Summary
Denne studien presenterer metoder for å studere patomorfologiske og molekylære mekanismer underliggendekikærter- Rhizoctonia bataticola interaksjon. Blotting papir metoden er nyttig for å raskt studere kikærter genotype svar, mens syke potten-basert metode kan brukes til å samtidig pålegge tørke og R. bataticola infeksjon og skjerm for tolerant genotyper.
Abstract
Tørr rot råte (DRR) sykdom er en fremvoksende biotisk stress trussel mot kikært dyrking rundt om i verden. Det er forårsaket av et jordbåren sopppatogen, Rhizoctonia bataticola. I litteraturen er omfattende og detaljerte trinnvise protokoller om sykdomsanalyser sparsomme. Denne artikkelen inneholder fullstendige detaljer om trinnene som er involvert i å sette opp en blotting papir teknikk for raskt screening genotyper for motstand mot DRR. Blotting papir teknikken er enkel og billigere. En annen metode, basert på den syke potten tilnærming, er en etterligning av naturlig infeksjon og kan brukes til å studere de interagerende komponentene- plante, patogen og miljø- involvert i sykdommen trekanten.
Videre, i naturen, drr forekommer det meste i rainfed kikært dyrking områder, hvor jord fuktighet trekker seg tilbake som avling vekst fremskritt. Tørke stress er kjent for å predisponere kikærter planter til DRR sykdom. Patologisk og molekylær forståelse av plante-patogen interaksjon under tørke stress kan bane vei for identifisering av elite DRR-resistente varianter fra kikærter germplasm bassenget. Denne artikkelen gir en trinnvis metodikk for fremstilling av en sykepotte og påfølgende sykdomsanalyse. Samlet sett vil informasjonen som presenteres her, hjelpe forskere med å forberede R. bataticola soppinokuleum, opprettholde dette patogenet, sette opp blotting papirteknikken, forberede sykekultur og sykepott, og vurdere patogen infeksjon i kikærtplanter.
Introduction
Tørr rot råte (DRR) er en av de økonomisk signifikante sykdommene i kikært1,2. Det er en rotspesifikk sykdom forårsaket av Rhizoctonia bataticola (teleomorph, Macrophomina phaseolina). Infiserte planter mangler laterale røtter og har sprø taproots og gult løvverk1,3. DRR under tørke stress har blitt rapportert å være en fremvoksende trussel mot kikært dyrking1,2,3. Videre er DRR forekomsten rapportert å bli forverret under tørke stress under feltforhold1,2,3. DRR er mer utbredt i regnvær enn i vanning felt4. Utnyttelsen av resistente varianter er måten å overvinne sykdommen og omgå soppdrepende bruk1,13. Fordi kikærter germplasm tilgjengelig over hele verden havner genetisk variasjon for egenskapen5,screening og identifisering av resistente / utsatt genotyper er avgjørende for molekylær avl for avling forbedring.
Robuste, enkle og kostnadseffektive sykdomsanalyser er avgjørende for å undersøke R. bataticola infeksjonsmønstre i kikærter. Den primære sykdomsanalysen som brukes til å observere responsen fra kikærtgenotyper til R. bataticolainfeksjon er blotting papirteknikk1,4. Det er en enkel teknikk og kan utføres ved hjelp av flytende soppinokuleum, frøplanter med røtter og sterilt blottingpapir. Denne teknikken har imidlertid ikke blitt brukt til det maksimale fordi ingen trinnvis-protokoll er tilgjengelig i litteraturen.
I mellomtiden innebærer sykepottteknikken utarbeidelse av en potensiell syk kultur og ileggelse av tørkestress. Gitt at tørkestress forverrer DRR sykdomsforekomst3, er det viktig å studere plante-patogene interaksjon under tørke stress6,7. Sykepotteteknikken gir plattformen for en slik samtidig studie, noe som fremmer bedre muligheter for germplasmscreening og forståelse av det mekanistiske grunnlaget for samspillet. Patologiske endringer som en økning i rotlengde og reduksjon i lateral rotnummer - iboende til DRR sykdom - kan løses ved hjelp av syke pottenteknikk 1,3,7.
Her presenteres en detaljert protokoll for blotting papir og sykepotteteknikker, som kan brukes til å studere samspillet mellom kikærter og R. bataticola og screen kikærterkimplasm. Detaljene i materialene som brukes i studien er gitt i Materials tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Isolering av R. bataticola og lagring
- Detaljer om kikærtgenotype og DRR symptomer
- Bruk kikærtplanter (genotype, JG 62) som vanligvis viser typiske DRR symptomer, for eksempel tørr, sprø primærrot uten laterale røtter og mikrosklerotia under barken og inne i pith1,3.
- Innsamling og vasking
- Uproot planter som viser symptomer som tørr halm-farget foliar og sprø primær rot med mikrosklerogi under epidermis laget. Mens du rykker opp, vil en stor del av røttene forbli inne i jorden som de infiserte røttene er sprø. Fjern grov jordrester festet til roten. Klipp røttene separat og samle dem i papirkonvolutter (27,5 cm x 12 cm) med riktig etikett og legg dem i en prøveoppsamlingsboks.
- Etter å ha transportert prøver til laboratoriet, legg røttene i et 200 ml beger og dekk med mesh (Nylonnett med porestørrelsen på 3 mm diameter), og vask røttene grundig med rennende vann fra springen for å fjerne vedfyring av jordpartikler.
- Bruk omvendt osmose (RO) vann til å skylle en gang på slutten.
- Overflatesterilisering
- Bryt røttene i fire stykker med 2 cm lengde hver med et skalpellblad og legg dem i et rent 200 ml beger.
- Monter autoklavet RO-vann, 2 % NaOCl, kasseringskannen og autoklavet blottingpapir (5 cm2) inne i laminærstrømningskammeret.
- Vask røttene med 50 ml autoklavet RO-vann tre ganger og deretter med 50 ml 2% NaOCl i 10 min. Vask røttene med 50 ml RO-vann tre ganger igjen for å fjerne NaOCl.
- Blot tørke røttene ved å plassere røttene på autoklavet blotting papir og la til røttene er tørket.
- Medier og inkubasjon
- Fjern kantene på røttene med et sterilisert skalpellblad. Del røttene ved hjelp av bladet og bruk de steriliserte tangene til å plassere dem på en potetdekstrosegar (PDA) media Petri plate som inneholder streptomycinsulfat (50 mg L-1) og ampicillin (50 mg L-1).
- Lukk platen, forsegle med parafilm, og inkuber i en inkubator ved 28 °C i to dager i mørket.
- Bindestrek metode
- Etter to dager med inkubasjon, ta platene inn i laminært strømningskammeret. Skjær spissen av bindestrekveksten8 under et stereomikroskop (Leica EZ4 pedagogisk stereomikroskop) og overfør den til en frisk PDA-plate med streptomycinsulfat og ampicillin.
- Inkuber platene i inkubatoren ved 28 °C i ti dager i mørket.
- Lagring og vedlikehold av R. bataticola sopp inoculum
- Lag PDA skrånende i testrør og overføre en sopp agar plugg fra en ti dager gammel kulturplate ved hjelp av flammen sterilisert inokulasjon loop. Forsegle testrørhetten med parafilm.
- Inkuber skrånende ved 28 °C i ti dager i mørket.
- Forsegle hetten med parafilm igjen og oppbevar den ved 4 °C i kjøleskapet for fremtidig bruk.
- Subkultur hver sjette måned for å opprettholde soppen.
- Vedlikehold av virulens
- Infisere plantene med ren soppinokus tilberedt som nevnt i sykepotten teknikk3. Isoler den samme soppen fra de infiserte plantene (Kochs postulater)9 og bruk til videre eksperimenter.
MERK: I denne studien ble det brukt en feltisolert stamme av soppen (GenBank: MH509971,1 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MH509971)
- Infisere plantene med ren soppinokus tilberedt som nevnt i sykepotten teknikk3. Isoler den samme soppen fra de infiserte plantene (Kochs postulater)9 og bruk til videre eksperimenter.
2. Blotting papir teknikk
MERK: Blotting papirteknikken innebærer fremstilling av flytende soppinokuleum, frøplantepreparat og sykdomsvurdering.
- Fremstilling av flytende R. bataticola inokuler
MERK: Flytende R. bataticola soppinkulum inneholder både mycelia og mikroskleroopi. Begge disse strukturene fungerer som primær inoculum.- Forbered 500 ml PDB-medier i en 1000 ml kolbe og autoklav den på 121 lbs i 15 min.
- Etter at mediet er avkjølt, inokulerer buljongen med en løkkefull sopp agarplugg fra en soppskråkultur og inkuber ved 28 ° C i fem dager i en shaker ved 180 rpm i mørket.
- Monter et autoklavet glass eller plasttrakt (10 cm), en-liters konisk kolbe og to lag mesh (10 cm2 størrelse) (Nylonnett med porestørrelse på 3 mm diameter) på bordet. Filtrer ut soppmycelia og mikrosklerothet ved hjelp av nettet. Blot tørke soppen i autoklavet blotting papir.
- Vei 100 g mycelia for 50% inoculum og hold ved romtemperatur.
- Utarbeidelse av kikærter plante
- Velg 50 sunne frø (i denne studien ble DRR-utsatt genotype JG 62 brukt), plasser dem i et 100 ml beger, og dekk med et nett.
- Vask frøene med vann fra springen først for å fjerne jordavfall.
- Ta begeret med frø inn i laminærstrømningskammeret og vask dem med sterilisert 50 ml RO-vann tre ganger i 1 min per vask.
- Steriliser frøene med 50 ml 2% vandig NaOCl i 2 min med kontinuerlig risting og vask frøene med 50 ml sterilisert vann fem ganger i 1 min hver.
- Fyll en polyetenpose (47,5 cm x 25 cm) med Soilrite (en blanding av hagebruksgrad utvidet perlite, irsk torvmose og eksfoliert vermikulitt i like forhold, det vil at 1/3:1/3:1/3), så den overflatesteriliserte 50 frøene to cm dyp, og hold i et vekstkammer/rom med 28 °C ± 2 °C temperatur, 16 t fotoperiode med en lysintensitet på 150 μmol m-2 s-1og relativ fuktighet på 70 %. Vann dem med RO vann og rykke plantene åtte dager etter såing.
- Vask røttene i vann fra springen for å fjerne Soilrite-partiklene. Skyll røttene med sterilisert RO-vann, og hold dem i RO-vannet i et 1000 ml beger.
- Tilberedning av blotting papir i skuffer
- Ta et blotting papir og kutte dem i stykker (30 cm × 23 cm) i tilstrekkelig antall for å møte replikeringer.
- Pakk arkene i autoklaverbar polyetenpose og autoklav dem på £ 121 i 15 minutter og hold det i en varmluftsovn for tørking.
- Brett hvert blotting papirark i to.
- Plasser papiret på et rent, åndspenst plastbrett, som vist i figur 2i-iv.
- Plante inokulasjon ved å dyppe
- Oppløs 100 g soppinkulum i 200 ml autoklavet RO-vann i et 200 ml beger for å oppnå 50 % inokuleum.
- Dypp planterøttene i det tilberedte inokulumet i 1 min med intermitterende opp-og-ned-bevegelse for å sikre jevn feste av soppinokuleum.
- Plassere plantene i blotting papiret
- Fukt undersiden av blottingpapiret plassert på brettet med sterilt RO-vann. Plasser plantene på papiret på en måte der bare røttene er dekket av papiret, og skudd er utelatt.
- Lukk det ved å brette oversiden av blotting papiret og våt hele papiret for å gi nok vann til å opprettholde plantevekst.
- Vann brettet én gang om dagen og oppbevar brettene ved 28 °C. Vær oppmerksom på symptomer som nekrose, rotråte og bladgulering daglig.
3. Sick pot teknikk
MERK: Sykepotteteknikken innebærer fremstilling av virulent inokum og en sykepotte, vedlikehold av fuktighetsnivå og vurdering av sykdomssymptomer.
- Utarbeidelse av substrat
- Ta en kg av noen kommersielt tilgjengelige kikærtfrø. Fjern infiserte frø (frø med soppvekst, infeksjonsflekker og insektskader). Legg dem i 5 L plastbeger og vask med vann fra springen grundig 3–4 ganger for å fjerne store rester.
- Vask frøene med 2 L RO vann tre ganger og suge 1 kg frø i en 5 L beger med tredelt mer vann i fem timer.
- Når frøene imbibed vannet, vaske dem med RO vann tre ganger for å fjerne frø exudates.
- Fjern vannet helt og pakk frøene i syltetøyflasker (300 ml, 12 cm høyde, 6 cm diameter og 155 g vekt) til ca 1/4kapasitet (100 g per syltetøyflaske) og lukk flaskene med caps. Pakk ti syltetøyflasker i en autoklaverbar plastpose (48 cm x 30 cm) autoklav to ganger ved 121 lbs i 15 min kontinuerlig.
- Tørk frøene ved 40 °C i en ovn over natten for å fjerne vanndråpene inne i flasken.
- Utarbeidelse av sykekultur
- Slå på BSL-2 nivå laminær strømningskammer. Tørk gulvet grundig med 70% etanol, og slå på UV i 15 min. Deretter holder frøene inne i laminærstrømningskammeret.
- Ta 10-dagers gammel nyisolert R. bataticola kultur (del 1). Deretter tar du tre sopp agar plugger (4 mm diameter) ved hjelp av en steril pipette tips eller kork borer, og sette dem i syltetøy flasker aseptisk. Dekk flaskene med caps og forsegle med parafilm.
- Rist flaskene for å blande soppskiven med kikærtfrøene jevnt.
- Inkuber flaskene ved 30 °C i 15 dager i mørket.
- Ta syltetøyflasker med svart soppvekst (figur 4iii) og overfør den syke kulturen (frø med mikrosklerotia) fra syltetøyflasker til et glass Petri plate ved hjelp av sterile tang. Tørk dem ved romtemperatur i to dager i et glass Petri plate.
- Pulver soppmassen ved hjelp av en mørtel og pestle, og lagre pulveret ved 4 °C.
- Autoklave Soilrite to ganger på £ 121 i 15 min.
- Tørk den autoklave jordrittblandingen under en parasform.
- Bland sopppulveret med Soilrite på 50% m / w, fyll pottene med blandingen, og hold dem ved romtemperatur i en dag.
- Så en overflatesterilisert DRR-mottakelig kikærtfrø per gryte (10 cm runde potter) (Table of Materials) og opprettholde et fuktighetsnivå på 80% feltkapasitet (FC).
- Vær oppmerksom på symptomer som nekrose og rotrot ved å rykke opp plantene etter spiring.
- Vurdering av sykepotten effektivitet
MERK: Planter viser gule foliar symptomer når røttene er helt råtten.- Utvikle en sykdomscore basert på lesjonen (nekrotiske flekker) (Supplerende figur 2C) tall og alvorlighetsgraden av rotråte. Syke potter som viser 90% plantedød kan brukes videre.
- Genotype screening
- Forbered sykekulturen i store mengder og bland den enten med sterilisert jordsmonn eller jordsmonn (5 % w/w) i 30 cm høye potter. Vann pottene for å våt overflaten og la dem uforstyrret i syv dager.
- Så ett overflatesterilisert frø per 10 cm rund gryte og tre frø per 30 cm runde potter og vann dem tilstrekkelig.
- Vær oppmerksom på de gule foliar- og rotrotsymptomene.
- Kombinert tørke og R. bataticola infeksjon
- Pålegge tørke stress ved å følge protokollene nevnt i Sinha et al. (2019).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne studien hadde som mål å demonstrere teknikker som blotting papir og syke potten teknikker for å lette patologisk og molekylær forståelse av plante-patogen interaksjon under tørke stress. For å oppnå dette ble planter som viser DRR symptomer1,3,4 samlet inn fra et kikærtfelt, og soppen ble isolert ved hjelp av bindestrekmetoden8. R. bataticola soppkultur vises mørk grå på PDA-platen og skrår på fire dager etter inkubasjon (figur 1A & C) og mørkere i grå farge i PDB-mediet på fem dager etter inkubasjon ( figur1B). R. bataticola har septate mycelia (Figur 1D), og det produserer mikroskleroopi (Figur 1E), som fungerer som primær inoculum ijorda 10.
Trinnene i figur 2 ble fulgt for å utføre blotting papirteknikken. Åtte dager gamle planter ble smittet med flytende inokuleum (50%), og åtte dager etter infeksjon ble planter observert for symptomer. Planter viste rotråte på grunn av omfattende nekrose, samt bladgulering, som er de typiske rot- og foliarsymptomene på DRR-sykdom (figur 3B og supplerende figur 1A).
Sykepotteteknikken ble utført ved hjelp av trinnene vist i figur 4. Konsentrasjonene av soppinokuleum i Soilrite og feltjord var henholdsvis 10% og 5%. DRR-mottakelige frø viser de typiske DRR symptomer som rot rot, mangel på laterale røtter, blad gulning, og tidlig død, sammenlignet med kontroll planter (Figur 5A og B). Planter utsatt for infeksjon i sykepotten laget med Soilrite døde og viste rotråte syv dager etter såing (Figur 5C og supplerende figur 2C). I mellomtiden viste planter som vokser i sykepotten laget med feltjord typiske foliar symptomer, det vil at halmfarget løvverk 48 dager etter såing (figur 5E).
Påvirkningen av tørke på DRR sykdom ble også studert i sykepotten under laboratorieforhold. Tørke stress ble pålagt ved å holde tilbake vann3. Plantene under tørkestress (30% FC) viste forverret sykdomsforekomst sammenlignet med de patogene-bare-behandlede (90% FC) planter(Figur 6A og B). Kontroll og tørkebehandlede planter viste ingen symptomer (figur 6A og B). Røtter under kombinert stress hadde mer nekrotiske flekker og råte sammenlignet med patogene bare planter (Figur 6B).
Figur 1: Karakteristiske morfologiske trekk ved Rhizoctonia bataticola. Årsaksmidlet til tørrrotrot (Rhizoctonia bataticola, ITCC 8635) ble isolert fra feltet (National Institute of Plant Genome Research, New Delhi, 28.6139° N, 77.2090 ° E). Fra kulturene ble soppen isolert ved hjelp av bindestrekmetoden8. Bilder viser den 4 dager gamle R. bataticola kulturen i potet dextrose agar i en Petri plate (A), 5 dager gammel flytende kultur (B) og 10 dager gammel skråkultur (C). Soppmycelia (D) og mikrosklerotia (svarte piler) (E) ble ertet på et mikroskop lysbilde og farget med WGA-FITC og anilin blå, henholdsvis. Bilder (E, F, skala bar, 20 og 50 μm) ble fanget under 20x og 40x objektivobjektiv av et epifluorescerende mikroskop. Hvite piler viser korsveggene i mycelia. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Trinn involvert i R. bataticola inokulasjon og DRR-analyser i blotting papirteknikken. Overflaten steriliserer frøene ved å passere dem gjennom rennende vann fra springen og vaske med 2% natriumhypokloritt, etterfulgt av vask med sterilt RO-vann 3–4 ganger (trinn 1). Deretter sår du 30 frø i 15 cm høye potter som inneholder Soilrite (trinn 2) og lar frøene vokse i åtte dager i et vekstrom med 28 °C ± 2 °C temperatur, 16 t fotoperiode med en lysintensitet på 150 μmol m-2 s-1og relativ fuktighet på 70 % (trinn 3). Rykke opp plantene og vask dem med sterilisert vann (trinn 4). Forbered soppinokumen ved å vaksinere 500 ml PDB-medier med sopp (trinn 5). For infeksjonen, bruk 5 dager gammel soppbuljongkultur. Deretter inokulerer plantene ved å dyppe røttene i soppinokumen i et beger i 30 s og fjern overflødig inokuleum ved å berøre begerets indre sidevegg (trinn 6). Etter infeksjon, plasser sopp-inoculated og mock-inoculated planter i forskjellige blotting papirer i separate rene skuffer (trinn 7). Fukt blotting papiret med tilstrekkelig sterilt vann daglig og observere symptomene, viz., shedding av laterale røtter, gulning og visning av planteblader, råtne frø, og rot rot på åtte dager etter infeksjon (trinn 8) (A). Bilder representerer viktige trinn (trinn 3–7) (B). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: DRR sykdom symptomer i kikærter-basert på blotting papir teknikk. Etter protokollen avbildet i figur 2 ble DRR-mottakelige planter (genotype, JG 62) utsatt for infeksjon ved hjelp av blotting papirteknikken, og symptomene ble fanget åtte dager etter infeksjon. Bilder viser de representative kontrollplantene (mock-inoculated) med sunne skudd (rød pil) og røtter med flere laterale røtter (gul pil) (A). Bilder viser de representative infiserte plantene med typiske symptomer, som visnering, gulfering og tørking av blader (blå piler) og tørkede/ nekrotiske røtter med færre laterale røtter (hvite piler) (B). Vektstangen er 1 cm. Eksperimenter ble gjentatt minst fem ganger. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Oversikt over sykepotten forberedelse for R. bataticola inokulasjon og DRR sykdomsanalyser. Forbered soppinokumen ved å vaksinere en PDA-tallerken med en 5 mm soppplate av aktivt voksende soppkultur og inkuber ved 28 °C i ti dager. Deretter, for å forberede substratet, vask kikærtfrøene med vann fra springen, suge frøene i vann over natten, og autoklav på 121 lbs i 15 min. Deretter inokulerer 100 g av substratet med tre agarplugger fra 10-dagers gammel kultur og bland godt. Deretter inkuberer du det inokulerte substratet ved 30 °C i 15 dager i en inkubator. Knus den syke kulturen (soppdyrket substrat), tørk og pulver den, og lagre ved 4 °C. Bland deretter 50 g syk kultur med 100 g tørr Soilrite grundig (sykepotte) (A). Deretter så overflaten-sterilisert utsatt kikærtfrø og observere symptomene, viz., trykk rotråte, lateral rotnekrose, og blad gulning. Assimilere plantene som viser symptomer i samme pott. For ytterligere eksperimenter, bruk pottene som viser 90% infeksjon som den følsomme genotypen. Bilder representerer inokulet (i), underlaget (ii) og kontroll og inokulert sykekultur (iii) (B). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: DRR sykdom symptomer i kikærter-basert på syke potten teknikk. For å lage en sykepotte ble protokollen avbildet i figur 4 brukt. Deretter ble overflatesteriliserte DRR-mottakelige kikertgenotype (JG 62) frø sådd i kontrollen (A) og sykepotten (B). Hver plante i potten representerer en replikere, og død eller forkrøplet plantevekst ble observert i sykepotten. Planter på høyre side av panelet (C) indikerer tilstedeværelse og fravær av laterale røtter (gul pil) i henholdsvis kontroll og behandling. Grafen viser antall døde planter i sykepotten behandling i forhold til kontrollen (D). Sykepotten ble utarbeidet på sterilisert jordsmonn samlet fra NIPGR-feltet, og sykekulturen ble blandet. Overflatesteriliserte frø ble sådd, og sykdomssymptomer ble fanget 48 dager etter såing. Bildet viser kontrollanleggene (E), og de typiske DRR foliar symptomene, nemlig tørking av planter, er angitt (hvite piler). Statistisk signifikans ble bestemt ved hjelp av Studentens t-test. Baren representerer SEM av ni biologiske repliker, og stjernen betegner en statistisk signifikant verdi på P < 0,0001. Den gule pilen indikerer nekrotisk / råtten, tørket primærrot uten laterale røtter. Eksperimenter ble gjentatt minst ti ganger, med lignende resultater. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Sykepottemetoden er nyttig for å studere påvirkning av tørkestress på plante-patogeninteraksjon. Et pot eksperiment ble utført for å studere effekten av tørke på R. bataticola infeksjon. Eksperimentet besto av kontroll, tørke-bare, patogen-bare (R. bataticola, patogen), og kombinert tørke og R. bataticola stress (kombinert stress). Planter ble dyrket i et vekstrom med 28 °C ± 2 °C temperatur, 16 t fotoperiode med en lysintensitet på 150 μmol m-2 s-1og 70% relativ fuktighet. Sykepotten ble utarbeidet etter protokollen avbildet i figur 4. Deretter ble overflatesteriliserte DDR-mottakelige kikærter genotype (JG 62) frø sådd i kontroll og syke potter. Kontroll og patogen behandlinger ble vannet gjennom hele eksperimentet. Tørkestress ble pålagt planter under tørke og kombinert stressbehandling. Vann ble holdt tilbake 18 dager etter såing, og ønsket tørkenivå ble nådd 24 dager etter såing. Planter ble observert for symptomer 29 dager etter såing. Bildet viser foliar- og rotendringer under behandlinger (A). Bilder viser uopphetede planterøtter observert under 0,5X objektivobjektiv av et SMZ25/SMZ18-forskningsstereokroskop (B). Den røde pilen indikerer de uinfiserte laterale røttene, og de svarte pilene indikerer de infiserte laterale røttene. Eksperimenter ble gjentatt minst ti ganger, med lignende resultater. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur S1: Inokuletallstørrelse og reduksjon i siderottall i kikærter. Etter protokollen avbildet i figur 2 ble DRR-mottakelige planter (genotype, JG 62) utsatt for infeksjon med variert størrelse på inokuleum ved hjelp av blotting papirteknikk, og symptomene ble fanget åtte dager etter infeksjon. Planter ble inokulert med variert inoculum størrelse (0,1%, 1%, 10% og 20% w / v i vann)Bilder viser de representative infiserte planter med typiske symptomer som visnering, gulning, og tørking av blader og tørket / nekrotisk røtter med mindre laterale røtter (B). Grafen viser antall laterale røtter i planter under infeksjon med inokulvariasjon (B). Vektstangen er 1 cm. n=10. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Supplerende figur S2: Foliar symptomer på DRR i kikærter i soilrite. Etter protokollen avbildet i figur 4, ble overflatesteriliserte frø sådd, og sykdomssymptomer ble fanget på 14 dager etter såing. Det representative bildet viser kontrollanleggene (A), og bildet viser de typiske DRR foliar symptomene, nemlig tørking av planter (hvite piler) (B). Sykdomsscore ble utviklet basert på nekrotiske flekker på røttene. Scoringen ble utviklet i løpet av dagene (C). Fotografiene (A&B) er fra samme eksperiment. Vektstang= 3 cm. n= 10. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Blotting papir teknikken gir en enkel tilnærming til skjermen kikærter genotyper under laboratorieforhold. Dip inokulasjon muliggjør utredning av interaksjon på timelig basis med enkel kontroll over inoculum belastning (Supplerende figur 1) og forenkler in vitro screening. Videre kan selv unge frøplanter brukes. Fem dager gammel soppkultur ( figur1B) kan gi nok inokuleum til å infisere plantene. Flytende inoculum inneholder både mycelia og mikrosklerotia (figur 1D & E). Rotrotsymptomer ( figur 3B) kan brukes til å score sykdommen og identifisere resistente genotyper. DRR forekomst er i stor grad påvirket av tørke stress1,3,5. Men med denne teknikken alene er tørkestresspålegg umulig, og screening med denne teknikken vil ikke gjenspeile naturlige reaksjoner.
Den syke potteteknikken tillater studiet av interaksjonene mellom planter, patogener og tørkestress. Det gir en måte å screene genotypene under kombinert tørke og patogenstress for å identifisere resistente genotyper. I en sykepott kan tørkestress pålegges i alle aldre av planten og skjerme plantene. Planter viser typiske DRR symptomer (Figur 5C & F og Supplerende Figur 2B & C) i syke potten metoden. Planter utsatt for kombinert tørke og patogen infeksjon viste alvorlig rot rot sammenlignet med patogen-bare behandling. Dette innebærer at tilgjengelig kikærtertkimplasma må screenes for å identifisere en resistent genotype til ikke bare patogen, men også kombinert patogen og tørkestress. Flere studier ble forsøkt tidligere å screene genotypene, men ved hjelp av blotting papirteknikk 11,12. Dessuten har feltscreening også blitt gjennomført, men uten å pålegge tørkestress11. Det er avgjørende å pålegge tørkestress i ulike stadier av kikærter og vurdere genotyperesponsen.
FEILSØKING
For blotting papir teknikk, bør volumet av inokulumet i begeret være på det nivået der hele planten roten er dyppet. I tillegg vil overflødig vanning føre til våt råte av planterøttene. Ikke bruk vann fra springen til vanning av plantene fordi det kan forårsake forurensning.
For syke potten teknikk, Desi kikærter varianter er å foretrekke. Antall frø kan variere avhengig av forskernes behov. Volumet av vann som brukes til å suge frø bør tredelt mer fordi frøene imbibe vann. Bakteriell vekst vil oppstå hvis vasken ikke gjøres riktig. Ikke-autoklavet vann kan brukes til å suge frøene. Fargen på frøene etter autoklavering skal være svart i stedet for brun, noe som indikerer feil autoklavering. Over tørking i en varmluftsovn fører til tørking av frø; slike frø kan ikke brukes til sopp inokulasjon. Inokusering av flaskene utenfor laminærstrømmen kan forårsake kontaminering. Hvit soppvekst i inokulert kikærtmåltid er et tegn på feil autoklavering. Biosikkerhet forholdsregler bør følges i kassering av brukte inoculum, blotting papir, og infiserte planter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre
Acknowledgments
Prosjekter ved M.S.K lab støttes av National Institute of Plant Genome Research kjernefinansiering. VI anerkjenner DBT- JRF (DBT/2015/NIPGR/430). Vi takker traineestudenter, Miss Rishika, Mr. Jayachendrayan og Miss. Durgadevi for teknisk hjelp under videoopptak og Mr. Sandeep Dixit, Miss. Anjali og Dr. Avanish Rai for kritisk vurdering av rådata og manuskriptfilene. Vi takker Mr. Rahim H Tarafdar og Mr. Sunder Solanki for deres hjelp i laboratoriet. Vi anerkjenner DBT-eLibrary Consortium (DeLCON) og NIPGR Library for å gi tilgang til e-ressurser og NIPGR Plant Growth Facility for plantevekststøtte / plass.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fungus- Rhizoctonia bataticola | Pathogen inoculum | Indian Type Culture Collection No. 8365 | GenBank: MH509971.1, ITCC 8635 (https://www.iari.res.in/index.php?option=com_content&view=article& id=1251&Itemid=1370) |
| Soilrite mix | Soil medium in the lab | Keltech Energies Limited, Bangalore, India | http://www.keltechenergies.com/ |
| Filter paper | Blotting paper to support the plant growth | Himedia | http://himedialabs.com/catalogue/chemical2017/index.html#374 |
| Pot | Growing plants | 10 and 30 cm size pots | Routinely used nursery pots, for example, https://dir.indiamart.com/impcat/nursery-pots.html |
| Potato dextrose agar/broth | Culture and maintain the fungus | Cat# 213400, DifcoTM, MD, USA | https://www.fishersci.com/shop/products/bd-difco-dehydrated-culture-media-potato-dextrose-agar-3/p-4901946 |
| Incubator | Culture the fungus | LOM-150-2, S/N AI13082601-38, MRC, incubator, and shaker | http://www.mrclab.com/productDetails.aspx?pid=91131 |
| Growth chamber | Growing plants in controlled condition | Model No. A1000, Conviron, Canada | https://www.conviron.com/products/gen1000-reach-in-plant-growth-chamber |
| Laminar airflow | Carrying out aseptic exercises | Telstar, Bio II advance, Class II cabinet, EN-12469-2000 | https://www.telstar.com/lab-hospitals-equipment/biological-safety-cabinets/bio-ii-advance-plus/, http://www.atlantisindia.co.in/laminar-air-flow.html |
| Mesh | Filtering the fungal mycelia | Nylon mosquito net | Mesh with 0.6-1 mm diameter pore size |
| Autoclave | Autoclaving media and chickpea seeds | Autoclave | http://www.scientificsystems.in/autoclave |
| Microscopes | Visualizing the infection ang fungal mycelia | SMZ25 / SMZ18, Research Stereomicroscopes, Leica EZ4 educational stereomicroscope | https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18 https://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/p/leica-ez4/ https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-80i |
| Weighing balance | Weighing fungus and chemicals | Sartorius Electronic Weighing Balance, BSA 4202S-CW | https://www.sartorius.com/en/products/weighing/laboratory-balances |
| WGA-FITC | Fungus staining | Sigma | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l4895?lang=en®ion=IN |
| Aniline blue | Fungus staining | Himedia | http://www.himedialabs.com/intl/en/products/Chemicals/Dyes-Indicators-and-Stains/Aniline-blue-Water-soluble-Practical-grade-GRM901 |
References
- Sharma, M., Ghosh, R., Pande, S. Dry root rot (Rhizoctonia bataticola (Taub.) Butler): an emerging disease of chickpea - where do we stand. Archives of Phytopathology and Plant Protection. 48 (13-16), 797-812 (2015).
- Srinivas, P. Studies on dry root rot of chickpea (Cicer arietinum L.). , Available from: http://krishikosh.egranth.ac.in/handle/1/93135 (2016).
- Sinha, R., Irulappan, V., Mohan-Raju, B., Suganthi, A., Senthil-Kumar, M. Impact of drought stress on simultaneously occurring pathogen infection in field-grown chickpea. Scientific Reports. 9 (1), (2019).
- Nene, Y., Haware, M., Reddy, M. Chickpea diseases: resistance screening techniques, information bulletins No. 10. Patancheru. Information Bulletin No. 10. Patancheru, A.P., India: International CroDS Research Institute for the Semi-Arid Tropics. , 1-10 (1981).
- Pande, S., Krishna Kishore, G., Upadhyaya, H. D., Narayana Rao, J. Identification of sources of multiple disease resistance in mini-core collection of chickpea. Plant Disease. , (2006).
- Pandey, P., Irulappan, V., Bagavathiannan, M. V., Senthil-Kumar, M. Impact of combined abiotic and biotic stresses on plant growth and avenues for crop improvement by exploiting physio-morphological traits. Frontiers in Plant Science. 8, (2017).
- Irulappan, V., Senthil-Kumar, M. Morpho-physiological traits and molecular intricacies associated with tolerance to combined drought and pathogen stress in plants. Biotechnologies of Crop Improvement, Volume 3: Genomic Approaches. , (2018).
- Jensen, A. B., et al. Standard methods for fungal brood disease research. Journal of Apicultural Research. 52 (1), 1-39 (2013).
- Agrios, G. Plant Pathology: Fifth Edition. , 9780080473 (2004).
- Coley-Smith, J. R., Cooke, R. C. Survival and germination of fungal sclerotia. Annual Review of Phytopathology. , (1971).
- Nagamma, G., Saifulla, M., Sab, J., Pavitra, S. Screening of chickpea genotypes against dry root rot caused by Macrophomina phaseolina (tassi) goid. 10 (4), 1795-1800 (2015).
- Infantino, A., et al. Screening techniques and sources of resistance to root diseases in cool season food legumes. Euphytica. 147 (1-2), 201-221 (2006).
- Khaliq, A., et al. Integrated control of dry root rot of chickpea caused by Rhizoctonia bataticola under the natural field condition. Biotechnology Reports. 25, 00423 (2020).
