Summary
Hier präsentieren wir eine einfache und effiziente Methode, um lebende meiotische und postmeiotische Keimzellen von erwachsenen Maushoden zu isolieren. Mit einem zytotoxischen, violett-erregten DNA-Bindungsfarbstoff und fluoreszenzaktivierter Zellsortierung kann man hoch angereicherte spermatogene Zellpopulationen für viele nachgelagerte Anwendungen isolieren.
Abstract
Die Isolierung meiotischer Spermatozyten ist wichtig, um molekulare Mechanismen zu untersuchen, die der Meiose und Spermatogenese zugrunde liegen. Obwohl es etablierte Zellisolationsprotokolle mit Hoechst 33342 Färbung in Kombination mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung gibt, sind Zellsortierer mit einem ultravioletten Laser erforderlich. Hier beschreiben wir ein Zellisolationsprotokoll mit dem DyeCycle Violet (DCV) Fleck, einem DNA-Bindungsfarbstoff mit geringer Zytotoxizität, der Hoechst 33342 strukturell ähnelt. DCV kann sowohl von ultravioletten als auch von violetten Lasern angeregt werden, was die Flexibilität der Geräteauswahl verbessert, einschließlich eines Zellsortierers, der nicht mit einem ultravioletten Laser ausgestattet ist. Mit diesem Protokoll kann man drei lebende Zellsubpopulationen in der meiotischen Prophase I isolieren, einschließlich Leptotene/Zygoten, Pachyten und Diploten-Spermatozyten sowie postmetiotische runde Spermatien. Wir beschreiben auch ein Protokoll zur Vorbereitung der einzelzelligen Suspension von Maushoden. Insgesamt benötigt das Verfahren eine kurze Zeit (4-5 Stunden abhängig von der Anzahl der benötigten Zellen), was viele nachgelagerte Anwendungen erleichtert.
Introduction
Spermatogenese ist ein komplexer Prozess, bei dem eine kleine Population von SpermatogonialStammzellen die kontinuierliche Produktion einer großen Anzahl von Spermien während des Erwachsenenlebens1,2aufrechterhält. Während der Spermatogenese findet die dynamische Chromatin-Remodellierung statt, wenn spermatogene Zellen einer Meiose unterzogen werden, um haploide Spermaatiden3,4,5zu produzieren. Die Isolierung meiotischer Spermatozyten ist für die molekulare Untersuchung von wesentlicher Bedeutung, und es wurden verschiedene Ansätze zur Isolierung meiotischer Spermatozyten etabliert, einschließlich sedimentationsbasierter Trennung6,7 und fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS)8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. Diese Methoden haben jedoch technische Einschränkungen. Während sedimentationsbasierte Trennung eine große Anzahl von Zellenergibt 5,6,7, ist es arbeitsintensiv. Die etablierte FACS-basierte Methode verwendet Hoechst 33342 (Ho342), um meiotische Spermatozyten basierend auf DNA-Gehalt und Lichtstreuungseigenschaften zu trennen und erfordert FACS-Zellsortierer, die mit einem ultravioletten (UV) Laser8,9,10,11ausgestattet sind. Alternative FACS-basierte Methoden erfordern transgene Mauslinien, die floreszierende Proteine ausdrücken, Synchronisation von Spermatogenese12oder Zellfixierung und Antikörperkennzeichnung, die nicht mit der Isolierung von lebenden Zellen kompatibel ist13. Zwar gibt es eine andere alternative Methode mit einem zelldurchlässigen DNA-Bindungsfarbstoff, DyeCycle Green Stain14,15,16,17, Diese Methode wird für die Isolierung von spermaatogenen Zellen aus juvenilen Hoden empfohlen. Daher besteht die kritische Notwendigkeit, eine einfache und robuste Isolationsmethode für lebende meiotische Spermatozyten zu entwickeln, die auf jeden Mausstamm jeden Alters angewendet werden können und mit jedem FACS-Zellsortierer durchgeführt werden können.
Hier beschreiben wir ein so lang ersehntes Zellisolationsprotokoll mit dem DyeCycle Violet (DCV) Fleck. DCV ist ein geringer Zytotoxizität, zelldurchlässiger DNA-Bindungsfarbstoff strukturell ähnlich Ho342, aber mit einem Anregungsspektrum in Richtung des violetten Bereichs18verschoben. Darüber hinaus verfügt DCV über ein breiteres Emissionsspektrum im Vergleich zu DCG. So kann es sowohl durch UV- als auch violette Laser angeregt werden, was die Flexibilität der Geräte verbessert, so dass ein FACS-Zellsortierer nicht mit einem UV-Laser ausgestattet ist. Das hier vorgestellte DCV-Protokoll verwendet eine zweidimensionale Trennung mit DCV-Blau und DCV-Rot, was den Vorteil des Ho342-Protokolls nachahmt. Mit diesem Vorteil ermöglicht uns unser DCV-Protokoll, hoch angereicherte Keimzellen aus den adulten Hoden zu isolieren. Wir bieten ein detailliertes Gating-Protokoll, um lebende spermatogene Zellen von erwachsenen Maushoden einer Maus (aus zwei Hoden) zu isolieren. Wir beschreiben auch ein effizientes und schnelles Protokoll zur Vorbereitung einer einzelzelligen Suspension aus Maushoden, die für diese Zellisolierung verwendet werden können. Das Verfahren erfordert eine kurze Zeit zu vervollständigen (Vorbereitung der einzelzelligen Suspension - 1 Stunde, Farbstoff Färbung - 30 min, und Zellsortierung - 2-3 Stunden: insgesamt - 4-5 Stunden abhängig von der Anzahl der benötigten Zellen; Abbildung 1). Nach der Zellisolation kann eine breite Palette von nachgelagerten Anwendungen wie RNA-seq, ATAC-seq, ChIP-seq und Zellkultur abgeschlossen werden.
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Protocol
Dieses Protokoll folgt den Richtlinien des Institutionellen Ausschusses für Tierpflege und -nutzung (Protokoll Nr. IACUC2018-0040) im Cincinnati Children es Hospital Medical Center.
1. Ausrüstungs- und Reagenzaufbau zur Herstellung der Hodenzellsuspension
- Bereiten Sie jeden Enzymbestand in 1x Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) vor und lagern Sie bei -20 °C . (Tabelle1).
HINWEIS: Bereiten Sie jederzeit vor dem Experiment vor. - Einen Tag vor dem Experiment: Mantelsammelrohre (1,5 ml Röhren) mit Fetal rinderserum (FBS) bei 4 °C über Nacht.
- Am Tag des Experiments: Stellen Sie das Wasserbad auf 37 °C.
- Vorwärmes Dulbecco es Modified Eagle Medium (DMEM) bei 37 °C und bereiten 2 ml 1x Dissoziationspuffer für jede Probe direkt vor Gebrauch vor (Tabelle 1) in 15 ml Zentrifugenrohr.
HINWEIS: 2 ml Dissoziationspuffer wird für zwei Hoden vorbereitet. Das Dissoziationspufferrezept finden Sie in Tabelle 1.
2. Tierische Zerlegung und Vorbereitung der Hodenzellsuspension
- Opfern Sie eine 8 Wochen alte männliche Maus, indem Sie mindestens 10 min in einer Kohlendioxidkammer zurücklassen.
- Entfernen Sie beide Hoden und legen Sie sie auf eine 60 mm Petrischale, die 2 ml eiskalte Phosphat-gepufferte Saline (PBS) enthält.
- Entfernen Sie die Tunika albuginea aus den Hoden. Die seminiferen Tubuli leicht zerstreuen, indem sie sich sanft mit Zangen trennen.
- Die seminiferen Tubuli mit einem neuen Tropfen eiskaltem PBS in eine 100 mm Petrischale geben und seminiferous Tubuli sanft mit Zangen entwirren. Wiederholen Sie diese Wäsche 3 Mal, um interstitielle Zellen so weit wie möglich zu entfernen.
- Inkubieren Sie unverwirrte seminiferöse Tubuli in einem 15 ml-Rohr, das 2 ml Dissoziationspuffer bei 37 °C für 20 min enthält.
- Die Tubuli mit einer 1000-L-Mikropipette 20 Mal sanft pipette.
- Inkubieren Für 6 min. Wiederholen Sie sanftes Pipettieren 20 Mal.
- Inkubieren Sie für 3 min. Wiederholen Sie die sanfte Pipettierung 10 Mal, bis keine sichtbaren Brocken mehr sichtbar sind.
- Fügen Sie der Federung 10 ml FACS-Puffer hinzu. Zentrifuge bei 300 x g für 5 min bei Raumtemperatur und den Überstand entsorgen.
- Wiederholen Sie Schritt 2.9 zweimal, um die Spermatozoen und so viel Schmutz wie möglich zu entfernen.
3. Zellfärbung
- Setzen Sie das Zellpellet mit 3 ml FACS-Puffer (Tabelle 1) wieder auf und filtern Sie die Zellsuspension durch ein 70 m Nylon-Zellsieb in ein 50 ml-Rohr.
HINWEIS: Die erwartete Zellausbeute beträgt etwa 100 Millionen Zellen pro zwei Hoden (von einer 8 Wochen alten B6-Wildtypmaus). - Zählen Sie die Zellzahl und teilen Sie 10% der Zellen in eine neue Röhre als ungefärbte Negative Kontrolle und lassen Sie auf Eis.
- Fügen Sie der verbleibenden Zellsuspension 6 l DCV-Färbung (die ursprüngliche Konzentration beträgt 5 mM) hinzu und mischen Sie sie gut. Die Endkonzentration beträgt 10 M, die Kapazität beträgt etwa 100 Millionen Zellen.
- Bei 37 °C für 30 min im Dunkeln inkubieren. Schütteln Sie die Zellsuspension alle 10 min.
- Nach der Inkubation, ohne Waschschritt, direkt 5 l DNase I (die Lagerkonzentration beträgt 10 mg/ml) in die Zellsuspension geben und die Zellen durch die 35-m-Nylon-Mesh-Kappe in ein 5 ml FACS-Rohr filtern. Halten Sie die Proben auf Eis bis zum Sortieren.
4. Durchflusszytometrie und Versuchstore
- Bereiten Sie den FACS-Zellensortierer vor. Stellen Sie sicher, dass der FACS-Zellsortierer mit einer Excitation-Optik ausgestattet ist: Violett (405-nm) Laser; Detektionsoptik: Filterkombination aus 450/50 Bandpass [gleicher Filtersatz aus 4,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) zur DCV-blauen Detektion] und 665/30 Bandpass [gleicher Filtersatz von Allophycocyanin (APC) zur DCV-Rot-Erkennung]. Hier verwenden wir Sony SH800S Zellsortierer als Beispiel.
- Erstellen Sie ein neues Experiment und richten Sie die folgenden Arbeitsdiagramme ein, in denen die zu optimierenden Parameter angezeigt werden: Klicken Sie auf "Neue Dichte" in der Menüleiste"Arbeitsblattwerkzeuge", um eine Vorwärtsstreuung - Fläche (FSC-A) vs. Zurückstreuung – Flächendiagramm (BSC-A) auf einer linearen Skala zu erstellen. Klicken Sie auf "Neues Histogramm", um ein DCV-blaues Histogrammdiagramm auf logarithmischer Skala zu erstellen.
- Kurz wirbeln Sie die ungefärbte Negativkontrolle (ab Schritt 3.2) und laden Sie die Probe.
- Klicken Sie auf "Start" und "Record", um mit der Verarbeitung des nicht befleckten Samples zu beginnen. Während die Probe läuft, klicken Sie auf"Detektor- & Schwellenwerteinstellungen ",um die FSC- und BSC-Spannungen zu optimieren, indem Sie beide Photomultiplier-Rohr-Spannungen (PMT) nach oben oder unten anpassen, um die ungefärbten Zellen auf der Skala des FSC/BSC-Plots zu platzieren.
- Passen Sie die PMT-Spannung aufFL1: DAPInach oben und unten an, während die Probe läuft, um die Position der DCV-negativen Population im ersten Jahrzehnt des DCV-blauen histogramm-logarithmischen Diagramms zu lokalisieren (Abbildung 2A). Nachdem Sie die PMT-Spannungseinstellung abgeschlossen haben, klicken Sie auf "Stopp", um die unbefleckte Probe zu entladen.
- Wirbeln Sie die Probe kurz (ab Schritt 3.5) und laden Sie die Probe.
- Klicken Sie auf"Nächste Röhre", um ein neues Arbeitsblatt für die DCV-befleckte Probe zu erstellen. und klicken Sie auf "Start" und "Record", um die DCV-befleckte Probe zu erhalten, ≥ 1 x 106 Ereignisse aufzuzeichnen. Fügen Sie die folgenden Arbeitsplots hinzu: Klicken Sie auf "Neue Dichte" in der Menüleiste"Arbeitsblattwerkzeuge", um ein FSC-H (Höhe) vs. FSC-W (Breite) Dichtediagramm auf einer linearen Skala zu erstellen; Klicken Sie auf "Neue Dichte", um ein DCV-blau-rot-rotedichtes Diagramm auf einer linearen Skala zu erstellen. Nachdem Sie ≥ 1 x 106 Ereignisse aufgezeichnet haben, klicken Sie auf "Beenden" und entladen Sie das Sample.
- Klicken Sie auf der Menüleiste"Plot Tools" auf "Polygon" auf " Polygon " , um ein großes Tor "Zellen" zu zeichnen, um die meisten Zellen einzuschließen und kleine Trümmer auszuschließen (Abbildung 2B). Wenden Sie das Tor "Zellen" auf FSC-H vs. FSC-W Dichteplot an. Klicken Sie auf "Rechteck", um ein "Single Cells" Gate zu zeichnen, um nicht-einzelne Zellen auszuschließen (Abbildung 2C).
- Wenden Sie "Single Cells" Gate auf DCV-blau vs. DCV-rote Dichte Diagramm und passen Sie die Skala, um ein erweitertes Profil zu erfassen, wie in Abbildung 2Dgezeigt. Klicken Sie auf "Polygon" auf die Menüleiste "Plot Tools", um ein "DCV" Tor zu zeichnen, um die unbefleckten Zellen und die Seitenpopulation auszuschließen (Abbildung 2D).
- Wenden Sie "DCV" Gate auf DCV-blauehistogramm-Plot auf einer linearen Skala an. Die drei Hauptspitzen beziehen sich auf unterschiedliche DNA-Gehalte: 1C, 2C und 4C (Abbildung 2E).
- Klicken Sie auf "Neue Dichte", um ein DCV-blaues vs. DCV-rotdichtes Diagramm auf einer linearen Skala zu erstellen und "DCV" Gate anzuwenden, um das Zurückgating aus Abbildung 2E durchzuführen, um die 1C- und 4C-Populationen zu lokalisieren (Abbildung 2F). Klicken Sie auf "Ellipse", um ein Tor auf die 1C-Population zu zeichnen, die sich innerhalb eines kondensierten Bereichs (Tor 1C) befindet. Klicken Sie auf "Polygon", um ein Tor auf der 4C-Population zu zeichnen, die eine kontinuierliche Kurve (Tor 4C) ist.
- Klicken Sie auf "Neue Dichte", um ein DCV-blaues vs. DCV-rotedichtedichtes Diagramm auf einer linearen Skala zu erstellen und das "4C"-Gate anzuwenden; Passen Sie die Skala an, um sie zu vergrößern, und klicken Sie auf"Polygon", um ein "4C_1"-Gate für eine genauere Auswahl zu zeichnen (Abbildung 2G).
- Klicken Sie auf "Neue Dichte", um ein neues FSC-A vs. BSC-A-Dichtediagramm auf einer linearen Skala zu erstellen und "4C_1"-Gate anzuwenden. Es wird drei angereicherte Populationen geben, die durch die Größe von Leptoten (L) /zygoten (Z), Pachyten (P) und Diploten (D) Spermatozyten getrennt sind. Klicken Sie auf "Polygon" oder "Ellipse", um 3 Tore zu zeichnen: "L/Z", "P" und "D" basierend auf der wachsenden Größe (Abbildung 2H).
- Klicken Sie auf"Neues Punktdiagramm", um ein DCV-blaues vs. DCV-rotes Farbpunktdiagramm auf einer linearen Skala zu erstellen, um Gate anzuwenden und sicherzustellen, dass sich die drei Gandaden in einer kontinuierlichen Reihenfolge innerhalb des "4C_1"-Gatebefindens befinden (Abbildung 2I).
- In ähnlicher Weise klicken Sie für die 1C-Population auf "Neue Dichte", um ein neues FSC-A vs. BSC-A-Dichtediagramm auf einer linearen Skala zu erstellen und "1C"-Gate anzuwenden, wählen Sie die einheitliche Größe der Zellen als reine runde Spermapopulation aus und klicken Sie auf "Ellipse", um ein "RS" Gate zu zeichnen (Abbildung 2J).
5. Männliche Keimzellsubpopulationen sortieren
- Bereiten Sie 1,5 ml-Rohre mit 500 L 50% FBS für die Zellsammlung vor und laden Sie das Sammelrohr in den Kollektor und klicken Sie auf"Lastsammlung".
- Klicken Sie auf "Next Tube", "Start", "Record" und "Sort Start". Für die Verwendung eines Zwei-Wege-Systems, das es ermöglicht, zwei von Interesse sindde Populationen gleichzeitig in das Sammelgerät zu sortieren, folgen Sie paarweise Kombinationen: Leptotene (L) /zygoten (Z) und pachytene (P) Spermatozyten basierend auf L/Z und P-Back-Gates; Runde Spermaatien (RS) und Diploten (D) Spermatozyten basierend auf RS und D-Rückentoren.
- Passen Sie während der Ausführung des Beispiels die Durchflussrate auf 3000 Ereignisse/s an, um die effizienteste Sortierung zu erhalten.
6. Reinheitsanalyse sortierter Zellen
- Sammeln Sie ≥ 10.000 Zellen/jede Population. Führen Sie eine Zellimmunostainierung durch, um die Unterstufe zu bestätigen.
- Zentrifuge bei 300 x g für 5 min bei 4 °C und sorgfältig den Überstand entsorgen, wobei etwa 110 l der Flüssigkeit im Boden des Rohres gehalten werden.
- Nehmen Sie einen 10-L-Tropfen der Zellsuspension, um unter dem Mikroskop zu beobachten und die Übersichtszellmorphologie und -zahl zu bewerten.
- Tragen Sie auf jeden der Probenkammerschlitten 100 l Zellsuspension auf (siehe Materialtabelle)auf, und laden Sie die Kammern auf den Cytospin.
- Drehen Sie die Proben bei 30 x g für 5 min bei Raumtemperatur. Zeichnen Sie einen Kreis um die Zelle mit einem hydrophoben Stift. Trockene Dias auf der Laborbank für ein paar Minuten bei Raumtemperatur.
- Legen Sie 50 L PBS in den Kreis der Rutsche und tippen Sie ab.
- Primäre Antikörperlösung (Verdünnung der primären Antikörper mit 5% Eselserum in PBS mit 0,02% Polysorbat 20) im Kreis der Rutsche und inkubieren bei 4 °C über Nacht.
ANMERKUNG: Um die Unterstufe der meiotischen Spermatozyten zu beurteilen, wurde SYCP3, ein Marker für meiotische Chromosomenachsen, und "H2AX", ein Marker für die Reaktion auf DNA-Schäden, nachgewiesen. (Für die Antikörper-Arbeitskonzentration, siehe Tabelle der Materialien). - Tippen Sie auf die primäre Antikörperlösung aus den Dias.
- Legen Sie 50 L PBS in den Kreis der Rutsche und tippen Sie ab. Wiederholen Sie dies einmal.
- Sekundäre Antikörperlösung (verdünnte sekundäre Antikörper in PBS mit 0,02% Polysorbat 20) im Kreis der Rutsche hinzufügen und bei Raumtemperatur für 1 h im Dunkeln brüten.
- Legen Sie 50 L PBS in den Kreis der Rutsche und tippen Sie ab. Wiederholen Sie dies einmal.
- Fügen Sie 50 l DAPI (Lagerkonzentration ist 0,1 g/ml) Fleck für 5 min und tippen Sie ab.
- Fügen Sie 1-2 Tropfen Montagemedien auf die Dias. Bedecken Sie die Montagemedien vorsichtig mit einem Deckglas und drücken Sie vorsichtig das Deckglas, um zusätzliche Montagemedien und Luftblasen zu entfernen. Die Dias sind für die Mikroskopie-Evaluierung bereit.
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Representative Results
Ein repräsentatives Ergebnis dieses Sortierprotokolls ist in Abbildung 3dargestellt. Die Gesamtsortierzeit von zwei Hoden (eine Maus) beträgt in der Regel etwa 3 Stunden, was von der Konzentration der Zellsuspension und der Sortiergeschwindigkeit abhängt. Nach der Sortierung wird die Reinheit der Spermatozyten durch Immunfärbung von SYCP3 und H2AX bestätigt (Abbildung 3A). Die repräsentative Reinheit der sortierten L/Z-, P-, D-Spermatozytenfraktionen beträgt etwa 80,4 %, 90,6 % bzw. 87,6 %(Abbildung 3C). Wir haben die Unterstufen auf der Grundlage der Kriterien bestimmt, die wir zuvor veröffentlicht haben19. Kurz gesagt, im Leptoten- und Zygotenstadium ist die Synapse zwischen homologen Chromosomen unvollständig, was durch dünne Fäden der SYCP3-Färbung angezeigt wird. Aufgrund programmierter DNA-Doppelstrangbrüche werden im gesamten Kernchromatin große H2AX-Domänen beobachtet. Im Pachytenstadium haben sich homologe Chromosomen vollständig synapsiert, und auf den Geschlechtschromosomen sammelt sich h2AX gezielt an. Im Diplotenstadium erziehen homologe Chromosomen nach und nach eine Desynapsis. Die Reinheit von RS wird durch Kernfärbung mit DCV bestätigt (Abbildung 3B). RS kann mit DNA-Färbung genau beurteilt werden: ein einzigartiges DAPI-intensives Chromocenter, umgeben von Euchromatin; oder kombinieren Sie mit spezifischen Markern, wie Sp56, die innerhalb des sich entwickelnden akrosomalen Granulats von Spermatid und Histonvariante H1T exprimiert wird, die nach der mittleren Pachytenphase stark im Kern exprimiert wird (Abbildung 3B).
DIE RS Reinheit liegt nach der Sortierung bei etwa 90,1 %(Abbildung 3C). Die Stichprobengröße der Reinheitsanalyse beträgt über 1.000 Zellen pro Experiment; die Reinheit der L/P- und D-Populationen wird aus 6 unabhängigen Experimenten gemittelt; die Reinheit der P- und RS-Populationen wird aus 3 unabhängigen Experimenten gemittelt. Die Lebensfähigkeit dieser isolierten Zellen liegt in der Regel bei über 95 % (Abbildung S1). Die Gesamtausbeute jedes Bruchs aus einer einzigen erwachsenen Maus wird geschätzt und in Abb. 3C aufgeführt, die ausreichende Zellen für verschiedene nachgelagerte Analysen liefert. Kürzlich haben wir dieses Protokoll verwendet, um Wildtyp-Pachyten-Spermatozyten für die ChIP-seq-Analyse20,21zu isolieren.
| Reagenz | Zutat | Lagerkonzentration | Volumen |
| (HBSS-Basis) | |||
| Dissoziationspuffer | DMEM | - | 2 ml |
| (DMEM-Basis) | Fbs | - | 40 l |
| Hyaluronidase | 100 mg/ml | 30 l | |
| DNase I | 10 mg/ml | 50 l | |
| Kollagenase Typ I | 100 mg/ml | 40 l | |
| Rekombinante Kollagenase | 14000 Stück/ml | 100 l | |
| FACS-Puffer | Pbs | - | 980 ml |
| (PBS-Basis) | Fbs | - | 20 ml |
Tabelle 1: Reagenzrezept. Der Dissoziationspuffer muss direkt vor der Verwendung vorbereitet werden. DMEM vor dem Start der Sezierung vorwärmen. Die Enzymvorräte können jederzeit vor dem Experiment hergestellt und bei -20 °C gelagert werden. DER FACS-Puffer muss vakuumgefiltert und bei 4 °C gelagert werden; Vorwarm auf Raumtemperatur vor Gebrauch.
Abbildung 1: Workflow der murinen Spermatogenzellen-Isolierung bei DCV-basierter Sortierung. Dieses Bild zeigt das allgemeine Verfahren, von der Gewebedissoziation über die FACS-Sortierung bis hin zur Ernte isolierter Spermatogenen innerhalb eines Tages. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: FACS-Analyse von adulten murinen Hodenzellen auf Basis von DCV-Fluoreszenz und Lichtstreuung. (A) Erworbene ungefärbte Zellen im ersten Jahrzehnt eines DCV-blauen Histogrammdiagramms (linke Seite des roten Balkens). (B) (C) Trümmer und nicht-einzelne Zellen, die durch Lichtstreuung ausgeschlossen sind. (D) Ausschluss von unbefleckten Zellen und Seitenpopulationen auf der Grundlage der DCV-Fluoreszenz. (E) BESTIMMUNG des DNA-Gehalts auf der Grundlage der DCV-blauen Fluoreszenz. Linker Peak (grün) und rechter Peak (rosa) entsprechen 1C- und 4C-Populationen. (F) Gating auf 1C und 4C Hodenpopulationen auf der Grundlage von DCV-blau/DCV-rot Fluoreszenz. (G) Präzise Gating auf 4C Hodenpopulationen. (H) Back-Gating von Tor 4C aus dem DCV-Plot auf einem FSC/BSC-Plot. Basierend auf Regionen mit minimalen Überlappungen auf dem FSC/BSC-Plot werden die Tore L/Z, P und D erstellt, um ihre jeweiligen Spermatozytenpopulationen zu bereichern. (I) Farbpunktdiagramm, das die L/Z-, P- und D-Populationen zeigt, sind in kontinuierlicher Reihenfolge innerhalb von Gate 4C. (J) Back-gating von Gate 1C aus dem DCV-Plot auf einem FSC/BSC-Plot. RS-Tor wurde geschaffen, um runde Spermapopulation mit gleichmäßiger Größe zu bereichern, was zu einer größeren Reinheit der Populationen während der Sortierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentative Ergebnisbilder und Statistiken von spermatogenen Zellen, die aus der Sortierung gewonnen werden. (A) Immunofluoreszenzcharakterisierung sortierter Spermatozyten. Oberteil: DCV-Färbung zeigt Kernmuster der lebenden Spermatozyten direkt nach der Sortierung; L/Z (Leptotene/Zygoten), P (Pachytene) und D (Diploten). Unteres Panel: Bestätigung der meiotischen Unterstufen für jede Population durch Immunfärbung für SYCP3 (grün) und H2AX (rot). (B) Repräsentatives DCV-Bild mit Rs-Kernmuster. Skalenbalken: 50 m (obere Paneele) und 10 m (untere vergrößerte Paneele). Rechte Panels: Immunfluoreszenzbestätigung von runden Spermaatiden, die mit Sp56 und H1T gefärbt sind. (C) Die Reinheit von L/Z, P und D wurde durch Immunfärbung bestätigt, die Probengröße betrug über 1.000 Zellen für jedes unabhängige Experiment, insgesamt 6 unabhängige Experimente. Die RS-Reinheit wurde durch Kernfärbung mit insgesamt 3 unabhängigen Experimenten bestätigt. Die Gesamtzellzahl der Hodenzellsuspension einer 8 Wochen alten WT B6-Maus betrug vor der Sortierung rund 100 Millionen Zellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung S1: Die Lebensfähigkeit isolierter Pachyten-Spermatozyten. Ein repräsentatives Bild zeigt die Zelllebensfähigkeit isolierter Pachyten-Spermatozyten (Rot: PI; Blau: DCV). PI konnte während der Sortierung nicht mit DCV kombiniert werden. Unter dem Mikroskop war das DCV-Rotsignal jedoch recht niedrig; daher wurden PI-positive abgestorbene Zellen leicht von anderen lebenden Zellen unterschieden. Die Lebensfähigkeit liegt in der Regel bei über 95 %. Skalenbalken: 10 m. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
Abbildung S2: Unvollständige Dissoziation oder Schutt stört das Gating. Die A-Population (roter Kreis) enthält Trümmer und Polymer von Spermatoren (durch Pfeil angezeigt). Die größere A-Population wird mit der B-Population (gelber Kreis) kreuzen und schließlich die 4C-Population kontaminieren. Skalenbalken: 200 m. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
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Discussion
Hier stellen wir ein praktisches und einfaches Protokoll vor, um Subpopulationen von Spermatozyten und Spermatoren aus einer einzigen erwachsenen männlichen Maus zu isolieren. Um die Reproduzierbarkeit dieses Protokolls zu gewährleisten, gibt es einige wichtige Schritte, die Aufmerksamkeit erfordern. Vor der Enzymverdauung, Waschschritt zielt darauf ab, interstitielle Zellen zu entfernen; nach der Verdauung hilft dieser Schritt, Spermatozoen und Schmutz zu entfernen. Waschen/Zentrieren ist wichtig. In unserem Dissoziationspufferrezept erleichtert die Kombination verschiedener Enzyme die Dissoziation von Hoden in die einzellige Suspension ohne übermäßige Zellschädigung. SanftePipettierung, um Luftblasen zu vermeiden, trägt auch zum Schutz der Zellintegrität bei. Bitte überprüfen Sie die Zellsuspension unter dem Mikroskop nach der Dissoziation, um sicherzustellen, dass die Suspension eine einzellige Ebene erreicht. Unvollständige Dissoziation oder Schmutzkontamination durch übermäßige Verdauung wirkt sich auf die Reinheit sortierter Zellen aus; wie in Abbildung S2dargestellt, enthält die aufrechte Population Trümmer und Tetramer von Spermien. DCV Färbung erfordert Inkubation im Dunkeln und keine Wäsche danach.
Um mögliche Schwierigkeiten beim Gating und Back-Gating von Spermatozyten-Subpopulationen zu beheben, empfehlen wir als Option zur Optimierung, eine synchronisierte Wild-Typ-Maus zu verwenden, um ein bestimmtes Stadium von Spermatozyten22,23,24zu finden. Es ist auch erwähnenswert, dass einige Knockout-Maus-Stämme mit Spermatogenese Verhaftung Phänotypen ungewöhnliche DCV-Profile haben können, weil sie einige Subpopulationen fehlen. In diesem Fall wird dringend eine ordnungsgemäße Wildtypkontrolle empfohlen. Darüber hinaus kann dieses Protokoll potenziell auf erwachsene Mäuse jeden Alters angewendet werden. Das Alter der Versuchsmaus könnte jedoch aufgrund des variablen Anteils der Keimzellen ein störer Faktor sein.
Im Laufe der Jahre wurden mehrere Protokolle zur Reinigung von Keimzellen entwickelt. Als eine der beliebtesten Methoden trennt die STA-PUT-Geschwindigkeitssedimentation Keimzellen durch den BSA-Gradienten und bietet eine gute Ausbeute an intakten Keimzellen6,7. STA-PUT benötigt jedoch nicht nur spezielle Geräte, die für viele Labore möglicherweise nicht ohne weiteres verfügbar sind, sondern ist auch zeitaufwändig und arbeitsintensiv, um in einem Kühlraum bei 4 °C zu arbeiten. Im Gegensatz zu STA-PUT, das für großflächige Trennunggeeignet ist, könnte diese FACS-basierte Methode eine hohe Reinheit und präzise Fraktion für ein kleines Experiment bieten. Eine groß angelegte Sortierung mit unserem Protokoll ist möglich, verlängert aber die Sortierzeit erheblich und kann die Zelllebensfähigkeit beeinträchtigen. Daher ist STA-PUT immer noch eine praktische Option, wenn eine große Anzahl von Zellen benötigt wird5,25,26.
Im Vergleich zur bisherigen FACS-Methode auf Basis der Ho342-Färbung8,9,10,11verwendet unser Protokoll DCV, das ein breiteres Anregungsspektrum hat und auf die meisten aktuellen FACS-Sortierer angewendet werden kann, die mit einem UV- oder 405 nm violetten Laser18ausgestattet sind. Obwohl es ein anderes Protokoll mit DCG14,15,16,17gibt, besteht der Unterschied zwischen unserem Protokoll und dem DCG-Protokoll darin, dass unser DCV-Protokoll eine zweidimensionale Trennung mit DCV-Blau und DCV-Rot verwendet, was den Vorteil des Ho342-Protokolls imitiert. Mit diesem Vorteil ermöglicht uns unser DCV-Protokoll, hoch angereicherte Keimzellen von adulten Hoden zu isolieren. Das DCG-Protokoll verwendet keine zweidimensionale Trennung und wird zur Isolierung von Keimzellen von juvenilen Mäusen empfohlen. Die zweidimensionale Trennung kann eine bessere Auflösung haben, um die Substadien von Spermatozyten zu trennen. Jedoch, unsere Methode ist immer noch nicht in der Lage, Leptotenund und Zygoten Spermatozyten getrennt zu isolieren, sowie "2C" Zelltypen einschließlich Spermatogonie, Preleptotene Spermatozyten, und sekundäre Spermatozyten.
Da das breite Emissionsspektrum von DCV-Färbungen zu Leckagen in anderen Kanälen führt, können die meisten Zelllebensfähigkeitsfarbstoffe wie PI und 7AAD aufgrund falsch positiver Signale nicht kombiniert werden. Andere Zelllebensfähigkeitfarbstoffe mit Emission in weitroten oder nahinfraroten Kanälen könnten es wert sein, in Zukunft einen Versuch zu machen. Aber unserer Erfahrung nach zeigen sortierte Zellen in der Regel ≥ 95% Lebensfähigkeit nach 2 Stunden FACS-Sortierung (Abbildung S1), was für die nachgelagerte Analyse ausreicht.
Sortierte Zellen aus unserem Verfahren können für verschiedene nachgelagerte Experimente verwendet werden, einschließlich der Sequenzierungsanalyse der nächsten Generation (RNA-seq, ATAC-seq und ChIP-seq). Die hier erhaltenen Zellen können auch für die Kurzzeitkultur27verwendet werden. Zusammenfassend bieten wir ein einfaches, aber effizientes Protokoll mit einem einstündigen einzelligen Suspensionsvorbereitungsverfahren und der detaillierten Gating-Strategie für FACS auf Basis der DCV-Färbefärbung, die für die isolierung kleiner spermatogener Zellen geeignet ist und von vielen Forschern, sogar Durchflusszytometrie-Anfängern, schnell übernommen werden kann.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.
Acknowledgments
Wir danken den Mitgliedern der Laboratorien Namekawa, Yoshida und Maezawa für ihre Hilfe; Katie Gerhardt für die Bearbeitung des Manuskripts; Mary Ann Händel für die gemeinsame Nutzung des H1T-Antikörpers, des Cincinnati Children es Hospital Medical Center (CCHMC) Research Flow Cytometry Core für die gemeinsame Nutzung der FACS-Ausrüstung, die von NIH S10OD023410 unterstützt wird; Grant-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI; 17K07424) an T.N.; Lalor Foundation Postdoktorandenstipendium an A.S.; AMED-CREST (JP17gm1110005h0001) nach S.Y.; das Forschungsprojekt Grant von der Azabu University Research Services Division, Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology (MEXT)-Supported Program for the Private University Research Branding Project (2016–2019), Grant-in-Aid for Research Activity Start-up (19K21196), the Takeda Science Foundation (2019) und dem Uehara Memorial Memorial Foundation Research Incentive Grant (2018) an S.M.; National Institute of Health R01 GM122776 bis S.H.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml tube | Watson | 131-7155C | |
| 100 mm Petri dish | Corning, Falcon | 351029 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Watson | 1332-015S | |
| 5 ml polystyrene tube with cell strainer snap cap (35 µm nylon mesh) | Corning, Falcon | 352235 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Watson | 1342-050S | |
| 60 mm Petri dish | Corning, Falcon | 351007 | |
| 70 µm nylon mesh | Corning, Falcon | 352350 | |
| Cell sorter | Sony | SH800S | |
| Centrifuge | |||
| Collagenase, recombinant, Animal-derived-free | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 036-23141 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington | LS004196 | |
| Cover glass | Fisher | 12-544-G | |
| Cytospin 3 | Shandon | ||
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Fisher | D1306 | working concentration: 0.1 μg/mL |
| Dnase I | Sigma | D5025-150KU | |
| Donkey serum | Sigma | S30-M | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11885076 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| Histone H1t antibody | gift from Mary Ann Handel | 1/2000 diluted | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Gibco | 14175095 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H3506-1G | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P5493-4L | |
| Pipettemen | |||
| ProLong Gold Antifade Mountant | Fisher | P36930 | |
| rH2AX antibody | Millipore | 05-635 | working concentration: 2 μg/mL |
| Sperm Fertilization Protein 56 (Sp56) antibody | QED Bioscience | 55101 | working concentration: 0.5 μg/mL |
| Sterilized forceps and scissors | |||
| Superfrost /Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | |
| SYCP3 antibody | Abcam | ab205846 | working concentration: 5 μg/mL |
| TWEEN 20 (Polysorbate 20) | Sigma | P9416 | |
| Vybrant DyeCycle Violet Stain (DCV) | Invitrogen | V35003 | |
| Water bath |
References
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