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Radiografia neutronica e tomografia computerizzata di sistemi biologici presso il reattore isotopico ad alto flusso dell'Oak Ridge National Laboratory

Published: May 7, 2021 doi: 10.3791/61688
Automatic Translation
*1, *2,3,4, *5, 6, 6, 1,7, 8, 1,9, 1, 9,10, 1
1Neutron Scattering Division, Oak Ridge National Laboratory, 2College of Veterinary Medicine, The University of Tennessee, 3UT-ORNL Graduate School of Genome, Science and Technology, The University of Tennessee, 4Integrity Laboratories, 5Environmental Sciences Division, Oak Ridge National Laboratory, 6Department of Cell & Molecular Medicine, Rush Medical College, Rush University, 7Computer Science and Mathematics Division, Oak Ridge National Laboratory, 8Electrification and Energy Infrastructures Division, Oak Ridge National Laboratory, 9Now at Second Target Station Project, Oak Ridge National Laboratory, 10Neutron Technologies Division, Oak Ridge National Laboratory
* These authors contributed equally

Summary

Questo manoscritto descrive un protocollo per la radiografia neutronica e la tomografia computerizzata di campioni biologici utilizzando una linea di fascio CG-1D del reattore isotopico ad alto flusso (HFIR) per misurare un impianto metallico in un femore di ratto, un polmone di topo e un sistema radice erbacea / suolo.

Abstract

I neutroni sono stati storicamente utilizzati per una vasta gamma di applicazioni biologiche impiegando tecniche come lo scattering neutronico a piccolo angolo, l'eco di spin neutronico, la diffrazione e lo scattering anelastico. A differenza delle tecniche di scattering neutronico che ottengono informazioni nello spazio reciproco, l'imaging neutronico basato sull'attenuazione misura un segnale nello spazio reale che viene risolto nell'ordine di decine di micrometri. Il principio dell'imaging neutronico segue la legge di Beer-Lambert e si basa sulla misurazione dell'attenuazione dei neutroni di massa attraverso un campione. Una maggiore attenuazione è esibita da alcuni elementi leggeri (in particolare, idrogeno), che sono componenti principali dei campioni biologici. Agenti di contrasto come deuterio, gadolinio o composti di litio possono essere utilizzati per migliorare il contrasto in modo simile a come viene fatto nell'imaging medico, comprese tecniche come l'imaging ottico, la risonanza magnetica, i raggi X e la tomografia ad emissione di positroni. Per i sistemi biologici, la radiografia neutronica e la tomografia computerizzata sono state sempre più utilizzate per studiare la complessità della rete di radici sotterranee delle piante, la sua interazione con i suoli e la dinamica del flusso d'acqua in situ. Inoltre, sono stati esplorati gli sforzi per comprendere i dettagli di contrasto nei campioni animali, come i tessuti molli e le ossa. Questo manoscritto si concentra sui progressi nella bioimaging neutronica come la preparazione del campione, la strumentazione, la strategia di acquisizione dei dati e l'analisi dei dati utilizzando la linea di fascio di imaging neutronico CG-1D del reattore isotopico ad alto flusso. Le capacità di cui sopra saranno illustrate utilizzando una selezione di esempi in fisiologia vegetale (pianta erbacea / radice / sistema del suolo) e applicazioni biomediche (femore di ratto e polmone di topo).

Introduction

Il principio della radiografia neutronica (nR) si basa sull'attenuazione dei neutroni attraverso la materia che attraversano. A differenza dei raggi X che sono dispersi dalla nube elettronica di un atomo, i neutroni possono essere assorbiti o dispersi dal suo nucleo. I neutroni sono sensibili agli elementi leggeri, come l'idrogeno (H), e possono quindi essere utilizzati per radiografare applicazioni biologiche come animali 1,2,3,4,5,6,7 o tessuti umani 8,9 e sistemi sotterranei/radici10,11,12,13,14,15. L'imaging neutronico è una tecnica complementare all'imaging a raggi X, che è in grado di rilevare elementi pesanti16,17,18. L'nR basato sull'attenuazione è governato dai coefficienti di attenuazione lineare dei materiali all'interno del campione e dallo spessore del campione, come descritto dalla legge di Beer-Lambert, che afferma che il fascio trasmesso è direttamente proporzionale alla quantità di materiale e alla lunghezza del percorso attraverso il materiale. Quindi, la trasmittanza, T, può essere calcolata come:

Equation 1(1)

dove I 0 e I sono, rispettivamente, le intensità del fascio incidente e trasmessa; μ e x sono rispettivamente il coefficiente di attenuazione lineare e lo spessore di un campione omogeneo. Il coefficiente di attenuazione μ è dato da:

Equation 2(2)

dove σ è la sezione d'urto di attenuazione neutronica del campione (sia lo scattering che l'assorbimento), ρ è la sua densità, NA è il numero di Avogadro e M è la sua massa molare.

Il contrasto nella radiografia di campioni biologici che utilizzano neutroni a bassa energia (cioè energie inferiori a 0,5 eV) è dovuto principalmente a una variazione della densità di H (per uno spessore fisso del campione). Ciò è dovuto alla probabilità di interazione di un neutrone con il nucleo H, che è maggiore rispetto ad altri nuclei presenti nei campioni biologici, e al fatto che la densità dell'atomo H è fondamentale in quanto è l'atomo più abbondante nei campioni biologici.

Fin dalle sue fasi iniziali, la tomografia computerizzata nR e neutronica (nCT) è stata ampiamente utilizzata per materiali e applicazioni ingegneristiche 19,20,21,22,23. I primi esperimenti dimostrativi di sensibilità neutronica all'H in campioni biologici iniziarono a metà degli anni 195024 con le misurazioni di campioni vegetali. Il lavoro è continuato per tutto il 1960 con, ad esempio, la radiografia di un torace umano25 o ratti26, in cui è stato esplorato l'uso di agenti di contrasto, come l'ossido di gadolinio (Gd2O3). Inoltre, è stato ipotizzato che il contrasto nel tessuto tumorale umano rispetto al tessuto normale fosse dovuto ad un aumento locale del contenuto di H. Durante questi studi iniziali, si è concluso che l'aumento del flusso di neutroni e della risoluzione spaziale migliorerebbe la qualità di nR e probabilmente aumenterebbe la sua popolarità come tecnica complementare per applicazioni industriali o biomediche. Gli studi più recenti comprendono misurazioni di nR e nCT eseguite su campioni di tessuto tumorale1 e sezioni di organi animali 2,3,27 per applicazioni biomediche e forensi.

Situato presso l'Oak Ridge National Laboratory, Oak Ridge, TN, l'High Flux Isotope Reactor (HFIR) è una potente sorgente di neutroni che produce neutroni per reazione di fissione. Questi neutroni hanno energie dell'ordine di 2 MeV e vengono "raffreddati" nella piscina del reattore da reazioni cinetiche con acqua pesante per raggiungere energie dell'ordine di 100-300 eV. L'ottimizzazione di un esperimento neutronico, sia esso di scattering o imaging, inizia con la comprensione della sorgente di neutroni e delle proprietà della linea di fascio come l'intensità del fascio, la distribuzione dell'energia e l'effetto del fondo (neutroni veloci, neutroni ritardati, raggi gamma). Nella sala di guida fredda HFIR dove si trova la linea di fascio di imaging, i neutroni vengono ulteriormente "raffreddati" dalle interazioni cinetiche con un moderatore H liquido. Vengono quindi trasportati in un sistema di guida curvo lontano dalla linea di vista della sorgente, eliminando così neutroni veloci e inquinamento gamma. Come illustrato nella figura 1, la linea di fascio CG-1D per immagini neutroniche28,29 è posta su una guida fredda, il che implica che l'intervallo di energia dei neutroni varia da pochi meV a poche decine di eV (in questo caso, la corrispondente lunghezza d'onda neutronica utilizzabile varia da 0,8 a 10 Å) con un flusso nell'intervallo 107 n/(cm2∙s) nella posizione del campione. Un sistema motorizzato di apertura/diffusore definisce la geometria stenopeica dello strumento di imaging. I neutroni percorrono una distanza di 6,59 m in un tubo di volo riempito di elio (He) con finestre in alluminio (Al) su ciascuna estremità. I tubi di volo sono usati per trasportare neutroni limitando la dispersione dell'aria in modo tale che la perdita di intensità del fascio sia minima. Per le misure descritte in questo manoscritto, il diffusore è costituito da una nano-polvere di ossido di alluminio (Al2O3) di 1 mm di spessore 50 nm racchiusa in un contenitore di Al. Il diffusore riduce gli artefatti del fascio provenienti dalla guida neutronica (che sono ingranditi dalla geometria stenopeica di una linea di fascio di imaging), altrimenti forti fluttuazioni di intensità orizzontale e verticale sono visibili nella radiografia e la normalizzazione dei dati diventa difficile.   Per gli esperimenti qui illustrati, i neutroni vengono convertiti in luce usando un fluoruro di litio-6 di 25 μm di spessore / fosforo di solfuro di zinco (6LiF / ZnS: Ag).

L'ottimizzazione della collimazione dipende dalla posizione del campione al rivelatore, dalla risoluzione spaziale richiesta e dal tempo di acquisizione. Quando il campione si trova a pochi cm di distanza dallo scintillatore, collimazioni elevate (L/D superiore a 800, dove L è la distanza dall'apertura stenopeica del diametro, D, e dal rivelatore) producono una migliore risoluzione spaziale al costo del flusso neutronico. Una bassa collimazione (L/D inferiore a 800) è preferibile per studi dinamici in situ in cui la risoluzione temporale prevale sulla risoluzione spaziale. Per le misure descritte in questo manoscritto, L/D e la risoluzione spaziale erano rispettivamente di circa 355 e 75 μm. La risoluzione temporale variava in base al rapporto segnale-rumore (SNR). Il campione è stato posizionato il più vicino possibile allo scintillatore per ridurre la distorsione geometrica come la sfocatura. Sono disponibili fasi di traslazione e rotazione per posizionare il campione vicino ai rivelatori ed eseguire la tomografia computerizzata (TC). CG-1D offre tre tipi di rivelatori: un dispositivo ad accoppiamento di carica (CCD) con 2048 pixel x 2048 pixel con un pixel pitch di 13,5 μm, un rivelatore scientifico complementare a semiconduttore metallo-ossido (sCMOS) con 2560 pixel x 2160 pixel con un pixel pitch di 6,5 μm e un rilevatore a piastra a microcanali (MCP)30,31 con 512 pixel x 512 pixel con una dimensione dei pixel di 55μm. I neutroni diffusi vengono assorbiti con gomma di boro spessa ~ 5 mm per proteggere il chip del rivelatore dalla vista dei neutroni. Questo assorbimento genera raggi gamma che possono essere fermati dal piombo (Pb) posto tra la gomma di boro e il rivelatore. Ogni rilevatore è ottimizzato per un diverso campo visivo (FOV), nonché per risoluzioni spaziali e temporali. Per le misurazioni del femore di ratto e del polmone di topo, il rivelatore CCD è stato utilizzato per la sua grande capacità FOV (~ 7 cm x 7 cm) e una ragionevole risoluzione spaziale di circa 75 μm. L'nCT del sistema radice / suolo della pianta è stato eseguito con l'sCMOS, poiché l'obiettivo era quello di acquisire nCT il più rapidamente possibile al costo del FOV (che era limitato a ~ 5 cm x 4,2 cm); Quindi, la risoluzione spaziale evidentemente ne ha sofferto. In questi rivelatori, i neutroni vengono convertiti in luce o in una particella alfa per scopi di rilevamento. La rotazione del campione attorno al suo asse verticale e l'acquisizione di radiografie ad angoli di rotazione consecutivi consente l'acquisizione di nCT. Il modello volumetrico volumetrico 3-dimensionale del campione in esame è ottenuto utilizzando il notebook interno Jupyter filtered-back-projection (FBP) basato su python iMARS3D, pyMBIR o un software commerciale, tutti descritti di seguito.

Infine, i neutroni che non hanno interagito con il campione o il rivelatore vengono raccolti in una posizione di arresto del fascio a circa 1 m a valle del sistema rivelatore per ridurre al minimo il rumore di fondo. Il fermafascio CG-1D è largo 0,75 m, alto 0,5 m e spesso 35 mm ed è realizzato in resina epossidica B4C. L'arresto del fascio è rinforzato con 10 mm di carbonato di litio arricchito al 95% (6 Li2CO3) in una resina epossidica resistente al fuoco dove il fascio di neutroni colpisce, con una cavità rivestita con 6Li, piombo (Pb) e acciaio progettato per contenere l'alta velocità dei raggi gamma secondari. L'arresto del fascio è direttamente fissato alla parete di schermatura in acciaio della beamline. Una fotografia della linea di luce CG-1D è riportata nella Figura 2.

Tre software di ricostruzione sono stati utilizzati per ricostruire i tre dati sperimentali in 3D, rispettivamente. La ricostruzione del campione polmonare del topo è stata eseguita utilizzando Octopus32, un software di ricostruzione commerciale che utilizza FBP. Il software Octopus si trova su un PC server e può essere utilizzato per ricostruire i dati raccolti sulla beamline. Un software di ricostruzione, chiamato iMARS3D, è disponibile su CG-1D. Si basa sul codice open source TomoPY33 con funzionalità aggiuntive come la correzione automatica dell'inclinazione, i filtri di post-elaborazione, ecc. iMARS3D include la pre-elaborazione dei dati (sottrazione dello sfondo e del rumore), il ritaglio, il filtraggio mediano (per correggere gli attacchi gamma e i pixel morti), la correzione automatica delle fluttuazioni dell'intensità del fascio e la correzione dell'inclinazione del campione. Una volta creati i sinogrammi, un'ulteriore elaborazione dei dati come la rimozione dell'artefatto dell'anello e il livellamento sono un'opzione. I diversi passaggi della ricostruzione vengono salvati nel server di analisi (e successivamente spostati nella cartella condivisa della proposta), mentre le sezioni 2D finali vengono immediatamente archiviate nella cartella condivisa della proposta. Il femore del ratto è stato ricostruito utilizzando iMARS3D. Il campione di radice / suolo della pianta è stato pre-elaborato filtrando mediana i dati utilizzando TomoPY seguito dalla correzione dell'asse di inclinazione utilizzando la libreria SciPy di Python.  La ricostruzione è stata effettuata utilizzando un pacchetto python sviluppato internamente chiamato pyMBIR (costruito utilizzando kernel dal toolbox ASTRA34) che implementa una suite di algoritmi tomografici dalla linea di base FBP a tecniche avanzate di ricostruzione iterativa basate su modelli35 che possono ottenere ricostruzioni di alta qualità da set di dati neutronici estremamente sparsi e rumorosi. Tutti i volumi renderizzati basati sugli strumenti di ricostruzione di cui sopra sono rappresentati in contrasto di attenuazione. Tutta la visualizzazione è stata eseguita utilizzando il pacchetto software di visualizzazione commerciale, segmentazione e analisi dei dati AMIRA36.

Questo manoscritto ha lo scopo di dimostrare la procedura di utilizzo dell'imaging neutronico (nR e nCT) sulla linea di fascio HFIR CG-1D. Questo studio illustra anche le attuali capacità all'avanguardia di nR e nCT per campioni biologici, in particolare un polmone di topo, un osso di ratto e sistemi radice / suolo delle piante. Il polmone di topo è stato scelto per illustrare la complementarità dei neutroni per misurare il tessuto polmonare, mentre i raggi X sono per lo più sensibili alle ossa. Il campione osseo, un femore di ratto, aveva un impianto di titanio (Ti), illustrando così il contrasto tra l'osso e il metallo e l'opportunità di vedere l'interfaccia osso / metallo (che è difficile da misurare con i raggi X poiché i metalli li attenuano fortemente4). Infine, il sistema idrico delle radici delle piante illustra la capacità tridimensionale (3D) di nCT di misurare i sistemi radicali/suolo in situ. Mostra inoltre i vantaggi / svantaggi dell'utilizzo di nR per campioni biologici. Evidentemente, questo metodo può essere tranquillamente utilizzato per misurare la dinamica dell'acqua in un sistema di radici vegetali, ma non può essere considerato come un animale vivo o una tecnica di imaging umana a causa dei rischi associati all'esposizione alle radiazioni, limitando così gli studi a topi (morti) o misurazioni simili alla patologia in cui, ad esempio, un campione di tessuto viene resecato da un paziente (animale o umano) e preparato per fissazione prima di essere misurato in un fascio di neutroni.

Protocol

1. Configurazione dello strumento (vedi Figura 3, sezione 3)

  1. Sul computer beamline, aprire una finestra di terminale, digitare css, quindi premere Invio per avviare l'interfaccia utente.
  2. Se non è aperta per impostazione predefinita, scegliere l'opzione Home utente nella scheda Menu per aprire l'interfaccia di imaging del sistema di controllo industriale e di fisica sperimentale (EPICS).
  3. Utilizzando la prima scheda (denominata Proposta/Fotocamera/Dispositivo SE) dell'interfaccia, selezionare l'ottica beamline facendo clic sul pulsante Ottica accanto a Camera/Detectors, ovvero la dimensione del foro stenopeico e l'apertura del sistema di fenditura facendo clic sul pulsante Slits .
  4. Imbullonare lo stadio di rotazione sugli stadi XY, dove deve essere posizionato il campione, e posizionare il rivelatore (sCMOS o CCD).
    1. Per il CCD o il rivelatore sCMOS, selezionare l'obiettivo con l'ingrandimento che fornisce la risoluzione spaziale e la lunghezza focale desiderate, in consultazione con il team dello strumento. Utilizzando prima la luce, mettere a fuoco la fotocamera avvicinando o allontanando il rilevatore dallo specchio oppure sintonizzando manualmente l'obiettivo in una posizione fissa del rilevatore. Focalizzare l'immagine nella posizione dello scintillatore di neutroni.
    2. Per il CCD o il rivelatore sCMOS, mettere a fuoco l'obiettivo con neutroni utilizzando una maschera di risoluzione ad assorbimento neutronico37 posizionata contro lo scintillatore del rivelatore. Raccogliere radiografie successive utilizzando impostazioni diverse (ad esempio, diverse posizioni del rilevatore dallo specchio automatizzate spostando il motore del rilevatore in EPICS).
    3. Confronta le radiografie valutando le coppie di linee in ImageJ / Fiji39 o uno strumento software di immagini simile.
  5. Se del caso, fissare il campione in un contenitore adatto (contenitore Al e/o foglio Al per impieghi gravosi), posizionandolo sullo stadio di rotazione il più vicino possibile al rivelatore. Schermare il rivelatore e l'apparecchiatura utilizzando schermature neutroniche (gomma boro) e gamma (mattoni Pb).
  6. Misurare la distanza tra campione e rilevatore e rimuovere il campione. Sostituiscila con la maschera di risoluzione per valutare la dimensione dei pixel nella posizione del campione in questa configurazione della linea di luce. Utilizzando una dimensione nota della feature, valutate il numero di pixel nella feature per determinare la dimensione in pixel.
  7. Riposizionare il campione sullo stadio di rotazione.
  8. Utilizzando l'interfaccia EPICS e la scheda Allinea campione, allineare il campione con il fascio di neutroni eseguendo radiografie veloci (da ms a 1 s) mentre il campione è in movimento fino a quando non è in piena vista del rivelatore. Salvare il file di allineamento di esempio come file di .csv, che verrà riutilizzato prima dell'inizio della scansione CT.
  9. Prima di iniziare la scansione CT, utilizzare l'opzione Controllo allineamento CT automatizzato (nella scheda Allineamento ) per verificare che il campione rimanga nel campo visivo a diverse angolazioni valutando le radiografie generate con diversi orientamenti del campione con il fascio.

2. Preparazione dei campioni e strategia di acquisizione dei dati

NOTA: I protocolli di campionamento animale sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Tennessee per il polmone del topo e dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del Rush University Medical Center per il femore di ratto.

  1. Femore di ratto
    1. Impiantare aste Ti6Al4V (diametro 1,5 mm e lunghezza 15 mm) nei femori di ratti maschi di Sprague-Dawley, posizionandoli all'interno dello spazio intramidollare attraverso i condili femorali distali.
    2. Sacrifica i ratti dopo 12 settimane e raccogli i femori. Rimuovere tutti i tessuti molli (che contribuiscono all'attenuazione dei neutroni) e congelare i femori con impianti in garza imbevuta di soluzione salina. Immergere completamente le spugne di garza quadrate da 2 pollici in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e avvolgere completamente ogni campione in queste spugne imbevute (vedere la tabella dei materiali).
    3. Scongelare i femori a temperatura ambiente per le scansioni microCT a raggi X38, prima di trasportarli in uno stato congelato all'HFIR.
      1. Prima di nCT, scongelare il campione e portarlo a temperatura ambiente presso il laboratorio HFIR Biohazard Safety Level 2 (BSL2) situato vicino alla linea di fascio di imaging neutronico CG-1D. Una volta a temperatura ambiente, avvolgere il campione in un foglio di Al resistente e metterlo in un cilindro di Al.
      2. Posizionare il cilindro verticalmente sullo stadio di rotazione sulla linea di luce e scansionare il femore sulla linea di luce a temperatura ambiente da 0 a 360°, con un angolo di passo di 0,25°. Acquisire ogni radiografia per 50 s.
        NOTA: Considerando il tempo morto per il movimento dello stadio di rotazione e il trasferimento di ogni radiografia dal CCD al computer di acquisizione dati, il tempo totale della scansione è stato di circa 24 ore.
    4. Una volta completato l'nCT e autorizzato a rimuovere il campione dalla beamline, riportare il campione al laboratorio BSL2, rimuovere il contenimento e ricongelare il campione per conservarlo per ulteriori misurazioni sperimentali.
  2. Polmoni di topo
    1. Resecare il tessuto polmonare di un topo morto utilizzato per esperimenti non correlati a questo studio. Fissare il campione in una soluzione di etanolo al 70% prima degli esperimenti sui neutroni.
    2. Avvolgere il tessuto in un foglio di Al resistente e trasportarlo dal laboratorio BSL2 direttamente alla linea di luce CG-1D. Inserire il campione in un cilindro Al per un doppio contenimento e per mantenere la posizione del campione nel fascio durante la scansione nCT.
    3. Posizionare il campione vicino al CCD ed eseguire la scansione durante la notte a temperatura ambiente.
      NOTA: Ogni radiografia era di 150 s e l'angolo di passo della rotazione era di 0,5°, da 0 a 182°. Il tempo totale per la scansione è stato di circa 16 ore.
  3. Sistema erbaceo/suolo delle piante
    NOTA: Come per altri campioni biologici, i sistemi pianta-suolo sono di dimensioni limitate a causa della forte attenuazione dell'idrogeno, in particolare dell'acqua nel suolo o nelle radici delle piante. I semi o i ramet possono essere piantati in contenitori (Al o quarzo, entrambi con basse sezioni d'urto di attenuazione neutronica), oppure una pianta più matura può essere trapiantata in un contenitore.
    1. Scavare e trapiantare con cura un'erba locale che cresce in loco (qui, erba di gelso (Fatoua villosa (Thunb.) Nakai) in un contenitore Al di sezione trasversale di 2,38 cm x 2,58 cm, un'altezza di 6,3 cm, uno spessore della parete di 0,055 cm e contenente sabbia pura (SiO2).
    2. Risciacquare le radici delle piante con acqua deionizzata e visualizzarle con cura all'interno del contenitore Al mentre si riempie il contenitore con un impasto di sabbia bagnata.
      NOTA: Quando si riempiono i contenitori con terra, è importante utilizzare terreno umido, poiché il terreno asciutto si separerà in base alla dimensione delle particelle e creerà artefatti strutturali nei contenitori12,13.
    3. Dopo la semina, misurare il peso saturo del sistema vegetale e pesare il sistema vegetale ogni giorno per valutare il tasso di utilizzo dell'acqua. Applicare acqua sulla superficie superiore del terreno o attraverso una porta o un foro sul fondo del contenitore usando un tubo o una siringa.
      NOTA: Qui, il sistema vegetale è stato posizionato su una bilancia e l'acqua è stata applicata in cima ogni giorno per sostituire l'uso quotidiano di acqua in base al peso. L'acqua può essere trattenuta prima dell'imaging per ridurre il contenuto di acqua del suolo e migliorare il contrasto nelle radici.
    4. Propagare il sistema vegetale in una camera di crescita in loco con temperatura e luce controllate12. Mantenere il sistema vegetale per 1 settimana prima dell'imaging per consentire l'acclimatazione della radice della pianta al contenitore Al.
      NOTA: Una volta iniziata l'imaging, non innaffiare la pianta.
    5. Eseguire le scansioni nCT in ~ 1,75 ore ciascuna e scansionare continuamente per un periodo di 2,5 giorni per mappare i cambiamenti 3D dinamici nel contenuto di acqua del suolo e delle piante. Per queste misurazioni, ridurre la risoluzione spaziale a poche centinaia di μm a favore della risoluzione temporale (cioè, un tempo di acquisizione più veloce per ogni proiezione).
      NOTA: Ogni scansione TC è stata eseguita con un angolo di rotazione di 0,93° e un tempo di acquisizione di 10 s per proiezione. Ai fini di questo manoscritto, viene presentata solo la prima scansione TC.

3. Acquisizione dei dati

NOTA: Il sistema di acquisizione dati di CG-1D utilizza il software EPICS40. EPICS è sviluppato per guidare il protocollo sperimentale e ridurre al minimo l'errore umano; questa interfaccia esegue logicamente i diversi passaggi necessari prima di misurare un campione, come illustrato nella Figura 3.  Il protocollo di acquisizione dati EPICS è il seguente (Figura 3). La sezione sinistra fornisce lo stato dell'esperimento in corso, insieme alle posizioni dei motori e ai dettagli dell'esperimento (informazioni sull'esempio, numero della proposta e membri del team). Ogni esperimento è associato a un numero di proposta e a uno o più campioni. Le informazioni sulla proposta come i membri del team e il nome del campione selezionato sono disponibili anche sul lato destro (prima scheda denominata "Proposta/Fotocamera/Dispositivo ambiente campione"). La sezione centrale comprendeva la radiografia corrente con una barra di scala della gamma dinamica sul lato, insieme alle informazioni sullo stato e sul registro sotto l'immagine.

  1. Selezionare la prima scheda EPICS intitolata Proposta/Fotocamera/Dispositivo SE. Fare clic sul pulsante Cambia proposta o campione. Selezionare il numero di progetto e l'ID di esempio# da misurare nell'elenco delle proposte (a sinistra) e nell'esempio (a destra) che hanno sostituito la scheda precedente.
  2. Utilizzare la freccia indietro per tornare all'interfaccia EPICS principale. Selezionare il rilevatore da utilizzare (sCMOS o CCD) scegliendo uno dei quattro rivelatori disponibili (Andor CCD, Andor sCMOS, SBIG CCD o MCP) nell'elenco delle opzioni Camera/Rivelatore .
    NOTA: Il CCD SBIG viene utilizzato per il test dallo strumento e può essere ignorato per il presente manoscritto.
  3. Selezionare la fase di rotazione da utilizzare nella sezione Dispositivo ambiente di esempio .
    1. Innanzitutto, fare clic su Fase di rotazione (scansione CT) nell'elenco Dispositivo ambiente di esempio . Quindi, selezionare una delle fasi di rotazione (che corrisponde al campione da scansionare).
  4. Infine, nella parte inferiore della scheda, seleziona la modalità di acquisizione dati. In questo caso, selezionare la prima opzione, White Beam.
    NOTA: La modalità di acquisizione è a fascio bianco (prendendo l'intera gamma di lunghezze d'onda neutroniche) o monocromatica sulla linea di fascio CG-1D.
  5. Selezionare la seconda scheda EPICS denominata Allinea campione. Digitare un nome di file di esempio e premere INVIO. Ripetere la procedura per il nome della sottocartella.
    NOTA: L'interfaccia EPICS è programmata per salvare automaticamente i dati nelle directory sperimentali appropriate, che il software di ricostruzione interno utilizza per produrre fette 2D (2D) dell'oggetto 3D in esame. La seconda scheda, Allinea campione, consente l'allineamento del campione utilizzando radiografie che durano solo pochi secondi in quanto queste radiografie non vengono utilizzate in seguito per l'elaborazione e l'analisi dei dati. Una volta che tutti i motori sono posizionati correttamente, le loro posizioni possono essere salvate in un formato di file .csv; pertanto, ogni allineamento del campione ha il suo corrispondente file .csv che può essere richiamato per posizionare i campioni per le scansioni TC in un secondo momento.
  6. Salta l'allineamento dei tre motori, cioè supponi che il campione sia allineato e pronto per la TC. Selezionare il tempo di acquisizione desiderato e fare clic sul pulsante Scatta immagini rapide . Raccogliere una serie di radiografie con tempi di acquisizione diversi per valutare SNR.
  7. Apri ImageJ/Figi; Trascina e rilascia le diverse radiografie. Tracciare un profilo che va dal campione a un'area aperta; valutare SNR.
  8. Se sullo stage XY sono impostati più campioni (più fasi di rotazione, ciascuno per un campione), registrare ogni posizione del campione dopo l'allineamento e salvare i dati come file .cvs facendo clic sul pulsante Salva in un file .
  9. Selezionare la terza scheda EPICS intitolata Raccogli dati per impostare i parametri di scansione CT. Digitare un nome di file nella prima riga scrivibile e premere INVIO. Ripetere l'operazione per il nome della sottocartella.
    NOTA: il layout della scheda Raccogli dati dipende dalla selezione di una serie di radiografie a tempo trascorso (senza SE) o scansioni TC (selezione di uno stadio di rotazione) nella prima scheda.
  10. Nella sezione Allinea esempio utilizzando il file salvato, selezionare il file che in precedenza ha registrato le posizioni del motore di esempio (passaggio 1.8). Utilizzare i file salvati di recente per sfogliare i file di allineamento di esempio salvati di recente . Fare clic su Allinea utilizzando file per far tornare il campione in posizione nel fascio di neutroni.
  11. Calcolare il numero di proiezioni richieste per la TC in base al teorema di campionamento di Nyquist. Calcolate il numero di pixel attraverso la dimensione orizzontale del campione e moltiplicate per 1,5 per ottenere il numero di proiezioni necessarie per eseguire il campionamento di Nyquist.
  12. Immettere l'angolo di inizio rotazione (in genere 0°), l'angolo finale di rotazione (di solito 180°), la dimensione del passo di rotazione, il numero di immagini per passo (in genere impostato su 1) e il tempo di esposizione per ogni immagine. Avviare la scansione CT facendo clic sul pulsante Raccogli dati .

4. Ricostruzione del volume ed elaborazione/analisi dei dati

NOTA: Tutti gli strumenti software CG-1D per la normalizzazione, la ricostruzione e l'analisi dei dati sono disponibili sul repository Python della struttura ORNL e sui server di analisi della struttura. Per le misurazioni 2D, la pre-elaborazione può essere eseguita utilizzando i notebook Jupyter Python41. Un'illustrazione di un blocco appunti è disponibile nella Figura 4. È possibile caricare e visualizzare in anteprima i propri dati prima di selezionare una regione di interesse al di fuori del campione che viene utilizzata per normalizzare a 1 (o 100%) trasmissione qualsiasi fluttuazione del fascio. Questi quaderni possono essere adattati a ogni misurazione, rendendo la pre-elaborazione uno sforzo semplice. Inoltre, l'analisi 2D può essere eseguita nello stesso notebook, ad esempio monitorando i cambiamenti cinetici (cioè l'assorbimento di acqua in un campione) in un campione nel tempo.

  1. Accedere al server di analisi Linux utilizzando il nome utente e la password. Aprire il browser Web e digitare jupyter.sns.gov.
  2. Aprire il notebook python Jupyter denominato iMARS3D. Eseguire le prime righe del codice (che carica gli strumenti necessari per eseguire iMARS3D). Carica dati, campo piatto e scuro. Verificare che tutti e tre i set di dati siano caricati correttamente.
  3. Procedere con il ritaglio dei dati, il filtraggio (se necessario), la normalizzazione (con correzione automatica dell'inclinazione del campione) e la ricostruzione volumetrica (un processo lungo). Salvare i dati nella cartella del numero di progetto denominata Condiviso. Dopo aver attivato AMIRA36, disponibile anche sui server di analisi della struttura, caricare le sezioni ricostruite nel software e procedere con la visualizzazione, l'ulteriore filtraggio e l'analisi.

Representative Results

La figura 5A è una fotografia di un femore rappresentativo di ratto di dimensioni simili a quello misurato; La figura 5B,C rappresenta la nCT del femore di un ratto con l'impianto Ti. La Figura 5B mostra la nCT basata sull'attenuazione del falso colore del femore, mentre la Figura 5C rappresenta un taglio diagonale attraverso l'osso con lo stesso orientamento della Figura 5B per rivelare l'impianto Ti (in scala di grigi) simile a una TC medica a raggi X. Questo impianto non interagisce con i neutroni tanto quanto il materiale osseo; Pertanto, la sua attenuazione è minima e appare più scura (cioè meno attenuante) dell'osso circostante. L'osso trabecolare, che è presente all'interno dello spazio midollare del femore, è chiaramente visibile all'estremità prossimale del campione (frecce rosse nella figura 5B).

La figura 6A,B mostra fotografie rappresentative del polmone di topo fissato con etanolo, in due diverse posizioni, utilizzato per nCT per dimostrare la capacità dei neutroni di rilevare campioni di tessuti molli. Il volume ricostruito del polmone di topo ottenuto da nCT è mostrato in Figura 6C,D, posizionato in modo simile alla Figura 6A,B. Un taglio attraverso il lobo destro del polmone è illustrato nella Figura 6E. Nonostante le dimensioni relativamente piccole del campione, la sensibilità ai neutroni è chiaramente dimostrata da una rilevazione della struttura del polmone a ~ 75 μm di risoluzione spaziale. Come previsto, la gamma di attenuazione è piuttosto ampia, con una grande porzione corrispondente a un'attenuazione neutronica da bassa a media poiché i polmoni hanno una struttura simile a una spugna contenente aria.

La Figura 7A mostra una fotografia del campione vegetale, mentre la Figura 7B rappresenta la resa volumetrica a falsi colori del sistema radice / suolo della pianta in un contenitore rettangolare Al (che non è visibile perché Al è per lo più trasparente ai neutroni). Rispetto ai set di dati precedenti, SNR è più scarso, come previsto, poiché i dati sono stati acquisiti più velocemente per tracciare i movimenti dinamici dell'assorbimento di acqua nella radice in 3D in 2,5 giorni. Pertanto, ogni scansione TC è stata ottimizzata per essere misurata entro una finestra di ~ 1,75 ore. Nonostante la scarsa SNR, il sistema radicale nel suolo è chiaramente visibile nei tagli verticali del campione visualizzati nella Figura 7C,D in falsi colori.

Figure 1
Figura 1: Disegno schematico della linea di fascio di immagini neutroniche HFIR CG-1D. Il fascio di immagini è definito dal sistema di apertura che definisce la geometria di un fascio di cono. Il fascio viene trasportato attraverso un tubo di volo riempito di He con raschiatori per rimuovere neutroni vaganti indesiderati. Un rivestimento in gomma borata all'interno del tubo di volo diminuisce lo sfondo dalle linee di luce vicine. Abbreviazioni: HFIR = High Flux Isotope Reactor; He = elio; L = distanza dall'apertura stenopeica del diametro, D e dal rivelatore. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: L'impianto di imaging neutronico CG-1D presso il reattore isotopico ad alto flusso. La fotografia mostra, davanti a destra a sinistra, i tubi di volo, l'area del campione e l'arresto del fascio. Il fascio di neutroni proviene dal lato destro della fotografia. Il tubo di volo è stato firmato dalle comunità scientifiche e di ricerca industriale che utilizzano lo strumento. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Interfaccia EPICS. L'interfaccia CG-1D EPICS è divisa in tre sezioni: la sezione di stato (a sinistra), l'area di visualizzazione (in questo esempio, una radiografia grezza di una meridiana nautica in ottone) e l'input dei parametri per l'imaging 2D e 3D. Abbreviazioni: EPICS = Fisica Sperimentale e Sistema di Controllo Industriale; 2D = bidimensionale; 3D = tridimensionale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Screenshot di un notebook Jupyter. Questo quaderno viene utilizzato per visualizzare in anteprima una serie di radiografie prima di normalizzarle. In questo esempio, viene visualizzata la stessa meridiana nautica in ottone mostrata nella Figura 3 . Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Femore di ratto con impianto in titanio. (A) Fotografia di un femore di ratto rappresentativo. (B) Volume reso in 3D del femore di ratto ottenuto da nCT. (C) Fetta diagonale che mostra l'asta di titanio all'interno del femore. Le frecce rosse mostrano l'osso trabecolare. Le barre della scala sono presentate rispettivamente dagli assi x e y. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Polmone di topo nCT. (A) e (B) Fotografie rappresentative del polmone di topo. (C) e (D) Volume del mouse sottoposto a rendering 3D basato sull'attenuazione utilizzando lo stesso posizionamento di (A) e (B). (E) Fetta rappresentativa attraverso il lobo destro del polmone di topo (D) che mostra una struttura del polmone ottenuta con un diverso gradiente di attenuazione neutronica (per lo più bassa attenuazione). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 7
Figura 7: Tomografia computerizzata a neutroni e fette attraverso il sistema radice della pianta/suolo . (A) Fotografia del campione di pianta. (B) Volume reso in 3D dalla tomografia computerizzata a neutroni della pianta che mostra il fusto fuori terra e il sistema del suolo con acqua (in rosso). (C) e (D) sono tagli attraverso il campione angolato per mostrare il fusto e le radici nel terreno (frecce rosse). Le aree blu più scure nel terreno indicano la presenza di acqua. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Discussion

La radiografia neutronica e la TC di campioni biologici sono tecniche di imaging promettenti che sono complementari all'imaging a raggi X o alla risonanza magnetica. Le fasi critiche nell'esecuzione di un esperimento di imaging neutronico di un campione biologico sono legate alla sua preparazione e al suo contenimento sulla linea di fascio. L'ottimizzazione di un esperimento è guidata dalla domanda scientifica a cui rispondere. Se la questione scientifica richiede un'alta risoluzione spaziale per osservare un fenomeno, sono necessari lunghi tempi di acquisizione e lo svantaggio di nCT (con campo visivo di dimensioni cm) è che ci vogliono ore per eseguire una scansione. Ciò è dovuto principalmente alla differenza nel flusso complessivo di neutroni disponibile in un reattore rispetto a una sorgente di sincrotrone, dove le scansioni TC a raggi X possono richiedere da secondi a minuti per un campo visivo di pochi mm2 . Sebbene il metodo possa essere applicato a campioni di tessuto ex vivo estratti da animali, non può essere esteso in vivo ad animali vivi o all'uomo a causa del rischio di esposizione alle radiazioni (come i raggi gamma prodotti dai neutroni e le interazioni neutroniche con gli atomi del campione). Tuttavia, è adatto per l'imaging delle interazioni radice / suolo delle piante (Figura 7) come le dinamiche di assorbimento dell'acqua.

Il vantaggio di utilizzare la nCT veloce per la dinamica delle piante è la sensibilità all'H nell'acqua e l'assenza di danni da radiazioni alla pianta, a differenza della TC a raggi X. Inoltre, un contrasto unico può essere osservato dall'uso di neutroni in campioni ossei / metallici come un femore di ratto in cui il metallo è relativamente trasparente rispetto ai tessuti circostanti (Figura 5), evitando potenzialmente artefatti metallici indotti da raggi XCT 39. I tessuti animali, come il polmone di topo (Figura 6), mostrano un'impressionante rilevazione della struttura dei tessuti molli perché i neutroni sono sensibili all'H, ma la risoluzione spaziale è in qualche modo il fattore limitante in queste misurazioni. Il contrasto è fornito dagli atomi di H presenti nei campioni biologici19,39.

Con i progressi di nuove tecniche come l'interferometria a reticolo neutronico e il miglioramento della risoluzione spaziale (pochi micron sono stati recentemente riportati42,43) l'imaging neutronico può offrire ancora nuovi meccanismi di contrasto per i tessuti biologici con una migliore risoluzione spaziale. L'esplorazione di neutroni ad alta energia (per consentire la misurazione di campioni spessi) promette anche la capacità di misurare sezioni più grandi di un tessuto animale come un topo intatto, offrendo così nuove possibilità per la ricerca biomedica.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Parte di questa ricerca ha utilizzato risorse presso l'High Flux Isotope Reactor, gestito dall'ORNL e sponsorizzato dal Dipartimento dell'Energia degli Stati Uniti, Office of Science, User Facilities, sotto contratto DE-AC05-00OR22725 con UT-Battelle, LLC. Parte di questa ricerca è stata sostenuta dall'ORNL attraverso il programma Eugene Wigner Distinguished Staff Fellowship. Questa ricerca è stata sponsorizzata anche dal DOE Office of Science, Office of Biological and Environmental Research. I campioni femorali di ratto sono stati ottenuti da esperimenti eseguiti in collaborazione con il Dr. Rick Sumner presso il Rush University Medical Center con finanziamenti ottenuti dal NIH (R01AR066562) e dal premio Orthopedic Research and Education Foundation-Smith and Nephew. Il team vuole ringraziare i team di supporto HFIR che consentono l'uso delle linee di fascio di diffusione dei neutroni.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aluminum containers custom Made from aluminum plates or tubing (alternate is quartz), plant and mouse sample
Aluminum foil Fisher 01-213-100 Mouse lung sample containment
Deionized water or deuterium oxide Water or D2O can be used to enhance contrast, plant sample
Ethanol Fisher 04-355-223 Mouse lung sample
Gauze sponges CardinalHealth Fully submerged in phosphate-buffered saline (PBS) and used to wrap samples, rat femur sample
Growth chamber Conviron A1000 Any growth chamber or greenhouse with controlled conditions would work, plant sample
Laboratory balance Weighing plant system can be used to measure actual water content in the soils, plant sample
Pure silica sand US Silica Co. Flint#13 Pure SiO2 provides low neutron attenuation compared to soils, plant sample
Sprague-Dawley Rats Harlan Order Code: 002-US Rat femur sample
Titanium Rod Goodfellow TI007905 Rat femur sample

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