Summary
Her presenterer vi en protokoll for å visualisere romlig korrelasjon av calcitonin genrelatert peptid (CGRP)-immunoreaktive nervefibre og blodkar i kranial dura mater ved hjelp av immunfluorescence og fluorescerende histokjemi med henholdsvis CGRP og falloidin. I tillegg ble opprinnelsen til disse nervefibrene retrograde sporet med en fluorescerende nevral tracer.
Abstract
Målet med denne studien var å undersøke fordelingen og opprinnelsen til calcitonin genrelatert peptid (CGRP)-immunoreaktive sensoriske nervefibre av kranial dura mater ved hjelp av immunfluorescence, tredimensjonal (3D) rekonstruksjon og retrograde sporing teknikk. Her ble nervefibrene og blodkarene farget ved hjelp av henholdsvis immunfluorescens og histokjemiteknikker med henholdsvis CGRP og fluorescerende falloidin. Den romlige korrelasjonen mellom dural CGRP-immuoreaktive nervefibre og blodkar ble demonstrert ved 3D-rekonstruksjon. I mellomtiden ble opprinnelsen til CGRP-immunoreaktive nervefibre oppdaget ved nevral sporingsteknikk med fluorogold (FG) fra området rundt midtre meningeal arterie (MMA) i kranial dura mater til trigeminal ganglion (TG) og cervical (C) dorsal root ganglia (DRGs). I tillegg ble de kjemiske egenskapene til FG-merkede nevroner i TG og DRG også undersøkt sammen med CGRP ved hjelp av doble immunfluorescenser. Ved å dra nytte av den gjennomsiktige helmonterte prøven og 3D-rekonstruksjonen, ble det vist at CGRP-immunoreaktive nervefibre og falloidinmerkede arterioler løper sammen eller separat danner et duralt nevrovaskulært nettverk i en 3D-visning, mens de FG-merkede nevronene ble funnet i oftalmiske, maksillære og mandibulære grener av TG, samt C2-3 DRGs ipsilateral til siden av tracerapplikasjon der noen av FG-merkede nevroner presentert med CGRP-immunoreaktivt uttrykk. Med disse tilnærmingene demonstrerte vi de fordelingsmessige egenskapene til CGRP-immunoreaktive nervefibre rundt blodkarene i kranial dura mater, samt opprinnelsen til disse nervefibrene fra TG og DRGs. Fra metodikkens perspektiv kan det gi en verdifull referanse for å forstå den kompliserte nevrovaskulære strukturen til kranial dura mater under den fysiologiske eller patologiske tilstanden.
Introduction
Kranial dura mater er det ytterste laget av meninger for å beskytte hjernen og inneholder rikelig blodkar og forskjellige typer nervefibre1,2. Mange studier har vist at sensibilisert kranial dura mater kan være nøkkelfaktoren som fører til forekomsten av hodepine, som involverer unormal vasodilatasjon og innervasjon3,4,5. Dermed er kunnskapen om nevrovaskulær struktur i kranial dura mater viktig for å forstå patogenesen av hodepine, spesielt for migrene.
Selv om dura-innerveringen tidligere har blitt studert med konvensjonell immunhiistokjemi, ble den romlige korrelasjonen mellom nervefibre og blodkar i kranial dura mater mindre studert6,7,8,9. For å avsløre den durale nevrovaskulære strukturen mer detaljert, ble calcitonin genrelatert peptid (CGRP) og falloidin valgt som markører for henholdsvis farging av durale nervefibre og blodkar i hele kranial dura mater med immunfluorescence og fluorescerende histokjemi10. Det kan være et optimalt valg å få en tredimensjonal (3D) visning av nevrovaskulær struktur. I tillegg ble fluorogold (FG) brukt på området rundt midtre meningeal arterie (MMA) i kranial dura mater for å bestemme opprinnelsen til CGRP-immunoreaktive nervefibre, og sporet til trigeminal ganglion (TG) og cervical (C) dorsal root ganglia (DRGs), mens FG-merkede nevroner ble ytterligere undersøkt sammen med CG ved hjelp av immunfluorescence.
Målet med denne studien var å gi et effektivt verktøy for å undersøke den nevrovaskulære strukturen i kranial dura mater for CGRP-immunoreaktiv innervasjon og opprinnelsen. Ved å dra nytte av den gjennomsiktige helmonterte dura mater og kombinere immunfluorescence, retrograde sporing, konfokale teknikker og 3D-rekonstruksjon, forventet vi å presentere en ny 3D-visning av den nevrovaskulære strukturen i kranial dura mater. Disse metodologiske tilnærmingene kan videre betjenes for å utforske patogenesen av forskjellige hodepine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien ble godkjent av Etikkkomiteen ved Institutt for akupunktur og moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences (referansenummer D2018-09-29-1). Alle prosedyrer ble utført i samsvar med National Institutes of Health Guide for care and use of Laboratory Animals (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). Tolv voksne Sprague-Dawley hannrotter (vekt 220 ± 20 g) ble brukt i denne studien. Dyr [lisensnummer SCXK (JING) 2017-0005] ble levert av National Institutes for Food and Drug Control.
1. Innervasjon av rotte kranial dura mater
-
Perfusjoner
- Intraperitonealt injisere en overdose av tribromoetanoloppløsning (250 mg/kg) til rotten for å indusere eutanasi.
- Når pusten stopper, perfuse transkardielt med 100 ml 0,9% normal saltvann etterfulgt av 250-300 ml 4% paraformaldehyd i 0,1 M fosfatbuffer (PB, pH 7,4).
- Etter perfusjon, fjern hodehuden og åpne skallen for å avsløre dura mater og dorsal side av hjernen. Deretter dissekerer dukranial dura mater langs hjernestammen til den olfaktoriske pæren i hele mønsteret (Figur 1). Utfør post-fiksering i 4% paraformaldehyd i 2 timer, og kryoprekt i 25% sukrose i 0,1 M PB i mer enn 24 timer ved 4 °C.
-
Fluorescensimmunohistokjemi for CGRP og phalloidinmerking
MERK: En kombinasjon av fluorescerende farging av CGRP og falloidin ble påført for å avsløre den romlige korrelasjonen mellom durale nervefibre og blodkar i rottekranial dura mater i hele mønsteret.- Skyll kranial dura mater i 0,1 M PB i ca. 1 min.
- Inkuber dura mater i en blokkeringsløsning som inneholder 3% normalt eselserum og 0,5% Triton X-100 i 0,1 M PB i 30 minutter.
- Overfør dura mater til mus anti-CGRP antistoff (1:1000) i 0.1 M PB som inneholder 1% normalt esel serum og 0,5% Triton X-100 over natten ved 4 °C11.
- Vask dura mater tre ganger i 0,1 M PB neste dag.
- Inkuber dura mater i en blandet løsning av esel anti-mus Alexa Fluor 488 sekundært antistoff (1:500) og falloidin 568 (1:1000) i 0,1 M PB som inneholder 1% normalt esel serum og 0,5% Triton X-100 for 1,5 h ved romtemperatur (26 °C).
- Vask dura mater tre ganger i 0,1 M PB.
- Trim kantene og monter den på mikroskopsklier (se Materialtabell).
- Sett på deksler med 50% glyserin før observasjon.
-
Observasjon og registrering
- Vær oppmerksom på fluorescerende prøver under et fluorescerende mikroskop eller et konfokalt bildebehandlingssystem.
- Ta bildene av den helmonterte dura materen med et fluorescerende mikroskop utstyrt med et digitalt kamera (4x, NA: 0,13), og bruk en eksponeringstid på 500 ms. Bildemosaikkene til dura mater ble fullført med en programvare for fluorescerende mikroskop (se Tabell over materialer).
- Ta bilder av CGRP-immunoreaktive nervefibre og falloidinmerkede blodkar i dura mater ved hjelp av et konfokalt mikroskop. Eksitasjons- og utslippsbølgelengdene var 488 nm (grønn) og 594 nm (rød). Det konfokale pinnehullet er 110 (20x) og 105 μm (40x). Oppløsningen for bildeopptak er 640 x 640 piksler.
- Ta 20 bilder i 2 μm-rammer fra hver 40 μm tykke seksjon og utfør enkel bildeintegrasjon i fokus med et konfokalt bildebehandlingsrelatert programvaresystem for 3D-analyse som følger: Angi Start Focal Plane-| Angi endepunktplan | Angi trinnstørrelse | Velg dybdemønster | | for avbildningsopptak Z-serien.
- Bruk en fotoredigeringsprogramvare til å justere lysstyrken og kontrasten til bilder for å optimalisere visualiseringen. Vær oppmerksom på at du ikke fjerner data fra bildene.
2. Retrograde sporingsstudie med FG
- Kirurgiske prosedyrer
- Bestem koordinatområdet av interesse for rottekranial dura mater.
- Forbered en 10 μL mikrosprøyte og test den med flytende parafin.
- Bedøv rottene med tribromoetanoloppløsning (150 mg/kg) via intraperitoneal injeksjon. Se etter dybden i anestesi ved mangel på respons på tåklemme.
- Barber rottens hode med en elektrisk barberhøvel.
- Sett stumpe ørestenger på rotten og legg den på stereotaxic-enheten. Sett deretter munnholderen og påfør oftalmisk salve på øynene.
- Rengjør det kirurgiske stedet for hodehuden ved hjelp av 10% povidon jod etterfulgt av 75% etanol.
- Lag et snitt langs midtlinjen i hodebunnen.
- Fjern periosteum- og muskelvevet direkte bort fra skallen ved hjelp av sterile bomullsspissede applikatorer (figur 1A).
- Bor et lite hull (~5-7 mm) med en burrbor med en rundspissbits (#106) på venstre parietal og temporale bein over MMA12, og sørg for at kranial dura mater ble holdt intakt (Figur 1B).
- Bygg en bank rundt hullet med tannsilikatsement for å begrense spredningen av sporstoffet (figur 1C).
- Tilsett 2 μL 2 % FG i hullet rundt MMA med en 10 μL mikrosprøyte (figur 1D).
- Dekk hullet med et lite stykke hemostatisk svamp.
- Sett et stykke parafinfilm på hullet og forsegle kantene med beinvoks for å forhindre lekkasje av tracer og for å unngå kontaminering til det omkringliggende vevet.
- Suturer såret med steril tråd.
- Hold rottene i et varmt område til de er helt gjenopprettet.
- Returner rottene tilbake til burene sine og legg til et antibiotika og smertestillende i drikkevannet.
- Perfusjoner og seksjoner
- Etter 7 overlevelsesdager, parfyme disse rotter som nevnt ovenfor i prosedyrene i pkt. 1.1.
- Disseker TG- og C1-4-DRG-ene, og deretter etterfikser og kryoprekk dem som nevnt ovenfor, som nevnt i avsnitt 1.1.3 (figur 1F).
- Klipp TG- og DRG-ene med en tykkelse på 30 μm på et kryostatmikrotomsystem i sagittal retning og montert på silanbelagte glasssklier.
- Doble immunfluorescenser for FG- og CGRP-merking i TG- og DRG-ene
MERK: Selv om FG-merkingen kan observeres direkte med UV-belysning under kvikksølvlampe uten ekstra flekker13,14,15,16, ble de merkede nevronene med FG ytterligere undersøkt i TG og Cervical DRGs ved hjelp av doble immunfluorescences med FG og CGRP for å avsløre opprinnelsen til durale CGRP-immunoreaktive nervefibre i TG og DRG.- Sirkle seksjonene med den histokjemiske pennen.
- Inkuber seksjonene i 30 min i en blokkeringsløsning som inneholder 3% normalt eselserum og 0,5% Triton X-100 i 0,1 M PB.
- Overfør prøvene til løsningen av kanin anti-fluorogold (1:1000) og mus anti-CGRP antistoff (1:1000) i 0,1 M PB som inneholder 1% normalt eselserum og 0,5% Triton X-100 over natten ved 4 °C.
- Vask seksjonene tre ganger i 0,1 M PB neste dag.
- Inkuber i en blandet løsning av esel anti-kanin Alexa Fluor 594 (1:500) og esel anti-mus Alexa Fluor 488 (1:500) sekundært antistoff i 0,1 M PB som inneholder 1% normalt eselserum og 0,5% Triton X-100 i 1,5 timer ved romtemperatur.
- Vask og påfør deksler på avsnittene som prosedyrer i trinn 1.2.6 og 1.2.8.
- Observasjon og registrering
- Ta bilder av FG-merkede nevroner i TG og DRG under UV-belysning av fluorescerende mikroskop utstyrt med et digitalt kamera.
- Ta bilder av FG- og CGRP-merkede nevroner i TG og DRG under et fluorescerende mikroskop utstyrt med et digitalt kamera.
- Bruk redigeringsprogramvaren til å justere lysstyrken og kontrasten til bilder og legge til etiketter i bildene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nevrovaskulær struktur av kranial dura mater
Etter immunfluorescerende og fluorescerende histokjemisk farging med CGRP og falloidin ble CGRP-immunoreaktive nervefibre og phalloidin-merkede duralarterioler og bindevev tydelig demonstrert gjennom hele kranial dura mater i et 3D-mønster (Figur 2C,D, E, F). Det ble vist at både tykke og tynne CGRP-immunoreaktive nervefibre løper parallelt med duralarteriolene, rundt den vaskulære veggen eller mellom blodkarene (Figur 2D, E, F). Ved å dra nytte av 3D-rekonstruksjonen, kan morfologien til duralarterioler og den romlige korrelasjonen mellom dural CGRP-immunoreaktive nervefibre og arterioler tydelig demonstreres fra forskjellige perspektiver.
Retrograd-merkede nevroner i TG og DRG
Syv dager etter FG-påføring på området MMA i rottekranial dura mater (Figur 3A), ble FG-merkede nevroner oppdaget i TG og Cervical DRGs på den ipsilaterale siden av tracerapplikasjonen, som ble direkte observert under UV-belysningen av fluorescerende mikroskopi (Figur 3B,C). FG-merkede nevroner ble funnet i alle de tre grenene av TG med høyere konsentrasjon på oftalmiske (V1) og maksillære (V2) divisjoner, og med mindre på mandibulær divisjon (V3) (Figur 3B). I mellomtiden ble noen av de FG-merkede nevronene også observert i C2-3 DRG -ene (figur 3C).
I tillegg ble det også utført doble immunfluorescenser med FG og CGRP på seksjonene TG og Cervical DRGs. I henhold til diameteren av CGRP-immunoreaktive nevroner i TG og DRG ble de fleste av dem først og fremst funnet i de små og mellomstore sensoriske nevronene (<50 μm). Noen av disse typene CGRP-immunoreaktive nevroner ble også merket med FG i TG og C2-3 DRG, noe som indikerer at CGRP-immunoreaktive nervefibre i kranial dura mater stammer fra disse subpopulering av sensoriske nevroner i TG og DRGs (Figur 4).
Figur 1: Fotografier av hoved eksperimentelle synspunkter i den nåværende studien. (A) Et snitt langs midtlinjen i hodebunnen. (B) Et hull over kranial dura mater som viser den midterste meningeale arterien (MMA). (C) En liten bank rundt hullet sirklet med dental silikat sement for påføring av tracer på kranial dura mater. (D) Påføring av fluorotgold (FG) i hullet med mikrosprøyte. (E) Den gjennomsiktige, helmonterte dura materen. (F) Den utvendige visningen av trigeminal ganglion (TG). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Korrelasjon mellom calcitonin genrelatert peptid (CGRP)-immunoreaktive nervefibre og falloidin (Pha)-merkede arterioler på hele braketten kranial dura mater. (A) Den gjennomsiktige helmonterte dura mater. (B) Den helmonterte dura materen ble flatet og montert på lysbildet. (C) Distribusjon av CGRP-immunoreaktive nervefibre og Pha-merkede blodkar langs midtre meningeal arterie (MMA). (D,E) De forstørrede bildene fra de samme områdene i d og e i panel C. (F) De forstørrede og justerte bildene fra panel E med rammen i et 3D-mønster. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Distribusjon av fluorogold (FG)-merkede nevroner i trigeminal ganglion (TG) og cervical (C) dorsal root ganglion (DRG) under UV-belysning. (A) Regionen med dura mater med FG-påføring. (B) Distribusjon av FG-merkede nevroner i oftalmiske (V1), maksillære (V2) og mandibulære (V3) grener av TG. (C) Distribusjon av FG-merkede nevroner distribuert i C2 DRG. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: De representative fotografiene som viser de merkede sensoriske nevronene i trigeminal ganglion (TG) og cervical dorsal root ganglion (DRG) ved å bruke doble immunfluorescenser med fluorogold (FG) og calcitonin genrelatert peptid (CGRP). (A,B) De merkede nevronene med FG, CGRP, og både FG og CGRP ble demonstrert i henholdsvis rødt, grønt og gult i TG (A) og DRG (B). (A1-B1), (A2-B2): Panelene A og B ble separat vist med FG-merking (A1, B1) og CGRP-merking (A2, B2). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne studien har vi med hell demonstrert fordelingen og opprinnelsen til CGRP-immunoreaktive nervefibre i kranial dura mater ved hjelp av immunfluorescence, 3D-rekonstruksjon og nevral sporing tilnærminger med CGRP antistoff og FG nevral tracer, som gir histologiske og kjemiske bevis for å bedre forstå det durale nevrovaskulære nettverket.
Som det var kjent, spiller CGRP en kritisk rolle i patogenesen av migrene4,17. Det ble vist at økt CGRP kan føre til vasodilatasjon og nevrogen betennelse for å forårsake perifer og sentral sensibilisering langs trigeminalveien4,18. CGRP-immunoreaktive nervefibre tilhører de unmyelinerte peptidergiske sensoriske axonene som er ansvarlige for transport av nociceptive signaler19. Å være i samsvar med tidligere studier, her, demonstrerte vi tydelig fordelingen av CGRP-immunoreaktive nervefibre i kranial dura mater og sporet opprinnelsen fra små og mellomstore sensoriske nevroner i TG og DRGs. Disse cellulære strukturene kan være kildene til syntetisering og frigjøring av CGRP. På den annen side er falloidin en spesifikk sonde for filamentøs aktin (F-aktin) som er rikelig i glatte muskulære og endotelceller. Som en riktig kandidat ble falloidin brukt til å merke vaskulære strukturer og bindevev10,20,21. Vår nylige studie har vist at, i motsetning til alfa glatt muskel aktin og CD31, falloidin er mer pålitelig og følsom for farging dural arterioles, og er optimal å kombinere med CGRP for å demonstrere kranial nevrovaskulært nettverk i detalj, som har blitt publisert eslewhere10,21.
Nevral tract tracing teknikk er et viktig verktøy for å undersøke nevral opprinnelse og avslutning. I den nåværende studien ble FG brukt til retrograd sporing av opprinnelsen til CGRP-immunoreaktive nervefibre i kranial dura mater. Siden kranial dura mater er en tynn membran, kan traceren ikke påføres praktisk ved injeksjonsmåte. I stedet ble FG direkte lagt til regionen rundt MMA i kranial dura mater i henhold til metoden som hadde blitt introdusert tidligere22,23, men det må tas hensyn til å holde dura mater intakt. Dessuten ble det gjort en innsats for å forhindre lekkasje av FG til tilstøtende vev. Fordi FG-merking kan observeres direkte under UV-belysning av kvikksølvlampe24, ved denne tilnærmingen sjekket vi stedet for FG-applikasjonen; det ble funnet at i tillegg til nevral forplantning, var FG begrenset i regionen sirklet med tannsilikat sement uten å forurense det omkringliggende vevet. Den andre fordelen er at FG-merkede nevroner også kan farges i forventet farge ved hjelp av immunfluorescens med FG-antistoff, noe som gjør det mer praktisk å brukes sammen med andre biomarkører14,15,16. Gjennom denne studien viste vi at FG ikke bare passer for retrogradsporing av dural innervasjon, men er også en riktig kandidat til å kombinere med CGRP for å bestemme de kjemiske egenskapene til FG-merkede nevroner.
Det skal bemerkes her at nåværende metoder fortrinnsvis brukes til unge dyr. På det tidlige stadiet av rotte er kranial dura mater mer gjennomsiktig i hele monteringsstilen. Denne funksjonen gjør det mer praktisk å visualisere den nevrovaskulære strukturen til kranial dura mater i et 3D-mønster uten ytterligere gjennomsiktig behandling.
Oppsummert gir den nåværende studien en verdifull tilnærming for effektivt å utforske innervering av kranial dura mater fra sensoriske nevroner i TG og Cervical DRGs, spesielt undertypen av små og mellomstore sensoriske nevroner med CGRP-immunoreaktivt uttrykk. Fra metodikkens perspektiv kan det gi en verdifull referanse for videre undersøkelse av de andre typer nervefibre i kranial dura mater, så vel som deres opprinnelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av prosjektet til National Key R&D Program of China (Project Code no. 2019YFC1709103; no. 2018YFC1707804) og National Natural Science Foundation of China (Prosjektkode nr. 81774211; nr. 81774432; nr. 81801561).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | A21202 | Protect from light; RRID: AB_141607 |
| Brain stereotaxis instrument | Narishige | SR-50 | |
| CellSens Dimension | Olympus | Version 1.1 | Software of fluorescent microscope |
| Confocal imaging system | Olympus | FV1200 | |
| Fluorogold (FG) | Fluorochrome | 52-9400 | Protect from light |
| Fluorescent imaging system | Olympus | BX53 | |
| Freezing microtome | Thermo | Microm International GmbH | |
| Olympus FV10-ASW 4.2a | Olympus | Version 4.2 | Confocal image processing software system |
| Micro Drill | Saeyang Microtech | Marathon-N7 | |
| Mouse anti-CGRP | Abcam | ab81887 | RRID: AB_1658411 |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Phalloidin 568 | Molecular Probes | A12380 | Protect from light |
| Photoshop and Illustration | Adobe | CS6 | Photo editing software |
| Rabbit anti- Fluorogold | Abcam | ab153 | RRID: AB_90738 |
| Sprague Dawley | National Institutes for Food and Drug Control | SCXK (JING) 2014-0013 | |
| Superfrost plus microscope slides | Thermo | #4951PLUS-001 | 25x75x1mm |
References
- Kekere, V., Alsayouri, K. Anatomy, Head and Neck, Dura Mater. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2020).
- Shimizu, T., et al. Distribution and origin of TRPV1 receptor-containing nerve fibers in the dura mater of rat. Brain Research. 1173, 84-91 (2007).
- Jacobs, B., Dussor, G. Neurovascular contributions to migraine: moving beyond vasodilation. Neuroscience. 338, 130-144 (2016).
- Dodick, D. W. A phase-by-phase review of migraine pathophysiology. Headache. 58, Suppl 1 4-16 (2018).
- Amin, F. M., et al. Investigation of the pathophysiological mechanisms of migraine attacks induced by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-38. Brain: A Journal of Neurology. 137, Pt 3 779-794 (2014).
- Keller, J. T., Marfurt, C. F. Peptidergic and serotoninergic innervation of the rat dura mater. The Journal of Comparative Neurology. 309 (4), 515-534 (1991).
- Messlinger, K., Hanesch, U., Baumgärtel, M., Trost, B., Schmidt, R. F. Innervation of the dura mater encephali of cat and rat: ultrastructure and calcitonin gene-related peptide-like and substance P-like immunoreactivity. Anatomy and Embryology. 188 (3), 219-237 (1993).
- Lennerz, J. K., et al. Calcitonin receptor-like receptor (CLR), receptor activity-modifying protein 1 (RAMP1), and calcitonin gene-related peptide (CGRP) immunoreactivity in the rat trigeminovascular system: differences between peripheral and central CGRP receptor distribution. The Journal of Comparative Neurology. 507 (3), 1277-1299 (2008).
- Eftekhari, S., Warfvinge, K., Blixt, F. W., Edvinsson, L. Differentiation of nerve fibers storing CGRP and CGRP receptors in the peripheral trigeminovascular system. The Journal of Pain: Official Journal of the American Pain Society. 14 (11), 1289-1303 (2013).
- Xu, D. S., et al. Characteristics of distribution of blood vessels and nerve fibers in the skin tissues of acupoint "Taichong" (LR3) in the rat. Zhen Ci Yan Jiu. 41 (6), 486-491 (2016).
- Cui, J. J., et al. The expression of calcitonin gene-related peptide on the neurons associated Zusanli (ST 36) in rats. Chinese Journal of Integrative Medicine. 21 (8), 630-634 (2015).
- Andres, K. H., von Düring, M., Muszynski, K., Schmidt, R. F. Nerve fibres and their terminals of the dura mater encephali of the rat. Anatomy and Embryology. 175 (3), 289-301 (1987).
- Leng, C., Chen, L., Li, C. Alteration of P2X1-6 receptor expression in retrograde Fluorogold-labeled DRG neurons from rat chronic neuropathic pain model. Biomedical Reports. 10 (4), 225-230 (2019).
- Huang, T. L., et al. Factors influencing the retrograde labeling of retinal ganglion cells with fluorogold in an animal optic nerve crush model. Ophthalmic Research. 51 (4), 173-178 (2014).
- Huang, T. L., Chang, C. H., Lin, K. H., Sheu, M. M., Tsai, R. K. Lack of protective effect of local administration of triamcinolone or systemic treatment with methylprednisolone against damages caused by optic nerve crush in rats. Experimental Eye Research. 92 (2), 112-119 (2011).
- Tsai, R. K., Chang, C. H., Wang, H. Z. Neuroprotective effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) in neurodegeneration after optic nerve crush in rats. Experimental Eye Research. 87 (3), 242-250 (2008).
- Iyengar, S., Ossipov, M. H., Johnson, K. W. The role of calcitonin gene-related peptide in peripheral and central pain mechanisms including migraine. Pain. 158 (4), 543-559 (2017).
- Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
- Kou, Z. Z., et al. Alterations in the neural circuits from peripheral afferents to the spinal cord: possible implications for diabetic polyneuropathy in streptozotocin-induced type 1 diabetic rats. Frontiers in neural circuits. 8, 6 (2014).
- Alarcon-Martinez, L., et al. Capillary pericytes express α-smooth muscle actin, which requires prevention of filamentous-actin depolymerization for detection. eLife. 7, 34861 (2018).
- Wang, J., et al. A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).
- Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. Central projections of sensory innervation of the rat superior sagittal sinus. Neuroscience. 129, 431-437 (2004).
- Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. Central projections of the sensory innervation of the rat middle meningeal artery. Brain Research. 1208, 103-110 (2008).
- Schmued, L. C., Fallon, J. H. Fluoro-Gold: a new fluorescent retrograde axonal tracer with numerous unique properties. Brain Research. 377 (1), 147-154 (1986).
