Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Generere akutte og kroniske eksperimentelle modeller av motorisk tic uttrykk hos rotter

Published: May 27, 2021 doi: 10.3791/61743
Automatic Translation
*1, *1, 1
1The Leslie & Susan Goldschmied (Gonda) Multidisciplinary Brain Research Center, Bar-Ilan University
* These authors contributed equally

Summary

Vi presenterer protokoller for å generere akutte og kroniske eksperimentelle modeller av tic expression i fritt oppføre rotter. Modellene er basert på striatal kanyleimplantasjon og påfølgende GABAA antagonistapplikasjon. Den akutte modellen bruker forbigående injeksjoner mens den kroniske modellen bruker langvarige infusjoner via en subkutan implantert mini-osmotisk pumpe.

Abstract

Motoriske tics er plutselige, raske, tilbakevendende bevegelser som er de viktigste symptomene på Tourettes syndrom og andre tic lidelser. Patofysiologien til tic generation er forbundet med unormal hemming av basal ganglia, spesielt den primære inngangsstrukturen, striatum. I dyremodeller av både gnagere og ikke-menneskelige primater induserer lokal anvendelse av GABA A-antagonister, som bicuculline og picrotoxin, inn i motordelene av striatum lokal disinhibition som resulterer i uttrykk for motoriske tics.

Her presenterer vi akutte og kroniske modeller av motoriske tics hos rotter. I den akutte modellen fremkaller bicuculline mikroinjeksjoner gjennom en kanyle implantert i dorsal striatum uttrykket av tics som varer i korte tidsperioder på opptil en time. Den kroniske modellen er et alternativ som muliggjør forlengelse av tic uttrykk til perioder på flere dager eller til og med uker, ved hjelp av kontinuerlig infusjon av bicuculline via en sub-kutan mini-osmotisk pumpe.

Modellene muliggjør studiet av adferds- og nevrale mekanismer for tic-generasjon gjennom cortico-basal ganglia-banen. Modellene støtter implantasjon av ekstra opptaks- og stimuleringsenheter i tillegg til injeksjonskanylene, og tillater dermed et bredt spekter av bruksområder som elektrisk og optisk stimulering og elektrofysiologiske opptak. Hver metode har forskjellige fordeler og mangler: Den akutte modellen muliggjør sammenligning av bevegelsens kinematiske egenskaper og de tilsvarende elektrofysiologiske endringene før, under og etter tic expression og effekten av kortsiktige modulatorer på tic expression. Denne akutte modellen er enkel å etablere; Det er imidlertid begrenset til en kort periode. Den kroniske modellen, mens den er mer kompleks, gjør det mulig å studere tic dynamics og atferdseffekter på tic expression over lengre perioder. Dermed driver typen empirisk spørring valget mellom disse to komplementære modellene av tic expression.

Introduction

Tics er det definerende symptomet på Tourettes syndrom (TS) og andre tic lidelser. Tics beskrives som plutselige, raske, tilbakevendende bevegelser (motoriske tics) eller vokaliseringer (vokal tics)1. Tic uttrykk svinger vanligvis i sin tidsmessige (frekvens)2 og romlige (intensitet, kroppsplassering)3 egenskaper over flere tidsskalaer (timer, dager, måneder og år). Disse endringene påvirkes av ulike faktorer, for eksempel miljøfunksjoner4,5, virkemåte6,7og frivillig og midlertidig undertrykking8.

Selv om nevronmekanismen som styrer motoriske tics fortsatt ikke er fullt ut forstått, har et økende antall teoretiske og eksperimentelle studier gitt nye bevis på sin natur9. For tiden antas patofysiologien til tic-generasjonen å involvere cortico-basal ganglia (CBG) -løkken, og er spesielt forbundet med unormal hemming av striatum, den primære basale ganglia inngangskjernen10,11,12. Tidligere studier hos gnagere og primater har vist at striatum kan disinhibited ved lokal anvendelse av forskjellige GABAA antagonister, som bicuculline og picrotoxin13,14,15,16,17,18. Denne farmakologiske intervensjonen fører til forbigående motorisk tic uttrykk i den kontralaterale siden til injeksjonen, og dermed etablere en robust akutt modell av tic lidelser med ansikt og konstruere gyldighet. Den akutte modellen er enkel å indusere og gjør det mulig å studere effekten av kortsiktig modulasjon som elektrisk og optisk stimulering samtidig med elektrofysiologiske og kinematiske opptak før, under og etter tic expression. Den akutte modellen er imidlertid begrenset til den korte tidsperioden etter injeksjonen. Basert på den akutte modellen foreslo vi nylig en kronisk modell av tic-generasjon hos rotter som bruker en langvarig, fast infusjon av bicuculline til striatum via en subkutan-implantert mini-osmotisk pumpe19. Denne modellen utvider perioden med tic expression til flere dager/uker. Den konstante frigjøringen av bicuculline over en lengre periode tillater undersøkelse av effekten av en rekke faktorer som farmakologiske behandlinger og atferdstilstander på tic expression.

Her presenterer vi protokoller for å generere de akutte og kroniske modellene av tic expression hos rotter. Som en funksjon av det spesifikke forskningsspørsmålet muliggjør protokollene finjustering av parametrene, inkludert ensidig kontra bilateral implantasjon, ticsstedet (i henhold til den somatotopiske organiseringen av striatum)18 og vinkelen på implantatkanylen (avhengig av plasseringen av ytterligere implanterte enheter). Metoden som brukes i den kroniske modellen er delvis basert på kommersielle produkter, men med kritiske justeringer for å passe til tic-modellen. Denne artikkelen beskriver justeringene som trengs for å skreddersy disse tic-modellene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle prosedyrer ble godkjent og veiledet av Institutional Animal Care and Use Committee og fulgt National Institutes of Health Guide for care and use of Laboratory Animals og Bar-Ilan University Guidelines for the Use and Care of Laboratory Animals in Research. Denne protokollen ble godkjent av Den nasjonale komitéen for forsøk i forsøk i forsøk på forsøk hos landbruksdyr i Helsedepartementet.

MERK: Denne protokollen benytter kvinnelige Long-Evans rotter (akutte og kroniske modeller) og kvinnelige Sprague Dawley rotter (akutt modell) i alderen 3-10 måneder, 280-350 g. Implementeringen av disse modellene i andre stammer, vekter eller aldre bør testes nøye for forskjellig reaksjon.

1. Akutt modell

  1. Pre-kirurgi forberedelse
    1. Implantat-kanyle forberedelse
      MERK: Implantatkanylen muliggjør lokale bikukulininjeksjoner i striatum.
      1. Klipp et rustfritt stål, 25 G (OD 0,02'', ID 0,015'') hyporør for å få en implantatkanyle (figur 1, enhet #1). Bruk et roterende verktøy for å oppnå rette kanter. Lengden på kanylen avhenger av implantasjonsmåldybden, vinkelen på kanyleimplantasjon og den endelige sementerte hettehøyden. Implantasjonsmåldybden må være 2 mm høyere enn det endelige injeksjonsmålet for å forhindre vevsskade.
        MERK: Det høyeste objektet implantert bestemmer hettehøyden.
      2. Slip og glatt ut implantatkanylekantene, og forhindre ytterligere mekanisk friksjon til hjernen. Sett en 30 G (0,01'') nål gjennom den for å fjerne eventuelle interne hindringer.
    2. Dummy forberedelse
      MERK: Dukken er en avtakbar innvendig ledning plassert inne i den implanterte kanylen. Dummy forsegler den implanterte kanylen, og forhindrer dermed hindringen.
      1. Lag en dummy ved å kutte en 0,013'' ledning med et roterende verktøy. Dummyen skal være 3 mm (0,118'') lengre enn implantatkanylelengden (Figur 1, enhet #2).
      2. Sett dukken inn i implantatkanylen til den når slutten. Bøy overflødig ledning ved å klemme den mot kanylen. Den bøyde delen skal skylles med implantatkanylen for å forhindre at dukken faller ut av den implanterte kanylen, og for å forhindre at rotten fjerner den.
    3. Klargjøring av injektor
      MERK: Injektoren, som består av et fleksibelt rør og en injeksjonskanyle (Figur 1, enhet #3), muliggjør direkte bikukulin injeksjon i striatum.
      1. Klipp et 70 cm fleksibelt polymermikroborrør (OD 0,06'', ID 0,02'') (Figur 1, enhet #3.1).
        MERK: Lengden på det fleksible røret defineres av avstanden mellom det eksperimentelle buret og plasseringen av infusjonspumpemaskinen. Det må være lenge nok til å muliggjøre fri bevegelse av rotten i injeksjonsperioden, men ikke for lenge, for å unngå at rotten blir viklet inn i den (se figur 3A).
      2. Klipp et rustfritt stål, 30 G (OD 0,012'', ID 0,007'') hyporør for å få injeksjonskanyle (figur 1, enhet #3.2). Bruk et roterende verktøy for å oppnå rette kanter. Den skal måle 5 mm lenger enn implantatkanylen: 2 mm lenger enn den implanterte kanylen i hjernen for å nå det endelige injeksjonsmålet, og 3 mm (0,118') for å sette den inn i det fleksible røret.
      3. Slip og glatt spissen av injeksjonskanylen, og forhindre ytterligere mekanisk friksjon til hjernen. Sett inn en ledning som måler 0,005'' diameter for å bekrefte at den er uhindret.
      4. Sett inn 3 mm (0,118'') av injeksjonskanylen i det fleksible røret og lim skjøten mellom dem for å få en injektor. Bruk cyanoacrylat (CA) lim og CA-akselerator.
      5. Fest en sprøyte med 25 G kanyle (0,018'') fylt med sterilt vann til injektoren og vask den gjennom. Dette sikrer at strømningsretningen som kommer ut av injeksjonskanylen er rett og uanstrengt. Avgjørende, hvis strømmen ikke er rett, bruk spissen av 30 G (OD 0.01'') nålen for å fjerne eventuelle hindringer og forstørre injeksjonskanylehullet, og kontroller strømmen på nytt.
    4. Cannula-holder forberedelse
      MERK: Kanyleholderen er koblet til den stereotaktiske armen og holder implantatkanylen under implantasjonen. Kanyleholderen består av kanyleholderbase og kanyleholderledning, som limes sammen (Figur 1, enhet #4). Under implantasjonen er kanyleholderbasen festet til den stereotaktiske armen, og kanyleholderledningen er festet til implantatkanylen.
      1. Kanyleholderbase: Kapp 10 cm (3,947'') av rustfritt stål, 22 G (OD 0,028'', ID 0,017'') hyporør (Figur 1, enhet #4.1).
      2. Kanyleholderledning: Kapp 0,013'' ledning til en lengde på 3 mm (0,118'') lengre enn ønsket implantatkanyle (Figur 1, enhet #4.2).
      3. Sett kanyleholderledningen inn i kanyleholderbasen og lim skjøten mellom dem ved hjelp av CA-lim og CA-akselerator. Ledningen skal være 1 mm kortere enn implantatkanylen, for å unngå vevsskade under implantasjon.
    5. Bicuculline forberedelse: oppløs bicuculline methiodid i fysiologisk saltvann eller kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) til en endelig konsentrasjon på 1 μg / μL. Del den oppløste bicuculline i 1 ml sprøyter, dekk med aluminiumsfolie, og frys ved -20 °C til det er nødvendig. Tine sprøyten om nødvendig før bruk.
  2. kirurgi
    1. Induser innledende anestesi ved å plassere rotten i et designet kammer og levere 4-5% isofluran blandet med et oksygen med en hastighet på0,5-1 l / min. Injiser deretter rotte intramuskulær (IM eller IP) med henholdsvis Ketamin og Xylazine (100 og 10 mg/kg).
    2. Barber rottens hode med en elektrisk hårklipper.
    3. Sett lidokaingel i rottens ører. Sett petroleumjell på rottens øyne for å forhindre hornhinnen tørking og traumer.
    4. Fest rotten i den stereotaktiske rammen ved hjelp av ørestenger og tannbar.
    5. Vattpinne rottens hodebunn med povidon jod og deretter med alkoholserviett for å sterilisere området. Infiltrer langs ønsket snittlinje med 0,5 - 1% lidokainoppløsning subkutant (SC). Bruk et skalpellblad, lag et snitt langs hodebunnen.
    6. Trekk fascia mot kantene for å åpne det kirurgiske området.
    7. Rengjør skallen med steril saltvann ved hjelp av bomullspinne. Ved blødning, bruk en cauterizer for å cauterize blodkapillæren. Dette trinnet er avgjørende for cap stabilitet over tid.
    8. Klem fascia med fire buede hemostater (to fremre, to bakre) for å forstørre det kirurgiske stedet.
    9. Mål bregma- og lambdakoordinatene. Utjevne dorsoventral (DV)-koordinatene til de to punktene, slik at de er innenfor et område på 100 μm.
    10. Bruk stereotaxisk apparat til å måle og markere koordinatene til områdene av interesse og ankerskruene som skal implanteres. De rette implantasjonskanylekoordinatene for tisk induksjon i forbensområdet er: AP: +1 til +1,5, ml: ±2,5, DV: 3; bakre område: AP: -0,4 til -0,5, ml: ±3,5, DV:318,20.
      MERK: Ved implantasjon av flere enheter som forhindrer implantering av kanyle rett, endre vinkelen på kanyleimplantasjon og koordinatene tilsvarende (forelimb koordinater: AP: +2,7, ml: ±2,5, DV: 3, vinkel 15° fra fremre til bakre).
    11. Bor hull i skallen under mikroskopet. Bruk en tannboremaskin med karbidrundebor i 1/4-1/2-biters størrelse. For å minimere risikoen for hjerneskade, juster borehastigheten i henhold til boreferdigheter og unngå mekanikertrykk. Bor til hjernen er synlig, i ca 1 mm. Absorber ethvert blod med en bomullspinne og vask med steril saltvann.
      MERK: Ankerskruene tjener til å stabilisere hetten. Pass på at skruene er plassert på begge halvkule og langs den fremre bakre aksen.
    12. Cannula implantasjon
      1. Skru ankerskruene inn i hullene. Bruk skruer i rustfritt stål #0 x 1/8 størrelse.
        MERK: Antall ankerskruer avhenger av totalt antall implanterte enheter. Jordskruer (f.eks. for elektriske opptak eller elektriske stimuleringer) skal nå hjerneoverflaten.
      2. Fest kanyleholderen til den stereotaktiske armen.
      3. Skyv implantatkanylen på kanyleholderen. Plasser implantatkanylen langsomt over hullet til den når hjernen.
      4. Mål DV-koordinatene fra hjerneoverflaten. Senk implantatkanylen opp til implantasjonsmålet. Absorber alt blod som kommer ut av hullet med en bomullspinne, vask med steril saltvann og tørk deretter grundig.
      5. Lim den implanterte kanylen til skallen ved hjelp av gellim. Vent til det er tørt.
      6. Påfør tannsement langs den implanterte kanylen for å feste den til skallen. La 2 mm (0,079'') strekke seg fra den øvre enden for å aktivere dummyinnsetting. Vent til det er tørt.
        MERK: Ikke legg sement på kanyleholderen.
      7. Løft kanyleholderen, og la den implanterte kanylen være på plass.
      8. Sett dukken inn i den implanterte kanylen.
      9. Implanter alle andre enheter som opptaksmatriser, optiske fibre, stimuleringselektroder etc. Påfør tannsement over resten av skallen, som dekker alle implantatene.
      10. Injiser 3 ml romtemperatur Ringers oppløsning og carprofen 5 mg/kg SC21.
      11. Overvåk rotten til den gjenvinner bevisstheten (dyret er oppreist, har kontroll over luftveiene og er ikke i fare for aspirasjon). Returner rotten til hjemmeburet for full gjenoppretting.
  3. Mikroinjeksjoner
    MERK: Under injeksjonen er det avgjørende å verifisere at strømningen av bikukullinen er intakt. Dette kan gjøres ved å la en liten luftboble danne seg i injektoren og overvåke bevegelsen. Det gjenværende volumet av injektoren kan fylles med saltvann, slik at ingen bicuculline er bortkastet.
    1. Fest injektoren til en bicuculline sprøyte med en 25 G kanyle (OD 0,018''). Fyll ~1/3-1/2 av injektoren og fjern sprøyten, slik at det dannes en liten luftboble.
    2. Fest injektoren til en steril saltvannsfylt sprøyte med en 25 G kanyle (OD 0,018''). Fyll injektoren til bicuculline når slutten og en liten dråpe kommer ut av den.
    3. Fjern stempelet på en 10 μL presisjonsglassmikrosyringe.
    4. Klipp og fest et kortfleksibel polymerrør (~3 cm, 1.181'') til presisjonsglassmikrosyringen.
    5. Koble den andre enden av det kortfleksible røret til en 1 ml sprøyte, 25 G kanyle (OD 0,018'') fylt med sterilt vann.
    6. Injiser vann gjennom det kortfleksible røret i presisjonsglassmikrosyringen til det kommer vann ut av det. Koble fra det kortfleksible røret.
    7. Sett stempelet inn igjen til det når ~7 μL-merket på presisjonsglassmikrosyringen.
    8. Sett presisjonsglassmikrosyringen inn i det bestemte sporet i infusjonspumpemaskinen.
    9. Fest injektoren til presisjonsglassmikrosyringen og konfigurer innstillingene til en hastighet på 0,35 μL/min og et totalt volum på 0,35 μL.
    10. Legg en papirserviett under injektorspissen. Merk luftbobleplasseringen på injektoren, start infusjonspumpemaskinen og kontroller at det vises et bikukulinsk fall. Etter injeksjonen markerer du luftbobleplasseringen igjen.
      MERK: Forskjellen mellom de to merkene tilsvarer ønsket forskjell under eksperimentell injeksjon.
    11. Sett rotten i det eksperimentelle buret og fjern dummy.
    12. Sett injektoren inn i den implanterte kanylen gjennom enden (se figur 3A).
    13. Start infusjonspumpemaskinen. Kontroller at luftboblen beveger seg. Start stoppeklokken for å holde oversikt over tic initierings- og avslutningstider.
    14. Ett minutt etter injeksjonen, fjern injektoren og sett langsomt inn dummyen igjen.
      MERK: Hvis du setter inn dummyen etter injeksjonen, skyves bikukullinen inn i injeksjonsmålet.
  4. Etter injeksjon
    1. Koble injektoren fra presisjonsglassmikrosyringen.
    2. Vask ut den gjenværende oppløsningen fra injektoren ved hjelp av en luftfylt sprøyte. Rengjør injektoren med sterilt vann og tøm den deretter ved å injisere luft gjennom injektoren.
    3. Koble presisjonsglassmikrosyringen fra infusjonspumpemaskinen og rengjør den med sterilt vann.

2. Kronisk modell

  1. Pre-kirurgi forberedelse
    1. Forberedelse av kanyleguide
      MERK: Kanyleføreren er en del av infusjonsrøret og brukes til å feste infusjonskanylen til kanyleholderen under implantasjonen.
      1. Klipp 12 mm (0,472'') rustfritt stål, 25 G (OD 0,02'', ID 0,015'') hyporør for å få en kanylefører (Figur 2, enhet #1). Bruk et roterende verktøy for å oppnå rette kanter.
      2. Klargjør en kanyleholder som beskrevet i trinn 1.1.4. Sett kanyleholderen inn i kanyleføreren for å kontrollere at den er ordentlig festet og fjern den.
    2. Infusjon-kanyle forberedelse
      MERK: Infusjonskanylen er også en del av infusjonsrøret. Det er implantert i det endelige målet av striatum og tillater fokal infusjon av bicuculline.
      1. Kutt rustfritt stål, 30 G (OD 0,012'', ID 0,007'') hyporør for å få en infusjonskanyle. Bruk et roterende verktøy for å oppnå rette kanter. Den totale infusjonskanylelengden er summen av ønsket implantasjonsdybde pluss en sikkerhetsfaktor (~ 1-2 mm, 0,039'-0,079''), den infusjonskanylebøyde delen (2 mm, 0,079''), overlappingen med kanyleføreren (3 mm, 0,118''), og den horisontale delen (4 mm, 0,157'') (Figur 2, enhet #2).
        MERK: I motsetning til den akutte modellen er implantasjonsdybden lik det endelige infusjonsmålet.
      2. Sett inn en ledning med en diameter på 0,005' i infusjonskanylen og bøy dem i en L-form på det tiltenkte stedet. Den vertikale delen tilsvarer ønsket implantasjonsdybde pluss 4-5 mm, og den horisontale delen er 4 mm lang.
        MERK: Innsetting av den indre ledningen forhindrer hindring av kanylen under bøyning.
    3. Fleksibelt kateter-rørpreparat
      MERK: Det er også en komponent i infusjonsrøret. Den kobler infusjonskanylen til mini-osmotisk pumpe via en slangeadapter.
      1. Klipp 8 cm (3,149'') polyetylen (PE)-10 slange (ID 0,011'', OD 0,025'') (Figur 2, enhet #3).
        MERK: Lengden på kateteret bestemmes av avstanden mellom implantasjonsmålet og pumpeplasseringen, slik at rottens hode og nakke beveger seg fritt (se figur 3B).
    4. Montering av infusjonsrøret
      MERK: Infusjonsrøret leder bicuculline fra mini-osmotisk pumpe til hjernen. Den består av kanyleføreren, infusjonskanylen, den fleksible kateterslangen, slangeadapteren og strømningsmoderatoren (figur 2).
      1. Fjern den indre ledningen fra infusjonskanylen. Inspiser kanylen under mikroskopet for å sikre at kantene er åpne og rene på begge sider; Hvis ikke, bruk en 30 G (OD 0,01'') kanyle for å åpne den.
      2. Fest kanyleføreren til den vertikale delen av infusjonskanylen, nær den bøyde delen, på overlappingen på 3 mm (0,118') ved hjelp av CA-lim og CA-akselerator.
      3. Sett den horisontale delen av infusjonskanylen inn i den fleksible kateterslangen. Overlappingen må være minst 2 mm .').
      4. Løs ut den gjennomskinnelige hetten til pumpeflytmoderatoren. Dette vil avsløre det korte kanylerøret i rustfritt stål (Figur 2, enhet #5.1).
        MERK: Strømningsmoderatoren er en del av mini-osmotisk pumpesett. Den består av en gjennomsiktig hette, en kort kanyledel, en hvit flens og en lang kanyledel. Den lange kanyledelen settes inn i den mini-osmotiske pumpen, og den korte kanyledelen er koblet til kateterslangen via slangeadapteren.
      5. Senk slangeadapteren (Figur 2, enheten #4) ned i 70 % alkohol. Vent noen minutter slik at materialet svulmer.
      6. Fest slangeadapteren til den korte kanyledelen av strømningsmoderatoren til den berører den hvite flensen (Figur 2, enhet #5.2). Røradapteren vil krympe i luften for å danne en tett forseglet tilkobling.
      7. Sett den fleksible kateterslangen inn i den åpne enden av slangeadapteren, til den berører den korte kanyledelen av strømningsmoderatoren.
      8. Hold den lange kanyledelen (Figur 2, enhet #5.3) ved hjelp av et klipsstativ og lim alle tilkoblingene. Tilkoblingene er mellom slangeadapteren og den hvite flensen, slangeadapteren og den fleksible kateterslangen, og til slutt den fleksible kateterslangen og den horisontale delen av infusjonskanylen. Vent flere timer til limet er helt tørt (avhengig av limtype).
        MERK: Bruk PE-kompatibelt lim for å hindre at tilkoblingene løsner.
      9. Injiser sterilt vann gjennom den lange kanyledelen av infusjonsrøret ved hjelp av en sprøyte med en 27 G (0,014') stump nål. Kontroller at vannet strømmer jevnt gjennom infusjonskanylen. Injiser luft gjennom infusjonsrøret for å tømme vannet.
    5. Påfylling av mini-osmotisk pumpe
      MERK: Grunningen er en oppstartsprosedyre som gjør det mulig for pumpen å starte infusjonen umiddelbart etter implantasjonen.
      1. Fyll et varmebad med vann ved kroppstemperatur (~37 °C). Fyll et lite beger med steril saltvann og legg det i varmebadet.
      2. Pakk den mini osmotiske pumpen med en papirserviett, og fest den vertikalt med åpningen vendt oppover ved hjelp av et klipsholderstativ.
      3. Fyll pumpen med ACSF med en sprøyte med en 27 G (0,014'' stump nål. Mens du fjerner sprøyten, fortsett å injisere ACSF for å forhindre at luft kommer inn. En ACSF-boble vises i pumpens blenderåpning.
        MERK: Den første ACSF-infusjonen gjør det mulig for rotten å komme seg helt etter operasjonen før tics blir indusert. Eventuelt kan den bikukulinfylte pumpen implanteres under primæroperasjonen for å unngå følgende pumpeutskifting, men den er ikke optimal19.
      4. Fest en sprøyte, 27 G (0,014'') stump nål til den lange kanyledelen av infusjonsrøret og injiser ACSF gjennom den. Mens du fjerner sprøyten, fortsett å injisere ACSF, for å forhindre at luft kommer inn. En ACSF-boble vises i den lange kanyledelen.
      5. Sett den lange kanyledelen inn i pumpen, boble til boble. En ACSF-boble skal vises på spissen av infusjonskanylen.
      6. Plasser pumpen i begeret. Prime pumpen, festet til infusjonsrøret, i minst 4-6 timer (ved ~ 37 °C) før pumpeimplantasjon. Pass på at bare pumpen kommer i kontakt med saltvannsslipen.
    6. Pumpe implantasjon kirurgi
      1. Bedøv rotten i henhold til anestesiprotokollen. Se trinn 1.2.1.
      2. Barber rottens hode og rygg ved hjelp av en elektrisk hårklipper, litt bakre til scapulaen.
      3. Utfør de grunnleggende trinnene i operasjonen, som beskrevet i trinn 1.2.3-1.2.11. Snittet skal være langs hodebunnen opp til oksipitalbenet.
      4. Steriliser en stor hemostat (~14 cm lang, 5,512'') i autoklaven. Sett hemostaten gjennom snittet og lag en subkutan lomme i rottens rygg ved vekselvis å åpne og lukke den under huden gjennom midtcapularlinjen.
        MERK: Lommen skal være stor nok til å inneholde pumpen og la den bevege seg litt.
    7. Mini-osmotisk pumpe og infusjonsrørimplantasjon
      1. Fest kanyleholderen til den stereotaktiske armen og plasser den i ønsket posisjon for implantasjon.
      2. Fjern pumpen fra varmebadet og legg den på rottens bakside dekket med en papirserviett.
      3. Skyv kanyleføreren på infusjonsrøret på kanyleholderen.
      4. Hold pumpen med en hemostat og sett den forsiktig inn i den subkutane lommen.
      5. Implanter ankerskruene.
        MERK: Implanter ankerskruene etter at du har satt inn pumpen, for å unngå blokkering av lommeåpningen og før kanyleimplantasjon for å unngå kanyleforskyvning.
      6. Implanter infusjonskanylen i målet og lim den til skallen ved hjelp av gellim. Vent til det er tørt. Koordinatene for forelimb tic induksjon er: AP: +1 til +1,5, ml: ±2,5, DV: 5.
      7. Påfør tannsement langs infusjonskanylen for å fikse den på skallen. Vent til det er tørt.
      8. Løft kanyleholderen og la den implanterte kanylen være på plass.
      9. Implantat alle andre enheter. Påfør tannsement på resten av skallen, som dekker alle implantatene. La det være nok fleksible kateterrør i den subkutane lommen som ikke er festet for å muliggjøre fri bevegelse av rotten.
        MERK: Pass på at det ikke er utsatte områder mellom skallen og lommeåpningen, og at kateteret ikke er bøyd.
      10. Fullfør operasjonen som beskrevet i trinn 1.2.12.10-1.2.12.11.
  2. Pumpe erstatning kirurgi
    MERK: Hver mini-osmotisk pumpetype har sin egen forhåndsbestemte infusjonsperiode. Derfor bør pumpeutskiftingsoperasjonen utføres før utløpsdatoen.
    1. Pre-kirurgi forberedelse
      1. Gjenta trinn 2.1.5.1-2.1.5.2.
      2. Fyll pumpen med bicuculline ved hjelp av en sprøyte med en 27 G (0,014'' stump nål. Mens du fjerner sprøyten, fortsett å injisere bicuculline, for å forhindre at luft kommer inn.
      3. Sett inn strømningsmoderatoren (festet til den gjennomsiktige hetten) inne i pumpen.
      4. Plasser pumpen i begeret. Klargjør pumpen i minst 4-6 timer (ved ~37 °C) før pumpen skiftes ut.
    2. kirurgi
      1. Bedøv rotten (se trinn 1.2.1.1) og barber ryggen ved hjelp av en elektrisk klippemaskin.
      2. Vattpinne rottens rygg med povidon jod og deretter med en alkoholserviett for å sterilisere området. Infiltrer langs ønsket snittlinje med en 0,5-1% lidokainløsning (SC).
      3. Lag et snitt på huden over den implanterte pumpen. Vask lommen med romtemperatur ACSF og tørk med gasbindputer. Bruk autoklavede engangsgardiner for å dekke området nær snittet.
      4. Koble den ACSF-fylte pumpen fra strømningsmoderatoren ved hjelp av en hemostat og kast den.
      5. Fjern den bikukulinfylte pumpen fra varmebadet. Løsne og kast strømningsmoderatoren fra den bikukulinfylte pumpen.
      6. Fest den bikukulinfylte pumpen forsiktig til den implanterte strømningsmoderatoren. Unngå å berøre den omkringliggende huden.
        MERK: Trinn 2.2.2.4-2.2.2.6 bør utføres raskt for å forhindre luftbobler. Pumpen bør imidlertid settes sakte inn for å forhindre rask innføring av bicuculline i hjernen.
      7. Trykk de to margene på snittet tett sammen ved hjelp av tang. Lim snittlinjen med et vevslim. Som et alternativ, lukk snittet ved hjelp av suturer.
      8. Vattpinne området med povidon jod og fullføre operasjonen som beskrevet i trinn 1.2.12.10-1.2.12.11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokoller for generering av de akutte og kroniske modellene for tisk induksjon hos rotter ble presentert ovenfor. Protokollene dekker hele forberedelsen til kirurgi og eksperimenter (Figur 1 for den akutte modellen, figur 2 for kronisk modell). Anvendelsen av bicuculline i motorområdene i striatum resulterer i uttrykk for pågående motoriske tics. Tics vises på den kontralaterale siden av søknaden og er preget av korte og repeterende muskelsammentrekninger. Etter bicuculline søknad til de fremre delene av striatum, tics uttrykkes vanligvis i rottens forben, hode og / eller kjeve, mens etter bakre injeksjoner uttrykkes tics i bakbenet18. I den akutte modellen (Figur 3A) begynner tics å dukke opp flere minutter etter bicuculline mikroinjeksjon, varer i dusinvis av minutter og til slutt forfaller og opphører18. I den kroniske modellen (Figur 3B)begynner tics vanligvis å vises den første dagen etter den bikukulinfylte pumpeimplantasjonen19. Tics svinger i løpet av dagen og er tydeligst observerbare i stillegående tilstand19. Tic uttrykk forblir pågående over en periode på flere dager og opptil noen uker, avhengig av typen mini-osmotisk pumpe.

Tic uttrykk kan overvåkes og kvantifiseres ved samtidig opptak av video, kinematiske sensorer og nevral aktivitet15,19,22. Motoriske tics har en stereotypisk kinematisk signatur som kan oppdages i akselerometer- og gyroskopsignalene (figur 4), og dermed muliggjør måling av deres frekvens og intensitet. Tic timing kan også vurderes ved hjelp av det lokale feltpotensialet (LFP) signalet gjennom HELE CBG-banen, på grunn av utseendet på store amplitude LFP forbigående pigger15 (Figur 4). Resultatene som presenteres her og ytterligere implementeringer av de akutte og kroniske modellene er beskrevet i detalj i våre tidligere verk15,18,19,22,23. Den striatale disinhibition-modellen hos både gnagere og ikke-menneskelige primater replikerte nøkkelegenskaper av tic expression i Tourettes syndrom og andre tic lidelser om både motor15,18 og vokal24 tics og deres uttrykk etter en annen atferdsmessig, miljømessig og farmakologisk intervensjon22,25,26. Imidlertid danner eksisterende funn bare toppen av isfjellet av den komplekse manifestasjonen av tic lidelser.  Vi tror at modellen vil muliggjøre studiet av et bredt spekter av slike faktorer, alt fra miljøeffekter som sensorisk input, atferdseffekter som samtidig virkningsytelse og kliniske effekter som respons på ulike behandlinger.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk representasjon av de skreddersydde enhetene som brukes i den akutte modellen. (1) Implant-kanyle som er kronisk implantert i striatum. (2) Dummy, en avtagbar indre ledning, brukes til å forsegle den implanterte kanylen. (3) Injektor, sammensatt av (3.1) fleksibelt rør og (3.2) injeksjonskanyle, brukes til akutt levering av bicuculline i striatum. (4) Kanyleholder, sammensatt av (4.1) base og (4.2) bly, brukes til å holde implantatkanylen under implantasjonen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Skjematisk representasjon av de skreddersydde enhetene og den mini-osmotiske pumpen som brukes i den kroniske modellen. (1) Kanyle-guide brukes til å holde infusjonskanylen under implantasjonen. (2) Infusjonskanyle er kronisk implantert i striatum. (3) Fleksibelt kateterrør kobler infusjonskanylen til mini-osmotisk pumpe. (4) Slangeadapteren kobler den fleksible kateterslangen til strømningsmoderatoren. (5) Flow-moderator består av (5.1) kort kanyledel, (5.2) hvit flens og (5.3) lang kanyledel. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Skjematisk representasjon av de eksperimentelle oppsettene. I den akutte modellen induserer tics etter en bicuculline injeksjon ved hjelp av en pumpeinfusjonsmaskin (A). I kronisk modell oppnås pågående tics ved langvarig infusjon av bicuculline via mini-osmotisk pumpeimplantasjon (B). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Et eksempel på synkroniserte signaler fra de kinematiske og nevrofysiologiske opptakene. Akselerometer, gyroskop og tilsvarende LFP fra primærmotor cortex under tic expression. Stiplet grå linje: tic utbrudd tid som oppdaget av LFP-signalet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I dette manuskriptet detaljerte vi protokollene til de akutte og kroniske modellene for tisk induksjon i en fritt oppførende rotte. Disse protokollene beskriver utarbeidelsen av alle komponenter, operasjonen og den eksperimentelle prosessen som kan tilpasses for tilpasning for å møte spesifikke forskningsbehov. Hovedprinsippet som ligger til grunn for disse modellene er direkte lokal anvendelse av bicuculline til motorområdene i striatum, som er kjent for å spille en nøkkelrolle i patofysiologien til tic lidelser10,11,12. I begge modellene leveres bicuculline til målet gjennom skreddersydde implanterte kanyler. Det spesifikke kanyleimplantasjonsmålet avhenger av ønsket kroppsplassering av tic expression. Striatum er somatotopisk organisert27,28,29,30. Påføring av bicuculline til sine fremre deler fører til tic uttrykk i forbenet, kjeven og hodet, mens anvendelsen på bakre deler resulterer i hindlimb tics18. Videre fører påføring til ventral striatum (nucleus accumbens – NAc) til hyperaktivitet31. Modellene muliggjør implantasjon av kanyler i begge halvkule og i begge striatale mål for samtidig injeksjon for å produsere bilaterale symptomer. Denne metoden gjelder ikke bare for tic expression-modeller, men også gyldig i andre nevrovitenskapsmodeller som krever injeksjon av nevroaktive forbindelser.

I den akutte modellen foreslår vi at du implanterer kanylen 2 mm over injeksjonsmålet for å forhindre vevsskade på målområdet. For å minimere påfølgende skade av injeksjonskanylen, bruker vi et tynt 30 G rør for å nå det endelige målet. Legg merke til at flere injeksjoner til samme mål til slutt vil føre til vevnekrose fra mekanisk stress, noe som vil føre til redusert tic uttrykk. En mulig løsning er å sette injektoren til dypere mål under de påfølgende injeksjonene, så lenge de forblir lokalisert i motorområdene i striatum. Denne vevnekrose forekommer ikke i kronisk modell, siden bicuculline infusjonen pågår gjennom en statisk direkte implantert infusjonskanyle i striatalmålet. For å minimere potensiell vevsskade fra kronisk infusjonskanyleimplantasjon, brukte vi også et 30 G rør. For å koble infusjonskanylen til strømningsmoderatoren via fleksibelt kateterrør, måtte vi imidlertid bruke en røradapter, noe som skapte et potensielt feilpunkt i prosessen. Tykkere fleksibelt kateterrør kan brukes til å passe til strømningsmoderatoren, noe som fører til en rimelig kostnad for en større vevsskade fra den større infusjonskanylen.

Pågående forskning de siste 10 årene har gjort det mulig for oss å definere spesifikke konsentrasjoner og leveringshastigheter for bicuculline15,18,22,23, noe som resulterer i et reproduserbart atferdsfenomen av observerbart tic uttrykk. Avvik fra disse verdiene mot høyere volumer, konsentrasjoner eller injeksjonshastigheter, kan forårsake episodisk anfall15,18,32 og ensidig rotasjon av rotter. Lavere konsentrasjoner resulterer i mer subtile, mindre påvisbare tics, uttrykt over kortere perioder. I kronisk modell ble det ikke observert anfall gjennom hele perioden; Imidlertid ble det observert omfattende tic expression og tendens til ensidig rotasjon den første dagen etter den bikukulinfylte pumpeimplantasjonen, som stabiliserte seg i løpet av den andre dagen. Dette, kombinert med gjenoppretting etter hjernekirurgi, forstyrrer dyrets komfortnivå og velvære. For å fjerne gjenopprettingsperioden fra tic expression, foreslår vi at du implanterer en ACSF-fylt pumpe først19. Denne perioden med ACSF-infusjon kan også brukes til å utføre kontrolleksperimenter før tic induksjon. Kontroll eksperimentelle økter kan også utføres i den akutte modellen, ved hjelp av ACSF injeksjoner18,33.

Både de akutte og kroniske modellene kan brukes til å studere de kinematiske egenskapene og nevrale korrelasjonene til tic expression. Tics kan identifiseres ved ramme-for-ramme offline videoanalyse, som imidlertid er tidkrevende og mindre nøyaktig. Mer sensitive evalueringsmetoder inkluderer elektromyografi (EMG) og kinematiske sensorer (akselerometer og gyroskoper) (figur 4). Til dette formål må de kinematiske enhetene være plassert i nærheten av det tic-uttrykkende stedet på kroppen for nøyaktig bevegelsesvurdering. Nevrale korrelasjoner av tic expression kan fanges opp av nevrofysiologiske opptak gjennom HELE CBG-banen (Figur 4). Når man vurderer implantasjon av flere opptaksenheter, må deres plasseringer både i og utenfor hjernen planlegges nøye for å forhindre forstyrrelser i injeksjonen.

Den eksperimentelle spørringens natur bør diktere valget av modell for tic expression. Den akutte modellen er enkel og enkel å implementere. Flere forbigående injeksjoner kan utføres over en relativt lang periode, kan kjøres samtidig i flere hjerneregioner og muliggjøre kombinering av kontroll og eksperimentelle økter. Den kroniske modellen er mer komplisert og krever daglig overvåking av rottens velvære. Likevel gir den konstante og langvarige bicuculline-applikasjonen muligheten til å adressere dynamikken i tic expression og dets modulering over tid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Denne studien ble delvis støttet av et Israel Science Foundation (ISF)-stipend (297/18). Forfatterne takker M. Bronfeld for å ha etablert den akutte gnagermodellen og M. Israelashvili for hennes kommentarer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anchor screws Micro Fasteners SMPPS0002 #0 x 1/8 - Pan Head Sheet Metal Screws
Bicuculline methiodide Sigma Aldrich 14343
Cyanoacrylate (CA) accelerator Zap PT29
Cyanoacrylate (CA) glue BSI IC-2000 This glue was found to be stronger than others
Dental cement Coltene H00322 Hygenic Perm Repair Material Reline Resin Self Cure
Glue gel Loctite Ultra Gel Control
Hemostat WPI 501242 Any hemostat sized approximately 14 cm would be sufficient
Hypo-tube, extra-thin wall 25G Component supply company HTX-25X
Hypo-tube, regular wall 22G Component supply company HTX-22R
Hypo-tube, regular wall 30G Component supply company HTX-30R
Infusion pump machine New Era Pump Systems NE-1000
Mini-osmotic pump ALZET 2001 1.0µl per hour, 7 days
PE compatible adhesive CEYS Special difficult plastics (suitable for PE)
PE-10 Catheter Tubing ALZET PE-10 ID = 0.28mm, OD = 0.61mm
Precision glass microsyringe, 10µl Hamilton 80065 1701 RNR 10µl syr (22s/51/3)
Tissue adhesive 3M 1469Sb Vetbond
Tubing-adapter CMA 3409500
Tygon micro bore tubing, 0.02 inch ID * 0.06 OD Component supply company TND80-020
Wire 0.005-inch Component supply company GWX-0050
Wire 0.013-inch Component supply company GWX-0130

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. American Psychiatric Association. DSM-5. American Psychiatric Association. , (2013).
  2. Peterson, B. S., Leckman, J. F. The temporal dynamics of tics in Gilles de la Tourette syndrome. Biol.Psychiatry. 44, 1337-1348 (1998).
  3. Ganos, C., et al. The somatotopy of tic inhibition: where and how much. Movement Disorders. , (2015).
  4. Barnea, M., et al. Subjective versus objective measures of tic severity in Tourette syndrome - The influence of environment. Psychiatry Research. 242, 204-209 (2016).
  5. Silva, R. R., Munoz, D. M., Barickman, J., Friedhoff, A. J. Environmental Factors and Related Fluctuation of Symptoms in Children and Adolescents with Tourette's Disorder. Journal of Child Psychology and Psychiatry. 36 (2), 305-312 (1995).
  6. Rothenberger, A., et al. Sleep and Tourette syndrome. Advances in Neurology. 85, 245-259 (2001).
  7. Conelea, C. a, Woods, D. W., Brandt, B. C. The impact of a stress induction task on tic frequencies in youth with Tourette Syndrome. Behaviour Research and Therapy. 49 (8), 492-497 (2011).
  8. Ganos, C., Rothwell, J., Haggard, P. Voluntary inhibitory motor control over involuntary tic movements. Movement Disorders. 33 (6), 937-946 (2018).
  9. Yael, D., Vinner, E., Bar-Gad, I. Pathophysiology of tic disorders. Movement Disorders. 30 (9), 1171-1178 (2015).
  10. Kurvits, L., Martino, D., Ganos, C., Eddy, C. M. Clinical Features That Evoke the Concept of Disinhibition in Tourette Syndrome. Frontiers in Psychiatry. 11, 1-10 (2020).
  11. Mink, J. W. Basal ganglia dysfunction in Tourette's syndrome: a new hypothesis. Pediatric Neurology. 25, 190-198 (2001).
  12. Bronfeld, M., Bar-Gad, I. Tic disorders: what happens in the basal ganglia. The Neuroscientist. 19 (1), 101-108 (2013).
  13. Tarsy, D., Pycock, C. J., Meldrum, B. S., Marsden, C. D. Focal contralateral myoclonus produced by inhibition of GABA action in the caudate nucleus of rats. Brain. 101 (1), 143-162 (1978).
  14. Crossman, A. R., Mitchell, I. J., Sambrook, M. A., Jackson, A. Chorea and Myoclonus in the Monkey Induced By Gamma-Aminobutyric Acid Antagonism in the Lentiform Complex. Brain. 111 (5), 1211-1233 (1988).
  15. McCairn, K. W., Bronfeld, M., Belelovsky, K., Bar-Gad, I. The neurophysiological correlates of motor tics following focal striatal disinhibition. Brain. 132 (8), 2125-2138 (2009).
  16. Worbe, Y., et al. Behavioral and movement disorders induced by local inhibitory dysfunction in primate striatum. Cerebral Cortex. 19 (8), 1844-1856 (2009).
  17. Pogorelov, V., Xu, M., Smith, H. R., Buchanan, G. F., Pittenger, C. Corticostriatal interactions in the generation of tic-like behaviors after local striatal disinhibition. Experimental Neurology. 265, 122-128 (2015).
  18. Bronfeld, M., Yael, D., Belelovsky, K., Bar-Gad, I. Motor tics evoked by striatal disinhibition in the rat. Frontiers in Systems Neuroscience. 7, 50 (2013).
  19. Vinner, E., Israelashvili, M., Bar-Gad, I. Prolonged striatal disinhibition as a chronic animal model of tic disorders. Journal of Neuroscience Methods. 292, 20-29 (2017).
  20. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 6, (2007).
  21. Flecknell, P. Analgesia and Post-Operative Care. Laboratory Animal Anaesthesia. , (2016).
  22. Israelashvili, M., Bar-Gad, I. Corticostriatal divergent function in determining the temporal and spatial properties of motor tics. Journal of Neuroscience. 35 (50), 16340-16351 (2015).
  23. Bronfeld, M., Belelovsky, K., Bar-Gad, I. Spatial and temporal properties of tic-related neuronal activity in the cortico-basal ganglia loop. Journal of Neuroscience. 31 (24), 8713-8721 (2011).
  24. McCairn, K. W., et al. A Primary Role for Nucleus Accumbens and Related Limbic Network in Vocal Tics. Neuron. 89 (2), 300-307 (2016).
  25. Rizzo, F., et al. Aripiprazole Selectively Reduces Motor Tics in a Young Animal Model for Tourette's Syndrome and Comorbid Attention Deficit and Hyperactivity Disorder. Frontiers in Neurology. 9, 1-11 (2018).
  26. Vinner, E., Matzner, A., Belelovsky, K., Bar-gad, I. Dissociation of tic expression from its neuronal encoding in the striatum during sleep. bioRxiv. , (2020).
  27. Webster, K. E. Cortico-striate interrelations in the albino rat. Journal of Anatomy. 95, Pt 4 532-544 (1961).
  28. Ebrahimi, A., Pochet, R., Roger, M. Topographical organization of the projections from physiologically identified areas of the motor cortex to the striatum in the rat. Neuroscience Research. 14, 39-60 (1992).
  29. Brown, L. L., Sharp, F. R. Metabolic mapping of rat striatum: somatotopic organization of sensorimotor activity. Brain Research. 686, 207-222 (1995).
  30. Brown, L. L., Smith, D. M., Goldbloom, L. M. Organizing principles of cortical integration in the rat neostriatum: Corticostriate map of the body surface is an ordered lattice of curved laminae and radial points. Journal of Comparative Neurology. 392 (4), 468-488 (1998).
  31. Yael, D., Tahary, O., Gurovich, B., Belelovsky, K., Bar-Gad, I. Disinhibition of the nucleus accumbens leads to macro-scale hyperactivity consisting of micro-scale behavioral segments encoded by striatal activity. The Journal of Neuroscience. , 3120 (2019).
  32. Obeso, J. A., Rothwell, J. C., Marsden, C. D. The spectrum of cortical myoclonus. From focal reflex jerks to spontaneous motor epilepsy. Brain. 108, 124-193 (1985).
  33. Bronfeld, M., et al. Bicuculline-induced chorea manifests in focal rather than globalized abnormalities in the activation of the external and internal globus pallidus. Journal of Neurophysiology. 104 (6), 3261-3275 (2010).

Tags

Oppførsel Utgave 171 Tic induksjon motoriske tics dyremodeller osmotisk pumpe basal ganglia striatum bicuculline GABA antagonister kronisk modell akutt modell Tourette syndrom
Generere akutte og kroniske eksperimentelle modeller av motorisk tic uttrykk hos rotter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vinner, E., Belelovsky, K., Bar-Gad, … More

Vinner, E., Belelovsky, K., Bar-Gad, I. Generating Acute and Chronic Experimental Models of Motor Tic Expression in Rats. J. Vis. Exp. (171), e61743, doi:10.3791/61743 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter