Summary
Här presenterar vi en enkel och effektiv metod för att isolera levande meiotiska och post-meiotiska könsceller från vuxna mustestes. Med hjälp av en lågcyttoxicitet, violett-upphetsad DNA bindande färgämne och fluorescens-aktiverad cell sortering, kan man isolera högberikad spermatogenic cell populationer för många nedströms applikationer.
Abstract
Isolering av meiotiska spermatocyter är avgörande för att undersöka molekylära mekanismer som ligger bakom meios och spermatogenes. Även om det finns etablerade cellisoleringsprotokoll med hjälp av Hoechst 33342-färgning i kombination med fluorescens-aktiverad cellsortering, kräver det cellsorterare utrustade med en ultraviolett laser. Här beskriver vi en cell isolering protokoll med hjälp av Stainen DyeCycle Violet (DCV) , en låg cytotoxicitet DNA bindande färgämne strukturellt liknar Hoechst 33342. DCV kan vara upphetsad av både ultraviolett och violetta lasrar, vilket förbättrar flexibiliteten i utrustning val, inklusive en cell sorterare inte utrustad med en ultraviolett laser. Med hjälp av detta protokoll kan man isolera tre live-cell subpopulationer i meiotiska prophase jag, inklusive leptotene/zygotene, pachytene och diplotene spermatocyter, samt post-meiotic runda spermatider. Vi beskriver också ett protokoll för att förbereda encellsfjädring från mustestes. Sammantaget kräver proceduren en kort tid för att slutföra (4-5 timmar beroende på antalet nödvändiga celler), vilket underlättar många nedströms applikationer.
Introduction
Spermatogenes är en komplex process där en liten population av spermatogariella stamceller upprätthålla kontinuerlig produktion av ett stort antal spermier under hela vuxenlivet1,2. Under spermatogenesen sker dynamisk kromatin remodeling när spermatogenic celler genomgår meios att producera haploid spermatider3,4,5. Isolering av meiotiska spermatocyter är avgörande för molekylär undersökning, och flera olika tillvägagångssätt för att isolera meiotiska spermatocyter har fastställts, inklusive sedimenteringsbaserad separation6,7 och fluorescens-aktiverad cellsortering (FACS)8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. Dessa metoder har dock tekniska begränsningar. Medan sedimenteringsbaserad separation ger ett stort antal celler5,6,7, är det arbetsintensivt. Den etablerade FACS-baserade metoden använder Hoechst 33342 (Ho342) för att separera mejotiska spermatocyter baserade på DNA-innehåll och ljusspridningsegenskaper och kräver FACS-cellsorterare utrustade med en ultraviolett (UV) laser8,9,10,11. Alternativa FACS-baserade metoder kräver transgena muslinjer som uttrycker fluorescerande proteiner, synkronisering av spermatogenes12, eller cellfixering och antikroppsmärkning som inte är kompatibel med isolering av levande celler13. Medan det finns en annan alternativ metod med hjälp av en cell-permeabel DNA bindande färgämne, DyeCycle Grön fläck14,15,16,17, Denna metod rekommenderas för isolering av spermatogenic celler från juvenila testis. Därför finns det ett kritiskt behov av att utveckla en enkel och robust isoleringsmetod för levande meiotiska spermatocyter som kan appliceras på alla musstam i alla åldrar och som kan utföras med hjälp av alla FACS-cellsorterare.
Här beskriver vi en sådan länge sökt cell isolering protokoll med hjälp av DyeCycle Violet (DCV) fläcken. DCV är en låg cytotoxicitet, cell-permeabelt DNA bindande färgämne strukturellt liknar Ho342 men med en excitation spektrum skiftat mot det violetta intervallet18. Dessutom har DCV ett bredare utsläppsspektrum jämfört med DCG. Således kan det vara upphetsad av både UV och violetta lasrar, vilket förbättrar flexibiliteten i utrustning, vilket möjliggör användning av en FACS cell sorterare inte utrustad med en UV-laser. DCV-protokollet som presenteras här använder tvådimensionell separation med DCV blå och DCV röd, härma fördelen med Ho342-protokollet. Med denna fördel, vår DCV protokoll tillåter oss att isolera högberikad könsceller från den vuxna testis. Vi ger en detaljerad gating protokoll för att isolera levande spermatogenic celler från vuxna mus testikel av en mus (från två testikel). Vi beskriver också ett effektivt och snabbt protokoll för att förbereda encellsfjädring från mustestes som kan användas för denna cellisolering. Förfarandet kräver en kort tid att slutföra (beredning av encellsupphängning - 1 timme, färgfärgning - 30 min, och cellsortering - 2-3 timmar: totalt - 4-5 timmar beroende på antalet nödvändiga celler; Bild 1). Efter cellisolering kan ett brett spektrum av nedströms applikationer inklusive RNA-seq, ATAC-seq, ChIP-seq och cellkultur slutföras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll följer riktlinjerna från kommittén för institutionsdjursvård och användning (protokoll nr. IACUC2018-0040) på Cincinnati Children's Hospital Medical Center.
1. Utrustning och reagensinställning för beredning av testikelcellsupphängning
- Förbered varje enzymlager i 1x Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) och förvara vid -20 °C. (Tabell1).
OBS: Förbered när som helst före experimentet. - En dag före försöket: Coatsamlande rör (1,5 mL rör) med Fetalt bovinserum (FBS) vid 4 °C över natten.
- På dagen för experimentet: Ställ in vattenbadet till 37 °C.
- Förvarva Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) vid 37 °C och bered 2 mL 1x dissociationsbuffert för varje provrätt före användning (Tabell 1) i 15 mL centrifugeringsrör.
OBS: 2 mL dissociationsbuffert är förberedd för två testi. För receptet för dissociationsbuffert hänvisas till tabell 1.
2. Animal dissekering och beredning av testikelcell suspension
- Offra en 8 veckor gammal manlig mus genom att lämna i en koldioxidkammare i minst 10 min.
- Ta bort båda testiklen och placera på en 60 mm Petri-skål innehållande 2 mL iskall fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Ta bort tunica albuginea från testiken. Något skingra seminiferous tubules genom att försiktigt separera med tärnor.
- Överför seminiferous tubules till en 100 mm Petri skålen med en ny droppe iskall PBS och reda ut seminiferous tubuli försiktigt med tärnor. Upprepa denna tvätt 3 gånger för att ta bort interstitial celler så mycket som möjligt.
- Inkubera untangled seminiferous tubuli i ett 15 mL rör som innehåller 2 mL dissociation buffert vid 37 °C för 20 min.
- Försiktigt pipettera tubulina 20 gånger med hjälp av en 1000 μL mikropipette.
- Inkubera i 6 min. Upprepa mild pipettering 20 gånger.
- Inkubera i 3 min. Upprepa mild pipettering 10 gånger tills inga synliga bitar kvar.
- Lägg till 10 mL FACS-buffert till suspensionen. Centrifugera i 300 x g i 5 min i rumstemperatur och kassera supernatanten.
- Upprepa steg 2,9 två gånger för att ta bort spermatozoa och så mycket skräp som möjligt.
3. Cellfärgning
- Resuspend cell pelleten med 3 mL AVS-buffert (tabell 1) och filtrera cellupphängningen genom en 70 μm nyloncellsil i ett 50 mL-rör.
OBS: Den förväntade cellavkastningen är cirka 100 miljoner celler per två testiklar (från en 8 veckor gammal B6-vild-typ mus). - Räkna cellnummer och dela upp 10% av cellerna i ett nytt rör som den obefläckade negativa kontrollen och lämna på is.
- Tillsätt 6 μL DCV-fläck (den ursprungliga koncentrationen är 5 mM) till den återstående cellupphängningen och blanda väl. Den slutliga koncentrationen är 10 μM, och kapaciteten är cirka 100 miljoner celler.
- Inkubera vid 37 °C i 30 min i mörker. Skaka försiktigt cellupphängningen var 10:e min.
- Efter inkubation, utan tvättsteg, tillsätt direkt 5 μL DNase I (lagerkoncentrationen är 10 mg/mL) till cellfjädringen och filtrera cellerna i ett 5 mL FACS-rör genom 35 μm nätlocket i nylon. Förvara proverna på is tills sortering.
4. Flödescytometri och experimentella grindar
- Förbered FACS-cellsorteraren. Se till att FACS cellsorterare är utrustad med Excitation-optik: Violett (405-nm) laser; Detektionsoptik: filterkombination av 450/50 bandpass [samma filteruppsättning av 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) för DCV-blå detektion] och 665/30 bandpass [samma filteruppsättning av Allophycocyanin (APC) för DCV-röd detektion]. Här använder vi Sony SH800S cell sorterare som exempel.
- Skapa ett nytt experiment och ställ in följande arbetsritningar som visar parametrar som ska optimeras: Klicka på "Ny densitet" på menyraden "Kalkylbladsverktyg" för att skapa en framåtspridd - område (FSC-A) jämfört med bakåt scatter – area (BSC-A) densitetsrit på en linjär skala. Klicka på "Nytt histogram" om du vill skapa ett DCV-blått histogram-plot på logaritmisk skala.
- Helt kort vortexa den ofläckade negativa kontrollen (från steg 3.2) och ladda provet.
- Klicka på "Start" och "Record" om du vill börja bearbeta det obefläckade provet. Medan provet är igång klickar du på "Detektor & Tröskelinställningar" för att optimera FSC- och BSC-spänningarna genom att justera både spänningarna för fotomultiplierrör (PMT) uppåt eller nedåt för att placera de ouppnåeliga cellerna på FSC/BSC-tomtens skala.
- Justera PMT-spänningen uppåt och nedåt på "FL1: DAPI" medan provet körs för att lokalisera positionen för den DCV-negativa populationen under det första årtiondet av det DCV-blåa histogrammet logaritmisk tomt (Bild 2A). Efter att du har slutfört JUSTERINGEN FÖR PMT-spänning klickar du på "Stopp" för att lossa det ej uppsnövade provet.
- Kort vortexa provet (från steg 3.5) och ladda provet.
- Klicka på "Next Tube" om du vill skapa ett nytt kalkylblad för det DCV-inmålade provet; och klicka på "Start" och " Record "föratt förvärva det DCV-färgade provet, spela ≥ 1 x 106 händelser. Lägg till följande arbetsritningar: Klicka på "New Density" på menyraden "Kalkylbladsverktyg" för att skapa en FSC-H (höjd) jämfört med FSC-W (bredd)täthetsytter på en linjär skala; Klicka på" New Density" (Ny densitet) om du vill skapa en DCV-blå kontra DCV-röd täthetsritning på en linjär skala. Klicka på " Stopp " ≥ 1 x 106 händelser efter att ha spelat in händelser som har spelats in och lossat provet.
- På FSC-A vs. BSC-A densitetsriten klickar du på "Polygon" på menyraden "Plot Tools" för att rita en stor grind "Celler" för att inkludera de flesta celler och utesluta små skräp (Figur 2B). Applicera grinden "Celler" på FSC-H vs. FSC-W densitetsrit. Klicka på "Rektangel" för att rita en "Single Cells" -grind för att utesluta icke-enstaka celler (Bild 2C).
- Applicera "Single Cells" -grinden på DCV-blå kontra DCV-röd densitetsrit och justera skalan för att fånga en utökad profil enligt bild 2D. Klicka på "Polygon" på menyraden "Plot Tools" för att rita en "DCV" -grind för att utesluta de obefläckade cellerna och sidopopulationen (Figur 2D).
- Applicera "DCV" -grind på DCV-blå histogram-plot på en linjär skala. De tre stora topparna avser olika DNA-innehåll: 1C, 2C och 4C (Figur 2E).
- Klicka på "New Density" för att skapa en DCV-blå kontra DCV-röd densitetsrit på en linjär skala och tillämpa "DCV" gate för att utföra tillbaka gating från figur 2E för att lokalisera 1C och 4C populationer (Bild 2F). Klicka på "Ellipse" för att rita en grind på 1C-populationen, som ligger inom ett kondenserat område (gate 1C). Klicka på "Polygon" för att rita en grind på 4C-populationen som är en kontinuerlig kurva (gate 4C).
- Klicka på "New Density" för att skapa en DCV-blå vs. DCV-röd densitetsrit på en linjär skala och tillämpa "4C" gate; justera skalan för att zooma in och klicka på "Polygon" för att rita en "4C_1" grind för mer exakt markering (Bild 2G).
- Klicka på "New Density" för att skapa en ny FSC-A vs. BSC-A densitetsrit på en linjär skala och tillämpa "4C_1" gate; det kommer att finnas tre berikade populationer åtskilda av storlek som motsvarar leptotene (L) /zygoten (Z), pachytene (P) och diploten (D) spermatocyter. Klicka på "Polygon" eller "Ellipse" för att rita 3 grindar: "L/Z", "P" och "D" baserat på den växande storleken (Figur 2H).
- Klicka på "New Dot Plot" för att skapa en DCV-blå vs. DCV-röd färgpunktsyt på en linjär skala för att applicera grind och se till att de tre populationerna är i en kontinuerlig ordning inom "4C_1" gate ( Bild2I).
- På samma sätt, för 1C befolkningen, klicka på "New Density" för att skapa en ny FSC-A vs. BSC-A densitet tomt på en linjär skala och tillämpa "1C" gate, välj enhetlig storlek av celler som ren runda spermatid befolkningen, och klicka på "Ellipse" för att rita en "RS" gate (Figur 2J).
5. Sortera manliga könscellsunderpopulationer
- Förbered 1,5 mL rör som innehåller 500 μL 50% FBS för celluppsamling och ladda uppsamlingsröret i kollektorn och klicka på "Load Collection".
- Klicka på "Next Tube", "Start", "Record" och "Sort Start". För att använda ett tvåvägssystem som gör att två populationer av intresse kan sorteras samtidigt i insamlingsanordningen, följ parvis kombinationer: leptotene (L) / zygoten (Z) och pachytene (P) spermatocyter baserade på L / Z och P back-grindar; Runda spermatider (RS) och diploten (D) spermatocyter baserade på RS och D back-grindar.
- Medan provet körs justerar du flödeshastigheten till ~3000 events/s för att få den mest effektiva sorteringen.
6. Renhetsanalys av sorterade celler
- Samla ≥ 10 000 celler/varje population. Utför cellimmunfärgning för att bekräfta delmängden.
- Centrifugera vid 300 x g i 5 min vid 4 °C och kassera försiktigt supernatanten, med kvarsehåll runt 110 μL av vätskan i botten av röret.
- Ta en 10 μL droppe cell suspension att observera under mikroskop och utvärdera översikt cell morfologi och antal.
- Applicera 100 μL cellupphängning på var och en av provkammarens objektglas (se Tabell över material), och ladda kamrarna på Cytospin.
- Snurra proverna i 30 x g i 5 min i rumstemperatur. Rita en cirkel runt cellen med en hydrofoba penna. Torra rutschkanor på labbbänk i några minuter i rumstemperatur.
- Droppa 50 μL PBS i cirkeln av bilden och knacka av.
- Tillsätt primär antikroppslösning (Späd primära antikroppar med 5% Donkey Serum i PBS med 0,02% Polysorbat 20) i cirkeln av objektglaset och inkubera vid 4 °C över natten.
OBS: För att bedöma underordnat meiotiska spermatocyter, SYCP3 upptäcktes, som är en markör för meiotiska kromosom axlar, och γH2AX, som är en markör för DNA-skador svar. (För antikroppen arbetskoncentrationen, hänvisastill tabellen över material ). - Knacka av den primära antikroppslösningen från objektglasen.
- Droppa 50 μL PBS i cirkeln av bilden och knacka av. Upprepa en gång.
- Lägg till sekundär antikroppslösning (späd sekundära antikroppar i PBS med 0,02% Polysorbat 20) i cirkeln av objektglaset och inkubera i rumstemperatur i 1 h i mörker.
- Droppa 50 μL PBS i cirkeln av bilden och knacka av. Upprepa en gång.
- Tillsätt 50 μL DAPI (lagerkoncentrationen är 0,1 μg/mL) fläck i 5 min och knacka av.
- Tillsätt 1-2 droppar monteringsmedia på objektglasen. Täck försiktigt över monteringsmediet med ett täckglas och tryck försiktigt på täckglaset för att ta bort extra monteringsmedia och luftbubbla. Bilderna är klara för mikroskopiutvärdering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett representativt resultat av detta sorteringsprotokoll visas i figur 3. Den totala sorteringstiden för två testikörare (en mus) är vanligtvis runt 3 timmar, vilket är beroende av koncentrationen av cellupphängning och sorteringshastigheten. Efter sortering bekräftas renheten hos spermatocyter genom immunfärgning av SYCP3 och γH2AX (figur 3A). Den representativa renheten för sorterade L/Z, P, D-spermatocytefraktioner är omkring 80,4 %, 90,6 % respektive 87,6 % (figur 3C). Vi har fastställt underordnorna baserat på de kriterier vi publicerade tidigare19. Kortfattat, i leptotene och zygoten skede, synaps mellan homologa kromosomer är ofullständig, vilket indikeras av tunna trådar av SYCP3 färgning. Breda γH2AX domäner observeras i hela kärnkromatin på grund av programmerade DNA dubbelsträngsbrott. I pachytenstadiet har homologa kromosomer synapsat helt, och γH2AX ackumuleras specifikt på könskromosomerna. I diplotenstadiet genomgår homologa kromosomer successivt desynaps. Renheten hos RS bekräftas genom nucleusfärgning med DCV (Bild 3B). RS kan exakt bedömas med DNA-färgning: ett unikt DAPI-intensivt kromocentrum omgivet av euchromatin; eller kombinera med specifika markörer, såsom Sp56 som uttrycks inom det utvecklande akrosomala granulatet av spermatid och histonvariant H1T som är mycket uttryckt i cellkärnor efter mellanspachytenstadiet (Figur 3B).
RS renhet är runt 90,1% efter sortering (Figur 3C). Provstorleken på renhetsanalysen är över 1 000 celler för varje experiment; renheten hos L/P- och D-populationer är i genomsnitt från 6 oberoende experiment, renheten hos P och RS populationer är i genomsnitt från 3 oberoende experiment. Livskraften hos dessa isolerade celler är vanligtvis över 95% (Figur S1). Det totala utbytet av varje fraktion från en enda vuxen mus uppskattas och anges i Fig 3C, vilket ger tillräckligt med celler för olika nedströmsanalyser. Nyligen har vi använt detta protokoll för att isolera vild-typ pachytene spermatocyter för ChIP-seq analys20,21.
| Reagens | Ingrediens | Lagerkoncentration | Volym |
| (HBSS-bas) | |||
| Dissociationsbuffert | DMEM | - | 2 ml |
| (DMEM bas) | Fbs | - | 40 μl |
| Hyaluronidase | 100 mg/ml | 30 μl | |
| DNase I | 10 mg/ml | 50 μl | |
| Kollagenas typ I | 100 mg/ml | 40 μl | |
| Rekombinant Kollagenas | 14000 enhet/ml | 100 μl | |
| FACS-buffert | Pbs | - | 980 ml |
| (PBS-bas) | Fbs | - | 20 ml |
Tabell 1: Reagens Recept. Dissociationsbufferten måste förberedas direkt före användning. Förkrigs-DMEM innan dissektion påbörjas. Enzymlagren kan beredas när som helst före försöket och lagras vid -20 °C. FACS-buffert behöver vakuum-filtreras och lagras vid 4 °C; förkrigsgrad till rumstemperatur före användning.
Figur 1: Arbetsflöde av murinspermaatogena celler isolering på DCV-baserad sortering. Denna bild illustrerar det allmänna förfarandet, från vävnadsavsvävning till FACS-sortering, till skörd av isolerade spermatogenic celler inom en dag. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: FACS-analys av testikelceller för vuxna murin baserat på DCV-fluorescens och ljusspridning. (A) Förvärvade obefläckade celler under det första årtiondet av en DCV-blå histogram plot (vänster sida av den röda stapeln). (B) (C) Skräp och icke-encell utesluts genom ljusspridning. (D) Obefläckad cell- och sidopopulationsutestängning baserad på DCV-fluorescens. (E) DNA-innehållsbestämning baserad på DCV-blå fluorescens. Vänster topp (grön) och höger topp (rosa) motsvarar 1C och 4C populationer. (F) Gating på 1C och 4C testikelpopulationer baserade på DCV-blå/DCV-röd fluorescens. (G) Exakt gating på 4C testikelpopulationer. (H) Back-gating av Gate 4C från DCV tomten på en FSC / BSC tomt. Baserat på regioner med minimal överlappning på FSC / BSC tomt, L / Z, P och D grindar skapas för att berika deras respektive spermatocyte populationer. (I) Färg punkt plot som visar L / Z, P och D populationer är i kontinuerlig ordning inom Gate 4C. (J) Back-gating av Gate 1C från DCV tomt på en FSC / BSC tomt. RS gate skapades för att berika runda spermatid befolkningen med enhetlig storlek, vilket resulterar i större renhet av populationer under sortering. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: Representativa resultatbilder och statistik över spermatogena celler som erhålls från sortering. (A) Immunofluorescens karakterisering av sorterade spermatocyter. Övre panel: DCV färgning visar kärnan mönster av de levande spermatocyter direkt efter sortering; L/Z (leptotene/zygoten), P (pachytene), och D (diplotene). Nedre panelen: Bekräftelse av meiotiska undertag för varje population genom immunfärgning för SYCP3 (grön) och γH2AX (röd). (B) Representativ DCV bild som visar kärnan mönster av RS. Skala barer: 50 μm (övre paneler), och 10 μm (nedre förstorade paneler). Höger Paneler: Immunofluorescens bekräftelse av runda spermatider färgas med Sp56 och H1T. (C) Renheten hos L/Z, P, och D bekräftades genom immunfärgning, provstorlek var över 1 000 celler för varje oberoende experiment, totalt 6 oberoende experiment. RS renhet bekräftades av kärnan färgning med totalt 3 oberoende experiment. Det totala cellnumret för testikelcellsupphängningen från en 8 veckor gammal WT B6-mus var omkring 100 miljoner celler före sortering. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur S1: Livsdugligheten hos isolerade pachytenepermaatocyter. En representativ bild visar cellen livskraft isolerade pachytene spermatocyter (Röd: PI; Blå: DCV). PI kunde inte kombineras med DCV under sorteringen. Under mikroskop var dock den DCV-röda signalen ganska låg; därför var PI-positiva döda celler lätt skiljas från andra levande celler. Lönsamheten är vanligtvis över 95%. Skala barer: 10 μm. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Bild S2: Ofullständig dissociation eller skräp stör gating. A-populationen (röd cirkel) innehåller skräp och polymer av spermatider (indikeras med pil). Den större A-befolkningen kommer att korsa med B-populationen (gul cirkel) och så småningom förorena 4C befolkningen. Skala barer: 200 μm. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här presenterar vi ett praktiskt och enkelt protokoll för att isolera subpopulationer av spermatocyter och spermatider från en enda vuxen manlig mus. För att säkerställa reproducerbarheten av detta protokoll finns det några kritiska steg som behöver uppmärksammas. Innan enzym matsmältningen, tvätta steg syftar till att ta bort interstitial celler; efter matsmältningen, detta steg hjälper till att ta bort spermatozoa och skräp. Tvätt/centrifugering 3 gånger är viktigt. I vårt dissociationsbuffertrecept underlättar kombinationen av flera olika enzymer dissociationen av testi ler i den encelliga suspensionen utan alltför stora cellskador. Försiktigt pipettering för att undvika att orsaka luftbubblor hjälper också till att skydda cellernas integritet. Kontrollera cellfjädringen under mikroskop efter dissociation för att se till att suspensionen uppnår encellsnivå. Ofullständig dissociation eller skräp kontaminering från överdriven matsmältning kommer att påverka renhet sorterade celler; som visas i figur S2, den upprätt populationen innehåller skräp och tetramer av spermatider. DCV-färgning kräver inkubation i mörker och ingen tvätt efteråt.
För att felsöka potentiella svårigheter på gating och back-gating av spermatocyte subpopulationer, som ett alternativ för optimering, rekommenderar vi att du använder en synkroniserad vild typ mus för att hjälpa till att lokalisera ett visst stadium av spermatocyter22,23,24. Det är också värt att notera att vissa knockout mus stammar med spermatogenes gripande fenotyper kan ha ovanligt DCV profiler eftersom de saknas några subpopulationer. Korrekt wildtype kontroll rekommenderas starkt i detta fall. Dessutom kan detta protokoll potentiellt tillämpas på vuxna möss i alla åldrar. Men, ålder experimentell mus kan vara en förvirrande faktor på grund av den varierande andelen könsceller.
Under årens lopp har flera protokoll för att rena könsceller utvecklats. Som en av de mest populära metoderna, sta-put hastighet sedimentering separerar könsceller av BSA-gradienten och ger ett bra utbyte av intakta könsceller6,7. STA-PUT kräver dock inte bara speciella anordningar som kanske inte är lätt tillgängliga för många laboratorier utan är också tidskrävande och arbetskrävande att bedriva i ett kylrum vid 4 °C. Till skillnad från STA-PUT, som är lämplig för storskalig separation, kan denna FACS-baserade metod ge hög renhet och exakt fraktion för ett småskaligt experiment. En storskalig sortering med hjälp av vårt protokoll är möjligt men kommer att förlänga sorteringstiden avsevärt och kan äventyra cellernas bärkraft. Därför är STA-PUT fortfarande ett praktiskt alternativ när ett stort antal celler behövs5,25,26.
I jämförelse med den tidigare FACS-metoden baserad på Ho342färgfärgning 8,9,10,11, vårt protokoll utnyttjar DCV, som har en bredare excitation spektrum och kan tillämpas på de flesta nuvarande FACS sorterare utrustade med en UV eller 405 nm violett laser18. Även om det finns ett annat protokoll med hjälp av DCG14,15,16,17, skillnaden mellan vårt protokoll och DCG-protokollet är att vårt DCV-protokoll använder tvådimensionell separation med DCV blå och DCV röd, härma fördelen med Ho342-protokollet. Med denna fördel, vår DCV protokoll tillåter oss att isolera högberikad könsceller från vuxna testis. DCG-protokollet använder inte tvådimensionell separation och rekommenderas för isolering av könsceller från unga möss. Den tvådimensionella separationen kan ha bättre upplösning för att separera undertagen av spermatocyter. Men vår metod är fortfarande oförmögen att isolera leptotene och zygotene spermatocyter separat, liksom "2C" celltyper inklusive spermatogonia, preleptoteen spermatocyter och sekundära spermatocyter.
Eftersom det breda emissionsspektrumet av DCV-fläck orsakar läckande till andra kanaler, kan de flesta av cellens livsdugliga färgämnen som PI och 7AAD inte kombineras på grund av falska positiva signaler. Andra cell livskraft färgämnen med utsläpp i långt röda eller nära infraröda kanaler kan vara värt att försöka i framtiden. Men enligt vår erfarenhet, sorterade celler visar vanligtvis ≥ 95% lönsamhet efter 2 timmar av FACS sortering (Figur S1), vilket är tillräckligt för nedströms analys.
Sorterade celler som erhålls från vårt förfarande kan användas för olika nedströms experiment, inklusive nästa generations sekvensering analys (RNA-seq, ATAC-seq, och ChIP-seq). Celler som erhålls här kan också användas för kortvarig odling27. Sammanfattningsvis ger vi ett enkelt men effektivt protokoll inklusive en timmes encellig suspension förberedelse förfarande och den detaljerade gating strategi för FACS bygger på DCV färgning, som är lämplig för småskaliga spermatogenic cell isolering och kan snabbt antas av många utredare, även flöde cytometriska nybörjare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Vi tackar medlemmar av laboratorierna Namekawa, Yoshida, och Maezawa för deras hjälp; Katie Gerhardt för redigering av manuskriptet; Mary Ann Händel för att dela H1T-antikroppen, Cincinnati Children's Hospital Medical Center (CCHMC) Research Flow Cytometry Core för att dela FACS-utrustning som stöds av NIH S10OD023410; Bidragsbistånd till vetenskaplig forskning (KAKENHI; 17K07424) till T.N.; Lalor Foundation Postdoktorsstipendium till A.S.; AMED-CREST (JP17gm1110005h0001) till S.Y.; forskningsprojektet Grant av Azabu University Research Services Division, Ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik (MEXT)-stödda program för Private University Research Branding Project (2016–2019), Grant-in-Aid for Research Activity Start-up (19K21196), Takeda Science Foundation (2019) och Uehara Memorial Foundation Research Incentive Grant (2018) till S.M.; Medborgareinstitut av vård- R01 GM122776 till S.H.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml tube | Watson | 131-7155C | |
| 100 mm Petri dish | Corning, Falcon | 351029 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Watson | 1332-015S | |
| 5 ml polystyrene tube with cell strainer snap cap (35 µm nylon mesh) | Corning, Falcon | 352235 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Watson | 1342-050S | |
| 60 mm Petri dish | Corning, Falcon | 351007 | |
| 70 µm nylon mesh | Corning, Falcon | 352350 | |
| Cell sorter | Sony | SH800S | |
| Centrifuge | |||
| Collagenase, recombinant, Animal-derived-free | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 036-23141 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington | LS004196 | |
| Cover glass | Fisher | 12-544-G | |
| Cytospin 3 | Shandon | ||
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Fisher | D1306 | working concentration: 0.1 μg/mL |
| Dnase I | Sigma | D5025-150KU | |
| Donkey serum | Sigma | S30-M | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11885076 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| Histone H1t antibody | gift from Mary Ann Handel | 1/2000 diluted | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Gibco | 14175095 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H3506-1G | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P5493-4L | |
| Pipettemen | |||
| ProLong Gold Antifade Mountant | Fisher | P36930 | |
| rH2AX antibody | Millipore | 05-635 | working concentration: 2 μg/mL |
| Sperm Fertilization Protein 56 (Sp56) antibody | QED Bioscience | 55101 | working concentration: 0.5 μg/mL |
| Sterilized forceps and scissors | |||
| Superfrost /Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | |
| SYCP3 antibody | Abcam | ab205846 | working concentration: 5 μg/mL |
| TWEEN 20 (Polysorbate 20) | Sigma | P9416 | |
| Vybrant DyeCycle Violet Stain (DCV) | Invitrogen | V35003 | |
| Water bath |
References
- Griswold, M. D. Spermatogenesis: The Commitment to Meiosis. Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).
- Yoshida, S. Mouse Spermatogenesis Reflects the Unity and Diversity of Tissue Stem Cell Niche Systems. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 036186 (2020).
- Rathke, C., Baarends, W. M., Awe, S., Renkawitz-Pohl, R.
- Maezawa, S., et al. SCML2 promotes heterochromatin organization in late spermatogenesis. Journal of Cell Science. 131 (17), 217125 (2018).
- Maezawa, S., Yukawa, M., Alavattam, K. G., Barski, A., Namekawa, S. H. Dynamic reorganization of open chromatin underlies diverse transcriptomes during spermatogenesis. Nucleic Acids Research. 46 (2), 593-608 (2018).
- Bellve, A. R. Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods in Enzymology. 225, 84-113 (1993).
- Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation. Journal of Visualized Experiments. (80), e50648 (2013).
- Gaysinskaya, V., Bortvin, A.
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry Part A. 65 (1), 40-49 (2005).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. Journal of Visualized Experimments. (50), e2602 (2011).
- Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes. Cytometry Part A. 85 (6), 556-565 (2014).
- Romer, K. A., de Rooiji, D. G., Kojima, M. L., Page, D. C. Isolating mitotic and meiotic germ cells from male mice by developmental synchronization, staging, and sorting. Developmental Biology. 443 (1), 19-34 (2018).
- Lam, K. G., Brick, K., Cheng, G., Pratto, F., Camerini-Otero, R. D. Cell-type-specific genomics reveals histone modification dynamics in mammalian meiosis. Nature Communications. 10 (1), 3821 (2019).
- Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. Flow Cytometry for the Isolation and Characterization of Rodent Meiocytes. Methods in Molecular Biology. 1471, 217-230 (2017).
- da Cruz, I., et al. Transcriptome analysis of highly purified mouse spermatogenic cell populations: gene expression signatures switch from meiotic-to postmeiotic-related processes at pachytene stage. BMC Genomics. 17, 294 (2016).
- Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye. MethodsX. 1, 239-243 (2014).
- Trovero, M. F., et al. Revealing stage-specific expression patterns of long noncoding RNAs along mouse spermatogenesis. RNA Biology. 17 (3), 350-365 (2020).
- Telford, W. G., Bradford, J., Godfrey, W., Robey, R. W., Bates, S. E. Side population analysis using a violet-excited cell-permeable DNA binding dye. Stem Cells. 25 (4), 1029-1036 (2007).
- Alavattam, K. G., Abe, H., Sakashita, A., Namekawa, S. H. Chromosome Spread Analyses of Meiotic Sex Chromosome Inactivation. Methods in Molecular Biology. 1861, 113-129 (2018).
- Maezawa, S., et al. Super-enhancer switching drives a burst in gene expression at the mitosis-to-meiosis transition. Nature Structural & Molecular Biology. , (2020).
- Sakashita, A., et al. Endogenous retroviruses drive species-specific germline transcriptomes in mammals. Nature Structural & Molecular Biology. , (2020).
- Agrimson, K. S., et al. Characterizing the Spermatogonial Response to Retinoic Acid During the Onset of Spermatogenesis and Following Synchronization in the Neonatal Mouse Testis. Biology of Reproduction. 95 (4), 81 (2016).
- Hogarth, C. A., et al. Turning a spermatogenic wave into a tsunami: synchronizing murine spermatogenesis using WIN 18,446. Biology of Reproduction. 88 (2), 40 (2013).
- Patel, L., et al. Dynamic reorganization of the genome shapes the recombination landscape in meiotic prophase. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (3), 164-174 (2019).
- Alavattam, K. G., et al. Attenuated chromatin compartmentalization in meiosis and its maturation in sperm development. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (3), 175-184 (2019).
- Adams, S. R., et al. RNF8 and SCML2 cooperate to regulate ubiquitination and H3K27 acetylation for escape gene activation on the sex chromosomes. PLoS Genetics. 14 (2), 1007233 (2018).
- Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis. Developmental Biology. 169 (2), 557-567 (1995).
