Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Visualisera Calcitonin Genrelaterad peptid immunoreaktiv innervation av råtta hjärnskålen Dura Mater med immunofluorescens och neural spårning

Published: January 6, 2021 doi: 10.3791/61742
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences
* These authors contributed equally

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att visualisera rumslig korrelation av calcitonin gen-relaterade peptid (CGRP)-immunoreactive nerv fibrer och blodkärl i hjärnskålen dura mater med hjälp av immunofluorescens och fluorescerande histokemi med CGRP och phalloidin, respektive. Dessutom spårades ursprunget till dessa nerv fibrer bakåtsträvande med en fluorescerande neurala spårämne.

Abstract

Syftet med denna studie var att undersöka fördelningen och ursprunget av calcitonin genrelaterad peptid (CGRP)-immunoreactive sensoriska nerv fibrer av hjärnskålen dura mater med hjälp av immunofluorescens, tredimensionell (3D) återuppbyggnad och bakåtsträvande spårning teknik. Här var nervfibrerna och blodkärlen färgade med immunofluorescens och histokemi tekniker med CGRP och fluorescerande falloider, respektive. Den rumsliga korrelationen av hamburg CGRP-immuoreactive nerv fibrer och blodkärl visades av 3D återuppbyggnad. Under tiden upptäcktes ursprunget till CGRP-immunoreactive nerv fibrer genom neurala spårning teknik med fluorogold (FG) från området runt mellersta meningeal gatan (MMA) i hjärnskålen dura mater till trigeminal ganglion (TG) och massundersökning (C) dorsala rot ganglier (DRGs). Dessutom undersöktes de kemiska egenskaperna hos FG-märkta nervceller i TG och DRGs också tillsammans med CGRP med dubbla immunofluorescenser. Dra nytta av det transparenta helmonteringsprovet och 3D-rekonstruktionen visades att CGRP-immunoreaktiva nervfibrer och falloidinmärkta arterioler löper samman eller separat bildar ett hamburg neurovaskulärt nätverk i en 3D-vy, medan FG-märkta nervceller hittades i oftalmiska, maxillary och mandibular grenar av TG, samt C2-3 DRGs ipsilateral till sidan av spårämne ansökan där några av FG-märkta nervceller presenteras med CGRP-immunoreactive uttryck. Med dessa metoder visade vi de fördelningsegenskaperna hos CGRP-immunoreactive nerv fibrer runt blodkärlen i hjärnskålen dura mater, liksom ursprunget till dessa nerv fibrer från TG och DRGs. Ur metodiskt perspektiv kan det ge en värdefull referens för att förstå den komplicerade neurovaskulära strukturen hos hjärnskålen dura mater under det fysiologiska eller patologiska tillståndet.

Introduction

Hjärnskålen dura mater är det yttersta lagret av hjärnhinnor för att skydda hjärnan och innehåller rikliga blodkärl och olika typer av nervfibrer1,2. Många studier har visat att sensibiliserad hjärnskålen dura mater kan vara den viktigaste faktorn som leder till förekomsten av huvudvärk, som involverar onormal vasodilatation och innervation3,4,5. Således är kunskapen om neurovaskulär struktur i hjärnskålen dura mater viktig för att förstå patogenesen vid huvudvärk, särskilt för migrän.

Även om dura innervation har studerats tidigare med konventionella immunohistokemi, var den rumsliga korrelationen mellan nervfibrer och blodkärl i hjärnskålen dura mater mindrestuderade 6,7,8,9. För att avslöja hamburg neurovaskulära struktur mer detaljerat, calcitonin gen-relaterade peptid (CGRP) och falloidin valdes som markörer för respektive färgning hamburg nerv fibrer och blodkärl i hela mount hjärnskålen dura mater med immunofluorescens och fluorescerande histokemi10. Det kan vara ett optimalt val att få en tredimensionell (3D) syn på neurovaskulär struktur. Dessutom applicerades fluorogold (FG) på området runt mellersta meningeal gatan (MMA) i hjärnskålen dura mater för att bestämma ursprunget till CGRP-immunoreactive nerv fibrer, och spåras till trigeminal ganglion (TG) och massundersökning (C) dorsala rot ganglier (DRGs), medan FG-märkta nervceller undersöktes ytterligare tillsammans med CGRP med hjälp av immunofluorescens.

Syftet med denna studie var att tillhandahålla ett effektivt verktyg för att undersöka den neurovaskulära strukturen i hjärnskålen dura mater för CGRP-immunoreactive innervation och dess ursprung. Genom att dra nytta av den transparenta fullmonterade dura mater och kombinera immunofluorescens, bakåtsträvande spårning, konfokala tekniker och 3D-återuppbyggnad, förväntade vi oss att presentera en ny 3D-vy över den neurovaskulära strukturen i hjärnskålen dura mater. Dessa metodologiska metoder kan ytterligare tjänas för att utforska patogenesen vid olika huvudvärk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denna studie godkändes av etikkommittén vid Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences (referensnummer D2018-09-29-1). Alla ingrepp utfördes i enlighet med National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). Tolv vuxna Sprague-Dawley hanråttor (vikt 220 ± 20 g) användes i denna studie. Djur [licensnummer SCXK (JING) 2017-0005] tillhandahölls av National Institutes for Food and Drug Control.

1. Innervation av råtta hjärnskålen dura mater

  1. Perfusioner
    1. Intraperitoneally injicera en överdos av tribromoethanol lösning (250 mg/kg) till råtta att inducera dödshjälp.
    2. När andningen stannar, transcardially perfuse med 100 mL av 0,9% normal saltlösning följt av 250-300 mL 4% paraformaldehyd i 0,1 M fosfatbuffert (PB, pH 7,4).
    3. Efter perfusion, ta bort huvudhuden och öppna skallen för att exponera dura mater och dorsala sidan av hjärnan. Dissekera sedan ut hjärnskålen dura mater längs hjärnstammen till luktlampan i hela monteringsmönstret (Figur 1). Utför postfixering i 4% paraformaldehyd i 2 h och kryoprotect i 25% sackaros i 0,1 M PB i mer än 24 timmar vid 4 °C.
  2. Fluorescens immunohistokemi för CGRP och falloidinmärkning
    OBS: En kombination av fluorescerande färgning av CGRP och falloidin tillämpades för att avslöja den rumsliga korrelationen mellan hamburg nerv fibrer och blodkärl i råtta hjärnskålen dura mater i hela mount mönstret.
    1. Skölj hjärnskålen i 0,1 M PB i ca 1 min.
    2. Inkubera dura mater i en blockerande lösning som innehåller 3% normalt åsneserum och 0,5% Triton X-100 i 0,1 M PB i 30 min.
    3. Överför dura mater till mus anti-CGRP antikroppar (1:1000) i 0,1 M PB som innehåller 1% normalt åsneserum och 0,5% Triton X-100 över natten vid 4 °C11.
    4. Tvätta dura mater tre gånger i 0,1 M PB följande dag.
    5. Inkubera duramater i en blandad lösning av åsneantimus Alexa Fluor 488 sekundär antikropp (1:500) och falloidin 568 (1:1000) i 0,1 M PB som innehåller 1% normalt åsneserum och 0,5% Triton X-100 för 1,5 h vid rumstemperatur (26 °C).
    6. Tvätta dura mater tre gånger i 0,1 M PB.
    7. Trimma kanterna och montera dem på mikroskopbilder (se Materialförteckning).
    8. Sätt på täcklips med 50% glycerin före observation.
  3. Observation och inspelning
    1. Observera lysrörsproverna under ett fluorescerande mikroskop eller ett konfokalt bildsystem.
    2. Ta bilderna av helmonterade dura mater med ett fluorescerande mikroskop utrustat med en digitalkamera (4x, NA: 0,13) och använd en exponeringstid på 500 ms. Bildmosaikerna av dura mater avslutades med en programvara av fluorescerande mikroskop (se Tabell över material).
    3. Ta bilder av CGRP-immunoreaktiva nervfibrer och falloidinmärkta blodkärl i dura mater med hjälp av ett konfokalt mikroskop. Excitations- och emissionsvåglängderna var 488 nm (grön) och 594 nm (röd). Det konkala pinhole är 110 (20x) och 105 μm (40x). Bildinspelningens upplösning är 640 x 640 pixlar.
    4. Ta 20 bilder i 2 μm ramar av från varje 40 μm tjock sektion och utför en enda bildintegration i fokus med ett konfokalt bildbehandlings tillhörande programvarusystem för 3D-analys enligt följande: Ställ in Start Focal Plane | Ställ in fokalplanet End | Ange stegstorlek | Välj Djupmönster | Bildinspelning | Z-serien.
    5. Använd ett fotoredigeringsprogram för att justera bildernas ljusstyrka och kontrast för att optimera visualiseringen. Var uppmärksam på att inte ta bort data från bilderna.

2. Bakåtsträvande spårningsstudie med FG

  1. Kirurgiska ingrepp
    1. Bestäm koordinatområdet för råtta hjärnskålen dura mater.
    2. Förbered en 10 μL mikrospruta och testa den med flytande paraffin.
    3. Bedöva råttorna med tribromoethanollösning (150 mg/kg) via intraperitoneal injektion. Kontrollera djupet i anestesi genom bristen på svar på tå nypa.
    4. Raka råttans huvud med en rakhyvel.
    5. Sätt trubbiga öronstänger på råttan och placera den på stereotaxiska enheten. Sätt sedan munhållaren och applicera oftalmisk salva på ögonen.
    6. Rengör den kirurgiska platsen för huvudhuden med 10% povidone jod följt av 75% etanol.
    7. Gör ett snitt längs hårbottens mittlinje.
    8. Avlägsna omedelbart bukhinna och muskelvävnaderna från skallen med sterila applikatorer med bomullsspets(figur 1A).
    9. Borra ett litet hål (~5-7 mm) med en borrborr med en rundspetsbit (#106) på vänster parietal och temporala ben ovanför MMA12, och se till att hjärnskålen dura mater hölls intakt (Figur 1B).
    10. Bygg en bank runt hålet med tandsilikatcement för att begränsa spridningen av spårämnet (Figur 1C).
    11. Tillsätt 2 μL 2 % FG i hålet runt MMA med en 10 μL mikrospruta (figur 1D).
    12. Täck hålet med en liten bit hemostatisk svamp.
    13. Sätt en bit paraffinfilm på hålet och försegla kanterna med benvax för att förhindra läckage av spårämne och för att undvika att förorena till de omgivande vävnaderna.
    14. Suturera såret med steril tråd.
    15. Håll råttorna i ett varmt område tills de har återhämtat sig helt.
    16. Sätt tillbaka råttorna i sina burar och tillsätt ett antibiotikum och smärtstillande medel i dricksvattnet.
  2. Perfusioner och sektioner
    1. Efter 7 överlevnadsdagar, granska dessa råttor som nämnts ovan i procedurerna i avsnitt 1.
    2. Dissekera TG och C1-4 DRGs, sedan postfixa och cryoprotect dem som ovan nämnts i avsnitt 1.1.3 (Figur 1F).
    3. Skär TG och DRGs vid tjockleken 30 μm på ett kryostatmikrotomsystem i sagital riktning och monteras på silanbelagda glasrutschbanor.
  3. Dubbla immunofluorescenser för FG- och CGRP-märkning i TG- och DRGs
    OBS: Även om FG-märkningen kan observeras direkt med UV-belysning under kvicksilverlampa utan ytterligarefärgning 13,14,15,16, undersöktes de märkta nervcellerna med FG ytterligare i TG och massundersökning DRGs med dubbla immunfluorescenser med FG och CGRP för att avslöja ursprunget till dural CGRP-immunoreactive nervfibrer i TG och DRGs.
    1. Cirkla sektionerna med den histokemiska pennan.
    2. Inkubera sektionerna i 30 minuter i en blockerande lösning som innehåller 3% normalt åsneserum och 0,5% Triton X-100 i 0,1 M PB.
    3. Överför proverna till lösningen av kaninantifluorblomma (1:1000) och musantikropp mot CGRP (1:1000) i 0,1 M PB som innehåller 1% normalt åsneserum och 0,5% Triton X-100 över natten vid 4 °C.
    4. Tvätta sektionerna tre gånger i 0,1 M PB följande dag.
    5. Inkubera i en blandad lösning av åsneantikaninen Alexa Fluor 594 (1:500) och åsnemusen Alexa Fluor 488 (1:500) sekundär antikropp i 0,1 M PB som innehåller 1% normalt åsneserum och 0,5% Triton X-100 för 1,5 h vid rumstemperatur.
    6. Tvätta och applicera täcken på avsnitten som procedurer i steg 1.2.6 och 1.2.8.
  4. Observation och inspelning
    1. Ta bilder av de FG-märkta nervcellerna i TG och DRGs under UV-belysning med fluorescerande mikroskop utrustade med en digitalkamera.
    2. Ta bilder av de FG- och CGRP-märkta nervcellerna i TG och DRGs under ett fluorescerande mikroskop utrustat med en digitalkamera.
    3. Använd redigeringsprogrammet för att justera bildernas ljusstyrka och kontrast och lägga till etiketter i bilderna.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Neurovaskulär struktur av hjärnskålen dura mater
Efter immunofluorescent och fluorescerande histochemical färgning med CGRP och falloidin, CGRP-immunoreactive nerv fibrer och falloidin-märkt hamburg artärer och bindväv visades tydligt i hela mount hjärnskålen dura mater i ett 3D mönster (Figur 2C,D, E, F). Det visade sig att både tjocka och tunna CGRP-immunoreaktiva nervfibrer löper parallellt med hamburgartärerna, runt kärlväggen eller mellan blodkärlen (Figur 2D, E, F). Genom att ta fördelar med 3D återuppbyggnad, morfologi av hamburg arterioles och rumsliga korrelationen av hamburg CGRP-immunoreactive nerv fibrer och arterioles kunde tydligt visas från olika perspektiv.

Bakåtsträvande märkta nervceller i TG och DRGs
Sju dagar efter FG ansökan om regionen MMA i råtta hjärnskålen dura mater (Figur 3A), upptäcktes FG-märkta nervceller i TG och massundersökning DRGs på den ensidiga sidan av spårämne ansökan, som observerades direkt under UV belysning av fluorescerande mikroskopi (Figur 3B, C). FG-märkta nervceller hittades i alla tre grenarna av TG med högre koncentration på de oftalmiska (V1) och maxillary (V2) divisionerna, och med mindre på mandibular divisionen (V3) (Figur 3B). Under tiden observerades också några av de FG-märkta nervcellerna i C2-3 DRGs(figur 3C).

Dessutom utfördes dubbla immunofluorescences också med FG och CGRP på avsnitten av TG och massundersökning DRGs. Enligt diametern på CGRP-immunoreaktiva nervceller i TG och DRGs, de flesta av dem hittades främst i små och medeldiameter sensoriska nervceller (<50 μm). Vissa av dessa typer av CGRP-immunoreaktiva nervceller var också märkta med FG i TG och C2-3 DRGs, vilket indikerar att CGRP-immunoreactive nerv fibrer i hjärnskålen dura mater härstammar från dessa subpopulation av sensoriska nervceller i TG och DRGs (Figur 4).

Figure 1
Figur 1: Fotografier av de viktigasteexperimentella vyerna i den aktuella studien. B)Ett hål ovanför hjärnskålen dura mater som visar mellersta meningeal gatan (MMA). C)En liten bank runt hålet inringad med tandsilikatcement för applicering av spårämne på hjärnskålen dura mater. D)Applicering av fluorblomma (FG) i hålet med mikrospruta. (E) Den genomskinliga helmonterade duramater. F)Den yttre synen på den trigeminala ganglionen (TG). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2:Korrelation mellan kalcitoningenrelaterad peptid (CGRP)-immunoreaktiva nervfibrer och falloidin (Pha)-märkta artärer på hela berget cranial dura mater. (A) Den genomskinliga helmonterade dura mater. (B) Helmonterad duramater plattades ut och monterades på rutschkanan. C)Distribution av CGRP-immunreaktiva nervfibrer och Pha-märkta blodkärl längs den mellersta hjärnhinneartären (MMA). (D,E) De förstorade bilderna från samma områden d och e i panel C. (F) De förstorade och justerade bilderna från panel E med ramen i ett 3D-mönster. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: Fördelning av fluorgulära (FG)-märkta nervceller i trigeminal ganglion (TG) och cervikal (C) dorsala rot ganglion (DRG) under UV-belysning. (A) Regionen dura mater med FG-applicering. B)Distribution av FG-märkta nervceller i TG:s oftalmiska (V1), maxillary (V2) och mandibular (V3) grenar. C)Distribution av FG-märkta nervceller fördelade i C2 DRG. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4: De representativa fotografierna som visar de märkta sensoriska nervcellerna i trigeminal ganglion (TG) och cervikal dorsala rot ganglion (DRG) med hjälp av dubbla immunfluorescenser med fluorogold (FG) och kalcitonin genrelaterad peptid (CGRP). CGRP, och både FG och CGRP visades i rött, grönt respektive gult, i TG (A) respektive DRG (B). (A1-B1), (A2-B2): Panelerna A och B visades separat med FG-märkning (A1, B1) och CGRP-märkning (A2, B2). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denna studie har vi framgångsrikt visat fördelningen och ursprunget för CGRP-immunoreactive nerv fibrer i hjärnskålen dura mater med hjälp av immunofluorescens, 3D återuppbyggnad och neurala spårning metoder med CGRP antikroppar och FG neurala spårämne, ger histologiska och kemiska bevis för att bättre förstå hamburg neurovaskulära nätverket.

Som det var känt spelar CGRP en kritisk roll i patogenesen vid migrän4,17. Det visades att ökad CGRP kan leda till vasodilatation och neurogen inflammation för att orsaka perifer och central sensibilisering längs trigeminal väg4,18. CGRP-immunoreaktiva nervfibrer tillhör de omyelinerade peptidergiska sensoriska axoner som ansvarar för transport av nociceptiva signaler19. I enlighet med tidigare studier visade vi här tydligt fördelningen av CGRP-immunoreactive nervfibrer i hjärnskålen dura mater och spårade deras ursprung från små och medelstora sensoriska nervceller i TG och DRGs. Dessa cellulära strukturer kan vara källorna för att syntetisera och släppa CGRP. Å andra sidan är falloidin en specifik sond för filamentöst aktin (F-aktin) som är rikligt i de släta muskulösa och endotelcellerna. Som en riktig kandidat användes falloidin för märkning av kärlstrukturer och bindväv10,20,21. Vår senaste studie har visat att, i motsats till alfa glatt muskel aktin och CD31, falloidin är mer tillförlitlig och känslig för färgning hamburg artärer, och är den optimala att kombinera med CGRP för att visa hjärnskålen neurovaskulära nätverk i detalj, som har publicerats eslewhere10,21.

Neurala spårning teknik är ett viktigt verktyg för att undersöka neurala ursprung och uppsägning. I den aktuella studien användes FG för bakåtsträvande spårning av ursprunget till CGRP-immunoreactive nervfibrer i hjärnskålen dura mater. Eftersom hjärnskålen dura mater är ett tunt membran, kan spårämnet inte appliceras bekvämt genom injektion. Istället lades FG direkt till regionen kring MMA i hjärnskålen enligt den metod som tidigare införts22,23, men man måste vara noga med att hålla dura mater intakt. Dessutom gjordes ansträngningen för att förhindra läckage av FG till de intilliggande vävnaderna. Eftersom FG-märkningen kan observeras direkt under UV-belysning avkvicksilverlampa 24, genom detta tillvägagångssätt, kontrollerade vi platsen för FG-applikation; det konstaterades att förutom neurala förökning, FG var begränsad i regionen cirklas med tandläkare silikat cement utan att förorena de omgivande vävnaderna. Den andra fördelen är att FG-märkta nervceller också kan färgas i den förväntade färgen med hjälp av immunofluorescens med FG-antikroppar, vilket gör det bekvämare att användas tillsammans med andra biomarkörer14,15,16. Genom denna studie bevisade vi att FG inte bara passar för bakåtsträvande spårning av dural innervation utan också är en lämplig kandidat att kombinera med CGRP för att bestämma de kemiska egenskaperna hos FG-märkta nervceller.

Det bör noteras här att nuvarande metoder helst används för unga djur. I början av råttan är hjärnskålen dura mater mer transparent i hela monteringsstilen. Denna funktion gör det bekvämare att visualisera den neurovaskulära strukturen hos hjärnskålen dura mater i ett 3D-mönster utan ytterligare transparent behandling.

Sammanfattningsvis ger den aktuella studien ett värdefullt tillvägagångssätt för att effektivt utforska innervation av hjärnskålen dura mater från sensoriska nervceller i TG och massundersökning DRGs, särskilt undertypen av små och medeldiameter sensoriska nervceller med CGRP-immunoreactive uttryck. Ur metodiskt perspektiv kan det ge en värdefull referens för att ytterligare undersöka de andra typerna av nervfibrer i hjärnskålen dura mater, liksom deras ursprung.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Denna studie stöddes av projektet national key R&D Program of China (Project Code nr 2019YFC1709103; nr 2018YFC1707804) och National Natural Science Foundation of China (Project Code nr 81774211; nr 81774432; nr 81801561).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG (H+L) Invitrogen by Thermo Fisher Scientific A21202 Protect from light; RRID: AB_141607
Brain stereotaxis instrument Narishige SR-50
CellSens Dimension Olympus Version 1.1 Software of fluorescent microscope
Confocal imaging system Olympus FV1200
Fluorogold (FG) Fluorochrome 52-9400 Protect from light
Fluorescent imaging system Olympus BX53
Freezing microtome Thermo Microm International GmbH
Olympus FV10-ASW 4.2a Olympus Version 4.2 Confocal image processing software system
Micro Drill Saeyang Microtech Marathon-N7
Mouse anti-CGRP Abcam ab81887 RRID: AB_1658411
Normal donkey serum Jackson ImmunoResearch 017-000-121
Phalloidin 568 Molecular Probes A12380 Protect from light
Photoshop and  Illustration Adobe CS6 Photo editing software
Rabbit anti- Fluorogold Abcam ab153 RRID: AB_90738
Sprague Dawley National Institutes for Food and Drug Control SCXK (JING) 2014-0013
Superfrost plus microscope slides Thermo #4951PLUS-001 25x75x1mm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kekere, V., Alsayouri, K. Anatomy, Head and Neck, Dura Mater. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2020).
  2. Shimizu, T., et al. Distribution and origin of TRPV1 receptor-containing nerve fibers in the dura mater of rat. Brain Research. 1173, 84-91 (2007).
  3. Jacobs, B., Dussor, G. Neurovascular contributions to migraine: moving beyond vasodilation. Neuroscience. 338, 130-144 (2016).
  4. Dodick, D. W. A phase-by-phase review of migraine pathophysiology. Headache. 58, Suppl 1 4-16 (2018).
  5. Amin, F. M., et al. Investigation of the pathophysiological mechanisms of migraine attacks induced by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-38. Brain: A Journal of Neurology. 137, Pt 3 779-794 (2014).
  6. Keller, J. T., Marfurt, C. F. Peptidergic and serotoninergic innervation of the rat dura mater. The Journal of Comparative Neurology. 309 (4), 515-534 (1991).
  7. Messlinger, K., Hanesch, U., Baumgärtel, M., Trost, B., Schmidt, R. F. Innervation of the dura mater encephali of cat and rat: ultrastructure and calcitonin gene-related peptide-like and substance P-like immunoreactivity. Anatomy and Embryology. 188 (3), 219-237 (1993).
  8. Lennerz, J. K., et al. Calcitonin receptor-like receptor (CLR), receptor activity-modifying protein 1 (RAMP1), and calcitonin gene-related peptide (CGRP) immunoreactivity in the rat trigeminovascular system: differences between peripheral and central CGRP receptor distribution. The Journal of Comparative Neurology. 507 (3), 1277-1299 (2008).
  9. Eftekhari, S., Warfvinge, K., Blixt, F. W., Edvinsson, L. Differentiation of nerve fibers storing CGRP and CGRP receptors in the peripheral trigeminovascular system. The Journal of Pain: Official Journal of the American Pain Society. 14 (11), 1289-1303 (2013).
  10. Xu, D. S., et al. Characteristics of distribution of blood vessels and nerve fibers in the skin tissues of acupoint "Taichong" (LR3) in the rat. Zhen Ci Yan Jiu. 41 (6), 486-491 (2016).
  11. Cui, J. J., et al. The expression of calcitonin gene-related peptide on the neurons associated Zusanli (ST 36) in rats. Chinese Journal of Integrative Medicine. 21 (8), 630-634 (2015).
  12. Andres, K. H., von Düring, M., Muszynski, K., Schmidt, R. F. Nerve fibres and their terminals of the dura mater encephali of the rat. Anatomy and Embryology. 175 (3), 289-301 (1987).
  13. Leng, C., Chen, L., Li, C. Alteration of P2X1-6 receptor expression in retrograde Fluorogold-labeled DRG neurons from rat chronic neuropathic pain model. Biomedical Reports. 10 (4), 225-230 (2019).
  14. Huang, T. L., et al. Factors influencing the retrograde labeling of retinal ganglion cells with fluorogold in an animal optic nerve crush model. Ophthalmic Research. 51 (4), 173-178 (2014).
  15. Huang, T. L., Chang, C. H., Lin, K. H., Sheu, M. M., Tsai, R. K. Lack of protective effect of local administration of triamcinolone or systemic treatment with methylprednisolone against damages caused by optic nerve crush in rats. Experimental Eye Research. 92 (2), 112-119 (2011).
  16. Tsai, R. K., Chang, C. H., Wang, H. Z. Neuroprotective effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) in neurodegeneration after optic nerve crush in rats. Experimental Eye Research. 87 (3), 242-250 (2008).
  17. Iyengar, S., Ossipov, M. H., Johnson, K. W. The role of calcitonin gene-related peptide in peripheral and central pain mechanisms including migraine. Pain. 158 (4), 543-559 (2017).
  18. Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
  19. Kou, Z. Z., et al. Alterations in the neural circuits from peripheral afferents to the spinal cord: possible implications for diabetic polyneuropathy in streptozotocin-induced type 1 diabetic rats. Frontiers in neural circuits. 8, 6 (2014).
  20. Alarcon-Martinez, L., et al. Capillary pericytes express α-smooth muscle actin, which requires prevention of filamentous-actin depolymerization for detection. eLife. 7, 34861 (2018).
  21. Wang, J., et al. A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).
  22. Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. Central projections of sensory innervation of the rat superior sagittal sinus. Neuroscience. 129, 431-437 (2004).
  23. Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. Central projections of the sensory innervation of the rat middle meningeal artery. Brain Research. 1208, 103-110 (2008).
  24. Schmued, L. C., Fallon, J. H. Fluoro-Gold: a new fluorescent retrograde axonal tracer with numerous unique properties. Brain Research. 377 (1), 147-154 (1986).

Tags

Neurovetenskap Utgåva 167 kranial dura mater mellersta meningeal gatan calcitonin genrelaterad peptid neural spårningsteknik fluorogold
Visualisera Calcitonin Genrelaterad peptid immunoreaktiv innervation av råtta hjärnskålen Dura Mater med immunofluorescens och neural spårning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, J., Xu, D., Cui, J., She, C.,… More

Wang, J., Xu, D., Cui, J., She, C., Wang, H., Wu, S., Zou, L., Zhang, J., Bai, W. Visualizing the Calcitonin Gene-Related Peptide Immunoreactive Innervation of the Rat Cranial Dura Mater with Immunofluorescence and Neural Tracing. J. Vis. Exp. (167), e61742, doi:10.3791/61742 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter