Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Vandrette hippocampale skiver af musehjernen

Published: September 22, 2020 doi: 10.3791/61753
Automatic Translation
1,2, 2, 2, *1, *1,2
1Laboratory of Endometrium, Endometriosis and Reproductive Medicine, Department of Development and Regeneration, KU Leuven, 2Laboratory of Ion Channel Research, VIB-KU Leuven Center for Brain and Disease Research, Leuven, Belgium and Department of Molecular Medicine, KU Leuven
* These authors contributed equally

Summary

Denne artikel har til formål at beskrive en systematisk protokol for at opnå vandrette hippocampale hjerneskiver i mus. Formålet med denne metode er at bevare integriteten af hippocampale fiberveje, såsom perforantstien og den mosede fiberkanal for at vurdere dentate gyrusrelaterede neurologiske processer.

Abstract

Hippocampus er en velorganiseret struktur i hjernen, der er en del af det limbiske system og er involveret i hukommelsesdannelse og konsolidering samt manifestation af alvorlige hjernesygdomme, herunder Alzheimers sygdom og epilepsi. Hippocampus modtager en høj grad af intra- og inter-connectivity, der sikrer en ordentlig kommunikation med interne og eksterne hjernestrukturer. Denne forbindelse opnås via forskellige informationsstrømme i form af fiberveje. Hjerneskiver er en hyppigt anvendt metode, når man udforsker hippocampus neurofysiologiske funktioner. Hippocampale hjerneskiver kan bruges til flere forskellige applikationer, herunder elektrofysiologiske optagelser, lette mikroskopiske målinger samt flere molekylære biologiske og histokemiske teknikker. Derfor repræsenterer hjerneskiver et ideelt modelsystem til vurdering af proteinfunktioner, til at undersøge patofysiologiske processer, der er involveret i neurologiske lidelser såvel som til lægemiddelforskningsformål.

Der findes flere forskellige måder at skære præparater. Hjerneskivepræparater med en vibratome giver en bedre bevarelse af vævsstrukturen og garanterer en tilstrækkelig iltforsyning under udskæring, hvilket giver fordele i forhold til den traditionelle brug af en vævshelikopter. Desuden kan forskellige skæreplaner anvendes til vibratome hjerne skive præparater. Her leveres en detaljeret protokol til en vellykket forberedelse af vibratomeskårne vandrette hippocampale skiver af musehjerner. I modsætning til andre skivepræparater gør vandret udskæring det muligt at holde fibrene i hippocampal inputstien (perforant sti) i en fuldt intakt tilstand inden for en skive, hvilket letter undersøgelsen af entorhinal-hippocampal interaktioner. Her giver vi en grundig protokol for dissektion, udvinding og akut horisontal udskæring af murinhjernen og diskuterer udfordringer og potentielle faldgruber i denne teknik. Endelig vil vi vise nogle eksempler på brugen af hjerneskiver i yderligere applikationer.

Introduction

Den omfattende udforskning af hippocampus startede, da Scoville og Milner rapporterede en patients manglende evne (H.M.) til at danne ny, deklarativ hukommelse efter kirurgisk fjernelse af hippocampus og nærliggende temporal lapstrukturer som en behandling for alvorlig epilepsi1. Fra det øjeblik er hippocampus blevet undersøgt grundigt med udgangspunkt i generelle neuronale egenskaber og funktioner op til udviklingen af alvorlige hjernesygdomme, såsom epilepsi og Alzheimers sygdom2,3,4,5. Hippocampus er en del af det limbiske system, der består af en gruppe relaterede hjernestrukturer involveret i følelser og hukommelsesdannelse6,7. Et tæt netværk af flere fiberveje opnår en stram hippocampal forbindelse til interne og eksterne hjernestrukturer. Disse veje omfatter den mediale og laterale perforant sti (entorhinal cortex at dentate gyrus, CA3 – CA1 og subiculum)8,den mosede fiber sti (dentate gyrus til CA3)9 og Schaffer sikkerhedsstillelse / associational commissural vej (CA3 til CA1)10 (Figur 1). Hippocampus præsenterer et af de mest udforskede hjerneområder indtil videre på grund af dets stærkt bevarede laminarorganisation af neuronal lagdannelse og muligheden for at opnå vitale neuronale kulturer og hjerneskiver relativt let5.

Figure 1
Figur 1: Tegneserie, der illustrerer de forskellige hippocampale regioner og de vigtigste fiberveje. De forskellige hippocampale regioner er angivet med ensfarvede linjer: entorhinal cortex (EF; sort), dentate gyrus (DG; orange), Cornu Ammonis (CA) 3 (cyan), 2 (gul) og 1 (magenta) og subiculum (grøn). Fiber veje er vist med en farvet prikket linje: mediale (MPP, rød) og lateral perforant sti (LPP, blå) (fra entorhinal cortex til dentate gyrus, CA3, CA1, og subiculum), den mosede fiber vej (MF, violet) (fra dentate gyrus til CA3) og Schaffer sikkerhedsstillelse (SC, brun) (ipsilateral fra CA3 til CA1) / associational commissural veje (AC, lysegrøn) (kontralateral fra CA3 til CA1). Klik her for at se en større version af dette tal.

Brain slice protokoller resulterer ofte i tab af forbindelser fra fjernere hjerneområder til det område af interesse5. Desuden er kapillærerne ikke længere funktionelle5 og blodcirkulationen er berøvet11. På trods af disse begrænsninger bruges hjerneskiver stadig primært til undersøgelse af hippocampus neurofysiologiske funktioner på grund af en række fordele. For det første er udvindingen af hippocampus hurtig12 og kræver ikke mange materialer. De eneste væsentlige instrumenter omfatter en dissektion kit, et laboratorium vandbad, adgang til carbogen og en vibrerende mikrotome (vibratome)13. Andre aktiver i hjerneskiveteknikken er omgåelsen af blod-hjerne-barrieren (BBB) og udvaskning af endogent frigivne molekyler før eksperimentets start5, hvilket gør det muligt at studere effekten af lægemidler med relativt præcis doseringskontrol14. Desuden bevarer hjerneskiver cytoarkitekturen og synaptiske kredsløb inden for hippocampus15,16, hvor neuroanatomien og det lokale miljø med neuronal forbindelse og komplekse neuron-glia-interaktioner bevares4,11,17. Derudover er hippocampal fiberforbindelser overvejende ensrettede og hippocampale neuroner har en høj synaptisk plasticitet, hvilket enormt forenkler indsamling og fortolkning af elektrofysiologiske optagelser af høj kvalitet for at forstå neurologiske processer18,19. Det er vigtigt, at hjerneskiver udgør et værdifuldt aktiv, der kan anvendes i en lang række forskellige videnskabelige teknikker, der spænder fra molekylære biologiske teknikker over billedoptagelser op til elektrofysiologiske målinger12,20,21,22,23,24,25,26.

Som skitseret ovenfor præsenterer hippocampale hjerneskiver et kraftfuldt eksperimentelt værktøj til at studere strukturelle og funktionelle træk ved den synaptiske forbindelse. Dette giver mulighed for at vurdere virkningerne af kemikalier eller mutationer på neuronal excitabilitet og plasticitet16.

Akut hjerne skive præparater præsenterer en relativt følsom teknik og optimal skive kvalitet er meget afhængig af ideelle eksperimentelle forhold, herunder alder af dyret, metoden til aktiv dødshjælp, hastigheden af dissektion og udskæring, udskæring løsninger og parametre (f.eks udskæring hastighed) samt betingelserne for skive opsving4. Derfor er en veldesignet protokol af allerstørste betydning og sikrer reproducerbarheden på tværs af forskellige forskningsenheder13.

Her giver vi en detaljeret protokol for akutte horisontale hippocampale skivepræparater med det formål at bevare integriteten af hippocampal lateral og mediale perforantsti og den mosede fibervej, der gør det muligt at undersøge dentate gyrusrelaterede processer9. Vi vil detaljeret beskrive de vigtigste trin til dissekering, ekstrakt og vandret skive den murinske hjerne, efterfulgt af repræsentative resultater af calcium-mikrofluorimetriske optagelser og felt excitatoriske postsynaptiske potentielle optagelser (fEPSPs) under baseline betingelser og under LTP induktion protokoller i hjernen skiver af vilde type C57BL/6J mus.

Protocol

Alle dyreforsøg til denne undersøgelse blev godkendt af KU Leuvens (Belgien) etiske undersøgelsesudvalg (P021/2012).

1. Tilberedning af en opløsning med højt saccharoseskiver og kunstigt cerebrospinalvæske (ACSF)

  1. Forud for eksperimentel dag
    1. Forbered 1 L af 10x skive præopløsning med laboratoriekvalitet Type 1 vand indeholdende (i mM): 25 KCl, 20 CaCl2, 10 MgSO4, 12,5 KH2PO4 (Tabel 1). For at undgå udfældning af calciumphosphat blandes langsomt kemikalierne i et bægerglas, der er forfyldt med 800 mL H2O under konstant omrøring med en magnetisk omrører. Opløsningen opbevares ved 4 °C eller stuetemperatur (RT).
  2. På den eksperimentelle dag
    1. Forbered 1 L af 1x ACSF med laboratoriekvalitet Type 1 vand indeholdende (i mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl2, 1 MgSO4, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 25 Glukose (Tabel 2). Brug et damptryks osmometer til at validere osmolariteten mellem 305-315 mOsm (pH ~ 7,55-7,6).
      BEMÆRK: For at undgå udfældning af calciumphosphat blandes langsomt alle faste kemikalier i et bægerglas, der er forfyldt med 800 mL H2O under konstant omrøring med en magnetisk omrører. Tilsæt MgSO4 og CaCl2 til allersidst, langsomt dryppende i den nødvendige mængde fra 1 M lageropløsninger.
    2. Boble 1x ACSF-opløsning ved RT med carbogen for at indstille pH mellem 7,3-7,4.
      BEMÆRK: Hvis pH-vinduet er lidt for højt eller for lavt, vil små justeringer i bilbogens styrke være tilstrækkelige. Hvis pH-værdi er højere end 7,45 med carbogenation, justere den ved at tilføje nogle dråber af 1 M NaH2PO4 løsning.
    3. Der fremstilles 250 ml (pr. hjerne) 1x opløsning med høj saccharoseskiver i et bægerglas, der indeholder 25 ml 10x skiveforopløsning og (i mM): 252 saccharose, 26 NaHCO3og 10 glucose (tabel 3). Kontroller, at osmolariteten er mellem 320 og 325 mOsm (pH ~ 7,55-7,6).
    4. Boble den høj-saccharose skive opløsning i 10-15 min med carbogen til at styre pH mellem 7,3-7,4.
      BEMÆRK: Hvis pH-værdi er højere end 7,45 med carbogenation, skal du justere den ved at tilføje et par dråber 1 M KH2PO4-opløsning.
    5. Opløsningen med høj saccharoseskiver opbevares i 20-30 minutter i ultrafryseren (-80 °C), indtil den er delvist frosset.

2. Forberedelse af arbejdsområdet til hjernen dissektion

  1. Under nedkølingen af opløsningen med den høje saccharoseskiver, fremstilles følgende.
    1. Varm vandbadet op til 32 °C.
    2. Fyld opvågningskammeret (Figur 2A) med den carbogenerede ACSF-opløsning og læg kammeret i vandbadet. Påfør løbende carbogen på acsf-hovedflasken og ACSF'en i opvågningskammeret.
    3. Indvarsle dyret til det eksperimentelle rum.
      BEMÆRK: Dyrets alder, køn og stamme skal bestemmes af den enkelte forsøgsperson og afhænger af det specifikke undersøgelsesspørgsmål. Dyrets parametre bør dog forblive konstante inden for en undersøgelse for at sikre sammenlignelighed mellem de forskellige forsøgsdage. Denne protokol er designet til brug af C57BL/6J hanmus i en alder af 2-6 uger. Hvis der skal anvendes ældre dyr, skal skive- og genvindingsopløsninger muligvis tilpasses i overensstemmelse hermed4,27 (f.eks. NMDG+-baserede opløsninger23,28) for at bevare de akutte skivers hjernesundhed.
    4. Gør anæstesikammeret klar.
    5. Læg silkepapir, plast Pasteur pipette med bred åbning (skåret åben), 90 mm kultur skål fyldt med is, en firkant af filterpapir oven på den kølede kulturskål, stærk saks til halshugning, dissektionssaks, buede tang, spatel, 35 mm kulturskål, fin børste, klinge, prøveplade (leveres med vibratome), superlim, pipettespids, fire stropper filterpapir (~ 2 cm x 0,5 cm) (Figur 2A).
    6. Opsæt vibratomet: Programmer først vibratomet til de korrekte indstillinger (klingevandringshastighed: 0,08 mm/s, skæring af amplitude: 1,4 mm, skærefrekvens: 85 Hz) og fastgør carbogenlinjen i skivekammeret. Placer derefter skivekammeret i holderen, fyld holderen omkring skivekammeret med is og fastgør alt til vibratomet. Til sidst anbringes barberbladet i vibratomebladets holder (Figur 2B).
  2. Efter frysning af høj saccharoseopløsningen udføres følgende trin.
    1. Efter 20-30 minutter skal du tage opløsningen med høj saccharoseskiver ud af ultrafryseren på -80 °C og holde bægeret på is.
    2. Placer den høje saccharoseopløsning ved siden af vibratomet på din bænk, knus og bland den delvist frosne opløsning med en spatel for at få en dejlig sjap og begynde at boble med carbogen.
    3. Tag nogle høj-saccharose skive opløsning med plast Pasteur pipette at suge den firkantede filterpapir på toppen af den kølede 90 mm kultur parabol.
    4. Fyld 35 mm dyrkningsskålen (eller en tilsvarende lille beholder, der er egnet til at opbevare hele hjernen) op til 75% med den høje saccharose skiveopløsning (tilstrækkelig til at dække hele hjernen) og afkøle kulturretten på is, der holdes ved siden af bægeret med resten af opløsningen. Carbogenate opløsningen i 35 mm kulturret.

3. Dissektion og placering af murin hjernen

  1. Bedøve dyret med 5% isoflurane. Bestem den korrekte dybde af anæstesi ved at klemme poten. Ingen pote tilbagetrækning refleks bør forekomme.
  2. Overfør dyret på silkepapir og halshugge det med stærk saks eller en lille dyre guillotine.
  3. Brug dissektion saks til at skære åbne hovedbunden.
  4. Skær calvaria langs sagittal sutur og fjern det ved hjælp af buede pincet, indtil hele hjernen, herunder olfaktoriske pærer, er synlig.
    BEMÆRK: Pas på ikke at beskadige hjernen med calvarias skarpe kanter eller pincet.
  5. Brug en spatel til omhyggeligt scoop ud hjernen (olfaktoriske pærer bør forblive fastgjort).
  6. Overfør hjernen i den kølede 35 mm dyrkningsskål, og fjern alle hår- eller blodpartikler fra vævet ved forsigtigt at vaske hjernen med en ACSF-fyldt Pasteur-pipette (blod har cytotoksiske virkninger påhjernevævet 29).
  7. Overfør hjernen ved hjælp af spatelen på det gennemblødte filterpapir oven på den kølede 90 mm kulturret(Figur 2A).
  8. Brug en kniv til at skære hjernen i halve, der adskiller de to halvkugler, og placere begge halvkugler på frisk skåret mediale side.
  9. Brug en kniv til at fjerne den dorsale del (5%-10%) fra hver halvkugle med et parallelt snit til den dorsale top (Figur 2C)30, og placer begge halvkugler på den friskskårne side med den ventrale del af hjernen opad.
  10. Placer en dråbe superlim på prøvepladen og spred den korrekt ud med en pipettespids for at imødekomme begge halvkugler.
  11. Brug en filterpapirrem til at opfange en halvkugle med kapillærkræfter ved at røre ved den ventrale side med filterpapirremmen og derved ikke beskadige vævet.
  12. Brug en anden filterpapirrem til forsigtigt at halvtørre den dorsale side af hjernen, før du placerer halvkuglen med den dorsale side ned på toppen af limen på prøvepladen. Gentag den samme procedure med den anden halvkugle.
    BEMÆRK: Halvkuglerne skal placeres i vandret justering på en spejlet måde på vibratomepladen, hvor rostralsiderne peger mod ydersiden og de kaudale sider vender (men ikke rører) hinanden i midten. De mediale sider af begge halvkugler skal pege mod vibratomebladet og sidesiderne mod eksperimentatoren (Figur 2D).
  13. Placer prøvepladen i udskæringskammeret og hurtigt, men forsigtigt, dæk den med iskold høj saccharose skiveopløsning sjap. Så snart opløsningen rører limen, vil den størkne og korrekt lim halvkuglerne til prøvepladen.
  14. Sørg for, at halvkuglerne er ordentligt dækket af høj saccharose skiveopløsning og bekræfte, at opløsningen er boblet med carbogen.
    BEMÆRK: Hele dissektionsproceduren skal udføres så hurtigt som muligt. Sørg for, at hjernen ikke forbliver uden tilførsel af ilt i meget lang tid. Det bør kun tage omkring 1-1,5 minutter fra halshugning til hjernesænkning i den høj-saccharose skive opløsning sjap. Dette er det mest kritiske krav til akut hjerne skive præparater for at berettige høj kvalitet af skiven.

4. Horisontal udskæring af hjernen

  1. Placer vibratomebladet foran halvkuglens mediale side, og sænk det til samme højde som halvkuglernes ventrale sider, der nu vender opad. Sænk klingen ved hjælp af vibratomstyringen til 600 μm længere i rygretningen og begynd at skære. Klingen skal ramme vævet (hvis ikke, skal du vende bladet og sænke det lidt mere). Skær indtil de første to skiver er helt adskilt fra de to halvkugler.
  2. Vend klingen og sænk yderligere 300 μm og skær igen.
  3. Når hippocampus bliver synlig (brug musen31 hjerne atlas for at få hjælp, hvis det er nødvendigt) (Figur 2E) indsamle skiver med den udvidede plast Pasteur pipette. Saml skiverne, indtil caudate putamen bliver synlig ved siden af hippocampus. Typisk kan der indsamles mellem 8-12 skiver på 300 μm (4-6 pr. halvkugle) til musehjernen.
  4. Brug plast pasteurpipetten til at samle skiverne og overføre dem til opvågningskammeret i vandbadet (Figur 2F) (saml skiver efter hver runde udskæring for at forhindre dem i at flyde rundt i skivekammeret).
    BEMÆRK: Arbejd så hurtigt som muligt, og sørg for, at den høj-saccharose skive opløsning er iskold og carbogenated under hele proceduren. Hvis det er nødvendigt, skal isen omkring skivekammeret genopfyldes.

5. Genvinding af hjerneskiver til elektrofysiologiske optagelser

  1. Skiverne i det ACSF-fyldte genvindingskammer efterlades i vandbadet på 32 °C i 1 time.
    BEMÆRK: Recovery kamre er også kommercielt tilgængelige.
  2. Tag opvågningskammeret ud af vandbadet.
  3. Placer skiverne på RT i mindst yderligere 30 minutter til genopretning, før du starter yderligere påføring.

6. fEPSP optagelser i den mediale perforant sti (MPP) af hippocampus

  1. Træk optagelsespipetter fra borosilicate glaskapillærer med en vandret pipettetrækker for at modtage pipetter på størrelse med ~ 2 MΩ, når de fyldes med ACSF-opløsning og nedsænkes i det ACSF-fyldte optagekammer.
  2. Fyld ACSF-badeopløsning og ACSF-opløsning, der indeholder de relevante kemikalier (f.eks. Bicuculline) i et tyngdekraftsstyret multitøndeperfusionssystem, der er forbundet med optagekammeret. Løbende carbogenate alle løsninger.
  3. Tænd for en peristaltisk pumpe eller vakuumpumpe, der er forbundet til en sugeslange, der ender modsat perfusionslinjen i optagekammeret. Åbn den ACSF-fyldte tønde, og begynd at etablere et kontinuerligt flow (1-2 dråber i sekundet). Kontroller, at referenceelektroden er nedsænket i ACSF-opløsningen.
  4. Tænd for installationscomputeren, forstærkeren, mikromanipulatoren, stimulatoren, mikroskoplysene, kameraet og skærmen (hvis det er relevant).
  5. Åbn den relevante software til elektrofysiologiske optagelser (der findes flere forskellige hardware- og softwareleverandører til elektrofysiologisk udstyr).
  6. Overfør en hjerneskivehalvdel fra opvågningskammeret til indspilningskammeret i skiveopsætningen, og placer den i den korrekte retning med det dentate gyrus granulatcellelag og det molekylære lag i synsfeltet. Sørg for, at stimuleringselektroden kan nå MPP i skiven fra retningen af entorhinal cortex, og at optagelseselektroden har adgang til MPP fra den stik modsatte side fra retningen af CA3.
  7. Stabilisere skiven i optagekammeret med en papirclips (Figur 3A) eller et kommercielt tilgængeligt hjerneskivegitter.
    BEMÆRK: Det kan være nyttigt at slukke for perfusionen under skiveoverførsel og placering. Dette bør dog ikke tage for lang tid for at garantere kvaliteten af hjerneskiven.
  8. Nedre og placer registrerings- og stimuleringselektroderne i MPP i den nederste tredjedel af det molekylære lag tæt på granulatcellelaget (Figur 3B), der vender mod hinanden i en afstand på ca. 100-150 μm. Stimuleringselektroden skal minimalt kontakte overfladen, mens optagelseselektroden skal infiltrere det øverste skivelag lidt.
  9. Påfør en stimulus med lav intensitet (30-50 μA for 0,1 ms) på hjerneskiven for at opnå fEPSP-signalet. Elektrodernes position tilpasses om nødvendigt (f.eks. lavt eller atypisk formet fEPSP-signal).
  10. Begynd at optage input-output kurver: anvende stigende stimulus intensiteter til hjernen skive i intervaller på 30 s.
  11. Indstil stimulusintensiteten til 50% af den maksimale fEPSP-respons, og start baseline fEPSP-optagelser, der anvender stimulusintensiteten på 50 % i 20-40 minutter i 30 s intervaller på hjerneskiven.
  12. Hvis basislinjen ser ud til at være stabil, skal du fortsætte med yderligere optagelser (f.eks. LTP/LTD-protokoller og/eller lægemiddelapplikationer). (For LTP induktion i MPP, her en protokol bestående af fire gange 1 s 100 Hz impulser anvendes i et interval på 5 min blev brugt. Bicuculline blev anvendt 10 minutter før og under konditioneringsfasen.)
    BEMÆRK: Alle optagelser skal udføres i den aktuelle klemmetilstand med passende lavpasfiltrering (<5 kHz) og samplingfrekvenser (>10 kHz).
  13. Udtræk dataene i et passende filformat, og analyser fEPSP-parametre, f.eks.

7. Calciumbilledoptagelser af hjerneskiver

  1. Overfør en hjerneskivehalvdel i et 12-brønds kammer og læg det i 30 minutter til 1 time med et passende calciumfarvestof. Løbende carbogenate lasteopløsningen ved at indsætte et carbogenationsrør gennem et selvfremstillet hul (med en varm 18G nål) i låget på 12-brøndspladen.
    BEMÆRK: Dette trin er ikke nødvendigt i tilfælde af hjerneskivepræparater fra genetisk modificerede dyr, der endogent udtrykker en fluorescerende reporter som GCaMP.
  2. Forbered optagelsesopsætningen som beskrevet i trin 6.2-6.5.
    BEMÆRK: Der er ikke behov for forstærker eller mikromanipulator til mikrofluorometriske billeddiagnostiske forsøg. Brugen af en stimulator er eksperimentafhængig. Specifik software til fluorescensbilledeksperimenter er afgørende.
  3. Juster softwaren til de korrekte billedindstillinger: Dette omfatter kameraforstærker- og placeringsindstilling, indstilling af bølgelængden, eksponeringstid og timingprotokol. Indstillingerne kan variere afhængigt af de nøjagtige eksperimenter. (For eksempel spor, 1 x 1 binning, 2,4x pre-forstærker gevinst, 300 EM kamera gevinst, eksponering på 50 ms ved 488 nm gentages hver 500 ms for varigheden af forsøget blev brugt.)
  4. Efter pålæsning med calciumfarvet skal du overføre hjerneskivehalvdelen fra 12-brønden til optagekammeret og placere den på mikroskopstadiet.
  5. Stabilisering af skiven i optagekammeret med en papirclips (Figur 3A) eller et kommercielt tilgængeligt hjerneskivegitter svarende til det, der er beskrevet i trin 6.7.
  6. Sørg for, at interesseområdet er i det rigtige mikroskopiske felt og i fokus.
  7. Brug fluorescens imaging software til at vælge flere områder af interesse (ROIs) på din skive.
    BEMÆRK: Det kan være nyttigt at markere hele synsfeltet for at følge de generelle udsving i lysstyrken på grund af fotobleaching.
  8. Start optagelsen, og påfør de eksperimentelle testmedicin på udvalgte tidspunkter.
    BEMÆRK: Det anbefales at anvende en høj K+ opløsning i slutningen af hvert eksperiment for at verificere cellernes neuronale karakter og skivekvaliteten.
  9. Udtræk dataene i et passende filformat, og analyser de ændringer af fluorescenssignalet, der forekommer i ROI'erne, over hele målingen. ROI'er kan også tilpasses under offlineanalysen.
    BEMÆRK: Andre protokoller, der beskriver fEPSP-optagelser og calciummikrofluorimetry i hjerneskiver, findes ilitteraturen 24,32,33,34,35.

Representative Results

Generel oversigt over værktøjer og kritiske trin, der er nødvendige for protokollen
Figur 2 præsenterer alle de nødvendige værktøjer og kritiske trin til forberedelse af vandrette akutte hippocampale hjerneskiver som beskrevet i denne protokol. Generelt kræves der et begrænset antal nøgleinstrumenter, herunder et par dissektionsværktøjer og et skivegenvindingskammer (figur 2A), et laboratorievandbad og en vibratome (Figur 2B). Figur 2C-E visualiserer vigtige trin og retninger i hjernen og halvkuglerne under udsnitsforberedelsesprotokollen. Figur 2F er en illustration af et forventet resultat af vandrette hjerneskiver.

fEPSP-optagelser i den mediale perforantsti
Efter genopretningsperioden kan hjerneskiverne bruges til elektrofysiologiske optagelser af fEPSP'er. Her brugte vi et opretstående mikroskop udstyret med et multikanals tyngdekraftskontrolleret perfusionssystem(Figur 3A og Figur 3B). En glasmikropipette (~ 2 MΩ) blev fyldt med ACSF-opløsning og fastgjort oven på en chloridbelagt sølvelektrode, der er monteret på en operationel forstærker i kredsløb med en kloreret badeelektrode. fEPSP'er blev optaget og visualiseret med en forstærker og passende optagelsessoftware ved at indsætte glasmikropipetten i hippocampus'ens MPP i det øverste lag af hjerneskiven. fEPSP'er blev fremkaldt ved stimulering med et 2-kontakt klyngemikroelektronid, der anvendte forskellige aktuelle intensiteter på MPP opstrøms for optagelseselektroden. Bemærk, at denne protokol ikke er beregnet til at forklare, hvordan man får MPP-optagelser, men blot bruger optagelser i MPP som et eksempel til at demonstrere succesen med den udsnitsforberedelsesprotokol, der er beskrevet her. Hvis nogen forsøger at udføre MPP-optagelser, kan visse kontroller (f.eks. parrede pulsoptagelser) være nødvendige for at sikre det korrekte optagelsessted og skelne MPP'en fra LPP8,36,37.

Figur 3C illustrerer et negativt eksempel (venstre panel, udsnit af lav kvalitet) og et positivt eksempel (højre panel, udsnit af høj kvalitet) på en fEPSP-optagelse. Det negative eksempel spor viser en stor fiber volley (FV) amplitude, der er endnu højere end den faktiske fEPSP amplitude (≈0,5 mV). I modsætning hertil viser udsniteksepel af høj kvalitet (højre panel) et lille FV til fEPSP-forhold og en høj fEPSP-amplitude (>0,5 mV). Fibervolley er det signal, der opstår ved depolarisering af de stimulerede neuronale fibre og går derfor forud for den postsynaptiske potensering (fEPSP). Relationen mellem FV og fEPSP-egenskaber giver vigtige oplysninger om bevarelsen af de axonale og synaptiske egenskaber. Høj kvalitet skiver med intakt nervefibre bør vise en høj fEPSP amplitude til FV ratio. Tværtimod vil skiver af lav kvalitet med nedsat ledningsegenskaber have et nedsat fEPSP- til FV-forhold. Tilsvarende kan levedygtigheden af en hjerne skive analyseres ved at plotte fEPSP skråninger versus fiber volley amplitudes(Figur 3D).

Desuden anvendes input-output-kurver (fEPSP-hældning og FV-amplitude over stimulusintensitet) standard for at bestemme skivekvaliteten. Sådanne kurver opnås ved at anvende stigende nuværende stimuli på hjerneskiven og ved at overvåge de efterfølgende fEPSP-reaktioner. Hjerneskiver af lav kvalitet viser en reduceret input-output-kurve på grund af suboptimale ledningsegenskaber af dårligt bevaret hjernevæv(Figur 3E, F). Desuden er input-output-kurver nødvendige for at definere det ideelle stimuleringsintensitetsområde til undersøgelse af synaptiske processer. Ideelt set bør stimulusintensiteten indstilles omkring 50% af intensiteten for maksimale reaktioner. På dette valgte stimulus intensitet, fEPSP svar er meget følsomme for eventuelle ændringer i synaptisk plasticitet, som giver mulighed for at undersøge både langsigtet potensering (LTP) og langsigtet depression (LTD).

For at studere synaptisk plasticitet overvåges den synaptiske overførsel af hjerneskiven (fEPSP-hældning) ved den valgte 50% stimulusintensitet i en længere periode (normalt mellem 20-40 min. ) før konditioneringsfasen. Levedygtige hjerneskiver vil have stabile basislinjer, mens hjerneskiver med en ustabil basislinje ikke kan bruges til yderligere konditioneringsprotokoller for at studere synaptisk plasticitet i hjernekredsløbene(Figur 3G, øverste panel). fEPSP baseline optagelser kan også være nyttige for at overvåge narkotika virkninger på synaptisk transmission selv (Figur 3G, lavere panel). Gennemsnittet af de registrerede fEPSP-basissignaler bruges typisk til at normalisere et fEPSP-tidskursus og er standard indstillet til 100%.

Synaptisk plasticitet kan studeres ved at anvende specifikke konditioneringsprotokoller på hjerneskiverne. Disse protokoller afhænger af det undersøgte hjernekredsløb og interessemekanismen (f.eks. LTP eller LTD). For at fremkalde LTP i MPP af dentate gyrus er en stærk konditioneringsprotokol nødvendig på grund af den stærke GABAergic-hæmning, der er til stede ved MPP-synapserne38. Det forlyder, at GABAergic hæmning er endnu mere udtalt i hjernen skiver tilberedt med høj-saccharose udskæring løsninger39. Her bruger vi en protokol bestående af fire stimuleringer af 1 s lange 100 Hz impulser anvendes i en 5 min interval, mens de behandles med GABAA receptor antagonist Bicuculline (Figur 3H). Sammenlægningen af NMDA og Bicuculline i konditioneringsperioden resulterer i en øget LTP (Figur 3H). Lav kvalitet af skiven og ustabil synaptisk transmission (fEPSP baseline) kan resultere i ændret eller mislykket LTP og LTD induktion. Derfor er det af stor betydning at arbejde med skivepræparater af høj kvalitet og anvende strenge udelukkelseskriterier (lavt fEPSP-og fibervolleyforhold (<3), lille fEPSP-hældning (<0,5 mV/ms) eller amplitude (<0,5 mV) og ustabil fEPSP-basislinje (ændring på mere end 5%) for uigennemførlige skiver, når synaptiske processer undersøges.

Mikrofluormetriske målinger af calcium i dentate gyrusens granulatcellelag
Efter genopretning blev en hjerneskive inkuberet ved stuetemperatur med 2 μM calciumfølsomt farvestof i 1 time i carbogeneret ASCF, afskærmet fra lys. Skiven blev overført til et indspilningskammer (Figur 3A) på et opretstående fluorescensmikroskop udstyret med et multikanaltyngdekraftskontrolleret perfusionssystem. Fluorescensemissionsbilleder blev anskaffet hvert 500 millisekunder efter belysning ved 488 nm (figur 4A,B). Excitation blev udført med en Xenon lampe og en scanner monteret diffraktion rist monokromator og billederhvervelse blev udført med en computerstyret CCD kamera. Under målingerne blev skiven behandlet med NMDA-receptorantagonisten APV, hvilket resulterede i et fald i den intracellulære calciumkoncentration. Stimulering af skiven med en ekstracellulær opløsning, der indeholder en høj kaliumkoncentration (50 mM), resulterede i en massiv tilstrømning af ekstracellulært calcium på grund af depolariseringen af neuronerne og åbningen af spændingsportede ionkanaler (Figur 4C).

Sammensatte Koncentration (mM) Molekylvægt (g/mol) Beløb (g)
KCl 25 74.55 1.86
CaCl2 * 2H2O 20 147.01 2.94
MgSO4 * 7H2O 10 246.48 2.46
KH2PO4 12.5 136.08 1.7

Tabel 1: 10 x skiveforløsning (1 L).

Sammensatte Koncentration (mM) Molekylvægt (g/mol) Beløb (g)
Nacl 125 58.44 7.3
KCl 2.5 74.55 0.19
CaCl2 * 2H2O 2 fra 1 M CaCl2 løsning 2 mL
MgSO4 * 7H2O 1 fra 1 M MgSO4 opløsning 1 mL
NaH2PO4 * 2H2O 1.25 156.02 0.2
NaHCO3 26 84.01 2.18
Glukose * H2O 25 198.17 4.95

Tabel 2: 1x ACSF (1 L) (osmolaritet mellem 305-315 mOsm).

Sammensatte Koncentration (mM) Molekylvægt (g/mol) Beløb (g)
10x skive presolution Nielsen Nielsen 25 mL
Saccharose 252 342.3 21.57
NaHCO3 26 84.01 0.55
Glukose * H2O 10 198.17 0.49

Tabel 3: 1x opløsning med høj saccharoseskiver (250 ml) (osmolaritet mellem 320 og 325 mOsm).

Figure 2
Figur 2: Detaljerede oplysninger om forberedelsen af vandrette hippocampale hjerneskiver. a)Billede af de værktøjer, der er nødvendige for dissektion og udskæring af gnaverhjernen: a) ±2 cm lange og ±0,5 cm brede stropper af filtrerpapir (f.eks. klasse 413); b) klinge c) superlim d) pipettespids e) prøveplade (leveres med vibratome) f) 35 mm kulturret g) fin børste h) spatel i) buede pincet j) dissektionssaks k) stærk saks (klingelængde over 10 cm) l) pasteurpipette af plast med bred åbning (mellem 0,6 og 0,8 cm i diameter) m) genvindingskammer (selvfremstillet med 250 mL bægerglas, plastring, nylonnet, stykke af en 10 mL serologisk pipette) n) 90 mm kulturret fyldt med is og (o) kvadratpapir oven på den kølede kulturret. b)Billede af en vibratome med a) holder af skivekammer fyldt med is; b) skivekammer c) carbogen line og d) udskæring af barberblad. (C) Tegneserie, der illustrerer orienteringen af snittet på den dorsale side af en halvkugle for at forberede hjernen til vandret udskæring (se trin 3.9). (D) Isometrisk projektion af hjerneretningen på vibromens prøveplade. (E)Tegneserie, der illustrerer et topbillede af de to halvkuglers position på prøvepladen. (F)Tegneserie, der viser hippocampus' position i en vandret hjerneskive. Dentate gyrus (DG) og Cornu Ammonis (CA)-Subiculum (SB) regioner i hippocampus er angivet. (G) Billede af et opvågningskammer med carbogenated ACSF, der indeholder ti friskskårne vandrette hjerneskiver. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Elektrofysiologiske optagelser af hippocampale hjerneskiver. (A) Billede af et optagekammer med perfusion og sugning, der anvendes under et opretstående mikroskop. En hjerne skive vil blive placeret i kammeret og immobiliseret med et stykke af et papirclips før starten af optagelserne. (B) Lyse felt billede af en hippocampal hjerne skive under en opretstående mikroskop (10x mål). Dentate gyrus (DG) og CA3-regionen er angivet samt stimulering (nederst til venstre) og optagelse (nederst til højre) elektroder, rettet mod den mediale perforant sti under fEPSP optagelser. (C) Venstre: repræsentation af en lav kvalitet skive eksempel på en fEPSP optagelse med en robust fiber volley og en lille amplitude. Højre: høj kvalitet skive eksempel på en fEPSP optagelse. Den grå linje angiver det oprindelige niveau. De punkterede linjer peger på cut-off amplitude på 0,5 mV. (d) Afbildning af fEPSP-hældningen i forhold til FV-amplituden for høj kvalitet (sort; n=10) og hjerneskiver af lav kvalitet (grå; n=4). Data repræsenteret som middelværdi ± SEM. (E) Input-Output-plot (fEPSP-hældning) for forskellige stimuleringsintensiteter (μA) for skiver af høj kvalitet (sort; n = 10) og skiver af lav kvalitet (grå; n = 4)). (F)Samme som i (E), men for FV amplitudes versus stimulus intensiteter. (G) Tidsforløb for tre forskellige baseline fEPSP-optagelser (hældning af fEPSP i %; normaliseret til den gennemsnitlige fEPSP-hældning på de første 5 min. ). Øverste panel repræsenterer et positivt (sort) og negativt (rødt) eksempel, hvor sidstnævnte har en ustabil basislinje på grund af udeladelse af carbogen under optagelsen. Nederste panel viser to stabile baseline optagelser i behandlet (efter 20 min stabil baseline, AMPA receptorer blev blokeret ved anvendelse af AMPA receptor antagonist DNQX (10 μM)) (blå) og ubehandlet tilstand (sort). (H) Tidsforløb for LTP-optagelser til forskellige behandlingsforhold (angivet i nederste panel). Sort farve til påføring af Bicuculline (20 μM) under konditionering og blå til anvendelse i bicuculline (20 μM) og NMDA (10 μM) under konditionering. Pile i det øverste panel angiver de tidspunkter, hvor højfrekvent stimulering blev anvendt (4 x 1s på 100Hz). Søjlediagram i nederste panel repræsenterer de gennemsnitlige fEPSP-skråninger (%) i 50-60 minutter efter LTP-induktion af forsøgene vist i det øverste panel (enkelt repræsentativ optagelse for hver betingelse). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Calcium-mikrofluorimetry af hippocampale hjerneskiver. (A og B) Fluorescens billede (ophidset på 488 nm) (A) og tilsvarende varme kort (B) af en vandret hippocampal hjerne skive af musens hjerne. Dentate gyrus (DG), CA3-regionen og et eksempel på en interesseregion (ROI) er angivet i panel A. (C) Tidsforløb med calciumresponser (F488 nm)fra et investeringsafkast i dentate gyrus af en akut hippocampal hjerneskive under behandling med NMDA-receptorantagonisten APV (50 μM) og opløsning, der indeholder højt ekstracellulært kalium (K+) (50 mM). Sporet normaliseres til den højeste calciumrespons under høj K+ perfusion og er baseline korrigeret for fotobleaching. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Selvom det er almindeligt anvendt blandt neurovidenskabssamfundet, står hjerneskivepræparater også over for flere ulemper. For eksempel er input- og outputforbindelser til de interesseområder, der er interesseområder, ikke længere forbundet i en hjerneskive. Desuden, når isoleret, vævet begynder nedværdigende langsomt over tid, og denne proces kan ændre de fysiologiske forhold i hjernen skive. Dette emne i særdeleshed er meget bekymrende, fordi de fleste hjerne skive optagelser tager flere minutter til timer, hvilket resulterer i lange eksperimentelle dage med optagelser udført på væv, der blev isoleret op til 6-8 timer før starten af forsøget. Desuden afbrydes cerebrospinalvæsken og blodcirkulationen under skivepræparater, hvilket kan føre til mangel på vigtige endogene forbindelser i en hjerneskive. Og mest tydeligt kan udskæringsproceduren i sig selv forårsage mekanisk vævsskade, der kan kompromittere de opnåede resultater. Men de faktiske fordele ved hjerne skive præparater er stadig opvejer deres ulemper, hvilket er grunden til de præsenterer en højt værdsat og ansat teknik i neurovidenskab forskning.

Akutte hippocampale hjerneskiver udgør en kraftfuld og derfor udbredt teknik til at undersøge neuronale processer fra et molekylært niveau op til komplekse hjernekredsløbsundersøgelser. Dette er baseret på hippocampus ideelle neuroanatomi, der let kan bevares i et skiveforberedelse18. Derfor anvendes hippocampale hjerneskiver i en lang række videnskabelige forskningsprojekter, herunder lægemiddelscreeninger17, undersøgelser af neuronale og synaptiske egenskaber involveret i kognitive funktioner40,41og undersøgelser af patologiske hjerneforhold14,42,43. Et bredt spektrum af forskellige applikationer forårsager imidlertid også en bred vifte af tilgængelige skiveforberedelsesprotokoller, der kan variere i forskellige parametre, såsom dissektionsforhold og skæreplanorientering, blandt andre. Derfor skal det nøjagtige forskningsspørgsmål om et videnskabeligt projekt afgøres for at vælge en passende skiveforberedelsesprotokol.

Vævshelikopteren præsenterer en af de ældste anvendte teknikker til at forberede hippocampale hjerneskiver44,45. De største fordele ved denne forberedelsesmetode omfatter helikopterens lave omkostninger og hurtig og nem brug46. Imidlertid forårsager vævshurtninger mekanisk stress, der resulterer i morfologiske ændringer og celledød47. Til sammenligning er vibratomet en ret dyr maskine, og tiden til skiveforberedelse øges betydeligt, hvilket kan have indflydelse på skivens kvalitet. Vibratomet tilbyder dog normalt en mere blid måde at adskille skiverne fra vævet og gør det muligt at holde hjernen pænt afkølet og iltet over hele isolationsproceduren og derved forbedreskiveegenskaberne 46. Derfor anvender flere grupper standard denne teknik og har fremrykket protokoller til forberedelse af akutte hippocampale hjerneskiver ved hjælp af vibratome16,30,48. Mens nogle protokoller kun indeholder nogle få detaljer om selve udskæringen, men snarere fokuserer på en specifik anvendelse af en sådan skiveforberedelse48, giver andre detaljerede skiveprotokoller, der adskiller sig i skæreplan eller andre protokoloplysninger (f.eks . agaroseintegrering eller skive / gendannelsesløsninger) i denne artikel27,30.

Den protokol, der er beskrevet her, præsenterer en ligetil metode til at forberede akutte vandrette hippocampale musehjerneskiver af høj kvalitet fra unge dyr. Protokollen er især nyttig til at bevare den perforante sti (mediale og laterale), der præsenterer hippocampal inputvejen, som projekterer fra den entorhinale cortex til hippocampus8,49,50. Sagittal, koronal samt isolerede hippocampus tværgående skivepræparater bevarer ikke korrekt den perforante sti, der stammer fra hovedsageligt lag II og V af entorhinal cortex og projekter til flere områder inden for hippocampus18. På grund af den anatomiske placering af den entorhinale cortex i forhold til hippocampus er vandrette hjerneskiver en nødvendighed for at opretholde fuldt intakte perforante stifibre i skiveforberedelsen31. Derudover bevarer vandret udskæring ideelt de mosede fibre, der projicerer fra dentate gyrus til CA3-neuronerne i hippocampus9,30,50. Derfor er denne forberedelsesmetode af høj værdi for undersøgelser, der undersøger hippocampale inputveje og DG-relaterede processer. Derudover tillader denne protokol undersøgelse af Schaffer-sikkerhedsvejen50. Men, sagittal og koronar hjerne skive præparater er mere almindeligt anvendt, når de undersøger CA3 til CA1 fiber fremskrivninger, formentlig på grund af deres lidt hurtigere forberedelsestid, der kan øge chancen for at opnå høj kvalitet skiver. Ikke desto mindre udgør horisontale hippocampale skivepræparater et kraftfuldt forskningsværktøj, da det giver mulighed for bevarelse og undersøgelse af alle hippocampale fiberveje inden for en skive halvkugle. Dette kan især være nyttigt, når kredsløbsresponser undersøges, for eksempel i multielektrodeanalyseoptagelser.

En stor bekymring, når man forbereder hjerneskiver, er den korrekte bevarelse af hjernevævet. Dette opnås ved flere kritiske trin i vores protokol, herunder en hurtig dissektion, den kontinuerlige og tilstrækkelige iltning og afkøling af vævet og beskyttelse af hjernevævet ved brug af den beskyttende skæremetode med en lavnatrium, høj saccharose udskæringsopløsning39,51. På trods af at den protokol, der er beskrevet her, giver en succesrate på omkring 90%, kan der være behov for potentielt yderligere beskyttelsesforanstaltninger, når man arbejder med væv, der stammer fra ældre eller genetisk forskellige dyr, eller når man forsøger at bevare en bestemt cellepopulation. Flere metoder blev allerede rapporteret for at beskytte følsomme hjernevæv præparater. Disse metoder omfatter brugen af NMDG-baserede udskæringsopløsninger til at reducere natriumgennemtrængningen52, brugen af høje magnesiumniveauer i udskæringsopløsningen for at blokere NMDA-receptoraktivitet53, og langvarig brug af beskyttende opløsninger også i restitutionsperioden23. Alle disse foranstaltninger vil resultere i en reduceret excitotoksicitet. Derudover anvendes og er en trans-cardial perfusion med iskold beskyttende ACSF-løsninger ofte ansat og nødvendig, når man arbejder med ældre dyr27.

Akutte hippocampale hjerneskiver er velegnede og flittigt anvendt til elektrofysiologiske undersøgelser af årsager som de høje amplitudesignaler, der kan opnås fra en relativt tyk (300-500 μm) akut hjerneskive, som garanterer et højt signal til støjforhold11. Standard brugte elektrofysiologiske anvendelser omfatter ekstracellulære feltoptagelser og intracellulære helcelleoptagelser i spændings- eller strømklemmetilstand. For at erhverve elektrofysiologiske data af høj kvalitet er skivesundheden af primær betydning og kan garanteres ved nøje at følge den præsenterede protokol. Da skivepræparater imidlertid frembyder en meget følsom teknik, bør der rutinemæssigt medtages et kvalitetskontrol, inden hvert forsøg påbegyndes. Flere parametre kan bruges som kvalitetskontrol af udsnittet og vurderes standard via input-output-kurver og baseline fEPSP- eller EPSC-optagelser19. Ikke desto mindre skal det bemærkes, at suboptimale elektrofysiologiske egenskaber kan opstå som følge af eksperimentelle fejl som elektrodepositionering, orientering eller endda skade og ikke kun repræsenterer den forberedte skives sundhed. Derfor er det tilrådeligt at udføre yderligere kvalitetskontroller såsom simpel visualisering og vurdering af cellerne under et 40x mål eller en DAPI-kernebejdning. Sådanne kvalitetskontroller kan bruges til at bekræfte konstant skive sundhed over flere skive forberedelse sessioner.

Calcium mikrofluorimetry præsenterer en mindre almindeligt anvendt teknik til at studere hippocampal hjerne skiver. Denne teknik er imidlertid af ekstra værdi til standard ekstracellulære og intracellulære elektrodeoptagelser, da den gør det muligt at visualisere og kvantificere intracellulære calciumfluxer, som er af stor betydning i neuronal og synaptisk signalering. Ændringer i intracellulære calciumkoncentrationer er involveret i neurotransmitter vesikel frigivelse, postsynaptisk potentiel generation, regulering af synaptisk plasticitet og axonal nerveledning54,55,56. Som en illustration af denne teknik (Figur 4), gjorde vi brug af et kommercielt tilgængeligt calciumfarvestof. Inarguably, behandling af væv skiver med calcium farvestoffer kan give vanskeligheder såsom en øget eksperimentel tidsramme samt ineffektiv belastning af lavere beliggende neuronale celler. Variationer over denne teknik kan imidlertid bruges til at omgå disse tekniske udfordringer. For eksempel er det muligt at kombinere calciummålinger og patch clamp optagelser i hippocampal skiver. På denne måde kan et calciumfluorescerende farvestof indlæses i en bestemt celle gennem plasterpipetten, hvilket gør det muligt at måle calciumdynamik i en bestemt celle af interesse57. Alternativt kan genetisk manipulerede dyr, der udtrykker calciumindikatoren, GCaMP58, enten i hele hjernen eller drevet af en cellespecifik promotor, anvendes. Interessant, hjernevæv fra GCaMP dyr med en direkte linker til et protein af interesse kunne give mulighed for at bestemme neuronale udtryk mønster eller undersøge inddragelsen i calcium gnister og bølger.

Alt i alt giver vi retningslinjerne for en vellykket forberedelse af sunde og levedygtige vandrette hippocampale hjerneskiver fra mus til elektrofysiologiske og billeddiagnotiske optagelser. Denne metode er meget nyttig til at få adgang til neurologiske ændringer, der forekommer i hjernens patologier, der er beskrevet i dentate gyrus.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker elektrofysiologienheden på VIB-KU Leuven Center for Brain and Disease Research under tilsyn af Dr. Keimpe Wierda og prof. Dr. Joris De Wit for brugen af deres forskningsfaciliteter. Desuden takker vi alle medlemmer af Laboratoriet for Ion Channel Research og Laboratoriet for Endometrium, Endometriose og reproduktiv medicin på KU Leuven for deres nyttige diskussioner og kommentarer.

Dette projekt har modtaget støtte fra Forskningsfonden-Flandern (G.084515N og G.0B1819N til J.V.) og KU Leuvens Forskningsråd (C1-finansiering C14/18/106 til J.V.). K.P. er FWO [PEGASUS]2 Marie Skłodowska-Curie Fellow og modtog støtte fra EU's Horizon 2020 forsknings- og innovationsprogram under Marie Skłodowska-Curie-tilskudsaftalen (665501) med Forskningsfonden Flandern (FWO) (12T0317N). K.H. er postdoc ved Forskningsfonden Flandern i Belgien (12U7918N).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthesia chamber home made - Generic N/A plexiglas
Anesthesia vaporizer Dräger & MSS International Ltd Isoflurane Vapor 19.3 & MSS Isoflurane to vaporize isoflurane for rodent anesthetization
Barrels for the perfusion system TERUMO Hypodermic syringes without needle https://www.terumotmp.com/products/hypodermics/terumo-hypodermic-syringes-without-needle.html
Bicuculline methiodide hellobio HB0893 https://www.hellobio.com/bicuculline-methiodide.html
Borosilcate glass capillaries Science Products GB150F-8P https://science-products.com/en/shop/micropipette-fabrication-1/capillary-glass-for-micropipette-pullers/borosilicate-glass-capillaries/borosilicate-filament-polished
Calcium chlorid dihydrate Merck 102382 https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Calcium-chloride-dihydrate,MDA_CHEM-102382?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Calcium Imaging software Till Photonics LiveAcquisition v2.3.0.18
Carbogen tank Air Liquide Alphagaz mix B50 Gasmixture CO2/O2: 5/95, purity 5
Cluster microelectrode FHC CE2C55 https://www.fh-co.com/product/cluster-microelectrodes/
Culture dish (35 mm) Corning Life Sciences 353001 https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2c/US/en/Cell-Culture/Cell-Culture-Vessels/Dishes%2C-Culture/Falcon®-Cell-Culture-Dishes/p/353001
Culture dish (90 mm) Thermo Fisher Scientific 101VR20 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/101R20#/101R20
Curved forceps Fine Science tools 11270-20 https://www.finescience.de/de-DE/Products/Forceps-Hemostats/Dumont-Forceps/Dumont-7b-Forceps/11270-20
D-AP5 hellobio HB0225 https://www.hellobio.com/dap5.html
D-(+)-Glucose monohydrate Sigma Aldrich 16301 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/16301?lang=en&region=BE
Digital CMOS camera HAMAMATSU ORCA-spark C11440-36U https://www.hamamatsu.com/eu/en/product/type/C11440-36U/index.html
Dissection scissors Fine Science tools 14058-09 https://www.finescience.de/de-DE/Products/Scissors/Standard-Scissors/Fine-Scissors-ToughCut®/14058-09
DNQX hellobio HB0262 https://www.hellobio.com/dnqx-disodium-salt.html
EMCCD camera Andor iXon TM + DU-897E-CSO-#BV https://andor.oxinst.com/products/ixon-emccd-cameras?gclid=CjwKCAjw97P5BRBQEiwAGflV6ULsKjXfhN2YZxtvsWAmF4QghyXZKuqYHVMa6KU9JyS80ATQkSKeBBoCIM0QAvD_BwE
EPC10 USB Double Patch Clamp Amplifier HEKA Elektronik 895278 https://www.heka.com/sales/brochures_down/bro_epc10usb.pdf
Filter paper VWR 516-0818 grade 413
Fine brush Raphael Kaerell 8204 Size #1
18G needle Henke Sass Wolf Fine-Ject 18G X 1 1/2" 4710012040 https://www.henkesasswolf.de/cms/de/veterinaer_produkte/produkte_vet/einmalkanuelen/hsw_henke_ject_einmalkanuelen/
Isoflurane Dechra Veterinary Products Iso-Vet 1000mg/g 250 ml bottle
Loctite 406 Henkel Adhesive technologies Loctite 406 Super glue
Magnesium sulfate heptahydrate Merck 105886 https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Magnesium-sulfate-heptahydrate,MDA_CHEM-105886?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Micromanipulator Luigs & Neumann SM-10 with SM-7 remote control system https://www.luigs-neumann.org
Microscope (for calcium imaging) Olympus BX51WI https://www.olympus-lifescience.com/de/microscopes/upright/bx61wi/
Microscope (for ephys recordings) Zeiss Axio Examiner.A1 https://www.micro-shop.zeiss.com/de/de/system/axio+examiner-axio+examiner.a1-aufrechte+mikroskope/10185/
Microscope light source CAIRN Research dual OptoLed power supply https://www.cairn-research.co.uk/product/optoled/
Monochromator Till Photonics Polychrome V
N-Methyl-D-aspartic acid (NMDA) Sigma Aldrich M3262 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m3262?lang=en&region=BE
Oregon Green® 488 BAPTA-1 Invitrogen Molecular Probes #06807 10x50ug
Osmometer Wescor 5500 vapor pressure osmometer to verify osmolarity of salt solutions
Peristaltic pump Thermo Fisher Scientific Masterflex C/L 77120-62 https://www.fishersci.be/shop/products/masterflex-peristaltic-c-l-dual-channel-pump-2/p-8004229
pH meter WTW inoLab series pH 720 https://www.geminibv.nl/wp-content/uploads/manuals/wtw-720-ph-meter/wtw-inolab-ph-720-manual-eng.pdf
Pipette puller Sutter Instrument P-1000 https://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-1000.html
Potassium chlorid Chem-lab CL00.1133 https://www.chem-lab.be/#/en-gb/prod/1393528
Potassium dihydrogen phosphate Merck 104873 https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Potassium-dihydrogen-phosphate,MDA_CHEM-104873?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Razor blade to prepare hemispheres SPI supplies Safety Cartridge Dispenser - Pkg/10 GEM Scientific Single Edge Razor Blades
Razor blade for vibratome Ted Pella Inc 121-6 double edge breakable style razor blades (PTFE-coated stainless steel)
Recovery chamber home made - Generic N/A to collect and store brain slices in (see details in manuscript)
Scissors Any company N/A Blade should be well sharpened and at least 15 cm long for easy decapitation
Silver electrode wire Any company for recording and reference electrodes
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate Merck 106342 https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Sodium-dihydrogen-phosphate-dihydrate,MDA_CHEM-106342?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Sodium hydrogen carbonate Alfa Aesar 14707 https://www.alfa.com/en/catalog/014707/
Sodium chlorid Fisher Scientific S/3160/60 https://www.fishersci.co.uk/shop/products/sodium-chloride-certified-ar-analysis-meets-analytical-specification-ph-eur/10428420
Software for field recordings HEKA Elektronik PatchMaster https://www.heka.com/downloads/software/manual/m_patchmaster.pdf
Spatula Sigma Aldrich S9147-12EA https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s9147?lang=en&region=BE
Stimulator A.M.P.I ISO-FLEX http://www.ampi.co.il/isoflex.html
Sucrose VWR International Ltd. 102745C https://es.vwr-cmd.com/ex/downloads/magazine/lupc_userguide_uk.pdf
Tubing for carbogen, perfusion and suction lines 1 Warner Instruments 64-0167 Tygon tubing (TY-50) for standard valve systems
Tubing for carbogen, perfusion and suction lines 2 Fisher Scientific 800/100/200 & 800/100/280 Smiths Medical Portex Fine Bore LDPE Tubing
Vacuum pump home made - Generic N/A
8 valve multi-barrel perfusion system home made N/A consists of barrels, tubing and a self-made automated valve control (specifications of all purchased parts can be found in this Table)
Magnetic valves (to control the perfusion lines) NResearch Inc. p/n 161P011 https://nresearch.com/
Vibratome Leica 14912000001 Semi-automatic vibrating blade microomei VT1200
Water bath Memmert WNB 7 https://www.memmert.be/wp-content/uploads/2019/09/Memmert-Waterbath-WNB-7.en_.pdf
Water purification system Merck Synergy millipore to obtain highly purified water
12-well plates Greiner Bio-One CELLSTAR, 665180 http://www.greinerbioone.com/UserFiles/File/Catalogue%202010_11/UK/3680_005-Kapitel1_UK.pdf

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Scoville, W. B., Milner, B. Loss of recent memory after bilateral hippocampal lesions. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 20 (1), 11-21 (1957).
  2. Cavarsan, C. F., Malheiros, J., Hamani, C., Najm, I., Covolan, L. Is mossy fiber sprouting a potential therapeutic target for epilepsy. Frontiers in Neurology. 9, 1023 (2018).
  3. Nadler, J. V. The recurrent mossy fiber pathway of the epileptic brain. Neurochemical Research. 28 (11), 1649-1658 (2003).
  4. Raimondo, J. V., et al. Methodological standards for in vitro models of epilepsy and epileptic seizures. A TASK1-WG4 report of the AES/ILAE translational task force of the ILAE. Epilepsia. 58, Suppl 4 40-52 (2017).
  5. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. , 86-98 (2015).
  6. Tohno, Y., et al. Relationships among the hippocampus, dentate gyrus, mammillary body, fornix, and anterior commissure from a viewpoint of elements. Biological Trace Element Research. 140 (1), 35-52 (2011).
  7. Maclean, P. D. The limbic system and its hippocampal formation; studies in animals and their possible application to man. Journal of Neurosurgery. 11 (1), 29-44 (1954).
  8. Petersen, R. P., et al. Electrophysiological identification of medial and lateral perforant path inputs to the dentate gyrus. Neuroscience. 252, 154-168 (2013).
  9. Amaral, D. G., Scharfman, H. E., Lavenex, P. The dentate gyrus: fundamental neuroanatomical organization (dentate gyrus for dummies). Progress in Brain Research. 163, 3-22 (2007).
  10. Szirmai, I., Buzsaki, G., Kamondi, A. 120 years of hippocampal schaffer collaterals. Hippocampus. 22 (7), 1508-1516 (2012).
  11. Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Current Neuropharmacology. 5 (1), 19-33 (2007).
  12. Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. Journal of Visualized Experiments. (49), e2330 (2011).
  13. Papouin, T., Haydon, P. G. Obtaining Acute Brain Slices. Bio-protocol. 8 (2), 2699 (2018).
  14. Li, Q., Han, X., Wang, J. Organotypic hippocampal slices as models for stroke and traumatic brain injury. Molecular Neurobiology. 53 (6), 4226-4237 (2016).
  15. Lo, D. C., McAllister, A. K., Katz, L. C. Neuronal transfection in brain slices using particle-mediated gene transfer. Neuron. 13 (6), 1263-1268 (1994).
  16. Lein, P. J., Barnhart, C. D., Pessah, I. N. Acute hippocampal slice preparation and hippocampal slice cultures. Methods in Molecular Biology. 758, Clifton, N.J. 115-134 (2011).
  17. Magalhaes, D. M., et al. Ex vivo model of epilepsy in organotypic slices-a new tool for drug screening. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 203 (2018).
  18. Bliss, T. The hippocampus book. Andersen, P., Morris, R., Amaral, D., O'Keefe, J. , Oxford University Press. Ch. 3 37-114 (2007).
  19. Bortolotto, Z. A., Amici, M., Anderson, W. W., Isaac, J. T. R., Collingridge, G. L. Synaptic plasticity in the hippocampal slice preparation. Current Protocols in Neuroscience. 54 (1), 11-26 (2011).
  20. Al-Osta, I., et al. Imaging calcium in hippocampal presynaptic terminals with a ratiometric calcium sensor in a novel transgenic mouse. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 209 (2018).
  21. McLeod, F., Marzo, A., Podpolny, M., Galli, S., Salinas, P. Evaluation of synapse density in hippocampal rodent brain slices. Journal of Visualized Experiments. (128), e56153 (2017).
  22. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024 (2016).
  23. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. 1183, Clifton, N.J. 221-242 (2014).
  24. Weng, W., Li, D., Peng, C., Behnisch, T. Recording synaptic plasticity in acute hippocampal slices maintained in a small-volume recycling-, perfusion-, and submersion-type chamber system. Journal of Visualized Experiments. (131), e55936 (2018).
  25. Zhou, Q., Abe, H., Nowak, T. S. Immunocytochemical and in situ hybridization approaches to the optimization of brain slice preparations. Journal of Neuroscience Methods. 59 (1), 85-92 (1995).
  26. Koike-Tani, M., Tominaga, T., Oldenbourg, R., Tani, T. Birefringence changes of dendrites in mouse hippocampal slices revealed with polarizing microscopy. Biophysical Journal. 110 (10), 2366-2384 (2020).
  27. Ting, J. T., et al. Preparation of acute brain slices using an optimized N-Methyl-D-glucamine protective recovery method. Journal of Visualized Experiments. (132), e53825 (2018).
  28. Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8 (9), 745-752 (2011).
  29. Hua, Y., Keep, R. F., Hoff, J. T., Xi, G. Brain injury after intracerebral hemorrhage: the role of thrombin and iron. Stroke. 38, 2 Suppl 759-762 (2007).
  30. Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1 (4), 2075-2081 (2006).
  31. Paxinos, G., Franklin, K. The Mouse Brain In Stereotaxic Coordinates. 3 edn. , Academic Press. 256 (2008).
  32. Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Preparation of acute subventricular zone slices for calcium imaging. Journal of Visualized Experiments. (67), e4071 (2012).
  33. Schauer, C., Leinders-Zufall, T. Imaging calcium responses in GFP-tagged neurons of hypothalamic mouse brain slices. Journal of Visualized Experiments. (66), e4213 (2012).
  34. Tetteh, H., Lee, J., Lee, J., Kim, J. G., Yang, S. Investigating Long-term Synaptic Plasticity in Interlamellar Hippocampus CA1 by Electrophysiological Field Recording. Journal of Visualized Experiments. (150), e59879 (2019).
  35. Smith, C. J., et al. Investigations on alterations of hippocampal circuit function following mild traumatic brain injury. Journal of Visualized Experiments. (69), e4411 (2012).
  36. McNaughton, B. L. Evidence for two physiologically distinct perforant pathways to the fascia dentata. Brain Research. 199 (1), 1-19 (1980).
  37. Colino, A., Malenka, R. C. Mechanisms underlying induction of long-term potentiation in rat medial and lateral perforant paths in vitro. Journal of Neurophysiology. 69 (4), 1150-1159 (1993).
  38. Coulter, D. A., Carlson, G. C. Functional regulation of the dentate gyrus by GABA-mediated inhibition. Progress in Brain Research. 163, 235-243 (2007).
  39. Kuenzi, F. M., Fitzjohn, S. M., Morton, R. A., Collingridge, G. L., Seabrook, G. R. Reduced long-term potentiation in hippocampal slices prepared using sucrose-based artificial cerebrospinal fluid. Journal of Neuroscience Methods. 100 (1-2), 117-122 (2000).
  40. Connor, S. A., et al. Loss of synapse repressor MDGA1 enhances perisomatic inhibition, confers resistance to network excitation, and impairs cognitive function. Cell Reports. 21 (13), 3637-3645 (2017).
  41. Lisman, J., et al. Viewpoints: how the hippocampus contributes to memory, navigation and cognition. Nature Neuroscience. 20 (11), 1434-1447 (2017).
  42. Moodley, K. K., Chan, D. The hippocampus in neurodegenerative disease. Frontiers of Neurology and Neuroscience. 34, 95-108 (2014).
  43. Kong, H., et al. Inhibition of miR-181a-5p reduces astrocyte and microglia activation and oxidative stress by activating SIRT1 in immature rats with epilepsy. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. , (2020).
  44. Skrede, K. K., Westgaard, R. H. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Research. 35 (2), 589-593 (1971).
  45. Schwartzkroin, P. A. Characteristics of CA1 neurons recorded intracellularly in the hippocampal in vitro slice preparation. Brain Research. 85 (3), 423-436 (1975).
  46. Wang, T., Kass, I. S. Preparation of brain slices. Methods in Molecular Biology. 72, Clifton, N.J. 1-14 (1997).
  47. Garthwaite, J., Woodhams, P. L., Collins, M. J., Balazs, R. On the preparation of brain slices: morphology and cyclic nucleotides. Brain Research. 173 (2), 373-377 (1979).
  48. Booker, S. A., Song, J., Vida, I. Whole-cell patch-clamp recordings from morphologically- and neurochemically-identified hippocampal interneurons. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51706 (2014).
  49. Aydin-Abidin, S., Abidin, İ 7,8-Dihydroxyflavone potentiates ongoing epileptiform activity in mice brain slices. Neuroscience Letters. 703, 25-31 (2019).
  50. Xiong, G., Metheny, H., Johnson, B. N., Cohen, A. S. A comparison of different slicing planes in preservation of major hippocampal pathway fibers in the mouse. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 107 (2017).
  51. Aghajanian, G. K., Rasmussen, K. Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices. Synapse. 3 (4), 331-338 (1989).
  52. Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 118-125 (2008).
  53. Reid, K. H., Edmonds, H. L., Schurr, A., Tseng, M. T., West, C. A. Pitfalls in the use of brain slices. Progress in Neurobiology. 31 (1), 1-18 (1988).
  54. Brini, M., Calì, T., Ottolini, D., Carafoli, E. Neuronal calcium signaling: function and dysfunction. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 71 (15), 2787-2814 (2014).
  55. Gleichmann, M., Mattson, M. P. Neuronal calcium homeostasis and dysregulation. Antioxidants & Redox Signaling. 14 (7), 1261-1273 (2011).
  56. Padamsey, Z., Foster, W. J., Emptage, N. J. Intracellular Ca(2+) release and synaptic plasticity: a tale of many stores. The Neuroscientist: A Review Journal Bringing Neurobiology, Neurology and Psychiatry. 25 (3), 208-226 (2019).
  57. Chen-Engerer, H. J., et al. Two types of functionally distinct Ca2+ stores in hippocampal neurons. Nature Communications. 10 (1), 3223 (2019).
  58. Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).

Tags

Neurovidenskab Problem 163 neurovidenskab hippocampus akutte hjerneskiver elektrofysiologi gnavere ex vivo
Vandrette hippocampale skiver af musehjernen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Van Hoeymissen, E., Philippaert, K., … More

Van Hoeymissen, E., Philippaert, K., Vennekens, R., Vriens, J., Held, K. Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain. J. Vis. Exp. (163), e61753, doi:10.3791/61753 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter