Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Analyses de la maladie de la pourriture des racines sèches chez les pois chiches : une méthodologie détaillée

Published: January 17, 2021 doi: 10.3791/61702
Automatic Translation
1, 1
1National Institute of Plant Genome Research

Summary

Cette étude présente des méthodologies pour étudier les mécanismes pathomorphologiques et moléculaires sous-jacents à l’interaction entre le pois chiches etla rhizoctonia bataticola. La méthode du papier buvard est utile pour étudier rapidement les réponses du génotype de pois chiches, tandis que la méthode à base de pot malade peut être utilisée pour imposer simultanément la sécheresse et l’infection à R. bataticola et dépister les génotypes tolérants.

Abstract

La maladie de la pourriture sèche des racines (DRR) est une menace émergente pour le stress biotique pour la culture des pois chiches dans le monde entier. Elle est causée par un pathogène fongique transmis par le sol, Rhizoctonia bataticola. Dans la littérature, les protocoles complets et détaillés étape par étape sur des analyses de maladie sont clairsemés. Cet article fournit des détails complets sur les étapes impliquées dans la mise en place d’une technique de papier buvard pour le dépistage rapide des génotypes pour la résistance à la DRR. La technique du papier buvard est facile et moins coûteuse. Une autre méthode, basée sur l’approche du pot malade, est un mimétisme de l’infection naturelle et peut être appliquée pour étudier les composants en interaction - plante, agent pathogène et environnement - impliqués dans le triangle de la maladie.

De plus, dans la nature, le DRR se produit principalement dans les zones de culture des pois chiches plu la pluie, où l’humidité du sol recule à mesure que la croissance des cultures progresse. Le stress dû à la sécheresse est connu pour prédisposer les plants de pois chiches à la maladie de DRR. La compréhension pathomorphologique et moléculaire de l’interaction plante-pathogène sous le stress dû à la sécheresse peut ouvrir la voie à l’identification de variétés d’élite résistantes au DRR à partir du bassin de germplasmes de pois chiches. Cet article fournit une méthodologie stepwise pour la préparation d’un pot malade et l’essai suivant de maladie. Dans l’ensemble, l’information présentée ci-après aidera les chercheurs à préparer l’inoculum fongique R. bataticola, à maintenir cet agent pathogène, à mettre en place la technique du papier buvard, à préparer la culture malade et le pot malade, et à évaluer l’infection pathogène chez les plantes de pois chiches.

Introduction

La pourriture sèche des racines (DRR) est l’une des maladies économiquement significatives chez les poischiches 1,2. Il s’agit d’une maladie spécifique aux racines causée par Rhizoctonia bataticola (télomorphe, Macrophomina phaseolina). Les plantes infectées n’ont pas de racines latérales et possèdent des taproots cassants et un feuillagejaune 1,3. DRR sous le stress de sécheresse a été rapporté pour être une menace émergente pour la culture de poischiches 1,2,3. En outre, l’incidence du DRR serait aggravée par le stress dû à la sécheresse sur leterrain 1,2,3. Le DRR est plus répandu dans les zones plu pleuvoir que dans les champs irrigués4. L’utilisation de variétés résistantes est le moyen de surmonter la maladie et de contourner l’utilisation de fongicides1,13. Étant donné que le germplasme de pois chiches disponible dans le monde entier abrite des variations génétiques pour le caractère5,le dépistage et l’identification des génotypes résistants/sensibles sont essentiels à la sélection moléculaire pour l’amélioration des cultures.

Des analyses robustes, faciles et rentables de la maladie sont essentielles pour étudier les modèles d’infection à R. bataticola chez les pois chiches. L’analyse primaire de la maladie utilisée pour observer la réponse des génotypes de pois chiches à l’infection à R. bataticola est la technique du papier buvard1,4. Il s’agit d’une technique simple qui peut être exécutée à l’aide d’inoculum fongique liquide, de semis aux racines et de papier buvard stérile. Cependant, cette technique n’a pas été utilisée à son maximum parce qu’aucun protocole étape par étape n’est disponible dans la littérature.

Pendant ce temps, la technique du pot malade implique la préparation d’une culture malade potentielle et l’imposition du stress dû à la sécheresse. Étant donné que le stress dû à la sécheresse aggrave l’incidence de la maladie de DRR3, il est essentiel d’étudier l’interaction plante-pathogène sous le stressdû à la sécheresse 6,7. La technique du pot malade fournit la plate-forme pour une telle étude simultanée, favorisant de meilleures possibilités pour le criblage de germplasme et comprenant la base mécaniste de l’interaction. Les changements pathomorphologiques tels qu’une augmentation de la longueur des racines et la réduction du nombre de racines latérales — inhérentes à la maladie du DRR — peuvent être abordés à l’aide de la technique du potmalade 1,3,7.

Dans ce cas, un protocole détaillé pour le papier buvard et les techniques de pot malade, qui peut être utilisé pour étudier l’interaction entre les pois chiches et R. bataticola et le germplasme de pois chiches, est présenté. Les détails des matériaux utilisés dans l’étude sont donnés dans le Tableau des matériaux.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Isolement de R. bataticola et stockage

  1. Détails du génotype de pois chiches et des symptômes du DRR
    1. Utilisez des plants de pois chiches (génotype, JG 62) qui présentent généralement des symptômes typiques de DRR, tels que la racine primaire sèche et cassante sans racines latérales et microscléotie sous l’écorce et à l’intérieur du pith1,3.
  2. Collecte et lavage
    1. Plantes déracinées présentant des symptômes tels que le foliar sec de couleur paille et la racine primaire cassante avec microscléotie sous la couche épiderme. Pendant le déracinement, une grande partie des racines resteront à l’intérieur du sol car les racines infectées sont cassantes. Enlever les débris grossiers du sol attachés à la racine. Coupez les racines séparément et recueillez-les dans des enveloppes en papier (27,5 cm x 12 cm) avec l’étiquette appropriée et placez-les dans une boîte de collecte d’échantillons.
    2. Après avoir transporté des échantillons au laboratoire, placez les racines dans un bécher de 200 mL et couvrez-les de maille (maille en nylon de la taille du pore de 3 mm de diamètre) et lavez soigneusement les racines avec de l’eau courante du robinet pour éliminer les particules de sol adhérentes.
    3. Utilisez de l’eau d’osmose inverse (RO) pour rincer une fois à la fin.
  3. Stérilisation de surface
    1. Casser les racines en quatre morceaux de 2 cm de longueur chacun avec une lame de scalpel et les mettre dans un bécher propre de 200 mL.
    2. Assemblez de l’eau RO autoclavée, 2 % de NaOCl, un bocal de rejet et du papier buvard autoclavé (5 cm2)à l’intérieur de la chambre d’écoulement laminaire.
    3. Laver les racines avec 50 mL d’eau RO autoclavée trois fois, puis avec 50 mL de 2% de NaOCl pendant 10 min. Lavez les racines avec 50 mL d’eau RO trois fois de plus pour enlever le NaOCl.
    4. Éponger les racines en plaçant les racines sur du papier buvard autoclavé et laisser jusqu’à ce que les racines soient séchées.
  4. Médias et incubation
    1. Retirer les bords des racines à l’l’arme d’une lame de scalpel stérilisée. Fendre les racines à l’aide de la lame et utiliser les forceps stérilisés pour les placer sur une plaque petri de dextrose de pomme de terre (PDA) contenant du sulfate de streptomicine (50 mg L-1)et de l’ampicilline (50 mg L-1).
    2. Fermez la plaque, scellez avec du parafilm et incubez dans un incubateur à 28 °C pendant deux jours dans l’obscurité.
  5. Méthode de pointe hyphal
    1. Après deux jours d’incubation, apportez les plaques dans la chambre d’écoulement laminaire. Couper la pointe de la croissance hyphale8 sous un stéréomicroscope (Stéréomicroscope éducatif Leica EZ4) et le transférer dans une plaque PDA fraîche avec du sulfate de streptomie et de l’ampicilline.
    2. Incuber les assiettes dans l’incubateur à 28 °C pendant dix jours dans l’obscurité.
  6. Stockage et entretien de l’inoculum fongique R. bataticola
    1. Faites des obliques PDA dans des tubes à essai et transférez un bouchon d’agar fongique à partir d’une plaque de culture vieille de dix jours à l’aide de la boucle d’inoculation stérilisée par la flamme. Sceller le bouchon du tube à essai avec du parafilm.
    2. Incuber les inclinaisons à 28 °C pendant dix jours dans l’obscurité.
    3. Sceller à nouveau le bouchon avec du parafilm et le conserver à 4 °C au réfrigérateur pour l’utilisation future.
    4. Sous-culture tous les six mois pour maintenir le champignon.
  7. Maintien de la virulence
    1. Infecter les plantes avec l’inoculum fongique pur préparé comme mentionné dans la technique de pot malade3. Isoler le même champignon des plantes infectées (postulats de Koch)9 et l’utiliser pour d’autres expériences.
      REMARQUE : Dans cette étude, une souche isolée sur le terrain du champignon a été utilisée (GenBank : MH509971.1 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MH509971)

2. Technique de papier blotting

REMARQUE : La technique du papier buvard implique la préparation de l’inoculum fongique liquide, la préparation des semis et l’évaluation de la maladie.

  1. Préparation du liquide R. bataticola inoculum
    REMARQUE : L’inoculum fongique liquide R. bataticola contient à la fois du mycélia et de la microscléotie. Ces deux structures agissent comme inoculum primaire.
    1. Préparez 500 mL de supports PDB dans un flacon de 1 000 mL et autoclavez-le à 121 lb pendant 15 min.
    2. Une fois les supports refroidis, inoculer le bouillon avec une boucle de bouchon d’agar fongique d’une culture fongique oblique et incuber à 28 °C pendant cinq jours dans un shaker à 180 rpm dans l’obscurité.
    3. Assembler un entonnoir en verre ou en plastique autoclavé (10 cm), un flacon conique d’un litre et deux couches de maille (taille de 10 cm2) (maille en nylon avec la taille du pore de 3 mm de diamètre) sur la table. Filtrer les mycélia fongiques et la microscléotie à l’aide du maillage. Éponger le champignon dans du papier buvard autoclavé.
    4. Pesez 100 g de mycélie pour 50% d’inoculum et maintenez à température ambiante.
  2. Préparation de la plante de pois chiches
    1. Sélectionnez 50 graines saines (dans cette étude, le génotype sensible au DRR JG 62 a été utilisé), placez-les dans un bécher de 100 mL et couvrez-les d’un maillage.
    2. Lavez d’abord les graines avec de l’eau du robinet pour enlever les débris du sol.
    3. Prendre le bécher avec des graines dans la chambre d’écoulement laminaire et les laver avec stérilisé 50 mL d’eau RO trois fois pendant 1 min par lavage.
    4. Stériliser les graines avec 50 mL de NaOCl 2% aqueux pendant 2 min avec des secousses continues et laver les graines avec 50 mL d’eau stérilisée cinq fois pendant 1 min chacune.
    5. Remplir un sac en polyéthène (47,5 cm x 25 cm) de Soilrite (un mélange de perlite élargie de qualité horticole, de mousse de tourbe irlandaise et de vermiculite exfoliée à rapport égal, c’est-à-dire 1/3:1/3:1/3), semer la surface stérilisée 50 graines de deux cm de profondeur, et garder dans une chambre de croissance / pièce avec 28 °C ± 2 °C température, 16 h photopériod avec une intensité lumineuse de 150 μmol m−2 s−1, et l’humidité relative de 70%. Arrosez-les avec de l’eau RO et déraciner les plantes huit jours après le semis.
    6. Laver les racines dans l’eau du robinet pour enlever les particules soilrite. Rincez les racines à l’eau RO stérilisée et gardez-les dans l’eau RO dans un bécher de 1000 mL.
  3. Préparation de papier buvard dans des plateaux
    1. Prenez un papier buvard et coupez-les en morceaux (30 cm × 23 cm) en nombre suffisant pour répondre aux réplications.
    2. Emballez les feuilles dans un sac en polyéthène autoclavable et autoclavez-les à 121 lb pendant 15 minutes et gardez-les dans un four à air chaud pour le séchage.
    3. Plier chaque feuille de papier buvard en deux.
    4. Placez le papier sur un plateau en plastique propre et essuyé par l’esprit, comme le montre la figure 2i-iv.
  4. Inoculation des plantes par trempage
    1. Dissoudre 100 g d’inoculum fongique dans 200 mL d’eau RO autoclavée dans un bécher de 200 mL pour obtenir 50% d’inoculum.
    2. Tremper les racines des plantes dans l’inoculum préparé pendant 1 min avec un mouvement intermittent de haut en bas pour assurer un attachement uniforme à l’inoculum fongique.
  5. Placer les plantes dans le papier buvard
    1. Mouiller le côté inférieur du papier buvard placé sur le plateau avec de l’eau RO stérile. Placez les plantes sur le papier d’une manière où seules les racines sont couvertes par le papier, et les pousses sont laissées de côté.
    2. Fermez-le en pliant le côté supérieur du papier buvard et mouiller tout le papier pour fournir suffisamment d’eau pour soutenir la croissance des plantes.
    3. Arrosez le plateau une fois par jour et gardez les plateaux à 28 °C. Observez quotidiennement les symptômes tels que la nécrose, la pourriture des racines et le jaunissement des feuilles.

3. Technique de pot malade

NOTE : La technique de pot malade implique la préparation de l’inoculum virulent et d’un pot malade, le maintien du niveau d’humidité, et l’évaluation des symptômes de la maladie.

  1. Préparation du substrat
    1. Prenez un kg de graines de pois chiches disponibles dans le commerce. Enlever les graines infectées (graines dont la croissance fongique est fongique, les taches d’infection et les dommages causés par les insectes). Placez-les dans un bécher en plastique de 5 L et lavez-les à l’eau du robinet 3 à 4 fois pour enlever les débris majeurs.
    2. Laver les graines avec 2 L d’eau RO trois fois et faire tremper les graines de 1 kg dans un bécher de 5 L avec trois fois plus d’eau pendant cinq heures.
    3. Une fois que les graines ont imbibé l’eau, la relivez-les avec de l’eau RO trois fois pour enlever les exsudats de graines.
    4. Retirer complètement l’eau et emballer les graines dans des bouteilles de confiture (300 mL, 12 cm de hauteur, 6 cm de diamètre et 155 g de poids) à environ 1/4de capacité (100 g par bouteille de confiture) et fermer les bouteilles avec des bouchons. Emballez dix bouteilles de confiture dans un sac en plastique autoclavable (48 cm x 30 cm) autoclave deux fois à 121 lb pendant 15 min en continu.
    5. Sécher les graines à 40 °C au four toute la nuit pour enlever les gouttelettes d’eau à l’intérieur de la bouteille.
  2. Préparation de la culture malade
    1. Allumez la chambre d’écoulement laminaire de niveau BSL-2. Essuyer le plancher à fond avec 70% d’éthanol, et allumer les UV pendant 15 min. Ensuite, gardez les graines à l’intérieur de la chambre d’écoulement laminaire.
    2. Prenez la culture R. bataticola fraîchement isolée de 10 jours (partie 1). Ensuite, prenez trois bouchons d’agar fongiques (diamètre de 4 mm) à l’aide d’une pointe stérile pipette ou de l’agrile du liège, et mettez-les dans des bouteilles de confiture aseptiques. Couvrir les bouteilles de bouchons et sceller avec du parafilm.
    3. Agiter les bouteilles pour mélanger uniformément le disque fongique avec les graines de pois chiches.
    4. Incuber les bouteilles à 30 °C pendant 15 jours dans l’obscurité.
    5. Prenez des bouteilles de confiture avec la croissance fongique noire (figure 4iii) et transférez la culture malade (graines avec la microscléotie) des bouteilles de confiture à une plaque en verre de Petri utilisant des forceps stériles. Séchez-les à température ambiante pendant deux jours dans une assiette de Pétri en verre.
    6. Poudrer la masse fongique à l’aide d’un mortier et d’un pilon, et conserver la poudre à 4 °C.
    7. Autoclave Soilrite deux fois à 121 lbs pendant 15 min.
    8. Séchez le mélange de Soilrite autoclaved sous un parasol.
    9. Mélanger la poudre fongique avec soilrite à 50% w/w, remplir les pots avec le mélange, et les garder à température ambiante pendant une journée.
    10. Semer une graine de pois chiches sensible à la DRR stérilisée de surface par pot (pots ronds de 10 cm)(tableau des matériaux)et maintenir un niveau d’humidité de 80 % de la capacité de champ (FC).
    11. Observez les symptômes tels que la nécrose et la pourriture des racines en déracinant les plantes après la germination.
  3. Évaluation de l’efficacité des pots malades
    REMARQUE : Les plantes présentent des symptômes fœlaux jaunes lorsque les racines sont complètement pourries.
    1. Développer un score de maladie basé sur les nombres de lésions (taches nécrotiques)(figure supplémentaire 2C)et la gravité de la pourriture des racines. Les pots malades montrant 90% de mortalité végétale peuvent être utilisés plus loin.
  4. Dépistage du génotype
    1. Préparer la culture malade en grande quantité et la mélanger soit avec du soilrite stérilisé, soit du sol de champ (5 % w/w) dans des pots de 30 cm de haut. Arrosez les pots pour mouiller la surface et laissez-les intacts pendant sept jours.
    2. Semer une graine stérilisée de surface par pot rond de 10 cm et trois graines par pot rond de 30 cm et les arroser adéquatement.
    3. Observez les symptômes jaunes de pourriture fœliar et de racine.
  5. Sécheresse combinée et infection à R. bataticola
    1. Imposer le stress dû à la sécheresse en suivant les protocoles mentionnés dans Sinha et coll. (2019).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Cette étude visait à démontrer des techniques telles que le papier buvard et les techniques de pot malade pour faciliter la compréhension pathomorphologique et moléculaire de l’interaction plante-pathogène sous le stress de la sécheresse. Pour ce faire, les plantes présentant des symptômes de DRR1,3,4 ont été recueillies dans un champ de pois chiches, et le champignon a été isolé en utilisant la méthode de pointe hyphale8. R. la culture fongique de bataticola apparaît gris foncé sur la plaque et l’inclinaison de PDA quatre jours après incubation (figure 1A et C) et plus foncée dans la couleur grise dans le milieu de PDB cinq jours après incubation (figure 1B). R. bataticola a septate mycélie (Figure 1D), et il produit la microscléotie (Figure 1E), qui agissent comme inoculum primaire dans le sol10.

Les étapes données à la figure 2 ont été suivies pour exécuter la technique du papier buvard. Les plantes de huit jours ont été infectées par l’inoculum liquide (50%), et huit jours après l’infection, des plantes ont été observées pour des symptômes. Les plantes ont montré la pourriture des racines en raison de la nécrose étendue, ainsi que le jaunissement des feuilles, qui est la racine typique et les symptômes foliaire de la maladie DRR (Figure 3B et Figure supplémentaire 1A).

La technique du pot malade a été effectuée à l’aide des étapes indiquées à la figure 4. Les concentrations d’inoculum fongique dans soilrite et sol de champ étaient de 10% et 5%, respectivement. Les graines sensibles au DRR présentent les symptômes typiques du DRR tels que la pourriture des racines, le manque de racines latérales, le jaunissement des feuilles et la mort prématurée, par rapport aux plantes de contrôle (figure 5A et B). Les plantes soumises à une infection dans le pot malade à base de Soilrite sont mortes et ont montré la pourriture des racines sept jours après le semis (figure 5C et figure supplémentaire 2C). Pendant ce temps, les plantes qui poussent dans le pot malade fait avec le sol de champ ont montré des symptômes foliar typiques, c.-à-d., feuillage paille-coloré 48 jours après semis (figure 5E).

L’influence de la sécheresse sur la maladie de DRR a également été étudiée dans le pot malade dans des conditions de laboratoire. Le stress dû à la sécheresse a été imposé en retenantl’eau 3. Les plantes stressées par la sécheresse (30 % de FC) présentaient une incidence de maladie aggravée par rapport aux plantes traitées uniquement par pathogène (90 % de FC)(figure 6A et B). Les plantes traitées par la lutte et la sécheresse n’ont présenté aucun symptôme( figure 6A et B). Les racines soumis à un stress combiné avaient plus de taches nécrotiques et de pourriture que les plantes pathogènes seulement (figure 6B).

Figure 1
Figure 1 : Caractéristiques morphologiques de Rhizoctonia bataticola. L’agent causal de la pourriture sèche desracines (Rhizoctonia bataticola, ITCC 8635) a été isolé du champ (National Institute of Plant Genome Research, New Delhi, 28.6139°N, 77.2090°E). Des cultures, le champignon a été isolé utilisant la méthode hyphal de pointe8. Les images montrent la culture R. bataticola de 4 jours dans l’agar dextrose de pomme de terre dans une assiette de Petri (A), la culture liquide de 5 jours (B), et la culture oblique de 10 jours (C). Mycélia fongique (D) et microscléotie (flèches noires) (E) a été taquiné sur une diapositive de microscope et taché avec WGA-FITC et bleu aniline, respectivement. Des images (E, F,barre d’échelle, 20, et 50 μm) ont été capturées sous l’objectif 20x et 40x d’un microscope épifluorescent. Les flèches blanches montrent les parois transversales dans la mycélie. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Étapes impliquées dans l’inoculation de R. bataticola et les analyses de DRR dans la technique de papier buvard. La surface stérilise les graines en les passant à travers l’eau courante du robinet et en les lavant avec 2 % d’hypochlorite de sodium, suivie d’un lavage à l’eau RO stérile 3 à 4 fois (étape 1). Ensuite, sèmez 30 graines dans des pots de 15 cm de haut contenant soilrite (étape 2) et laissez les graines pousser pendant huit jours dans une salle de croissance avec 28 °C ± température de 2 °C, 16 h photopériod avec une intensité lumineuse de 150 μmol m−2 s−1, et une humidité relative de 70% (étape 3). Déraciner les plantes et les laver avec de l’eau stérilisée (étape 4). Préparer l’inoculum fongique en inoculant des supports PDB de 500 mL avec un champignon (étape 5). Pour l’infection, utilisez la culture fongique de bouillon de 5 jours. Ensuite, inoculer les plantes en plongeant les racines dans l’inoculum fongique dans un bécher pendant 30 s et enlever l’excès d’inoculum en touchant la paroi latérale intérieure du bécher (étape 6). Après l’infection, placez les plantes fongiques inoculées et simulées dans différents papiers buvards dans des plateaux propres séparés (étape 7). Humidifiez le papier buvard avec suffisamment d’eau stérile tous les jours et observez les symptômes, c’est-à-dire l’excrétion des racines latérales, le jaunissement et le flétrissement des feuilles de plantes, des graines pourries et de la pourriture des racines à huit jours après l’infection (étape 8) (A). Les images représentent des étapes essentielles (étapes 3-7) (B). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Symptômes de la maladie du DRR chez les pois chiches selon la technique du papier buvard. Suivant le protocole décrit à la figure 2, les plantes sensibles au DRR (génotype, JG 62) ont été soumises à une infection à l’aide de la technique du papier buvard, et les symptômes ont été capturés huit jours après l’infection. Les images montrent les plantes de contrôle représentatives (simulées) avec des pousses saines (flèche rouge) et des racines avec des racines plus latérales (flèche jaune) (A). Les images montrent les plantes infectées représentatives présentant des symptômes typiques, tels que le flétrissement, le jaunâtre et le séchage des feuilles (flèches bleues) et des racines séchées/nécrotiques avec moins de racines latérales (flèches blanches) (B). La barre d’échelle est de 1 cm. Les expériences ont été répétées au moins cinq fois. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Aperçu de la préparation des pots malades pour l’inoculation de R. bataticola et les analyses de la maladie de DRR. Préparez l’inoculum fongique en inoculant une plaque PDA avec un disque fongique de 5 mm de culture fongique en croissance active et incubez à 28 °C pendant dix jours. Ensuite, pour préparer le substrat, laver les graines de pois chiches avec de l’eau du robinet, faire tremper les graines dans l’eau toute la nuit, et autoclaver à 121 lb pendant 15 min. Ensuite, inoculer 100 g du substrat avec trois bouchons d’agar de la culture de 10 jours et bien mélanger. Ensuite, incuber le substrat inoculé à 30 °C pendant 15 jours dans un incubateur. Écraser la culture malade (substrat fongique cultivé), la sécher et la poudrer, et la conserver à 4 °C. Ensuite, mélanger 50 g de culture malade avec 100 g de Soilrite sec à fond (pot malade) (A). Ensuite, sèmez les graines de pois chiches sensibles stérilisées à la surface et observez les symptômes, c’est-à-dire la pourriture des racines du robinet, la nécrose latérale des racines et le jaunissement des feuilles. Assimiler les plantes présentant des symptômes dans le même pot. Pour d’autres expériences, utilisez les pots montrant 90% d’infection comme génotype sensible. Les images représentent l’inoculum (i), le substrat (ii), et la culture malade de contrôle et inoculée (iii) (B). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Symptômes de la maladie du DRR chez les pois chiches selon la technique du pot malade. Pour la fabrication d’un pot malade, le protocole décrit à la figure 4 a été utilisé. Ensuite, les graines de génotype de pois chiches sensibles à la DRR (JG 62) stérilisées de surface ont été semées dans le contrôle (A) et le pot malade (B). Chaque plante dans le pot représente une réplique, et la croissance des plantes mortes ou rabougries a été observée dans le pot malade. Les plantes sur le côté droit du panneau ( C )indiquentla présence et l’absence de racines latérales (flèche jaune) dans le contrôle et le traitement, respectivement. Le graphique montre le nombre de plantes mortes dans le traitement pot malade par rapport à la lutte (D). Le pot malade a été préparé sur le sol de champ stérilisé recueilli dans le champ de NIPGR, et la culture malade a été mélangée. Les graines stérilisées de surface ont été semées, et les symptômes de la maladie ont été capturés 48 jours après le semis. L’image montre les plantes témoins (E), et les symptômes foliars typiques DRR, à savoir, le séchage des plantes, sont indiqués (flèches blanches). La signification statistique a été déterminée à l’aide du t-test del’élève. La barre représente la SEM de neuf répliques biologiques, et l’astérisque dénote une valeur statistiquement significative à P < 0,0001. La flèche jaune indique la racine primaire nécrotique/pourrie et séchée sans racines latérales. Les expériences ont été répétées au moins dix fois, avec des résultats similaires. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : La méthode des pots malades est utile pour étudier l’influence du stress dû à la sécheresse sur l’interaction plante-pathogène. Une expérience de pot a été menée pour étudier l’effet de la sécheresse sur l’infection de R. bataticola. L’expérience comprenait la lutte, la sécheresse seulement, l’agent pathogène seulement(R. bataticola, pathogène), et la sécheresse combinée et le stress R. bataticola (stress combiné). Les plantes ont été cultivées dans une salle de croissance avec 28 °C ± température de 2 °C, 16 h photopériod avec une intensité lumineuse de 150 μmol m−2 s−1, et 70% d’humidité relative. Le pot malade a été préparé selon le protocole décrit à la figure 4. Ensuite, les graines de génotype de pois chiches sensibles au DDR (JG 62) stérilisées en surface ont été semées dans des pots de contrôle et malades. Les traitements de contrôle et d’agent pathogène ont été irrigués tout au long de l’expérience. Le stress dû à la sécheresse a été imposé aux plantes en cas de sécheresse et de traitement combiné du stress. L’eau a été retenue 18 jours après le semis, et le niveau de sécheresse désiré a été atteint 24 jours après le semis. Des plantes ont été observées pour des symptômes 29 jours après le semis. L’image montre les changements foliar et racines sous les traitements (A). Les images montrent des racines végétales non tachées observées sous l’objectif de 0,5 X d’un stéréomicroscope de recherche SMZ25/SMZ18 (B). La flèche rouge indique les racines latérales non infectées, et les flèches noires indiquent les racines latérales infectées. Les expériences ont été répétées au moins dix fois, avec des résultats similaires. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure supplémentaire S1 : Taille de l’inoculum et réduction du nombre de racines latérales chez les pois chiches. Suivant le protocole décrit dans la figure 2, les plantes sensibles au DRR (génotype, JG 62) ont été soumises à une infection de taille variée d’inoculum à l’aide d’une technique de papier buvard, et les symptômes ont été capturés huit jours après l’infection. Les plantes ont été inoculées avec la taille variée d’inoculum (0.1%, 1%, 10% et 20% w/v dans l’eau)Images montrent les usines infectées représentatives avec des symptômes typiques tels que le flétrissement, le jaunâtrement, et le séchage des feuilles et des racines séchées/nécrotiques avec moins de racines latérales (B). Le graphique montre le nombre de racines latérales chez les plantes en infection par la variation de l’inoculum (B). La barre d’échelle est de 1 cm n=10. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.

Figure supplémentaire S2 : Symptômes foliar de DRR dans le pois chiches dans soilrite. Suivant le protocole décrit à la figure 4, les graines stérilisées de surface ont été semées, et les symptômes de la maladie ont été capturés 14 jours après le semis. L’image représentative montre les plantes de contrôle (A), et l’image montre les symptômes foliars typiques de DRR, à savoir le séchage des plantes (flèches blanches) (B). Le score de la maladie a été développé basé sur des taches nécrotiques sur les racines. La notation a été développée au cours des jours (C). Les photographies (A&B) proviennent de la même expérience. Barre d’échelle = 3 cm n= 10. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

La technique du papier buvard offre une approche simple pour dépister les génotypes de pois chiches dans des conditions de laboratoire. L’inoculation dip permet l’étude de l’interaction sur une base temporelle avec un contrôle facile sur la charge inoculum (Figure supplémentaire 1) et facilite le dépistage in vitro. En outre, même les jeunes semis peuvent être utilisés. La culture fongique de cinq jours (figure 1B) peut produire suffisamment d’inoculum pour infecter les plantes. L’inoculum liquide contient à la fois du mycélia et de la microscléotie (Figure 1D & E). Les symptômes de pourriture desracines ( figure 3B) peuvent être utilisés pour marquer la maladie et identifier les génotypes résistants. L’occurrence de DRR est principalement influencée par le stressde sécheresse 1,3,5. Cependant, avec cette seule technique, l’imposition du stress dû à la sécheresse est impossible, et le dépistage avec cette technique ne reflétera pas les réponses naturelles.

La technique du pot malade permet d’étudier les interactions entre les plantes, les agents pathogènes et le stress dû à la sécheresse. Il fournit un moyen de filtrer les génotypes sous la sécheresse combinée et le stress pathogène pour identifier les génotypes résistants. Dans un pot malade, le stress dû à la sécheresse peut être imposé à tout âge de la plante et l’écran des plantes. Les plantes présentent des symptômes typiques de DRR (figure 5C & F et figure supplémentaire 2B & C) dans la méthode des pot malades. Les plantes soumises à la sécheresse combinée et à l’infection pathogène ont montré la pourriture grave de racine par rapport au traitement pathogène-seulement. Cela implique que le germplasme disponible de pois chiches doit être examiné pour identifier un génotype résistant non seulement à l’agent pathogène, mais aussi à l’agent pathogène combiné et au stress dû à la sécheresse. Plusieurs études ont été tentées plus tôt pour examiner les génotypes mais en utilisant la technique de papierbuvard 11,12. En outre, le dépistage sur le terrain a également été effectué, mais sans imposer de stress dû àla sécheresse 11. Il est crucial d’imposer le stress dû à la sécheresse à différents stades du pois chiches et d’évaluer la réponse au génotype.

Dépannage

Pour la technique du papier buvard, le volume de l’inoculum dans le bécher doit être au niveau où toute la racine de la plante est trempée. De plus, l’arrosage excessif entraînera la pourriture humide des racines des plantes. N’utilisez pas l’eau du robinet pour arroser les plantes parce qu’elle peut causer une contamination.

Pour la technique du pot malade, les variétés de pois chiches Desi sont préférables. Le nombre de graines peut varier en fonction des besoins des chercheurs. Le volume d’eau utilisé pour tremper les graines devrait être trois fois plus élevé parce que les graines imbibent l’eau. La croissance bactérienne se produira si le lavage n’est pas fait correctement. L’eau non autoclavée peut être utilisée pour tremper les graines. La couleur des graines après le pavage automatique doit être noire au lieu de brune, ce qui indique un autoclaving inapproprié. Le séchage au-dessus d’un four à air chaud conduit au séchage des graines; ces graines ne peuvent pas être utilisées pour l’inoculation fongique. L’inocculation des bouteilles à l’extérieur du débit laminaire peut causer une contamination. La croissance fongique blanche dans le repas inoculé de pois chiches est un signe d’autoclaving incorrect. Les précautions de biosécurité doivent être suivies pour jeter l’inoculum utilisé, le papier buvard et les plantes infectées.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Nous n’avons rien à divulguer

Acknowledgments

Les projets du laboratoire M.S.K sont appuyés par le financement de base du National Institute of Plant Genome Research. VI reconnaît DBT- FRJ (DBT/2015/NIPGR/430). Nous remercions les étudiants stagiaires, Mlle Rishika, M. Jayachendrayan et Mlle Durgadevi pour leur aide technique pendant le tournage vidéo, ainsi que M. Sandeep Dixit, Mlle Anjali et le Dr Avanish Rai pour avoir évalué de façon critique les données brutes et les fichiers manuscrits. Nous remercions M. Rahim H Tarafdar et M. Sunder Solanki pour leur aide dans le laboratoire. Nous reconnaissons le DBT-eLibrary Consortium (DeLCON) et la Bibliothèque NIPGR pour avoir fourni l’accès aux ressources électroniques et à l’installation de croissance des plantes NIPGR pour le soutien et l’espace de croissance des plantes.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fungus- Rhizoctonia bataticola Pathogen inoculum Indian Type Culture Collection No. 8365 GenBank: MH509971.1, ITCC 8635 (https://www.iari.res.in/index.php?option=com_content&view=article&
id=1251&Itemid=1370)
Soilrite mix Soil medium in the lab Keltech Energies Limited, Bangalore, India http://www.keltechenergies.com/
Filter paper Blotting paper to support the plant growth Himedia http://himedialabs.com/catalogue/chemical2017/index.html#374
Pot Growing plants 10 and 30 cm size pots Routinely used nursery pots, for example, https://dir.indiamart.com/impcat/nursery-pots.html
Potato dextrose agar/broth Culture and maintain the fungus Cat# 213400, DifcoTM, MD, USA https://www.fishersci.com/shop/products/bd-difco-dehydrated-culture-media-potato-dextrose-agar-3/p-4901946
Incubator Culture the fungus LOM-150-2, S/N AI13082601-38, MRC, incubator, and shaker http://www.mrclab.com/productDetails.aspx?pid=91131
Growth chamber Growing plants in controlled condition Model No. A1000, Conviron, Canada https://www.conviron.com/products/gen1000-reach-in-plant-growth-chamber
Laminar airflow Carrying out aseptic exercises Telstar, Bio II advance, Class II cabinet, EN-12469-2000 https://www.telstar.com/lab-hospitals-equipment/biological-safety-cabinets/bio-ii-advance-plus/, http://www.atlantisindia.co.in/laminar-air-flow.html
Mesh Filtering the fungal mycelia Nylon mosquito net Mesh with 0.6-1 mm diameter pore size
Autoclave Autoclaving media and chickpea seeds Autoclave http://www.scientificsystems.in/autoclave
Microscopes Visualizing the infection ang fungal mycelia SMZ25 / SMZ18, Research Stereomicroscopes, Leica EZ4 educational stereomicroscope https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18

https://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/p/leica-ez4/

https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-80i
Weighing balance Weighing fungus and chemicals Sartorius Electronic Weighing Balance, BSA 4202S-CW https://www.sartorius.com/en/products/weighing/laboratory-balances
WGA-FITC Fungus staining Sigma https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l4895?lang=en&region=IN
Aniline blue Fungus staining Himedia http://www.himedialabs.com/intl/en/products/Chemicals/Dyes-Indicators-and-Stains/Aniline-blue-Water-soluble-Practical-grade-GRM901

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sharma, M., Ghosh, R., Pande, S. Dry root rot (Rhizoctonia bataticola (Taub.) Butler): an emerging disease of chickpea - where do we stand. Archives of Phytopathology and Plant Protection. 48 (13-16), 797-812 (2015).
  2. Srinivas, P. Studies on dry root rot of chickpea (Cicer arietinum L.). , Available from: http://krishikosh.egranth.ac.in/handle/1/93135 (2016).
  3. Sinha, R., Irulappan, V., Mohan-Raju, B., Suganthi, A., Senthil-Kumar, M. Impact of drought stress on simultaneously occurring pathogen infection in field-grown chickpea. Scientific Reports. 9 (1), (2019).
  4. Nene, Y., Haware, M., Reddy, M. Chickpea diseases: resistance screening techniques, information bulletins No. 10. Patancheru. Information Bulletin No. 10. Patancheru, A.P., India: International CroDS Research Institute for the Semi-Arid Tropics. , 1-10 (1981).
  5. Pande, S., Krishna Kishore, G., Upadhyaya, H. D., Narayana Rao, J. Identification of sources of multiple disease resistance in mini-core collection of chickpea. Plant Disease. , (2006).
  6. Pandey, P., Irulappan, V., Bagavathiannan, M. V., Senthil-Kumar, M. Impact of combined abiotic and biotic stresses on plant growth and avenues for crop improvement by exploiting physio-morphological traits. Frontiers in Plant Science. 8, (2017).
  7. Irulappan, V., Senthil-Kumar, M. Morpho-physiological traits and molecular intricacies associated with tolerance to combined drought and pathogen stress in plants. Biotechnologies of Crop Improvement, Volume 3: Genomic Approaches. , (2018).
  8. Jensen, A. B., et al. Standard methods for fungal brood disease research. Journal of Apicultural Research. 52 (1), 1-39 (2013).
  9. Agrios, G. Plant Pathology: Fifth Edition. , 9780080473 (2004).
  10. Coley-Smith, J. R., Cooke, R. C. Survival and germination of fungal sclerotia. Annual Review of Phytopathology. , (1971).
  11. Nagamma, G., Saifulla, M., Sab, J., Pavitra, S. Screening of chickpea genotypes against dry root rot caused by Macrophomina phaseolina (tassi) goid. 10 (4), 1795-1800 (2015).
  12. Infantino, A., et al. Screening techniques and sources of resistance to root diseases in cool season food legumes. Euphytica. 147 (1-2), 201-221 (2006).
  13. Khaliq, A., et al. Integrated control of dry root rot of chickpea caused by Rhizoctonia bataticola under the natural field condition. Biotechnology Reports. 25, 00423 (2020).

Tags

Biologie Numéro 167 Cicer arietinum Rhizoctonia bataticola pot malade papier buvard stress de sécheresse mycologie biologie végétale infection fongique protocole de dépistage biologie moléculaire pathologie résistance aux maladies
Analyses de la maladie de la pourriture des racines sèches chez les pois chiches : une méthodologie détaillée
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Irulappan, V., Senthil-Kumar, M. Dry … More

Irulappan, V., Senthil-Kumar, M. Dry Root Rot Disease Assays in Chickpea: a Detailed Methodology. J. Vis. Exp. (167), e61702, doi:10.3791/61702 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter