Summary
在这里，我们提出了一个协议，可视化钙素基因相关肽（CGRP）免疫活性神经纤维和血管的空间相关性，分别使用CGRP和phalloidin的免疫荧光和荧光组织化学。此外，这些神经纤维的起源是逆行跟踪荧光神经示踪剂。
Abstract
本研究的目的是利用免疫荧光、三维（3D）重建和逆行追踪技术，研究钙化物基因相关肽（CGRP）免疫感官神经纤维的分布和起源。在这里，神经纤维和血管分别使用CGRP和荧光法洛丁的免疫荧光和组织化学技术进行染色。3D重建证明了杜拉尔CGRP-免疫神经纤维和血管的空间相关性。同时，通过神经追踪技术从颅内杜拉母体中脑膜动脉（MMA）周围区域到三叉神经结节（TG）和颈椎（C）多头根神经痛（DRG）的神经追踪技术检测出CGRP免疫活性神经纤维的起源。此外，还使用双免疫荧光与CGRP一起检查了TG和DPG中FG标记神经元的化学特性。利用透明的全安装样本和3D重建，结果表明，CGRP免疫活性神经纤维和巴洛丁标记动脉一起运行或单独形成一个神经血管网络在3D视图， 而FG标记的神经元被发现在TG的眼科、最大侧和支线分支，以及C2-3 DRG ipsilateral到示踪器应用的一侧，其中一些FG标记的神经元呈现CGRP免疫活性表达。通过这些方法，我们演示了颅内杜拉母体血管周围CGRP免疫活性神经纤维的分布特征，以及TG和DPG这些神经纤维的来源。从方法论的角度看，它为理解颅骨在生理或病理条件下复杂的神经血管结构提供了宝贵的参考。
Introduction
颅骨母体是保护大脑的最外层，含有丰富的血管和不同种类的神经纤维1，2。许多研究表明，敏感颅杜拉母体可能是导致头痛发生的关键因素，涉及异常血管扩张和内向3，4，5。因此，颅内神经血管结构知识对于理解头痛的发病机理，特别是偏头痛的发病机理非常重要。
虽然杜拉内在研究以前与传统的免疫化学，神经纤维和血管的空间相关性在颅杜拉母体较少研究6，7，8，9。为了更详细地揭示杜拉神经血管结构，钙素基因相关肽（CGRP）和巴洛丁被选为分别用免疫荧光和荧光组织化学10染色全山颅骨神经纤维和血管的标记物。这可能是获得神经血管结构的三维（3D）视图的最佳选择。此外，氟金（FG）被应用于颅内杜拉母体中脑膜动脉（MMA）周围区域，以确定CGRP免疫活性神经纤维的来源， 并追溯到三角结节 （TG） 和颈椎 （C） 多面根神经质 （DRGs）， 而 FG 标记的神经元使用免疫荧光与 CGRP 一起进一步检查。
这项研究的目的是为研究颅内杜拉母体的神经血管结构提供一个有效的工具，用于CGRP免疫活性内分和其起源。通过利用透明的全山杜拉母校，结合免疫荧光、逆行追踪、共焦技术和3D重建，我们期望呈现颅杜拉母校神经血管结构的新3D视图。这些方法方法可以进一步用于探索不同头痛的发病机理。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
本研究经中国医学科学院针灸与莫西布西翁研究所伦理委员会批准（参考号D2018-09-29-1）。所有程序均按照《国家实验室动物护理和使用卫生指南》（1996年.C，华盛顿特区国家学院出版社）执行。这项研究使用了12只成年斯普拉格-道利雄性大鼠（体重220±20克）。动物[许可证号SCXK（JING） 2017-0005]由国家食品和药物管制研究所提供。
1. 大鼠颅杜拉母体的内向
-
香水
- 在内在一次注射过量的三纤维素溶液（250毫克/千克）给大鼠诱导安乐死。
- 一旦呼吸停止，心肌香水与100mL的0.9%正常盐水，然后250-300 mL的4%副甲醛在0.1 M磷酸盐缓冲（PB，pH 7.4）。
- 灌注后，取出头部皮肤，打开头骨，露出大脑的杜拉母体和后侧。然后解剖出颅骨杜拉母体沿脑系统到嗅球在整个安装模式（图1）。在4%的副甲醛中进行固定后2小时，然后在0.1 M PB中在25%蔗糖中进行低温保护，在4°C时超过24小时。
-
CGRP 和巴洛丁标签的荧光免疫化学
注：应用了CGRP和巴洛丁的荧光染色组合，以揭示全安装模式大鼠颅状杜拉母体中神经纤维和血管的空间相关性。- 在0.1 M PB中冲洗颅膜杜拉母体约1分钟。
- 在包含 3% 普通驴血清和 0.5% Triton X-100 的阻塞溶液中孵育杜拉母体 30 分钟。
- 将杜拉母马转移到小鼠抗CGRP抗体（1：1000）在0.1 M PB包含1%的正常驴血清和0.5%特里顿X-100过夜在4°C11。
- 第二天用 0.1 M PB 洗三次杜拉母校。
- 在驴抗鼠标 Alexa Fluor 488 次要抗体 （1：500） 和法洛丁 568 （1：10） 的混合溶液中孵育杜拉母体 00） 在 0.1 M PB 中，含有 1% 普通驴血清，在室温下含有 0.5% 的 Triton X-100，温度为 1.5 小时（26 °C）。
- 在 0.1 M PB 中洗三次杜拉母校。
- 修剪边缘并将其安装在显微镜幻灯片上（参见 材料表）。
- 观察前用50%甘油盖上盖子。
-
观察和记录
- 在荧光显微镜或共焦成像系统下观察荧光样品。
- 通过配备数码相机的荧光显微镜拍摄全山杜拉母校的图像（4 倍，NA： 0.13），并使用 500 毫秒的曝光时间。杜拉母校的图像马赛克是用荧光显微镜软件完成的（见 材料表）。
- 使用共焦显微镜拍摄杜拉母体中 CGRP 免疫活性神经纤维和巴洛丁标记血管的图像。兴奋和排放波长为488 nm（绿色）和594 nm（红色）。同焦针孔为 110 （20x） 和 105 μm （40x）。图像捕获的分辨率为 640 x 640 像素。
- 从每个 40μm 厚的部分在 2μm 帧中捕获 20 张图像，并与共焦图像处理相关软件系统进行单对焦图像集成，用于 3D 分析如下： 设置启动焦点平面|设置结束焦点平面|设置步幅大小|选择深度模式|图像捕获|Z 系列。
- 使用照片编辑软件调整图像的亮度和对比度，以优化可视化。注意不要从图像中删除任何数据。
2. 与 FG 的逆行跟踪研究
- 外科 手术
- 确定大鼠颅杜拉母体感兴趣的坐标区域。
- 准备一个10微升的微注射器，用液体石蜡测试它。
- 通过腹膜注射用三纤维素溶液（150毫克/千克）给大鼠麻醉。检查麻醉的深度，因为对脚趾紧要捏没有反应。
- 用电动剃须刀剃老鼠的头。
- 将钝耳棒放在老鼠身上，放在立体声装置上。然后把嘴架和应用眼药膏的眼睛。
- 使用10%的碘，然后用75%的乙醇清洁头部皮肤的手术部位。
- 沿着头皮的中线切开。
- 使用无菌棉尖施用器（图1A）从头骨上模糊地取出骨孔和肌肉组织。
- 使用毛刺钻头钻一个小孔（约 5-7 毫米），在 MMA12上方的左侧颅骨和时间骨骼上使用圆尖位（#106），并确保颅骨完好无损（图 1B）。
- 用牙科硅酸盐水泥在孔周围建造一个银行，以限制示踪剂（图1C）的扩散。
- 用 10 μL 微注射器（图 1D）将 2% FG 的 2μL 添加到 MMA 周围的孔中。
- 用一小块止血海绵盖住洞。
- 在孔上放一块石蜡膜，用骨蜡密封边缘，以防止示踪剂泄漏，避免对周围组织造成污点。
- 用无菌螺纹缝合伤口。
- 将老鼠关在温暖的区域，直到它们完全康复。
- 将老鼠送回笼子，在饮用水中加入抗生素和镇痛剂。
- 香水和部分
- 存活7天后，在第1.1节的程序中如上所述，对这些老鼠进行香水。
- 分解 TG 和 C1-4 DRG，然后按照第 1.1.3 节（图 1F）中提到的修复后和低温保护它们。
- 在下垂方向的低温统计微托米系统上以 30μm 的厚度切割 TG 和 DRG，并安装在硅烷涂层玻璃滑梯上。
- TG 和 DRG 中 FG 和 CGRP 标签的双免疫荧光
注：虽然在汞灯下可以通过紫外线照明直接观察到FG标签，而不会额外染色13、14、15、16，但TG和颈椎DGG中进一步检查了带有FG的标记神经元，使用FG和CGRP的双重免疫荧光来揭示TG和DRP中杜拉尔CGRP免疫活性神经纤维的来源。- 用组织化学笔圈成各部分。
- 在包含 3% 普通驴血清和 0.5% Triton X-100 的 0.1 M PB 的阻塞溶液中孵化部分 30 分钟。
- 将样品转移到兔子抗氟金（1：1000）和小鼠抗CGRP抗体（1：1000）的溶液中，在0.1 M PB中含有1%的普通驴血清和0.5%的Triton X-100过夜在4°C。
- 第二天用 0.1 M PB 清洗三节。
- 在驴抗兔亚历克萨氟 594 （1：500） 和驴反鼠 Alexa Fluor 488 （1：500） 二次抗体的混合溶液中孵育， 在室温下含有 1% 普通驴血清和 0.5% Triton X-100，温度为 1.5 h。
- 将盖片作为步骤 1.2.6 和 1.2.8 中的程序清洗并应用到各部分。
- 观察和记录
- 通过配备数码相机的荧光显微镜拍摄 TG 和 UV 照明下的 DRG 中 FG 标记神经元的图像。
- 在配备数码相机的荧光显微镜下，在 TG 和 DRG 中捕捉 FG 和 CGRP 标记神经元的图像。
- 使用编辑软件调整图像的亮度和对比度，并在图片中添加标签。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
颅体母体的神经血管结构
在免疫荧光和荧光组织染色与CGRP和phalloidin后，CGRP免疫活性神经纤维和法洛丁标记的杜拉尔动脉和结缔组织在3D模式（图2C，D，E，F）的全山颅骨母体中清晰地表现出来。结果表明，厚和薄的CGRP免疫活性神经纤维与神经动脉平行运行，在血管壁周围，或血管之间（图2D，E，F）。通过利用3D重建的优势，可以从不同的角度清楚地证明杜拉尔动脉的形态和杜拉尔CGRP免疫活性神经纤维和动脉的空间相关性。
TG 和 DRG 中标记的逆行神经元
在大鼠颅状杜拉母体（图3A）中对MMA区域进行FG应用7天后，在示踪剂应用的ipsilater侧的TG和颈椎DPG中检测到FG标记的神经元，这些神经元在荧光显微镜的紫外线照射下直接观察到（图3B，C）。在TG的所有三个分支中都发现了FG标记的神经元，这些神经元在眼科（V1）和最大辅助（V2）分裂上浓度较高，在支气管分裂（V3）（图3B）上较少。同时，在C2-3 DRG（图3C）中也观察到了一些FG标记的神经元。
此外，在TG和颈椎DPG的各部分还进行了双免疫荧光与FG和CGRP。根据TG和DPG中CGRP免疫活性神经元的直径，其中大多数主要存在于中小直径感官神经元（<50微米）中。其中一些类型的CGRP免疫活性神经元在TG和C2-3 DRG中也贴有FG标签，表明颅内的CGRP免疫活性神经纤维来自TG和DPG中感官神经元的这些亚群（图4）。
图1：本研究中主要实验视图的照片。 （A） 头皮中线的切口。（B） 颅体杜拉母体上方的一个洞，显示中间脑膜动脉 （MMA）。（C） 洞周围的一个小银行用牙科硅酸盐水泥圈成圆圈，用于在颅面杜拉母体上应用示踪器。（D） 使用微注射器将氟金 （FG） 应用到孔中。（E） 透明全山杜拉母校。（F） 三叉戟的外部视图 （TG）。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：钙西通宁基因相关肽（CGRP）-免疫活性神经纤维与全山颅骨母体上腺素（Pha）标签动脉的相关性。（B） 整座杜拉母马被夷为平地，安装在滑梯上。（C） 沿中脑膜动脉 （MMA） 分布 CGRP 免疫活性神经纤维和 Pha 标记血管。（D， E）面板 C. （F ） 中相同区域的放大照片 C.（F） 面板 E 的放大和调整图像，框架为 3D 模式。请单击此处查看此图的较大版本。
图3：在紫外线照射下，在三叉神经质（TG）和颈椎（C）多面根结核（DRG）中分布氟金（FG）标记神经元。（B） 在TG的眼科（V1）、最大辅助（V2）和支部中分布FG标记神经元。（C） 在 C2 DRG 中分布的 FG 标记神经元。请单击此处查看此图的较大版本。
图4：具有代表性的照片显示，三叉神经质 （TG） 和颈椎根结核 （DRG） 中的标记感官神经元使用双免疫荧光 （FG） 和钙西通宁基因相关肽 （CGRP）。 （A， B） 带有 FG、CGRP 以及 FG 和 CGRP 的标记神经元分别在 TG （A） 和 DRG （B） 中以红色、绿色和黄色进行演示。（A1-B1）、（A2-B2）：A 面板和 B 面板分别显示 FG 标签（A1、B1）和 CGRP 标签（A2、B2）。请单击此处查看此图的较大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
在这项研究中，我们成功地演示了CGRP免疫活性神经纤维在颅尿母体中的分布和起源，使用CGRP抗体和FG神经示踪剂的免疫荧光、3D重建和神经追踪方法，为更好地了解神经血管网络提供了组织学和化学证据。
众所周知，CGRP在偏头痛4、17的发病机因中起着至关重要的作用。结果表明，增加CGRP可导致血管扩张和神经原性炎症，导致沿三叉线4，18的外周和中央敏感。CGRP免疫活性神经纤维属于负责传递新感信号19的未髓化肽感官轴突。与以前的研究一致，在这里，我们清楚地证明了CGRP免疫活性神经纤维在颅体母体中的分布，并从TG和DRG中中小直径感官神经元中追踪其起源。这些细胞结构可能是合成和释放CGRP的来源。另一方面，法洛丁是细丝作用素（F-actin）的特定探针，富于光滑的肌肉和内皮细胞。作为一个合适的候选者，法乐丁用于标记血管结构和结缔组织10，20，21。我们最近的研究表明，与α平滑肌作用素和CD31相比，法洛丁对染色杜拉尔动脉更可靠、更敏感，是与CGRP结合以详细演示颅神经血管网络的最佳选择，该网络已于10、21年出版。
神经路跟踪技术是研究神经起源和终止的重要工具。在本研究中，FG用于追溯颅内CGRP免疫性神经纤维的来源。由于颅膜是薄膜，无法通过注射方式方便地应用示踪剂。相反，FG被直接添加到MMA周围的区域在颅杜拉母校根据以前采用的方法，已经引入22，23，但必须小心，以保持杜拉母校完好无损。此外，还努力防止FG泄漏到相邻的组织。由于FG标签可以在24号汞灯的紫外线照射下直接观察到，因此，我们通过这种方式检查了FG应用的现场：研究发现，除了神经传播外，FG在用牙科硅酸盐水泥圈成的区域是有限的，不会对周围的组织造成任何污染物。另一个优点是，FG标签的神经元也可以用免疫荧光与FG抗体染色在预期的颜色，使其更方便与其他生物标志物14，15，16一起使用。通过这项研究，我们证明，FG不仅适合逆行跟踪神经内侧，而且是与CGRP结合确定FG标记神经元的化学特征的合适候选者。
这里应该指出，目前的方法最好用于幼年动物。在老鼠的早期阶段，颅体在全山风格上更加透明。此功能使在不进一步透明治疗的情况下，以 3D 模式可视化颅状杜拉母体的神经血管结构更加方便。
总之，本研究为有效探索颅内杜拉母体从TG和颈椎DPG中的感官神经元，特别是具有CGRP免疫活性表达的中小直径感官神经元的亚型提供了有价值的方法。从方法学的角度看，它可能为进一步研究颅内其他种类的神经纤维及其起源提供宝贵的参考。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
本研究由中国国家重点研发项目（项目代码2019YFC1709103;2018YFC1707804号）和中国国家自然科学基金（项目代码81774211;第81774432号项目代码，第81801561号）支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | A21202 | Protect from light; RRID: AB_141607 |
| Brain stereotaxis instrument | Narishige | SR-50 | |
| CellSens Dimension | Olympus | Version 1.1 | Software of fluorescent microscope |
| Confocal imaging system | Olympus | FV1200 | |
| Fluorogold (FG) | Fluorochrome | 52-9400 | Protect from light |
| Fluorescent imaging system | Olympus | BX53 | |
| Freezing microtome | Thermo | Microm International GmbH | |
| Olympus FV10-ASW 4.2a | Olympus | Version 4.2 | Confocal image processing software system |
| Micro Drill | Saeyang Microtech | Marathon-N7 | |
| Mouse anti-CGRP | Abcam | ab81887 | RRID: AB_1658411 |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Phalloidin 568 | Molecular Probes | A12380 | Protect from light |
| Photoshop and Illustration | Adobe | CS6 | Photo editing software |
| Rabbit anti- Fluorogold | Abcam | ab153 | RRID: AB_90738 |
| Sprague Dawley | National Institutes for Food and Drug Control | SCXK (JING) 2014-0013 | |
| Superfrost plus microscope slides | Thermo | #4951PLUS-001 | 25x75x1mm |
References
- Kekere, V., Alsayouri, K. Anatomy, Head and Neck, Dura Mater. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2020).
- Shimizu, T., et al. Distribution and origin of TRPV1 receptor-containing nerve fibers in the dura mater of rat. Brain Research. 1173, 84-91 (2007).
- Jacobs, B., Dussor, G. Neurovascular contributions to migraine: moving beyond vasodilation. Neuroscience. 338, 130-144 (2016).
- Dodick, D. W. A phase-by-phase review of migraine pathophysiology. Headache. 58, Suppl 1 4-16 (2018).
- Amin, F. M., et al. Investigation of the pathophysiological mechanisms of migraine attacks induced by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-38. Brain: A Journal of Neurology. 137, Pt 3 779-794 (2014).
- Keller, J. T., Marfurt, C. F. Peptidergic and serotoninergic innervation of the rat dura mater. The Journal of Comparative Neurology. 309 (4), 515-534 (1991).
- Messlinger, K., Hanesch, U., Baumgärtel, M., Trost, B., Schmidt, R. F. Innervation of the dura mater encephali of cat and rat: ultrastructure and calcitonin gene-related peptide-like and substance P-like immunoreactivity. Anatomy and Embryology. 188 (3), 219-237 (1993).
- Lennerz, J. K., et al. Calcitonin receptor-like receptor (CLR), receptor activity-modifying protein 1 (RAMP1), and calcitonin gene-related peptide (CGRP) immunoreactivity in the rat trigeminovascular system: differences between peripheral and central CGRP receptor distribution. The Journal of Comparative Neurology. 507 (3), 1277-1299 (2008).
- Eftekhari, S., Warfvinge, K., Blixt, F. W., Edvinsson, L. Differentiation of nerve fibers storing CGRP and CGRP receptors in the peripheral trigeminovascular system. The Journal of Pain: Official Journal of the American Pain Society. 14 (11), 1289-1303 (2013).
- Xu, D. S., et al. Characteristics of distribution of blood vessels and nerve fibers in the skin tissues of acupoint "Taichong" (LR3) in the rat. Zhen Ci Yan Jiu. 41 (6), 486-491 (2016).
- Cui, J. J., et al. The expression of calcitonin gene-related peptide on the neurons associated Zusanli (ST 36) in rats. Chinese Journal of Integrative Medicine. 21 (8), 630-634 (2015).
- Andres, K. H., von Düring, M., Muszynski, K., Schmidt, R. F. Nerve fibres and their terminals of the dura mater encephali of the rat. Anatomy and Embryology. 175 (3), 289-301 (1987).
- Leng, C., Chen, L., Li, C. Alteration of P2X1-6 receptor expression in retrograde Fluorogold-labeled DRG neurons from rat chronic neuropathic pain model. Biomedical Reports. 10 (4), 225-230 (2019).
- Huang, T. L., et al. Factors influencing the retrograde labeling of retinal ganglion cells with fluorogold in an animal optic nerve crush model. Ophthalmic Research. 51 (4), 173-178 (2014).
- Huang, T. L., Chang, C. H., Lin, K. H., Sheu, M. M., Tsai, R. K. Lack of protective effect of local administration of triamcinolone or systemic treatment with methylprednisolone against damages caused by optic nerve crush in rats. Experimental Eye Research. 92 (2), 112-119 (2011).
- Tsai, R. K., Chang, C. H., Wang, H. Z. Neuroprotective effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) in neurodegeneration after optic nerve crush in rats. Experimental Eye Research. 87 (3), 242-250 (2008).
- Iyengar, S., Ossipov, M. H., Johnson, K. W. The role of calcitonin gene-related peptide in peripheral and central pain mechanisms including migraine. Pain. 158 (4), 543-559 (2017).
- Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
- Kou, Z. Z., et al. Alterations in the neural circuits from peripheral afferents to the spinal cord: possible implications for diabetic polyneuropathy in streptozotocin-induced type 1 diabetic rats. Frontiers in neural circuits. 8, 6 (2014).
- Alarcon-Martinez, L., et al. Capillary pericytes express α-smooth muscle actin, which requires prevention of filamentous-actin depolymerization for detection. eLife. 7, 34861 (2018).
- Wang, J., et al. A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).
- Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. Central projections of sensory innervation of the rat superior sagittal sinus. Neuroscience. 129, 431-437 (2004).
- Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. Central projections of the sensory innervation of the rat middle meningeal artery. Brain Research. 1208, 103-110 (2008).
- Schmued, L. C., Fallon, J. H. Fluoro-Gold: a new fluorescent retrograde axonal tracer with numerous unique properties. Brain Research. 377 (1), 147-154 (1986).
