活体显微成像下三维水凝胶的可控应变

摘要

本方法涉及在允许活细胞共聚焦显微镜观察的同时，对嵌入硅橡胶中的三维软水凝胶进行单轴拉伸。文中展示了对外部和内部水凝胶应变以及纤维取向的表征。所开发的装置与实验方案可用于评估细胞对不同应变条件的响应。

摘要

外部力是组织形成、发育和维持的重要因素。这些力的作用通常通过特制的体外拉伸方法进行研究。现有的各种系统采用基于二维基底的拉伸装置，而可用于对软性水凝胶施加应变的三维技术则相对受限。本文介绍一种方法，可通过弹性硅胶条作为样品载体，从软性水凝胶的周边对其进行外部拉伸。本方案所使用的拉伸系统由3D打印部件和低成本电子元件构成，结构简单，易于在其他实验室中复制。实验过程首先是在硅胶条中央的切口处聚合较厚（>100 μm）且柔软的纤维蛋白水凝胶（弹性模量约为100 Pa）。随后将硅胶-凝胶复合物固定于打印的拉伸装置上，并置于共聚焦显微镜载物台上。在活体显微成像过程中启动拉伸装置，对不同拉伸程度下的凝胶进行成像。通过图像处理量化凝胶的形变结果，显示在整个凝胶的三维厚度（Z-轴）方向上应变分布相对均匀，并伴有纤维的取向排列。该方法的优点包括能够在三维条件下对极软的水凝胶施加应变，同时实现原位显微观察，并可根据用户需求自由调节样品的几何形状和尺寸。此外，经过适当调整后，该方法还可用于拉伸其他类型的水凝胶（如胶原蛋白、聚丙烯酰胺或聚乙二醇），并可在更接近生物模拟的三维环境中分析细胞和组织对外部力的响应。

引言

组织对机械力的响应是多种生物功能的重要组成部分，包括基因表达¹、细胞分化²以及组织重塑³。此外，细胞外基质（ECM）在受力作用下发生的改变（如纤维排列和致密化）也会影响细胞行为和组织形成^4,5,6。ECM的纤维网状结构具有独特的力学特性，例如非线性弹性、非仿射变形以及塑性变形^{7,8,9,10,11,12}。这些特性影响着细胞及其周围微环境对外部机械力的响应方式^13,14。深入理解ECM和组织对机械力的响应机制，将有助于推动组织工程领域的发展，并促进构建更精确的计算模型和理论模型。

方案

1. 溶液配制（需提前进行）

1. 纤维蛋白原标记
   注意：仅当需要分析纤维蛋白凝胶变形时，才需进行标记步骤。对于细胞实验，可以使用未标记的凝胶。
   1. 添加 38 μL 将 10 mg/mL 琥珀酰亚胺酯荧光染料（溶于 DMSO）1.5 mL 加入 15 mg/mL 纤维蛋白原溶液 1.5 mL（摩尔比 5:1）中，置于 50 mL 离心管内，室温下振荡反应 1 小时。随后将离心管放入离心机，以 800 × g 离心 3 分钟 g （室温）
   2. 将上一步的上清液通过装有葡聚糖凝胶树脂的脱盐柱进行过滤（材料清单以分离未反应的染料，⁴² 通过执行以下步骤。
      1. 用 25 mL 纤维蛋白原缓冲液预洗涤层析柱。
      2. 缓慢将步骤1.1.1中标记的纤维蛋白原注入层析柱中，确保无气泡进入滤膜。弃去最初约0.3 mL的洗脱液（4–6滴淡色液体），随后收集接下来的1.0–1.5 mL纯化溶液（更详细的说明请参照试剂盒说明书）。
      3. 使用注射器式滤器（0.22 μm）对所得的纯化溶液进行过滤除菌，完成过滤过程。0.45 μm).
      4. 用20 mL纤维蛋白原缓冲液清洗柱子以进行清洁和回收，然后将其保存在25 mL的20%乙醇中。
2. ....

结果

对携带嵌有1 μm荧光微球的三维纤维蛋白水凝胶的硅胶条施加逐渐增加的静态拉伸，所得代表性数据如图9所示。分析结果展示了硅胶拉伸对切口几何形变以及凝胶内部应变发展的影响。Z-堆栈图像用于评估原始圆形切口向椭圆几何形状的变形情况（图9A）。利用这些图像可计算ε_xx(孔洞)（公式2）。在拉伸水凝胶过程中，放大图像并手动追踪多个微球聚集体（图9B），可计算凝胶中心区域在轴向ε_xx(gel)和垂直方向ε_yy(gel)的局部凝胶应变（图9C,D）。轴向应变从硅胶切口边缘向凝胶中心相对线性地传播，且其值大于压缩性的垂直应变（图9D）。<.......

讨论

本文所述方法与方案主要基于 Roitblat Riba 等人先前的研究⁴¹。我们在此提供了 SCyUS 装置的完整计算机辅助设计（CAD）、Python 程序及微控制器代码。

与现有方法相比，本方法的主要优势在于能够从三维水凝胶的周边对其施加应变，且适用于弹性模量低至约100 Pa的极软水凝胶，并可在拉伸过程中进行活细胞共聚焦成像。其他方法通常难以在Z轴方向施加应变场，且在拉伸过程中无法提供原位高倍显微图像，这主要是由于样品与物镜之间的工作距离受限所致。目前大多数可用系统基于二维基底拉伸，难以真实模拟生理组织环境。

该系统的局限性包括聚合后凝胶纤维密度可能存在不一致的均匀性（图7A），尤其是在使用较大凝胶体积或复杂几何形状时。此类非均匀性可能导致凝胶中应变分布和纤维排列不均。此外，在较深的 Z 轴截面（>30 μm）存在光学限制，可能引起纤维.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Alexa Fluor 546 羧酸琥珀酰亚胺酯	Invitrogen	A20002
细胞培养基（DMEM高糖）	生物工业公司	01-052-1A	加入10% FBS、1% PNS、1% L-谷氨酰胺、1%丙酮酸钠
盖玻片 #1.5	Bar-Naor Ltd.	BN72204-30	22×40 毫米
二甲基亚砜 99.5% 气相色谱级 DMSO	Sigma-Aldrich 公司	D-5879-500 ML
杜尔贝科磷酸盐缓冲液	生物工业公司	02-023-1A
EVICEL 人纤维蛋白胶	Omrix Biopharmaceuticals	3902	纤维蛋白原：70 mg/mL，凝血酶：800–1200 IU/mL
纤维蛋白原缓冲液	N/A		1升配方：7克 NaCl，2.94克二水合柠檬酸三钠，9克甘氨酸，20克盐酸精氨酸 & 0.15 g 二水合氯化钙。用纯水定容至 1 L（pH 7.0–7.2）
荧光微珠 FluoSpheres (1 µm)	Invitrogen	F8820	橙色（540/560） 以水溶液形式提供（含2%固体成分及2 mM叠氮化钠）
高温硅橡胶	McMaster-Carr	3788T41	580 µm厚的 E = 1.5 Mpa 泊松比 = 0.48 抗拉强度 = 4.8 MPa 拉伸上限 = +300% 工程应变
HiTrap 脱盐柱 5 mL （Sephadex G-25 填充）	GE Healthcare	17-1408-01
HIVAC-G 高真空密封胶	信越化学工业株式会社	HIVAC-G 100
ImageJ FIJI 软件39	美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州	版本 1.8.0_112
微控制器（Arduino Uno + Adafruit 电机扩展板 v2.3）	Arduino/Adafruit	Arduino-DK001/Adafruit-1438
MicroVL 21R 离心机	赛默飞世尔科技	75002470
Parafilm	Bemis	PM-996
Primovert 倒置显微镜	卡尔蔡司苏州有限公司	491206-0011-000
SCyUS CAD（Solidworks）	达索系统èmes	N/A
SCyUS 代码37	N/A	N/A
伺服电机 - TowerPro SG-5010	Adafruit	155
SL 16R 离心机	赛默飞世尔科技	75004030	50 mL 管
无菌 10 厘米 非培养板	康宁	430167
凝血酶缓冲液	N/A		1升配方：20克甘露醇，8.77克氯化钠，2.72克三水合乙酸钠，24毫升25%人血清白蛋白，5.88克氯化钙。用纯水定容至1升（pH 7.0）
0.25% 胰蛋白酶 EDTA 溶液 B，0.05% EDTA	生物工业公司	03-052-1B
USB线缆（B型公头至A型公头）	N/A	N/A
蔡司 LSM 880 共聚焦显微镜	卡尔蔡司股份公司	2811000417
ZEN 2.3 SP1 FP3（黑色）	卡尔·蔡司股份公司	发布版本 14.0.0.0