de corante DCV, que é adequada para o isolamento de células espermatogênicas de pequena escala e pode ser rapidamente adotada por muitos pesquisadores, até mesmo iniciantes de citometria de fluxo.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses concorrentes.
Acknowledgments
Agradecemos aos membros dos laboratórios Namekawa, Yoshida e Maezawa pela ajuda; Katie Gerhardt para a edição do manuscrito; Mary Ann Handel por compartilhar o anticorpo H1T, o Núcleo de Citometria de Fluxo de Fluxo do Hospital Infantil de Cincinnati (CCHMC) para compartilhar os equipamentos FACS suportados pelo NIH S10OD023410; Subvenção em Auxílio para Pesquisa Científica (KAKENHI; 17K07424) para T.N.; Bolsa de Pós-Doutorado da Fundação Lalor para a A.S.; AMED-CREST (JP17gm110005h0001) para S.Y.; o Projeto de Pesquisa Grant pela Divisão de Serviços de Pesquisa da Universidade de Azabu, Programa de Branding de Pesquisa da Universidade Privada (2016-2019), Grant-in-Aid for Research Activity Start-up (19K21196), Takeda Science Foundation (2019) e a Uehara Memorial Foundation Research Incentive Grant (2018) para S.M.; Instituto Nacional de Saúde R01 GM122776 para S.H.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml tube | Watson | 131-7155C | |
| 100 mm Petri dish | Corning, Falcon | 351029 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Watson | 1332-015S | |
| 5 ml polystyrene tube with cell strainer snap cap (35 µm nylon mesh) | Corning, Falcon | 352235 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Watson | 1342-050S | |
| 60 mm Petri dish | Corning, Falcon | 351007 | |
| 70 µm nylon mesh | Corning, Falcon | 352350 | |
| Cell sorter | Sony | SH800S | |
| Centrifuge | |||
| Collagenase, recombinant, Animal-derived-free | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 036-23141 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington | LS004196 | |
| Cover glass | Fisher | 12-544-G | |
| Cytospin 3 | Shandon | ||
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Fisher | D1306 | working concentration: 0.1 μg/mL |
| Dnase I | Sigma | D5025-150KU | |
| Donkey serum | Sigma | S30-M | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11885076 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| Histone H1t antibody | gift from Mary Ann Handel | 1/2000 diluted | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Gibco | 14175095 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H3506-1G | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P5493-4L | |
| Pipettemen | |||
| ProLong Gold Antifade Mountant | Fisher | P36930 | |
| rH2AX antibody | Millipore | 05-635 | working concentration: 2 μg/mL |
| Sperm Fertilization Protein 56 (Sp56) antibody | QED Bioscience | 55101 | working concentration: 0.5 μg/mL |
| Sterilized forceps and scissors | |||
| Superfrost /Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | |
| SYCP3 antibody | Abcam | ab205846 | working concentration: 5 μg/mL |
| TWEEN 20 (Polysorbate 20) | Sigma | P9416 | |
| Vybrant DyeCycle Violet Stain (DCV) | Invitrogen | V35003 | |
| Water bath |
References
- Griswold, M. D. Spermatogenesis: The Commitment to Meiosis. Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).
- Yoshida, S. Mouse Spermatogenesis Reflects the Unity and Diversity of Tissue Stem Cell Niche Systems. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 036186 (2020).
- Rathke, C., Baarends, W. M., Awe, S., Renkawitz-Pohl, R. Chromatin dynamics during spermiogenesis. Biochimica et Biophysica Acta. 1839 (3), 155-168 (2014).
- Maezawa, S., et al. SCML2 promotes heterochromatin organization in late spermatogenesis. Journal of Cell Science. 131 (17), 217125 (2018).
- Maezawa, S., Yukawa, M., Alavattam, K. G., Barski, A., Namekawa, S. H. Dynamic reorganization of open chromatin underlies diverse transcriptomes during spermatogenesis. Nucleic Acids Research. 46 (2), 593-608 (2018).
- Bellve, A. R. Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods in Enzymology. 225, 84-113 (1993).
- Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation. Journal of Visualized Experiments. (80), e50648 (2013).
- Gaysinskaya, V., Bortvin, A. Flow cytometry of murine spermatocytes. Current Protocols in Cytometry. 72, (2015).
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry Part A. 65 (1), 40-49 (2005).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. Journal of Visualized Experimments. (50), e2602 (2011).
- Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes. Cytometry Part A. 85 (6), 556-565 (2014).
- Romer, K. A., de Rooiji, D. G., Kojima, M. L., Page, D. C. Isolating mitotic and meiotic germ cells from male mice by developmental synchronization, staging, and sorting. Developmental Biology. 443 (1), 19-34 (2018).
- Lam, K. G., Brick, K., Cheng, G., Pratto, F., Camerini-Otero, R. D. Cell-type-specific genomics reveals histone modification dynamics in mammalian meiosis. Nature Communications. 10 (1), 3821 (2019).
- Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. Flow Cytometry for the Isolation and Characterization of Rodent Meiocytes. Methods in Molecular Biology. 1471, 217-230 (2017).
- da Cruz, I., et al. Transcriptome analysis of highly purified mouse spermatogenic cell populations: gene expression signatures switch from meiotic-to postmeiotic-related processes at pachytene stage. BMC Genomics. 17, 294 (2016).
- Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye. MethodsX. 1, 239-243 (2014).
- Trovero, M. F., et al. Revealing stage-specific expression patterns of long noncoding RNAs along mouse spermatogenesis. RNA Biology. 17 (3), 350-365 (2020).
- Telford, W. G., Bradford, J., Godfrey, W., Robey, R. W., Bates, S. E. Side population analysis using a violet-excited cell-permeable DNA binding dye. Stem Cells. 25 (4), 1029-1036 (2007).
- Alavattam, K. G., Abe, H., Sakashita, A., Namekawa, S. H. Chromosome Spread Analyses of Meiotic Sex Chromosome Inactivation. Methods in Molecular Biology. 1861, 113-129 (2018).
- Maezawa, S., et al. Super-enhancer switching drives a burst in gene expression at the mitosis-to-meiosis transition. Nature Structural & Molecular Biology. , (2020).
- Sakashita, A., et al. Endogenous retroviruses drive species-specific germline transcriptomes in mammals. Nature Structural & Molecular Biology. , (2020).
- Agrimson, K. S., et al. Characterizing the Spermatogonial Response to Retinoic Acid During the Onset of Spermatogenesis and Following Synchronization in the Neonatal Mouse Testis. Biology of Reproduction. 95 (4), 81 (2016).
- Hogarth, C. A., et al. Turning a spermatogenic wave into a tsunami: synchronizing murine spermatogenesis using WIN 18,446. Biology of Reproduction. 88 (2), 40 (2013).
- Patel, L., et al. Dynamic reorganization of the genome shapes the recombination landscape in meiotic prophase. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (3), 164-174 (2019).
- Alavattam, K. G., et al. Attenuated chromatin compartmentalization in meiosis and its maturation in sperm development. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (3), 175-184 (2019).
- Adams, S. R., et al. RNF8 and SCML2 cooperate to regulate ubiquitination and H3K27 acetylation for escape gene activation on the sex chromosomes. PLoS Genetics. 14 (2), 1007233 (2018).
- Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis. Developmental Biology. 169 (2), 557-567 (1995).
