Summary
Denna studie presenterar metoder för att studera de pathomorphological och molekylära mekanismerna bakom kikärter–Rhizoctonia bataticola interaktion. Metoden blotting papper är användbart för att snabbt studera kikärt genotyp svar, medan den sjuka pot-baserade metoden kan användas för att samtidigt införa torka och R. bataticola infektion och skärm för tolerant genotyper.
Abstract
Torr rotröta (DRR) sjukdom är en framväxande biotisk stress hot mot kikärter odling runt om i världen. Det orsakas av en jordburen svamp patogen, Rhizoctonia bataticola. I litteraturen är omfattande och detaljerade steg-för-steg-protokoll om sjukdomsanalyser glesa. Den här artikeln innehåller fullständiga detaljer om de steg som är inblandade i att inrätta en blotting papper teknik för snabbt screening genotyper för resistens mot DRR. Den blotting papper teknik är lätt och billigare. En annan metod, baserad på den sjuka potten strategi, är en härma av naturlig infektion och kan tillämpas för att studera de samverkande komponenterna-växt, patogen, och miljö-deltar i sjukdomstriangeln.
Dessutom, i naturen, drr förekommer främst i regnfed kikärter odlingsområden, där marken fukt avtar som gröda tillväxt framsteg. Torka stress är känt för att predisponera kikärter växter till DRR sjukdom. Patologiska och molekylär förståelse av växt-patogen interaktion under torka stress kan bana väg för identifiering av eliten DRR-resistenta sorter från kikärter germplasm poolen. Denna artikel ger en stegvis metodik för utarbetandet av en sjuk potten och efterföljande sjukdom assay. Sammantaget kommer den information som presenteras häri hjälpa forskare att förbereda R. bataticola svamp inokulat, upprätthålla denna patogen, ställa in blotting papper teknik, förbereda sjuka kultur och sjuka potten, och bedöma patogen infektion i kikärter växter.
Introduction
Torr rotröta (DRR) är en av de ekonomiskt signifikanta sjukdomarna ikikärter 1,2. Det är en rot-specifik sjukdom som orsakas av Rhizoctonia bataticola (teleomorf, Macrophomina phaseolina). Infekterade växter saknar laterala rötter och besitter spröda taproots och gult lövverk1,3. DRR under torka stress har rapporterats vara ett framväxande hot mot kikärter odling1,2,3. Drr-incidensen uppges dessutom förvärras under torkans stress under fältförhållanden1,2,3. DRR är vanligare i regnade områden än i bevattnade fält4. Utnyttjandet av resistenta sorter är sättet att övervinna sjukdomen och kringgå fungicid användning1,13. Eftersom kikärtermplasm finns över hela världen hamnar genetisk variation föregenskapen 5, screening och identifiering av resistenta / mottagliga genotyper är avgörande för molekylär avel för gröda förbättring.
Robust, lätt, och kostnadseffektiva sjukdomsanalyser är avgörande för att undersöka R. bataticola infektion mönster i kikärter. Den primära sjukdomsanalys som används för att observera svaret av kikärts genotyper på R. bataticola infektion är blotting papper teknik1,4. Det är en enkel teknik och kan utföras med hjälp av flytande svamp inokulat, plantor med rötter, och sterila blotting papper. Denna teknik har dock inte utnyttjats till sitt maximum eftersom ingen steg-för-steg-protokoll finns i litteraturen.
Samtidigt innebär den sjuka potten tekniken utarbetandet av en potentiell sjuk kultur och införandet av torka stress. Med tanke på att torkan stress förvärrar DRRsjukdomsincidens 3, är det viktigt att studera växt-patogen interaktion under torka stress6,7. Den sjuka potten tekniken ger plattformen för en sådan samtidig studie, främja bättre möjligheter för germplasm screening och förstå den mekanistiska grunden för interaktionen. Patologiska förändringar som en ökning av rotlängd och minskning av lateralt rottal—inneboende till DRR sjukdom—kan åtgärdas med hjälp av den sjukakrukan tekniken 1,3,7.
Häri presenteras ett detaljerat protokoll för blotting papper och sjuka pot tekniker, som kan användas för att studera samspelet mellan kikärter och R. bataticola och skärmen kikärtermplasm,. Detaljerna i de material som används i studien anges i tabellen över material.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Isolering av R. bataticola och lagring
- Uppgifter om kikärts genotyp och DRR-symtom
- Använd kikärtsväxter (genotyp, JG 62) som i allmänhet uppvisar typiska DRR-symptom, såsom torr, spröd primärrot med inga laterala rötter och mikrosklerotia under barken och inutimärg 1,3.
- Uppsamling och tvätt
- Rotlösa växter som visar symtom som torr halmfärgad foliar och spröd primärrot med mikrosklerotia under epidermisskiktet. Medan uprooting, en stor del av rötterna kommer att förbli inne i jorden som de infekterade rötterna är spröda. Ta bort det grova jordskräp som är fäst vid roten. Skär rötterna separat och samla dem i papperskuvert (27,5 cm x 12 cm) med rätt etikett och placera dem i en provsamlingslåda.
- Efter att ha transporterat prover till laboratoriet, placera rötterna i en 200 mL bägare och täck med nät (Nylonnät med porstorleken 3 mm diameter), och tvätta rötterna noggrant med rinnande kranvatten för att avlägsna fastande jordpartiklar.
- Använd omvänt osmosvatten (RO) för att skölja en gång i änden.
- Ytsterilisering
- Bryt rötterna i fyra stycken med 2 cm längd vardera med ett skalpellblad och lägg dem i en ren 200 mL-bägare.
- Montera autoklaverat RO-vatten, 2% NaOCl, kassera burk och autoklaverat blottingpapper (5 cm2) inuti laminärflödeskammaren.
- Tvätta rötterna med 50 mL autoklaverat RO-vatten tre gånger och sedan med 50 mL på 2% NaOCl i 10 min. Tvätta rötterna med 50 mL RO-vatten tre gånger igen för att ta bort NaOCl.
- Blot torka rötterna genom att placera rötterna på autoklaverade blotting papper och lämna tills rötterna torkas.
- Media och inkubation
- Ta bort rötternas kanter med ett steriliserat skalpellblad. Dela rötterna med hjälp av bladet och använd de steriliserade forceps för att placera dem på en potatis dextros agar (PDA) media Petri platta som innehåller streptomycin sulfat (50 mg L-1) och ampicillin (50 mg L-1).
- Stäng plattan, försegla med parafilm, och inkubera i en inkubator vid 28 °C i två dagar i mörker.
- Hyphal spets metod
- Efter två dagars inkubation, föra plattorna in i laminär flödeskammaren. Klipp spetsen på hyfalan tillväxt8 under en stereomicroskop (Leica EZ4 pedagogiska stereomikroskop) och överföra den till en färsk PDA-platta med streptomycin sulfat och ampicillin.
- Inkubera plattorna i inkubatorn vid 28 °C i tio dagar i mörker.
- Lagring och underhåll av R. bataticola svamp inokulat
- Gör PDA-snedställning i provrör och överför en svampagarplugg från en tio dagar gammal odlingsplatta med hjälp av flamsteriliserad inokuleringsslinga. Täta provrörslocket med parafilm.
- Inkubera snedstarna vid 28 °C i tio dagar i mörker.
- Försegla locket med parafilm igen och förvara den i 4 °C i kylskåp för framtida användning.
- Subkultur var sjätte månad för att behålla svampen.
- Upprätthållande av virulens
- Infektera växterna med ren svamp inokulat beredd som nämns i den sjuka potten teknik3. Isolera samma svamp från de infekterade växterna (Kochs postulat)9 och använd för ytterligare experiment.
OBS: I denna studie användes en fältisosolerad stam av svampen (GenBank: MH509971.1 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MH509971)
- Infektera växterna med ren svamp inokulat beredd som nämns i den sjuka potten teknik3. Isolera samma svamp från de infekterade växterna (Kochs postulat)9 och använd för ytterligare experiment.
2. Blotting papper teknik
OBS: Den blotting papper tekniken medför beredning av flytande svamp inokulat, planta preparat, och sjukdom bedömning.
- Beredning av flytande R. bataticola inokulat
OBS: Flytande R. bataticola svamp inokulat innehåller både mycelia och microsclerotia. Båda dessa strukturer fungerar som primär inokulat.- Förbered 500 mL PDB-media i en 1 000 mL-kolv och autoklavera den i 121 lbs i 15 min.
- Efter att media har svalnat, inokulera buljongen med en loopful av svamp agar plugg från en svamp snedkultur och inkubera vid 28 °C i fem dagar i en shaker vid 180 rpm i mörker.
- Sätt ihop en autoklaverad glas- eller plasttratt (10 cm), en-liters konisk kolv, och två lager av nät (10 cm2 storlek) (Nylonnät med porstorleken 3 mm diameter) på bordet. Filtrera bort svampmycelia och microsclerotia med hjälp av nätet. Blot torka svampen i autoklaverade blotting papper.
- Väg 100 g mycelia för 50% inokulat och håll i rumstemperatur.
- Beredning av kikärtsväxt
- Välj 50 friska frön (i denna studie användes den DRR-mottagliga genotypen JG 62), placera dem i en 100 mL-bägare och täck med ett nät.
- Tvätta fröna med kranvatten först för att ta bort jordskräp.
- Ta bägaren med frön in i laminär flödeskammaren och tvätta dem med steriliserat 50 mL RO-vatten tre gånger i 1 min per tvätt.
- Sterilisera fröna med 50 mL av 2% vattenhaltiga NaOCl i 2 min med kontinuerlig skakning och tvätta fröna med 50 mL steriliserat vatten fem gånger i 1 min vardera.
- Fyll en polyetenpåse (47,5 cm x 25 cm) med Soilrite (en blandning av trädgårdsodlingskvalitet expanderad perlit, irländsk torvmossa, och exfolierad vermikulit i lika förhållande dvs. 1/3:1/3:1/3), så de ytsteriliserade 50 fröna två cm djup, och förvara i en tillväxtkammare/rum med 28 °C ± 2 °C temperatur, 16 h fotoperiod med en ljusintensitet på 150 μmol m−2 s−1, och relativ fuktighet på 70%. Vattna dem med RO-vatten och rycka upp växterna åtta dagar efter sådd.
- Tvätta rötterna i kranvatten för att avlägsna Soilrite-partiklarna. Skölj rötterna med steriliserat RO-vatten, och förvara dem i RO-vattnet i en 1000 mL-bägare.
- Beredning av blottingpapper i fack
- Ta ett blottingpapper och skär dem i bitar (30 cm × 23 cm) i tillräckligt antal för att uppfylla replikationerna.
- Packa arken i autoklaverbara polyeten påse och autoklav dem på 121 lbs i 15 minuter och hålla den i en varmluftsugn för torkning.
- Vik varje blotting pappersark i hälften.
- Placera papperet på en ren, sprittormerad plastbricka, som visas i figur 2i-iv.
- Växt inokulering genom att doppa
- Lös 100 g svampinokulat i 200 mL autoklaverat RO-vatten i en 200 mL-bägare för att erhålla 50% inokulat.
- Doppa växtrötterna i det förberedda inokulatet i 1 min med intermittent upp-och-ner-rörelse för att säkerställa enhetlig fastsättning av svampinokulat.
- Placera anläggningarna i blottingpapperet
- Blöt ned undersidan av blottingpapperet som placeras på brickan med sterilt RO-vatten. Placera växterna på papperet på ett sätt där endast rötterna omfattas av papperet, och skott lämnas ut.
- Stäng den genom att vika den övre sidan av blotting papper och väta hela papperet för att ge tillräckligt med vatten för att upprätthålla växttillväxt.
- Vattna tråget en gång om dagen och håll brickorna vid 28 °C. Observera symptomen såsom nekros, rotröta, och blad gulfärgning dagligen.
3. Sjuk kruka teknik
OBS: Den sjuka potten tekniken innebär beredning av virulent inokulat och en sjuk kruka, underhåll av fuktnivå, och bedömning av sjukdomssymptom.
- Beredning av substrat
- Ta ett kg av alla kommersiellt tillgängliga kikärtsfrön. Ta bort infekterade frön (frön med svamptillväxt, infektionsfläckar och insektsskador). Placera dem i 5 L plastbägare och tvätta med kranvatten noggrant 3–4 gånger för att få bort större skräp.
- Tvätta fröna med 2 L av RO vatten tre gånger och blöt 1 kg frön i en 5 L-bägare med trefaldigt mer vatten i fem h.
- När fröna insupit vattnet, rewash dem med RO vatten tre gånger för att ta bort utsäde exsudat.
- Ta bort vattnet helt och packa fröna i syltflaskor (300 mL, 12 cm höjd, 6 cm diameter, och 155 g vikt) till ca 1/4:e kapacitet (100 g per syltflaska) och stäng flaskorna med lock. Packa tio syltflaskor i en autoklaverbar plastpåse (48 cm x 30 cm) autoklav två gånger vid 121 lbs i 15 min kontinuerligt.
- Torka fröna vid 40 °C i en ugn över natten för att ta bort vattendropparna inuti flaskan.
- Förberedelse av sjukkultur
- Slå på BSL-2 nivå laminär flödeskammare. Torka golvet ordentligt med 70% etanol, och slå på UV i 15 min. Håll sedan fröna inne i laminär flödeskammaren.
- Ta 10-dagars gamla nyligen isolerade R. bataticola kultur (del 1). Ta sedan tre svampagarpluggar (4 mm diameter) med hjälp av en steril pipettspets eller korkborr, och lägg dem i syltflaskor aseptiskt. Täck flaskorna med lock och förslut med parafilm.
- Skaka flaskorna för att blanda svampskivan med kikärtsfrönen enhetligt.
- Inkubera flaskorna vid 30 °C i 15 dagar i mörker.
- Ta syltflaskor med svart svamptillväxt (Figur 4iii) och överför den sjuka kulturen (frön med mikrosklerotia) från syltflaskor till en petristallrik av glas med hjälp av sterila tåtkörningar. Torka dem i rumstemperatur i två dagar i en petriplatta av glas.
- Pulver svampmassan med hjälp av en mortel och mortelstöt, och lagra pulvret vid 4 °C.
- Autoklav Soilrite två gånger på 121 lbs i 15 min.
- Torka den autoklaverade Soilrite blanda under en solskydd.
- Blanda svamppulvret med Soilrite vid 50 % w/w, fyll krukorna med blandningen och håll dem i rumstemperatur under en dag.
- Sugga ett ytsteriliserat DRR-mottagligt kikärtsfrö per kruka (10 cm rund krukor) (Tabell över material) och bibehålla en fuktnivå på 80% fältkapacitet (FC).
- Observera symtomen som nekros och rotröta genom att rycka upp växterna efter groning.
- Bedömning av sjuk pott effektivitet
OBS: Växter visar gula bladsymptom när rötterna är helt ruttna.- Utveckla en sjukdom poäng baserat på lesion (nekrotiska fläckar) (Kompletterande Figur 2C) nummer och svårighetsgraden av rotröta. Sjuka krukor som visar 90% växtdöd kan användas vidare.
- Genotyp screening
- Förbered sjukkultur i stora mängder och blanda den antingen med steriliserad Soilrite eller fältjord (5% w/w) i 30 cm höga krukor. Vattna krukorna för att blöta ytan och lämna dem ostörda i sju dagar.
- Sugga en ytsteriliserad frö per 10 cm rund kruka och tre frön per 30 cm runda krukor och vattna dem tillräckligt.
- Observera de gula foliar och rotröta symptom.
- Kombinerad torka och R. bataticolainfektion
- Införa torka stress genom att följa de protokoll som nämns i Sinha et al. (2019).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denna studie syftade till att demonstrera tekniker som blotting papper och sjuka pot tekniker för att underlätta patologifmorphological och molekylär förståelse av växt-patogen interaktion under torka stress. För att åstadkomma detta, växter uppvisar DRR symtom1,3,4 samlades in från en kikärt fält, och svampen isolerades med hjälp av metoden hyphal spets8. R. bataticola svampkultur visas mörkgrå på PDA-plattan och snedställning på fyra dagar efter inkubation (Bild 1A & C) och mörkare i grå färg i PDB-mediet fem dagar efter inkubation ( Bild1B). R. bataticola har septate mycelia (Figur 1D), och det producerar microsclerotia (Figur 1E), som fungerar som primär inokulat i jorden10.
De steg som anges i figur 2 följdes för att utföra blotting papper teknik. Åtta dagar gamla växter var infekterade med flytande inokulat (50%), och åtta dagar efter infektion, växter observerades för symtom. Växter visade rotröta på grund av omfattande nekros, samt blad gulnande, som är den typiska rot och foliar symptom på DRR sjukdom (Figur 3B och kompletterande figur 1A).
Den sjuka kruk tekniken utfördes med hjälp av de steg som visas i figur 4. Koncentrationerna av svamp inokulat i Soilrite och fältjord var 10% respektive 5%. DRR-mottagliga frön visar de typiska DRR symtom såsom rotröta, brist på laterala rötter, blad gulfärgning, och för tidig död, jämfört med kontrollväxter (Figur 5A och B). Växter som utsätts för infektion i den sjuka potten som gjorts med Soilrite dog och visade rotröta sju dagar efter sådd (Figur 5C och kompletterande figur 2C). Samtidigt visade växter som växer i den sjuka potten som gjorts med fältjord typiska lövverkssymtom, dvs, halmfärgat bladverk 48 dagar efter sådd (Figur 5E).
Torkans påverkan på DRR-sjukdomen studerades också i den sjuka grytan under laboratorieförhållanden. Torka stress infördes genom att undanhålla vatten3. De växter som var under torkans stress (30% FC) visade på förvärrad sjukdomsincidens jämfört med de patogen-only-behandlade (90% FC) växterna (figur 6A och B). Kontroll och torka behandlade växter visade inga symtom (Figur 6A och B). Rötter under kombinerad stress hade mer nekrotiska fläckar och röta jämfört med patogen bara-växter (Figur 6B).
Figur 1: Karakteristiska morfologiska egenskaper hos Rhizoctonia bataticola. Orsakssamverkan av torr rotröta (Rhizoctonia bataticola, ITCC 8635) var isolerad från fältet (National Institute of Plant Genome Research, New Delhi, 28.6139°N, 77.2090°E). Från odlingarna isolerades svampen med hjälp av hyphal-spetsmetoden8. Bilder visar den 4-dagar gamla R. bataticola kulturen i potatis dextrosagar i en Petri platta (A), 5-dagar gammal flytande kultur (B), och 10-dagar gammal vinkling kultur (C). Svampmycelia (D) och microsclerotia (svarta pilar) (E) var retad på ett mikroskop glida och färgas med WGA-FITC och aniline blå, respektive. Bilder (E, F, skala bar, 20, och 50 μm) fångades under 20x och 40x objektivet av en epifluorescerande mikroskop. Vita pilar visar tvärväggarna i mycelien. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: Steg som är involverade i R. bataticola-inokulering och DRR-analyser i tekniken för blottingpapper. Ytbehandla sterilisera fröt, genom att passera dem till och med rinnande klappvatten och att tvätta med 2% natriumhypoklorit, följt av att tvätta med sterilt RO-bevattna 3–4 tider (steg 1). Därefter så 30 frön i 15 cm höga krukor som innehåller Soilrite (steg 2) och låt fröna växa i åtta dagar i ett tillväxtrum med 28 °C ± 2 °C-temperatur, 16 h fotoperiod med en ljusintensitet på 150 μmol m−2 s−1, och relativ fuktighet på 70% (steg 3). Ryck upp växterna och tvätta dem med steriliserat vatten (steg 4). Förbered svampinokulat genom att inokculera PDB-media på 500 mL med svamp (steg 5). För infektionen, använd 5-dagar gammal svampbuljongkultur. Därefter, inokulera växterna genom att doppa rötterna i svampinokulat i en bägare i 30 s och avlägsna överskott av inokulat genom att vidröra bägarens inre sidovägg (steg 6). Efter infektion, placera svamp-inokulerade och mock-inokulerade växter i olika blotting papper i separata rena brickor (steg 7). Fukta blottingpapper med adekvat sterilt vatten dagligen och observera symptomen, viz., shedding bort av laterala rötter, gulfärgning och vissnande av växtblad, ruttna frön, och rotröta vid åtta dagar efter infektion (steg 8) (A). Bilder representerar väsentliga steg (steg 3–7) (B). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: DRR-sjukdomssymtom i kikärtsbaserade på tekniken för blottingpapper. Efter det protokoll som avbildas i figur 2 utsattes DRR-mottagliga växter (genotyp, JG 62) för infektion med hjälp av tekniken blotting papper, och symtomen fångades åtta dagar efter infektion. Bilder visar den representativa kontroll växter (mock-inokulerad) med friska skott (röd pil) och rötter med mer laterala rötter (gul pil) (A). Bilder visar den representativa infekterade växter med typiska symtom, såsom vissnande, gulfärgning, och torkning av blad (blå pilar) och torkade / nekrotiska rötter med färre laterala rötter (vita pilar) (B). Skalstången är 1 cm. Experiment upprepades minst fem gånger. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 4: Översikt av sjuka potten förberedelse för R. bataticola inokulering och DRR sjukdom analyser. Förbered svampinokulat genom att inokulat en PDA-platta med en 5 mm svampskiva av aktivt växande svampkultur och inkubera vid 28 °C i tio dagar. Sedan, för att förbereda substratet, tvätta kikärtsfrön med kranvatten, blöta fröna i vatten över natten, och autoklav på 121 lbs för 15 min. Sedan, inokulera 100 g av substratet med tre agar pluggar från 10-dagars gammal kultur och blanda väl. Därefter, inkubera det inokulerade substratet vid 30 °C i 15 dagar i en inkubator. Krossa den sjuka kulturen (svamp odlad substrat), torr och pulver det, och lagra på 4 °C . Blanda sedan 50 g sjukkultur med 100 g torr Soilrite noggrant (sjukkruka) (A). Sedan, så den ytsteriliserade mottagliga kikärtsfrön och observera symptomen, viz., peka rotröta, lateral rot nekros, och blad gulnande. Assimilera växterna som visar symptom i samma kruka. För ytterligare experiment, använd krukorna som visar 90% infektion som mottaglig genotyp. Bilder representerar inokulat (i), substratet (ii), och kontroll och inokulerad sjukkultur (iii) (B). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 5: DRR sjukdomssymptom i kikärt-baserat på den sjuka potten tekniken. För att göra en sjuk pott, användes protokollet som avbildas i figur 4. Därefter såddes ytsteriliserade DRR-mottagliga kikärtsgenotyp (JG 62) frön i kontrollen (A) och sjukpott (B). Varje växt i potten representerar en replika, och döda eller hämmad växttillväxt observerades i den sjuka potten. Växter på panelens högra sida (C) indikerar förekomst och frånvaro av laterala rötter (gul pil) i kontrollen respektive behandlingen. Diagrammet visar antalet döda växter i den sjuka potten behandling jämfört med kontrollen (D). Den sjuka potten var beredd på steriliserad fältjord som samlats in från NIPGR fältet, och sjukkultur blandades. Ytsteriliserade frön såddes, och sjukdomssymptom fångades 48 dagar efter sådd. Bilden visar kontrollväxterna (E), och de typiska DRR-bladsymptomen, nämligen torkning av växter, anges (vita pilar). Statistisk signifikans fastställdes med hjälp av Students t-test. Stapeln representerar SEM för nio biologiska replikat, och asterisken betecknar ett statistiskt signifikant värde vid P < 0.0001. Den gula pilen indikerar nekrotisk/rutten, torkad primärrot utan några laterala rötter. Experiment upprepades minst tio gånger, med liknande resultat. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 6: Den sjuka potten metoden är användbart för att studera påverkan av torka stress på växt-patogen interaktion. En kruka experiment genomfördes för att studera effekten av torkan på R. bataticola infektion. Experimentet omfattade kontroll, endast torka, patogen-bara (R. bataticola, patogen), och kombinerad torka och R. bataticola stress (kombinerad stress). Växter odlades i ett tillväxtrum med 28 °C ± 2 °C temperatur, 16 h photoperiod med en ljusintensitet på 150 μmol m−2 s−1, och 70% relativ luftfuktighet. Den sjuka potten utarbetades efter det protokoll som avbildas i figur 4. Sedan, ytsteriliserade DDR-mottagliga kikärt genotyp (JG 62) frön såddes i kontroll och sjuka krukor. Kontroll och patogen behandlingar var bevattnas under hela experimentet. Torkan stress infördes på växter under torka och kombinerad stressbehandling. Vatten undanhölls 18 dagar efter sådd, och den önskade torkan nivå nåddes 24 dagar efter sådd. Växter observerades för symtom 29 dagar efter sådd. Bilden visar bladen och rotförändringar under behandlingar (A). Bilder visar obefläckade växtrötter som observerats under 0,5 X objektivet av en SMZ25/SMZ18 forskning stereomikroskop (B). Den röda pilen anger de icke infekterade laterala rötterna och de svarta pilarna anger de infekterade laterala rötterna. Experiment upprepades minst tio gånger, med liknande resultat. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Kompletterande figur S1: Inokulatstorlek och minskning av lateralt rottal i kikärter. Efter protokollet avbildas i figur 2, DRR mottagliga växter (genotyp, JG 62) utsattes för infektion med varierad storlek av inokulat med hjälp av blotting papper teknik, och symtom fångades åtta dagar efter infektion. Växter inokulerades med varierad inokulatstorlek (0,1%, 1%, 10% och 20% w/v i vatten)Bilder visar de representativa infekterade växterna med typiska symtom som vissnande, gulfärgning, och torkning av blad och torkade/nekrotiska rötter med mindre laterala rötter (B). Graf visar antalet laterala rötter i växter under infektion med inokulatvariation (B). Skalstången är 1 cm. n=10. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande figur S2: Foliar symtom på DRR i kikärter i soilrite. Efter protokollet avbildas i figur 4, var yta steriliserade frön sådd, och sjukdom symptom fångades på 14 dagar efter sådd. Den representativa bilden visar kontrollväxterna (A), och bilden visar de typiska DRR-bladsymtomen, nämligen torkning av växter (vita pilar) (B). Sjukdom poäng utvecklades baserat på necrotic fläckar på rötterna. Poängsättningen utvecklades över dagarna (C). Fotografierna (A&B) är från samma experiment. Skalstång= 3 cm. n= 10. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den blotting papper tekniken ger en enkel metod för att skärmen kikärt genotyper under laboratorieförhållanden. Dip-inympning möjliggör utredning av interaktion på tidsmässig basis med enkel kontroll över inokulatbelastning (Kompletterande Figur 1) och underlättar in vitro-screening. Vidare kan även unga plantor användas. Fem dagar gammal svampkultur ( Figur1B) kan ge tillräckligt med inokulat för att infektera växterna. Flytande inokulat innehåller både mycelia och microsclerotia (Figur 1D & E). Rotröta symptom (Figur 3B) kan användas för att göra mål på sjukdomen och identifiera resistenta genotyper. DRR förekomst påverkas i stor grad av torka stress1,3,5. Men med denna teknik ensam, torka stress införande är omöjligt, och screening med denna teknik kommer inte att återspegla naturliga reaktioner.
Den sjuka kruktekniken möjliggör studier av interaktionerna mellan växter, patogener och torka stress. Det ger ett sätt att screena genotyperna under kombinerad torka och patogenstress för att identifiera resistenta genotyper. I en sjuk kruka, torka stress kan införas i alla åldrar av anläggningen och skärmen växterna. Växter visar typiska DRR-symptom (Figur 5C & F och Tilläggsfigur 2B & C) i metoden med sjukpott. Växter som utsätts för kombinerade torka och patogen infektion visade allvarliga rotröta jämfört med patogen-bara behandling. Detta innebär att tillgängliga kikärtermplasm måste screenas för att identifiera en resistent genotyp för inte bara patogener utan även kombinerade patogener och torka stress. Flera studier försökte tidigare att skärmen genotyperna men genom att använda blotting papper teknik11,12. Dessutom har fältscreening också genomförts men utan att införa torka stress11. Det är avgörande att införa torka stress under olika stadier av kikärter och bedöma genotyp svar.
PROBLEM SKYTTE
För blotting papper tekniken bör volymen av inokulat i bägaren vara på den nivå där hela växtroten doppas. Dessutom kommer överskott vattning leda till våt röta av växtrötterna. Använd inte kranvatten för att vattna växterna eftersom det kan orsaka kontaminering.
För den sjuka potten tekniken, Desi kikärter sorter är att föredra. Antalet frön kan variera beroende på forskarnas behov. Den volym vatten som används för att blöta frön bör vara trefaldigt mer eftersom fröna insupa vatten. Bakterietillväxt kommer att ske om tvätten inte görs korrekt. Icke-autoklaverat vatten kan användas för att blötlägga fröna. Färgen på fröna efter autoklavering ska vara svart i stället för brun, vilket indikerar felaktig autoklavering. Över torkning i en varmluftsugn leder till torkning av frön; sådana frön inte kan användas för svampympning. Inokulat flaskorna utanför laminärflödet kan orsaka kontaminering. Vit svamptillväxt i inokulerad kikärtsmjöl är ett tecken på felaktig autoklavering. Försiktighetsåtgärder för biosäkerhet bör följas vid kassering av de använda inokulats-, blotting-papperet, och infekterade växter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inget att avslöja
Acknowledgments
Projekt vid M.S.K lab stöds av National Institute of Plant Genome Research kärnfinansiering. VI erkänner DBT- JRF (DBT/2015/NIPGR/430). Vi tackar praktikant studenter, Miss Rishika, Mr Jayachendrayan, och Miss Durgadevi för teknisk hjälp under videoinspelning och Mr Sandeep Dixit, Miss Anjali och Dr Avanish Rai för kritiskt bedöma rådata och manuskriptet filer. Vi tackar mr Rahim H Tarafdar och mr Sunder Solanki för deras hjälp i laboratoriet. Vi erkänner DBT-eLibrary Consortium (DeLCON) och NIPGR Library för att ge tillgång till e-resurser och NIPGR Plant Growth Facility för växttillväxt stöd / utrymme.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fungus- Rhizoctonia bataticola | Pathogen inoculum | Indian Type Culture Collection No. 8365 | GenBank: MH509971.1, ITCC 8635 (https://www.iari.res.in/index.php?option=com_content&view=article& id=1251&Itemid=1370) |
| Soilrite mix | Soil medium in the lab | Keltech Energies Limited, Bangalore, India | http://www.keltechenergies.com/ |
| Filter paper | Blotting paper to support the plant growth | Himedia | http://himedialabs.com/catalogue/chemical2017/index.html#374 |
| Pot | Growing plants | 10 and 30 cm size pots | Routinely used nursery pots, for example, https://dir.indiamart.com/impcat/nursery-pots.html |
| Potato dextrose agar/broth | Culture and maintain the fungus | Cat# 213400, DifcoTM, MD, USA | https://www.fishersci.com/shop/products/bd-difco-dehydrated-culture-media-potato-dextrose-agar-3/p-4901946 |
| Incubator | Culture the fungus | LOM-150-2, S/N AI13082601-38, MRC, incubator, and shaker | http://www.mrclab.com/productDetails.aspx?pid=91131 |
| Growth chamber | Growing plants in controlled condition | Model No. A1000, Conviron, Canada | https://www.conviron.com/products/gen1000-reach-in-plant-growth-chamber |
| Laminar airflow | Carrying out aseptic exercises | Telstar, Bio II advance, Class II cabinet, EN-12469-2000 | https://www.telstar.com/lab-hospitals-equipment/biological-safety-cabinets/bio-ii-advance-plus/, http://www.atlantisindia.co.in/laminar-air-flow.html |
| Mesh | Filtering the fungal mycelia | Nylon mosquito net | Mesh with 0.6-1 mm diameter pore size |
| Autoclave | Autoclaving media and chickpea seeds | Autoclave | http://www.scientificsystems.in/autoclave |
| Microscopes | Visualizing the infection ang fungal mycelia | SMZ25 / SMZ18, Research Stereomicroscopes, Leica EZ4 educational stereomicroscope | https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18 https://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/p/leica-ez4/ https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-80i |
| Weighing balance | Weighing fungus and chemicals | Sartorius Electronic Weighing Balance, BSA 4202S-CW | https://www.sartorius.com/en/products/weighing/laboratory-balances |
| WGA-FITC | Fungus staining | Sigma | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l4895?lang=en®ion=IN |
| Aniline blue | Fungus staining | Himedia | http://www.himedialabs.com/intl/en/products/Chemicals/Dyes-Indicators-and-Stains/Aniline-blue-Water-soluble-Practical-grade-GRM901 |
References
- Sharma, M., Ghosh, R., Pande, S. Dry root rot (Rhizoctonia bataticola (Taub.) Butler): an emerging disease of chickpea - where do we stand. Archives of Phytopathology and Plant Protection. 48 (13-16), 797-812 (2015).
- Srinivas, P. Studies on dry root rot of chickpea (Cicer arietinum L.). , Available from: http://krishikosh.egranth.ac.in/handle/1/93135 (2016).
- Sinha, R., Irulappan, V., Mohan-Raju, B., Suganthi, A., Senthil-Kumar, M. Impact of drought stress on simultaneously occurring pathogen infection in field-grown chickpea. Scientific Reports. 9 (1), (2019).
- Nene, Y., Haware, M., Reddy, M. Chickpea diseases: resistance screening techniques, information bulletins No. 10. Patancheru. Information Bulletin No. 10. Patancheru, A.P., India: International CroDS Research Institute for the Semi-Arid Tropics. , 1-10 (1981).
- Pande, S., Krishna Kishore, G., Upadhyaya, H. D., Narayana Rao, J. Identification of sources of multiple disease resistance in mini-core collection of chickpea. Plant Disease. , (2006).
- Pandey, P., Irulappan, V., Bagavathiannan, M. V., Senthil-Kumar, M. Impact of combined abiotic and biotic stresses on plant growth and avenues for crop improvement by exploiting physio-morphological traits. Frontiers in Plant Science. 8, (2017).
- Irulappan, V., Senthil-Kumar, M. Morpho-physiological traits and molecular intricacies associated with tolerance to combined drought and pathogen stress in plants. Biotechnologies of Crop Improvement, Volume 3: Genomic Approaches. , (2018).
- Jensen, A. B., et al. Standard methods for fungal brood disease research. Journal of Apicultural Research. 52 (1), 1-39 (2013).
- Agrios, G. Plant Pathology: Fifth Edition. , 9780080473 (2004).
- Coley-Smith, J. R., Cooke, R. C. Survival and germination of fungal sclerotia. Annual Review of Phytopathology. , (1971).
- Nagamma, G., Saifulla, M., Sab, J., Pavitra, S. Screening of chickpea genotypes against dry root rot caused by Macrophomina phaseolina (tassi) goid. 10 (4), 1795-1800 (2015).
- Infantino, A., et al. Screening techniques and sources of resistance to root diseases in cool season food legumes. Euphytica. 147 (1-2), 201-221 (2006).
- Khaliq, A., et al. Integrated control of dry root rot of chickpea caused by Rhizoctonia bataticola under the natural field condition. Biotechnology Reports. 25, 00423 (2020).
