Summary
Denne protokol beskriver en metode til at kombinere fluorescens in situ hybridisering (FISH) og fluorescens immunhistokemi (IHC) i både friske frosne og faste musehjernesektioner med det formål at opnå multilabel FISH og fluorescens IHC signal. IHC målrettede cytoplasmatiske og membranbundne proteiner.
Abstract
Fluorescerende in situ hybridisering (FISH) er en molekylær teknik, der identificerer tilstedeværelsen og rumlig fordeling af specifikke RNA-transkripter i celler. Neurokemisk fænotypning af funktionelt identificerede neuroner kræver normalt samtidig mærkning med flere antistoffer (målretningsprotein) ved hjælp af immunhistokemi (IHC) og optimering af in situ-hybridisering (målretning af RNA) i tandem. En "neurokemisk signatur" til karakterisering af bestemte neuroner kan opnås, men komplicerende faktorer omfatter behovet for at verificere FISH- og IHC-mål, før metoderne kombineres, og det begrænsede antal RNA'er og proteiner, der kan målrettes samtidigt inden for samme vævssektion.
Her beskriver vi en protokol, der bruger både friske frosne og faste musehjernepræparater, som detekterer flere mRNA'er og proteiner i samme hjernesektion ved hjælp af RNAscope FISH efterfulgt af henholdsvis fluorescensimmunfarvning. Vi bruger den kombinerede metode til at beskrive ekspressionsmønsteret for mRNA'er med lav forekomst (f.eks. galaninreceptor 1) og mRNA'er med høj forekomst (f.eks. glycintransportør 2) i immunhistokemisk identificerede hjernestammekerner.
De vigtigste overvejelser i forbindelse med proteinmærkning nedstrøms for FISH-analysen rækker ud over vævsforberedelse og optimering af FISH-sondemærkning. For eksempel fandt vi, at antistofbinding og mærkningsspecificitet kan påvirkes negativt af proteasetrinnet i FISH-sondeanalysen. Proteaser katalyserer hydrolytisk spaltning af peptidbindinger, hvilket letter FISH-sondeindtræden i celler, men de kan også fordøje proteinet, der er målrettet mod det efterfølgende IHC-assay, hvilket producerer off-target-binding. Den subcellulære placering af det målrettede protein er en anden faktor, der bidrager til IHC-succes efter FISH-sondeanalyse. Vi observerede, at IHC-specificitet skulle bevares, når det målrettede protein er membranbundet, mens IHC-målretning mod cytoplasmatisk protein krævede omfattende fejlfinding. Endelig fandt vi, at håndtering af glidemonteret fast frosset væv var mere udfordrende end frisk frosset væv, men IHC-kvaliteten var generelt bedre med fast frosset væv, når det kombineres med RNAscope.
Introduction
Proteiner og mRNA'er, der neurokemisk definerer subpopulationer af neuroner, identificeres almindeligvis med en kombination af henholdsvis immunhistokemi (IHC) og / eller in situ-hybridisering (ISH). Kombination af ISH med IHC-teknikker letter karakteriseringen af colokaliseringsmønstre, der er unikke for funktionelle neuroner (neurokemisk kodning) ved at maksimere multiplex-mærkningskapaciteten.
Fluorescerende ISH (FISH) metoder, herunder RNAscope, har højere følsomhed og specificitet sammenlignet med tidligere RNA-detektionsmetoder såsom radioaktiv ISH og ikke-radioaktiv kromogen ISH. FISH muliggør visualisering af enkelte mRNA-transkripter som punktfarvede pletter1. Desuden tillader RNAscope-assayet, at et øget antal RNA-mål mærkes ad gangen ved hjælp af forskellige fluoroformærker. På trods af disse fordele kan tekniske begrænsninger påvirke antallet af fluoroforer/kromogener, der kan anvendes i et enkelt forsøg. Disse omfatter tilgængelighed af mikroskopfiltersæt; Sådanne overvejelser forværres, når neurokemisk identifikation bruger kombineret FISH og IHC, sammenlignet med at bruge hver teknik isoleret, da iboende trin, der er optimale for den ene metode, kan være skadelige for den anden.
Tidligere anvendelse af FISH kombineret med IHC har vist ekspression af specifikke cellulære mål i humane B-celle lymfomer2, chick embryoner3, zebrafisk embryoner4, mus nethinden5 og mus indre øreceller6. I disse undersøgelser var vævspræparatet enten formalinfikseret paraffinindlejret (FFPE)2,3,5 eller frisk helmonteret 4,6. Andre undersøgelser anvendte kromogen RNAscope på faste muse- og rottehjernepræparater 7,8,9. Især Baleriola et al.8 beskrev to forskellige vævspræparater til kombineret ISH-IHC; faste musehjernesektioner og FFPE-sektioner af menneskelig hjerne. I en nylig publikation kombinerede vi FISH og fluorescerende IHC på friske frosne sektioner for samtidig at visualisere mRNA med lav overflod (galaninreceptor 1, GalR1), mRNA med høj overflod (glycintransportør 2, GlyT2) og vesikulær acetylcholintransportør (vAChT) protein10 i hjernestammens retikulære dannelse.
Kernen i den ensomme kanal (NTS) er en vigtig hjerneregion involveret i autonom funktion. Beliggende i baghjernen modtager og integrerer denne heterogene population af neuroner et stort antal autonome signaler, herunder dem, der regulerer vejrtrækningen. NTS har flere neuronale populationer, som kan være fænotypisk karakteriseret ved ekspressionsmønsteret af mRNA-mål, herunder GalR1 og GlyT2 og proteinmarkører for enzymet tyrosinhydroxylase (TH) og transkriptionsfaktoren Parret-lignende homeobox 2b (Phox2b).
RNAscope-indehaveren anbefaler friske frosne vævspræparater, men væv fremstillet ved transkardial perfusionsfiksering af hele dyr sammen med langvarig kryobeskyttelse (opbevaring ved -20 ° C) af faste frosne vævssektioner er almindelig i mange laboratorier. Derfor søgte vi at etablere protokoller for FISH i kombination med IHC ved hjælp af friske frosne og faste frosne vævspræparater. Her sørger vi for friske frosne og faste frosne hjernesektioner: (1) en protokol for kombineret FISH og fluorescerende IHC (2) en beskrivelse af kvaliteten af mRNA og proteinmærkning produceret ved anvendelse af hvert præparat (3) en beskrivelse af ekspressionen af GalR1 og GlyT2 i NTS.
Vores undersøgelse afslørede, at når det kombineres med RNAscope-metodologi, varierede IHC-succes i friske frosne og faste frosne præparater og var afhængig af lokalisering af målproteinerne i cellen. I vores hænder var membranbundet proteinmærkning altid vellykket. I modsætning hertil krævede IHC for cytoplasmatisk protein fejlfinding, selv i tilfælde, hvor det cytoplasmatiske protein blev overudtrykt i et transgent dyr (Phox2b-GFP)11. Endelig, mens GalR1 udtrykkes i ikke-katekolaminerge neuroner i NTS, er GlyT2-ekspression fraværende i NTS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Figur 1 indeholder et resumé af vævsforbehandlingstrinnene. Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med Animal Care and Ethics Committee ved University of New South Wales i overensstemmelse med retningslinjerne for brug og pleje af dyr til videnskabelige formål (Australian National Health and Medical Research Council).
1. Prøveforberedelse af friskfrosset hjernevæv
- Transkardial perfusion
- Der fremstilles hepariniseret (2500 E/L) 0,1 M fosfatbuffer (PB), pH 7,5. Lav tørisethanolopslæmning ved at blande tøris med ethanol. Dette vil have en temperatur på ca. -72 °C og vil blive brugt til øjeblikkelig frysning af det høstede væv.
- Aflive voksne C57BL/6 og Phox2b-GFP11 (Mouse Genome Informatics database ID MGI:5776545) mus ved bedøvelse med natriumpentobarbital (70 mg/kg, i.p.) ved hjælp af en 27,5 tommer nålemåler.
FORSIGTIG: Pentobarbital er et barbiturat. Det er akut giftigt i høje doser og kan forårsage død ved åndedrætsstop. Se lokale retningslinjer for sundhedspleje, juridisk og materialesikkerhed før brug. - Udsæt hjertet og kannulere venstre ventrikel med en tegningsnål (23 tommer måler). Udfør transkardieperfusion med hepariniseret 0,1 M PB, indtil blodet rydder (2-3 minutter) ved en strømningshastighed på 11-13 ml / min. Bestem blodrensning ved at overvåge leverens farve og effusatet fra højre atrium12.
- Isoler hjernen fra kraniehulen, indlejr den straks i optimal skæretemperaturforbindelse (OCT) i en kryomol- eller aluminiumsfolie og læg den på tørisethanolbadet. Opbevar det frosne indlejrede væv i en lufttæt beholder ved - 80 °C i op til 3 måneder.
- Sektionering af friskfrosset væv
- Indstil kryostattemperaturen til -20 °C. Lad det OCT-indlejrede væv og en kryostatpatron stå i kryostaten i ~30 minutter for at muliggøre ligevægt til den nye temperatur.
BEMÆRK: Hold vævet frosset til enhver tid; transporter vævet fra -80 °C fryseren til kryostaten på tøris. - Fastgør vævet til den forkølede kryostatpatron ved hjælp af OCT-forbindelse. I denne protokol blev vævsblokke monteret på borepatronen i koronalplanet.
BEMÆRK: Trim overskydende OCT fra vævet ved hjælp af et barberblad for at minimere mængden af OCT, der skæres af kryostaten og efterfølgende overføres til glasglasset. - Skær 14 μm tykke koronale sektioner og monter dem på ladede glasmikroskopiglas.
- Opvarm diasene til stuetemperatur, inden sektionerne monteres. Når sektionen er monteret, skal du opbevare diasene i en diasboks i kryostaten.
- Hvis der skal monteres mere end en sektion på et dias, skal du varme området for den anden sektion ved at placere en finger på den modsatte side af diaset i 5-10 sekunder for at hjælpe sektionen med at klæbe til diaset. En kold vævssektion fastgøres ikke til et koldt dias. Sektionerne skal klæbe til diasene fladt; Foldning får dem til at falde af diasene under vasketrin.
- Hvis der opdages revner i sektionerne, øges kryostattemperaturen med 1-5 °C for at undgå dette. Det er især vigtigt at placere vævssektioner tæt på hinanden på samme dias. Dette forhindrer spild af FISH-sonder og reagenser under analysen.
- Opbevar vævssektioner monteret på glasglas i en lufttæt beholder ved -80 °C i op til 6 måneder.
BEMÆRK: Hold sektionerne frosne hele tiden og undgå fryseoptøningscyklusser for at forhindre RNA-nedbrydning. Transporter glideboksen fra indersiden af kryostaten til -80 °C fryseren på tøris.
- Indstil kryostattemperaturen til -20 °C. Lad det OCT-indlejrede væv og en kryostatpatron stå i kryostaten i ~30 minutter for at muliggøre ligevægt til den nye temperatur.
- Fastgørelse af friskfrosset væv
- Den dag, hvor FISH-sondeanalysen skal udføres, fremstilles 4% paraformaldehyd (PFA) i 0,1 M PB, pH 7,5 (4% PFA-opløsning). Filtrer ved at passere gennem filterpapir (grad 1: 11 μm, materialetabel) i en Buchner-tragt eller et digelfilter.
FORSIGTIG: PFA er skadeligt og giftigt ved hudkontakt eller indånding. Alle procedurer med PFA-opløsning skal udføres i et stinkskabskab. PFA-opløsningsaffald skal bortskaffes omhyggeligt i henhold til institutionelle sikkerhedsprotokoller. - 4 % PFA-opløsningen afkøles til 4 °C. Det glidemonterede væv transporteres fra -80 °C-fryseren i tøris, og det nedsænkes straks i det forkølede fikseringsmiddel i 15 minutter.
BEMÆRK: Det er vigtigt, at dette fikseringstrin ikke overstiger 15 minutter, da overfiksering vil resultere i uspecifik baggrundsmærkning.
- Den dag, hvor FISH-sondeanalysen skal udføres, fremstilles 4% paraformaldehyd (PFA) i 0,1 M PB, pH 7,5 (4% PFA-opløsning). Filtrer ved at passere gennem filterpapir (grad 1: 11 μm, materialetabel) i en Buchner-tragt eller et digelfilter.
- Dehydrering af friskfrosset væv
- Dehydrere vævssektioner ved at nedsænke diasene i graduerede koncentrationer af ethanol. I en Coplin krukke, først nedsænket i 50%, derefter 70% og til sidst absolut ethanol, i 5 minutter hver ved stuetemperatur. Den endelige absolutte ethanolinkubation gentages endnu en gang.
- Lufttør glider og skitser gruppen af sektioner ved hjælp af en hydrofob barrierepen, og sørg for, at det indre område holdes på et minimum.
BEMÆRK: Sørg for, at glasobjektglasset er helt tørt, før du trækker den hydrofobe barriere. Den hydrofobe barriere skal omgive vævssektionerne helt uden huller og skal være tør inden videre behandling.
2. Prøveforberedelse af fast frosset hjernevæv
- Transkardial perfusionsfiksering
- Afliv mus ved bedøvelse med natriumpentobarbital (70 mg / kg, i.p) efterfulgt af transkardial perfusion, først med 0,1 M PB derefter 4% PFA-opløsning. Fastgør med 10 minutters perfusion ved 11-13 ml / min.
- Hjernen isoleres fra kraniehulen efter perfusionsfiksering og nedsænkes natten over i 4% PFA-opløsning ved 4 °C.
- Vævssektionering af fast væv
- Skyl hjernen i sterilt 0,1 M fosfatbufret saltvand (PBS), før meningeallagene fjernes ved hjælp af et dissekerende mikroskop ved hjælp af fine tang.
- Skær hjernen præcist i blokke (adskil hjernestammen fra forhjernen før vibratomsektionering) ved hjælp af en hjernematrix (materialetabel). Skær hjernestammen kausalt ved den pyramidale decussation og disseker lillehjernen væk. På samme måde skal du skære forhjernen straks rostral til den optiske chiasme.
- Fastgør vævet på en vibrerende mikrotompatron ved hjælp af cyanoacrylat og indlejr i 2% agaropløsning.
- Skær 30 μm tykke vævssektioner ved hjælp af et vibrerende mikrotom, og opbevar skårne sektioner i kryoprotektiv opløsning (30% RNasefri saccharose, 30% ethylenglycol, 1% polyvinylpyrrolidon (PVP-40), i 0,1 M PB, pH 7,4). Vævssektioner kan opbevares i kryoprotektive midler ved -20 °C i op til 6 måneder.
- Forberedelse af faste sektioner før FISH
- På dagen for FISH vaskes fritflydende sektioner tre gange i 10 minutter pr. vask for at fjerne kryoprotektiv opløsning. For at vaske skal du placere sektioner i 0,1 M PBS i en 12 brønds cellekulturplade og omryste på en roterende platformryster (90 - 100 o / min).
- Efter vask skal du bruge en pensel til at montere sektioner på glasmikroskopiglas og lufttørre i mindst 2 timer.
BEMÆRK: Sektionerne skal klæbe fladt på diasene, da eventuelle udtalte folder får dem til at løsne sig under vask. - Brug en hydrofob barrierepen til at tegne en barriere rundt om sektionerne for at begrænse FISH-reagenserne til sektionerne. Endnu en gang er det vigtigt at minimere det indre område af omridset tegnet med barrierepennen.
MULIGT BRUDPUNKT: Sektionerne kunne opbevares ved stuetemperatur natten over for at fortsætte analysen den næste dag.
3. FISKEANALYSE
BEMÆRK: Resten af protokollen gælder for både friskfrosset og fast frosset væv.
- Forbered reagenserne og instrumenterne til hybridiserings- og forstærkningstrin.
- Indstil en stationær inkubator og vandbad til 40 °C.
- Forbered et befugtet, lysbeskyttet kammer til inkubation af dias. Befugtning forhindrer tørring af væv - dias er sikkert placeret over et fugtigt reservoir. Ideelt set er kammeret lavet af kraftigt polystyren, det er lystæt og lufttæt for at opretholde en mættet vanddampatmosfære. Lukning af kammeret er afhængig af minimal friktion for at undgå bevægelse. Vi brugte en diaskasse foret med våde laboratorieservietter (materialebord) i bunden. Placer glideboksen inde i inkubatoren for at forvarme den til 40 °C.
- 50x vaskebufferen (materialebordet) og sonderne opvarmes til 40 °C i 10 minutter ved hjælp af vandbadet, hvorefter de afkøles til stuetemperatur.
- Forbered 1 L 1x vaskebuffer fra 50x lagerkoncentrationen.
- Forbered sondeblanding (materialetabel): C1-sonden er klar til brug ved lagerkoncentration, mens C2- og C3-sonder sendes som 50x koncentration og kræver fortynding med det fortyndingsmiddel, der leveres i sættet.
BEMÆRK: Sondeblandinger kan opbevares ved 4 °C i op til 6 måneder.
- Proteasebehandling
- Inkuber sektioner med Protease III (Table of Materials) ved stuetemperatur i 30 minutter.
BEMÆRK: Sørg for, at Protease III og inkubationsreagenser i downstream-processer (sondeblanding, amplifikationsopløsninger, blokerende buffer og antistofsera) dækker sektionerne fuldstændigt. En pipetspids kan anvendes til at sprede reagenset på sektionen for at dække hele området inden for den hydrofobe barriere. - Vask dias to gange med 0,1 M PBS, i 2 min hver gang, i en stor plast firkantet petriskål. Her blev der brugt en 245 mm x 245 mm firkantet bioassayskål (Materialetabel). Hold fra den ene side af fadet og vip forsigtigt 3-5 gange. Efter vask skal du svippe overskydende 0,1 M PBS fra dias og straks tilføje det næste reagens. Lad ikke vævssektioner tørre.
BEMÆRK: Under hver vask nedsænkes diasene i opløsning ved stuetemperatur. Dette er arbejdsgangen for alle efterfølgende vasketrin. De faste 30 μm tykke sektioner løsnes lettere fra dias end 14 μm tykke sektioner, vær forsigtige under vasken.
- Inkuber sektioner med Protease III (Table of Materials) ved stuetemperatur i 30 minutter.
- Hybridisering og forstærkning
- Efter vask af proteaseopløsningen skal du placere gliderne i det befugtede, forvarmede kammer. Inkuber sektioner med sondeblanding (materialetabel) i 2 timer ved 40 °C inde i en stationær inkubator.
BEMÆRK: Sørg for, at der er mindst 2 sektioner afsat til positive og negative kontrolsonder til vurdering af prøve-RNA-kvalitet og optimal permeabilisering. Positive kontrolsonder er rettet mod husholdningsgener; her var disse en cocktail af RNA'er rettet mod ubiquitin C (UBC; høj overflod), peptidylpropylisomerase B (PPIB; moderat overflod) og RNA-polymerase 2a (POLR2A; lav overflod). Negative kontrolsonder er målrettet mod det bakterielle 4-hydroxy-tetrahydrodipicolinatreduktase (DapB) gen, som normalt er fraværende i musehjerneprøver. Positivt DapB-signal indikerer uspecifikt signal og/eller bakteriel kontaminering af prøven. - Efter hybridisering med sondeblandingen består signalforstærkningstrinnene af inkubation med Amp 1-FL (30 minutter), derefter med Amp 2-FL (15 minutter) efterfulgt af Amp 3-FL (30 minutter) og endelig Amp 4-FL (15 minutter) - hver ved 40 °C. Brug de medfølgende pipetteflasker til at dække vævssektioner med amplifikationsopløsning. Fortsæt til IHC-assay efter det sidste forstærkningstrin.
- Skyl dias med vaskebuffer to gange i 2 minutter mellem sondehybridisering og hvert forstærkningstrin.
- Efter vask af proteaseopløsningen skal du placere gliderne i det befugtede, forvarmede kammer. Inkuber sektioner med sondeblanding (materialetabel) i 2 timer ved 40 °C inde i en stationær inkubator.
4. IHC-analyse
- IHC blokering trin
- For at forhindre ikke-specifik binding af antistoffer inkuberes sektionerne i 1 time ved stuetemperatur med blokerende opløsning indeholdende 10% normalt hesteserum, 0,3% Tween20 i 1x TBSm (50 mM Tris-Cl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,05% merthiolat) efter FISH-assayet. Forbered primære antistoffer i en fortyndingsbuffer indeholdende 1x TBSm, 5% normalt hesteserum og 0,1% Tween20. Primære antistofleverandører er opført i materialetabellen.
- Immunhistokemi
- Fjern overskydende blokerende buffer ved at svirpe diaset og inkuber sektioner med primære antistoffer natten over ved 4 °C.
- Vask dias 3 gange (5 minutter hver) med 1x TBSm og inkuber med sekundært antistof i fortyndingsvæske indeholdende 1x TBSm, 1% normalt hesteserum og 0,1% Tween20 i 2 timer ved stuetemperatur. Sekundære antistoffer, der anvendes i denne protokol, er anført i materialetabellen.
- Vask glider 3 gange med 1x TBSm (5 minutter hver) før dæksel glider med monteringsmedium med eller uden DAPI (Table of Materials).
5. Billedbehandling
- Undersøg immunfarvning under et epifluorescensmikroskop udstyret med et kamera (se materialetabel for detaljer). Hent repræsentative billeder ved 20x forstørrelse, og gem som TIFF-filer.
- Eksporter repræsentative billeder til en billedbehandlingssoftware (materialetabel) til justering af lysstyrke / kontrast for at øge klarheden og afspejle ægte gengivelse.
6. VALGFRIT: Kvantitativ analyse af måludskrifter
BEMÆRK: Dette er en metodeartikel, og kvantitative resultater leveres ikke. Den kvantificeringsmetode, der præsenteres her, stammer fra Dereli et al.10.
- Hent billeder fra de relevante områder som forklaret i 5.1, og anvend de samme mikroskop- og kameraindstillinger (f.eks. eksponeringstid og lysintensitet) på alle billeder af den samme fluorofor.
- Plot neuronale profiler ved hjælp af en billedanalyse software (Tabel over materialer).
- Juster sektionerne med henvisning til Bregma-niveau i henhold til et stereotaksisk hjerneatlas13.
- Anvend den samme lysstyrke og kontrast på alle billederne af den samme fluorofor. Overvej kun neuronerne med DAPI-farvede kerner.
- Tæl manuelt antallet af mRNA, proteinekspression, mRNA/mRNA, protein/protein og mRNA/protein, der coudtrykker celler inden for det pågældende område.
- For at mindske bias i de eksperimentelle resultater skal du få den person, der kvantificerer eksperimentelle resultater, blindet for de eksperimentelle grupper.
- Anvend Abercrombie-korrektion14 på det samlede antal celler ved hjælp af følgende Abercombie-ligning:
Korrigeret celletal = manuelt celleantal x sektionstykkelse / (sektionstykkelse + nuklear størrelse)
For eksempel beregnes den gennemsnitlige nukleare bredde for 14 μm tykke sektioner til at være 7,7 ± 0,3 μm, og den gennemsnitlige sektionstykkelse er 14 ± 1 μm baseret på henholdsvis 30 celler og 10 sektioner i 5 dyr10. Ifølge Abercrombie-ligningen ville korrigeret celletal være manuelt celletal x 14/(14+7,7).
Figur 1: Parallel arbejdsgang af vævsforbehandlingstrin for både friskfrosset og paraformaldehyd fast væv. Forarbejdningstrin for friskfrosset væv vises i de røde konturfelter, mens forarbejdningstrin for fast væv af paraformaldehyd (PFA) vises i de blå konturfelter. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Resumé af kombineret FISH-sonde og immunhistokemisk procedure. Efter forbehandling af væv omkranses det diasmonterede væv ved hjælp af en hydrofob barrierepen, som det ses i det første billede, og inkuberes i en proteaseopløsning ved stuetemperatur. Efter vask overføres væv til en benchtop-inkubator til hybridisering i 2 timer før sekventielle forstærkningstrin. In situ hybridiseringssystemet anvender et proprietært 'Z-sonde' design, forforstærkere og forstærkere, som det ses i ramme 3-66. Når vævet har gennemgået FISH-sondebehandling, vaskes det, før det blokeres med normalt hesteserum. Den primære antistofinkubation udføres natten over ved 4 °C for at maksimere antistof-antigenbindingen. Den sekundære antistofinkubation (2 timer) blev udført ved stuetemperatur. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her skitserer vi en metode til at kombinere multiplex FISH med fluorescerende IHC for at lokalisere mRNA-ekspression for GalR1 og GlyT2 ved hjælp af henholdsvis friskfrosset og paraformaldehydfikseret væv i musens NTS. Figur 1 og figur 2 viser en pipeline af vævsbehandlings-, FISH- og IHC-procedurerne, der er beskrevet i metoderne. Tabel 1 giver et resumé af de FISH-sonde- og antistofkombinationer, der er anvendt i hver figur.
Kontrolsonder analyseres rutinemæssigt samtidig med målsonden for at sikre integriteten af arbejdsgangen og bekræfte prøvekvaliteten. Den manglende DapB-mærkning bekræfter vævets sunde kvalitet og integritet og fraværet af bakteriel kontaminering (figur 3A). Mærkning fra positive kontrolsonder rettet mod ubiquitin C (UBC, høj forekomst), peptidylpropylisomerase B (PPIB, moderat overflod) og RNA-polymerase 2a (POLR2A, lav forekomst) mRNA bekræfter RNA-integritet, og signalet observeret mellem assays kan bruges til at kalibrere interassayvariabilitet (figur 3B). For at validere FISH-sondeekspression brugte vi kontrolvæv, der tidligere er blevet beskrevet til at udtrykke mRNA-transkriptet. For eksempel blev GalR1 mRNA-ekspression bekræftet at være positiv i thalamus som tidligere beskrevet10,15. Phox2b mRNA-fordeling blev desuden verificeret ved co-mærkning med Phox2b-antistof; vi bekræftede, at FISH-mærkning kun var til stede i neuroner, der også var positivt farvet ved hjælp af Phox2b-antistoffet (figur 5).
For at skelne GalR1+ neuroner i NTS fra nabokerner brugte vi yderligere neurokemiske markører. TH, Phox2b eller Phox2b-GFP immunoreaktivitet (figur 4-6) og Phox2b FISH (figur 5 og figur 6) differentierede NTS fra andre kerner i den dorsale hjernestamme, da NTS-neuroner tidligere er rapporteret at udtrykke Phox2b og TH16,17. Da NTS er beliggende af kolinerge kerner - den ligger dorsal til den hypoglossale kerne og dorsale motoriske kerne i vagus (DMNX) og ventral til den vestibulære kerne - vi co-mærket med den kolinerge markør vAChT18 (figur 4). Derfor blev ekspressionen af GalR1 inden for NTS vurderet i forhold til TH og Phox2b, mens vAChT-mærkning hjalp rumlig orientering med hensyn til rostrocaudale, dorsoventrale og mediolaterale koordinater. Vi fandt, at alle TH-immunoreaktive og GalR1 mRNA-positive neuroner i NTS var Phox2b-GFP-immunoreaktive, men ikke alle Phox2b-GFP-immunoreaktive neuroner i NTS var TH-immunreaktive eller GalR1 mRNA-positive (figur 4). Vi demonstrerede også, at mRNA for lavdensitetsreceptoren GalR1 var fraværende i TH- og vAChT-immunreaktive neuroner.
I friske frosne præparater, når de blev kombineret med FISH-sondeanalysen, var IHC-succes afhængig af målproteinets subcellulære placering. For eksempel var vAChT (et synaptisk vesikelmembranbundet protein) tydeligt immunmærket, mens TH og GFP (cytoplasmatiske proteiner) blev immunmærket på ubestemt tid og kun svagt observeret (figur 4). Vi beskriver denne ubestemte mærkning som "flokkulent", fordi cellerne manglede et klart omrids og viste sig vanskelige at skelne fra baggrunden. På samme ferskfrosne vævssektion blev GalR1 FISH-sondemærkning af cytoplasmatisk GalR1 mRNA punkteret og tydeligt observeret (figur 4).
Da TH- og vAChT-antistofferne desuden hæves i samme vært, blev begge proteiner mærket med det samme sekundære antistof og derfor den samme farve fluorofor (excitationslys: 594). De er lette at skelne af to grunde: de co-label aldrig i de samme neuroner, og den subcellulære lokalisering er forskellig for disse proteiner; vAChT i vesikler, der udviser et punkteret udseende, og TH i cytoplasmaet og neuronale processer.
For at understøtte vores hypotese om, at IHC-kvaliteten (i friskfrosne præparater) er afhængig af subcellulær lokalisering af proteiner, sammenlignede vi mærkning for Phox2b mRNA (placeret i cytoplasmaet), GFP (overudtrykt i cytoplasma) og Phox2b-protein (primært fundet i kernen) i neuroner. Som forventet viser vores resultater overlapning af Phox2b mRNA, GFP og Phox2b antistofmærkning i individuelle neuroner i NTS (figur 5). Celler med cytoplasmatisk mRNA-mærkning svarede til celler, der udviste nuklear mærkning af Phox2b-proteinet, hvilket gav validering af den kombinerede FISH-IHC-metode. Selvom cytoplasmatisk Phox2b-GFP havde et flokkulent udseende, var nukleært Phox2b-proteinsignal klart og specifikt. Det kan konkluderes, at membranbundne proteiner, herunder vAChT og Phox2B, når de kombineres med FISH på friskfrosne præparater, udviser immunmærkning af højere kvalitet end cytoplasmatiske proteiner.
I modsætning hertil var IHC pålidelig uanset subcellulær lokalisering, når den blev udført på faste frosne sektioner i kombination med FISH. Multiplex FISH for GlyT2 mRNA og Phox2b mRNA var vellykket, som vist i figur 6. GlyT2 mRNA-positive neuroner var placeret ventralt til NTS og ikke inden for NTS. GlyT2+ og Phox2b+ neuroner colokaliserede ikke. En subpopulation af Phox2b + NTS-neuroner var TH-immunreaktive, og ingen indeholdt GlyT2 mRNA. TH immunoreaktive neuroner er tydelige på samme vævssektion, der udviser positivt mærket soma og neuronale processer (figur 6). Dette står i kontrast til det 'flokkulente' udseende af TH immunoreaktive neuroner i friske frosne vævssektioner. Således er det faste frosne præparat, der er beskrevet her, en alternativ metode til vævsforberedelse, der muliggør pålidelig målretning af cytoplasmatiske proteiner immunhistokemisk i kombination med RNAscope.
Figur 3: Repræsentative mikroskopiske billeder fra koronale museforhjernesektioner på niveau med lateral septum (Bregma 1,1 til -0,1), der viser mærkning af positive og negative kontrolprober . (A) Manglende signal efter ISH med bakteriel 4-hydroxytetrahydrodipicolinatreduktase (DapB) bekræfter fraværet af baggrundssignaler. B) Mærkning med positive kontrolsonder rettet mod ubiquitin C (UBC), peptidylpropylisomerase B (PPIB) og RNA-polymerase 2a (POLR2A) illustrerer det signal, der kan forventes fra henholdsvis høj, moderat og lav forekomst. Skalastænger er 50 μm. Alle billeder blev erhvervet med 20x mål. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Repræsentative mikroskopiske billeder af en friskfrossen koronal hjernestammesektion fra en Phox2b-GFP-mus, der viser kombineret mærkning af GalR1 mRNA (FISH) og 3 proteiner (IHC) i kernen i ensomhedsområdet (NTS). Indsatser i A er forstørret i B. GalR1 mRNA er angivet ved punktlig FISH-sondemærkning (pilespidser). Antistoffer rettet mod de cytoplasmatiske proteiner GFP og tyrosinhydroxylase (TH) udviste "flokkulent" mærkning (pile). Vesikulær acetylcholintransportør (vAChT) immunreaktivitet er påvist (mærkning med rødt punkt) i hypoglossalkernen (XII). Skalastænger er 100 μm i A og 25 μm i B. Alle billeder blev erhvervet med 20x mål. Andre forkortelser: område postrema (AP), medial vestibulær kerne (MVe). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Repræsentative mikroskopiske billeder af en frisk frossen koronal hjernestammesektion fra en Phox2b-GFP-mus, der illustrerer målretning af Phox2b i kernen i den ensomme kanal (NTS) med tre forskellige tilgange: Phox2b mRNA (FISK), GFP (IHC) og Phox2b-protein (IHC). Phox2b protein er lokaliseret til kernen. Indsatser i A er forstørret i B. Pile angiver neuroner, der er tredobbelt mærket med Phox2b-sonde (orange-550), GFP-antistof (grøn-488) og Phox2b-antistof (rød-647). Skalastænger er 100 μm i A og 25 μm i B. Alle billeder er erhvervet med en 20x målsætning. Andre forkortelser: area postrema (AP). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Repræsentative billeder fra faste frosne koronale hjernestammesektioner, der viser vellykket FISH kombineret med pålidelig immunmærkning af cytoplasmatiske proteiner (tyrosinhydroxylase [TH]). Dobbelt FISH, der viser glycintransportør 2 (GlyT2-rød-647, fyldte pilespidser) og Phox2b (gul-550, pile) mRNA-mærkning i kernen i ensomhedsområdet (NTS). FISH blev kombineret med IHC for TH-protein (blå-346, tomme pilespidser). Indsatser i A er forstørret i B. Skalastænger er 25 μm. Alle billeder blev erhvervet med et 20x mål. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Primær antistof eller RNAscope sonde | Sekundært antistof eller Amp 4-FL-Alt Display modul |
Excitation (nm) | Vævsforberedelse | ||
| Figur 3 | sonde | POLR2A (C1) | Amp 4-FL-Alt B-skærmmodul | 647 | frisk frossen |
| sonde | PPIB (C2) | Amp 4-FL-Alt B-skærmmodul | 488 | ||
| sonde | UBC (C3) | Amp 4-FL-Alt B-skærmmodul | 550 | ||
| sonde | DapB (C1, C2, C3) | Amp 4-FL-Alt B-skærmmodul | 647, 488, 550 | ||
| DAPI | 346 | ||||
| Figur 4 | antistof | kanin-anti-GFP | æsel-anti-kanin | 488 | frisk frossen |
| antistof | får-anti-TH | æsel-anti-får | 647 | ||
| antistof | ged-anti-vAChT | æsel-anti-ged | 647 | ||
| sonde | GalR1 (C1) | Amp 4-FL-Alt B-skærmmodul | 550 | ||
| DAPI | 346 | ||||
| Figur 5 | antistof | kanin-anti-GFP | æsel-anti-kanin | 488 | frisk frossen |
| antistof | mus-anti-Phox2b | æsel-anti-mus | 647 | ||
| sonde | Phox2b (C2) | Amp 4-FL-Alt A-skærmmodul | 550 | ||
| DAPI | 346 | ||||
| Figur 6 | antistof | mus-anti-TH | æsel-anti-mus | 346 | fast |
| sonde | GlyT2 | Amp 4-FL-Alt A-skærmmodul | 647 | ||
| sonde | Phox2b | Amp 4-FL-Alt A-skærmmodul | 550 |
Tabel 1: FISH-sonde, antistof og tilsvarende fluroforkombinationer anvendt i figur 3-6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I neurovidenskaben bruges FISH og IHC rutinemæssigt til at undersøge den rumlige organisation og funktionelle betydning af mRNA eller proteiner inden for neuronale subpopulationer. Protokollen beskrevet i denne undersøgelse forbedrer kapaciteten til samtidig påvisning af mRNA'er og proteiner i hjernesektioner. Vores kombinerede multiplex FISH-IHC-assay muliggjorde fænotypisk identifikation af forskellige neuronale subpopulationer i NTS i både friskfrosne og faste hjernepræparater. FISH-IHC i faste frosne vævspræparater gav pålidelige IHC-resultater. For eksempel afslørede multiplex FISH for mRNA'er med lav og høj overflod (henholdsvis GalR1 og GlyT2) og IHC (målretning af tyrosinhydroxylase), at GalR1 og GlyT2 udtrykkes i ikke-katekolaminerge NTS-neuroner. IHC for TH var ikke vellykket inden for friskfrosset væv, hvilket understreger den begrænsede kapacitet for FISH-IHC i ferske frosne tilberedninger.
ISH kan være mere hensigtsmæssigt end IHC i en række scenarier. For det første fungerer IHC muligvis ikke godt, når man detekterer proteiner med lav overflod, såsom receptorer. Brug af ISH til at målrette relativt højere overflod mRNA'er for disse proteiner forbedrer detekterbarheden1. For det andet handles proteiner såsom neuropeptider ofte til de aksonale terminaler efter oversættelse i cellen soma19. Når neuropeptider målrettes med IHC, mærker de aksonale processer og terminaler af celler med antistoffet, men ikke soma, hvilket reducerer kapaciteten til at identificere oprindelsescellen eller udføre kvantitativ analyse af antallet af celler. Men da mRNA'er, der koder for alle proteiner, findes lokaliseret til somaen, er ISH-teknikken fordelagtig. Endelig er antistoffer ikke let tilgængelige for nogle proteinarter, eller de tilgængelige antistoffer er egnede til andre proteomiske teknikker (f.eks. Western blot), men ikke IHC. Under disse omstændigheder viser mRNA-mærkningsmetoder sig nyttige. En advarsel er, at mRNA'er muligvis ikke altid oversættes til protein, og derfor giver de kun en proxy til proteinidentifikation. Da kommercielle FISH-sæt kan være dyre, og ISH-sonderne er mindre tilbøjelige til at være kommercielt tilgængelige sammenlignet med antistoffer, udgør kombinationen af FISH med IHC en omkostnings- og tidseffektiv strategi for at øge antallet af mål, der kan mærkes samtidigt.
Friskfrosset versus fast vævspræparat var en faktor, der gav vellykket IHC efter FISH-sondeanalyse. Vi testede IHC ved hjælp af antistoffer rettet mod nukleare, vesikulære og cytoplasmatiske proteiner og fandt pålidelig mærkning af membranbundne proteiner (vAChT og Phox2b) på friske frosne prøver, men ikke cytoplasmatiske proteiner (TH og GFP). Coekspression af Phox2b-protein og mRNA med 'flokkulent' Phox2b-GFP-mærkning validerede, at neuroner, der udtrykte transkriptet, også udtrykte det relaterede protein, hvilket bekræftede neuronernes neurokemiske identitet (figur 5). I modsætning hertil gav faste frosne vævspræparater pålidelig IHC-mærkning uanset subcellulær lokalisering af antigenet. Tidligere undersøgelser har vist, at forbehandling af protease (f.eks. pronase 8,20) kan have en skadelig virkning på IHC. Indholdet af proteaseopløsningen, der anvendes i RNAscope-protokollen, er proprietært, og permeabilisering ved protease anbefales til RNAscope-sondeadgang til celler. Mærkning af cytoplasmatiske proteiner ved hjælp af antistofferne beskrevet her er tidligere verificeret på fritflydende 30 μm faste frosne musehjernesektioner 10,21,22. Vi diasmonterede 30 μm tykke faste prøver og udførte FISH-IHC-protokollen i modsætning til de 14 μm tykke ferske frosne sektioner, der anbefales af producenten. I mangel af analysemodifikationer eller ændring af andre variabler (antigenudtagning, højere antistofkoncentration, ændring af protease) blev der opnået pålidelig IHC på tykke, faste prøver med påvist mærkning af cytoplasma- og aksonale processer sammen med FISH-sondemærkning (figur 6). Mens lignende tilgange blev anvendt af andre forskningsgrupper 7,8,9, opnåede den aktuelle undersøgelse kombineret ISH-IHC på neuroner og i en fluorescerende opsætning.
Der var en række kritiske trin i metoderne at notere sig. For det friske frosne præparat bør fikseringstiden ikke overstige 15 minutter; Længere fikseringstider fremkaldte højere baggrundsmærkning. Proteasetrinnet blev optimeret, da væv af forskellig tykkelse og fra forskellige organer kræver forskellige typer protease for at opnå permeabilisering. Faste, frosne sektioner klæber mindre til glasskinner og løsner sig lettere under vasketrin. Derfor skal der udvises ekstra omhu ved manuel håndtering af faste frosne sektioner for at undgå tab eller beskadigelse af væv.
Selvom vi fandt, at kombineret FISH og IHC var en effektiv strategi, inkluderer ulemperne omkostninger og teknisk krævende analyse, når de to metoder kombineres. En begrænsning af undersøgelsen er, at der ikke blev udført en side-om-side sammenligning af de to vævspræparationsprotokoller. Vores evaluering af resultaterne var også begrænset af antallet af kanaler, som det epifluorescerende mikroskop kunne rumme; Opsætningen tillod maksimalt 4 kanaler på et givet tidspunkt: 346, 488, 550 og 647 nm (excitationslys). Vi var i stand til at opnå multiplex-mærkning af 5 mål ved at mærke to proteiner med forskellige subcellulære lokaliseringer ved hjælp af den samme fluroforer (figur 4, tabel 1). Ved hjælp af et konfokalmikroskop kan diskret excitation af mange yderligere fluoroforer anvendes til individuel proteinmærkning via IHC eller til billeddannelse af fluorescerende molekyler udtrykt ved transgener.
Kombineret FISH og fluorescerende IHC kan reducere pålideligheden af hver teknik isoleret. I fremtiden sigter vi mod at forbedre cytoplasmatisk proteinmærkning på frisk frosset væv med en antigenudtagningsbehandling23. Tidligere undersøgelser viser, at varmeinduceret antigenudtagning øger tilgængeligheden af proteinepitopen24,25,26. Varmebehandling spalter proteinets tværbindinger og methylolgrupper og udfolder antigenerne i væv og blotlægger epitoper, som ellers ville være skjult i den tertiære proteinstruktur under biologiske forhold. Denne tilgængelighed kan forbedre succesen med proteinmærkning26,27. Derudover vil vi målrette forskellige epitoper af det samme cytoplasmatiske protein for at afgøre, om succesen med protein-antistofmærkning afhænger af de specifikke antistofkloner, der anvendes.
Afslutningsvis er kombineret FISH og IHC nyttig til neurokemisk identifikation af heterogene populationer af celler i hjernen, såsom dem i NTS. Denne undersøgelse præsenterer to protokoller, der analyserer forskellige musehjernestamvævspræparater - friskfrosne eller faste - til samtidig multiplex fluorescerende mærkning af mRNA og proteiner in situ. Begge protokoller kan anvendes bredt til at detektere ekspressionsmønsteret for mRNA'er med lav forekomst, såsom GalR1. Tykke (30 μm) faste frosne præparater permeabiliseret med protease gav mere pålidelig cytoplasmatisk proteindetektion og flere vævshåndteringsudfordringer sammenlignet med tynde (14 μm) friske frosne præparater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af Australian Research Council Discovery Project grant DP180101890 og Rebecca L Cooper Medical Research Foundation projektbevilling PG2018110
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ANIMALS | |||
| C57BL/6 mouse | Australian BioResources, Moss Vale | MGI: 2159769 | |
| Phox2b-eGFP mouse | Australian BioResources, Moss Vale | MGI: 5776545 | |
| REAGENTS | |||
| Cyanoacrylate | Loctite | ||
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| Heparin-Sodium | Clifford Hallam Healthcare | 1070760 | Consult local veterinary supplier or pharmacy. |
| Lethabarb (Sodium Pentabarbitol) Euthanasia Injection | Virbac (Australia) Pty Ltd | N/A | Consult a veterinarian for local pharmaceutical regulations regarding Sodium Pentabarbitol |
| Molecular grade agarose powder | Sigma Aldrich | 5077 | |
| OCT Compound, 118mL | Scigen Ltd | 4586 | |
| Paraformaldehyde, prilled, 95% | Sigma-Aldrich | 441244-1KG | |
| Polyvinylpyrrolidone, average mol wt 40,000 (PVP-40) | Sigma-Aldrich | PVP40 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P36930 | With or without DAPI |
| RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit (up to 3-plex capability) | Advanced Cell Diagnostics, Inc. (ACD Bio) | ADV320850 | Includes 50x Wash buffer and Protease III |
| RNase Away | Thermo-Fisher Scientific | 7003 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 | |
| Tween-20, for molecular biology | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| EQUIPMENT | |||
| Benchtop incubator | Thermoline scientific micro incubator | Model: TEI-13G | |
| Brain Matrix, Mouse, 30g Adult, Coronal, 1mm | Ted Pella | 15050 | |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| Drawing-up needle (23 inch gauge) | BD | 0288U07 | |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector labs | H-4000 | |
| Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipes | Kimberley Clark Professional | 34120 | |
| Olympus BX51 | Olympus | BX-51 | |
| Peristaltic pump | Coleparmer Masterflex | L/S Series | |
| Retiga 2000R Digital Camera | QImaging | RET-2000R-F-CLR | colour camera |
| SuperFrost Plus Glass Slides (White) | Thermo-Fisher Scientific | 4951PLUS4 | |
| Vibrating Microtome (Vibratome) | Leica | VT1200S | |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 1, 110 mm diameter | Merck | WHA1001110 | |
| SOFTWARES | |||
| CorelDRAW | Corel Corporation | Version 7 | |
| FIJI (ImageJ Distribution) | Open Source/GNU General Public Licence (GPL) | N/A | ImageJ 2.x: Rueden, C. T.; Schindelin, J. & Hiner, M. C. et al. (2017), "ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data", BMC Bioinformatics 18:529, PMID 29187165, doi:10.1186/s12859-017-1934-z and Fiji: Schindelin, J.; Arganda-Carreras, I. & Frise, E. et al. (2012), "Fiji: an open-source platform for biological-image analysis", Nature methods 9(7): 676-682, PMID 22743772, doi:10.1038/nmeth.2019 |
| PRIMARY ANTIBODIES | |||
| Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody | Millipore Sigma | AB1542 | Sheep polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_90755 |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody, clone LNC1 | Millipore Sigma | MAB318 | Mouse monoclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2201528 |
| Anti-Vesicular Acetylcholine Transporter (VAchT) Antibody | Sigma-Aldrich | ABN100 | Goat polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2630394 |
| GFP Antibody | Novus Biologicals | NB600-308 | Rabbit polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_10003058 |
| Phox2b Antibody (B-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc-376997 | Mouse monoclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2813765 |
| SECONDARY ANTIBODIES | |||
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | Donkey anti-Rabbit (1:400 dilution), RRID: AB_2313584 |
| AMCA AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 713-155-147 | Donkey anti-Sheep (1:400 dilution), RRID: AB_AB_2340725 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 705-175-147 | Donkey anti-Goat (1:400 dilution), RRID: AB_2340415 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Rb, Rat, Shp Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 715-175-151 | Donkey anti-Mouse (1:400 dilution), RRID: AB_2619678 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 713-175-147 | Donkey anti-Sheep (1:400 dilution), RRID: AB_2340730 |
| RNASCOPE PROBES | |||
| Galanin Receptor 1 oligonucleotide probe | ACDBio | 448821-C1 | targets bp 482 - 1669 (Genebank ref: NM_008082.2) |
| Glycine transporter 2 oligonucleotide probe | ACDBio | 409741-C3 | targets bp 925 - 2153 (Genebank ref: NM_148931.3) |
| Phox2b oligonucleotide probe | ACDBio | 407861-C2 | targets bp 1617 - 2790 (Genebank ref: NM_008888.3) |
References
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
- Annese, T., et al. RNAscope dual ISH-IHC technology to study angiogenesis in diffuse large B-cell lymphomas. Histochemistry and Cell Biology. 153 (3), 185-192 (2020).
- Morrison, J. A., McKinney, M. C., Kulesa, P. M. Resolving in vivo gene expression during collective cell migration using an integrated RNAscope, immunohistochemistry and tissue clearing method. Mechanisms of Development. 148, 100-106 (2017).
- Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biology. 12, 55 (2014).
- Stempel, A. J., Morgans, C. W., Stout, J. T., Appukuttan, B. Simultaneous visualization and cell-specific confirmation of RNA and protein in the mouse retina. Molecular Vision. 20, 1366-1373 (2014).
- Kersigo, J., et al. A RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell and Tissue Research. 374 (2), 251-262 (2018).
- Grabinski, T. M., Kneynsberg, A., Manfredsson, F. P., Kanaan, N. M. A method for combining RNAscope in situ hybridization with immunohistochemistry in thick free-floating brain sections and primary neuronal cultures. PLoS One. 10 (3), 0120120 (2015).
- Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C., Hengst, U. Detection of axonally localized mRNAs in brain sections using high-resolution in situ hybridization. Journal of Visualized Experiments. (100), e52799 (2015).
- Fe Lanfranco, M., Loane, D. J., Mocchetti, I., Burns, M. P., Villapol, S. Combination of fluorescent in situ hybridization (FISH) and immunofluorescence imaging for detection of cytokine expression in microglia/macrophage cells. Bio-Protocol. 7 (22), (2017).
- Dereli, A. S., Yaseen, Z., Carrive, P., Kumar, N. N. Adaptation of respiratory-related brain regions to long-term hypercapnia: focus on neuropeptides in the RTN. Frontiers in Neuroscience. 13, 1343 (2019).
- Lazarenko, R. M., et al. Acid sensitivity and ultrastructure of the retrotrapezoid nucleus in Phox2b-EGFP transgenic mice. Journal of Comparative Neurology. 517 (1), 69-86 (2009).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (2004).
- Abercrombie, M. Estimation of nuclear population from microtome sections. Anatomical Records. 94, 239-247 (1946).
- Kerr, N., et al. The generation of knock-in mice expressing fluorescently tagged galanin receptors 1 and 2. Molecular and Cellular Neurosciences. 68, 258-271 (2015).
- Kachidian, P., Pickel, V. M. Localization of tyrosine hydroxylase in neuronal targets and efferents of the area postrema in the nucleus tractus solitarii of the rat. Journal of Comparative Neurology. 329 (3), 337-353 (1993).
- Stornetta, R. L., et al. Expression of Phox2b by brainstem neurons involved in chemosensory integration in the adult rat. Journal of Neuroscience. 26 (40), 10305-10314 (2006).
- Gilmor, M. L., et al. Expression of the putative vesicular acetylcholine transporter in rat brain and localization in cholinergic synaptic vesicles. Journal of Neuroscience. 16 (7), 2179-2190 (1996).
- Fisher, J. M., Sossin, W., Newcomb, R., Scheller, R. H. Multiple neuropeptides derived from a common precursor are differentially packaged and transported. Cell. 54 (6), 813-822 (1988).
- Towle, A. C., Lauder, J. M., Joh, T. H. Optimization of tyrosine-hydroxylase immunocytochemistry in paraffin sections using pretreatment with proteolytic-enzymes. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 32 (7), 766-770 (1984).
- Biancardi, V., et al. Mapping of the excitatory, inhibitory, and modulatory afferent projections to the anatomically defined active expiratory oscillator in adult male rats. Journal of Comparative Neurology. 529 (4), 853-884 (2021).
- Matthews, D. W., et al. Feedback in the brainstem: an excitatory disynaptic pathway for control of whisking. Journal of Comparative Neurology. 523 (6), 921-942 (2015).
- Ramos-Vara, J. A. Principles and methods of immunohistochemistry. Methods in Molecular Biology. 1641, 115-128 (2017).
- Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 39 (6), 741-748 (1991).
- Yamashita, S., Katsumata, O. Heat-induced antigen retrieval in immunohistochemistry: mechanisms and applications. Methods in Molecular Biology. 1560, 147-161 (2017).
- Yamashita, S., Okada, Y. Mechanisms of heat-induced antigen retrieval: analyses in vitro employing SDS-PAGE and immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (1), 13-21 (2005).
- Yamashita, S. Heat-induced antigen retrieval: mechanisms and application to histochemistry. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 41 (3), 141-200 (2007).
