Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Horisontale Hippocampal skiver av musen hjernen

Published: September 22, 2020 doi: 10.3791/61753
Automatic Translation
1,2, 2, 2, *1, *1,2
1Laboratory of Endometrium, Endometriosis and Reproductive Medicine, Department of Development and Regeneration, KU Leuven, 2Laboratory of Ion Channel Research, VIB-KU Leuven Center for Brain and Disease Research, Leuven, Belgium and Department of Molecular Medicine, KU Leuven
* These authors contributed equally

Summary

Denne artikkelen tar sikte på å beskrive en systematisk protokoll for å oppnå horisontale hippocampal hjerneskiver i mus. Målet med denne metodikken er å bevare integriteten til hippocampal fiber veier, for eksempel perforant banen og den mosete fiberkanalen for å vurdere bulke gyrus relaterte nevrologiske prosesser.

Abstract

Hippocampus er en svært organisert struktur i hjernen som er en del av det limbiske systemet og er involvert i minnedannelse og konsolidering, samt manifestasjonen av alvorlige hjernesykdommer, inkludert Alzheimers sykdom og epilepsi. Hippocampus mottar en høy grad av intra- og inter-tilkobling, og sikrer en riktig kommunikasjon med interne og eksterne hjernestrukturer. Denne tilkoblingen oppnås via forskjellige informasjonsflyter i form av fiberveier. Hjerneskiver er en ofte brukt metodikk når man utforsker nevrofysiologiske funksjoner i hippocampus. Hippocampal hjerneskiver kan brukes til flere forskjellige applikasjoner, inkludert elektrofysiologiske opptak, lette mikroskopiske målinger samt flere molekylære biologiske og histokjemiske teknikker. Derfor representerer hjerneskiver et ideelt modellsystem for å vurdere proteinfunksjoner, for å undersøke patofysiologiske prosesser involvert i nevrologiske lidelser, så vel som for narkotikaoppdagelsesformål.

Det finnes flere forskjellige måter å skive preparater. Hjerneskiver med vibratom gir bedre bevaring av vevsstrukturen og garanterer tilstrekkelig oksygentilførsel under kutting, noe som gir fordeler ved tradisjonell bruk av et vevshelikopter. Videre kan forskjellige skjæreplan påføres for vibratome hjerneskiver. Her er en detaljert protokoll for et vellykket fremstilling av vibratom-cut horisontale hippocampal skiver av musehjerner gitt. I motsetning til andre skivepreparater, gjør horisontal kutting det mulig å holde fibrene i hippocampal input path (perforant bane) i en helt intakt tilstand i et stykke, noe som letter undersøkelsen av entorhinal-hippocampal interaksjoner. Her gir vi en grundig protokoll for disseksjon, ekstraksjon og akutt horisontal kutting av murine hjernen, og diskutere utfordringer og potensielle fallgruver av denne teknikken. Til slutt vil vi vise noen eksempler for bruk av hjerneskiver i videre applikasjoner.

Introduction

Den omfattende utforskningen av hippocampus startet da Scoville og Milner rapporterte manglende evne til en pasient (H.M.) for å danne nytt, deklarativt minne etter kirurgisk fjerning av hippocampus og nærliggende temporal lobe strukturer som en behandling for alvorlig epilepsi1. Fra det øyeblikket har hippocampus blitt studert mye fra generelle nevronale egenskaper og funksjoner opp til utviklingen av alvorlige hjernesykdommer, som epilepsi og Alzheimers sykdom2,3,4,5. Hippocampus er en del av det limbiske systemet, bestående av en gruppe relaterte hjernestrukturer involvert i følelser ogminnedannelse 6,7. Et tett nettverk av flere fiberveier oppnår en tett hippocampal tilkobling til interne og eksterne hjernestrukturer. Disse banene inkluderer medial og lateral perforant bane (entorhinal cortex å bulke gyrus, CA3 – CA1 og subiculum)8, den mossy fiber banen (bulke gyrus til CA3)9 og Schaffer sikkerhet / assosiasjonskommissural vei (CA3 til CA1)10 (Figur 1). Hippocampus presenterer et av de mest utforskede hjerneområdene så langt på grunn av sin høyt bevarte laminær organisering av den nevronale lagdannelsen, og muligheten til å oppnå vitale nevronale kulturer og hjerneskiver med relativletthet 5.

Figure 1
Figur 1: Tegneserie som illustrerer de forskjellige hippocampal regionene og hovedfiberbanene. De forskjellige hippocampal regionene er indikert med ensfargede linjer: entorhinal cortex (EC; svart), bulke gips (DG; oransje), Cornu Ammonis (CA) 3 (cyan), 2 (gul) og 1 (magenta), og subiculum (grønn). Fiberveier vises med en farget stiplet linje: medial (MPP, rød) og lateral perforant bane (LPP, blå) (fra entorhinal cortex til dentate gyrus, CA3, CA1, og subiculum), mossy fiber pathway (MF, fiolett) (fra dentate gyrus til CA3) og Schaffer sikkerhet (SC, brun) (ipsilateral fra CA3 til CA1)/assosiasjonelle kiosker (AC, lys grønn) (contralateral fra CA3 til CA1). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Hjerneskiverprotokoller resulterer ofte i tap av forbindelser fra fjernere hjerneområder til interesseområdet5. Videre er kapillærene ikke lenger funksjonelle5 og blodsirkulasjonen er fratatt11. Til tross for disse begrensningene brukes hjerneskiver fortsatt primært til undersøkelse av nevrofysiologiske funksjoner i hippocampus på grunn av en rekke fordeler. For det første er utvinningen av hippocampus rask12 og krever ikke mange materialer. De eneste essensielle instrumentene inkluderer et disseksjonssett, et laboratorievannbad, tilgang til karbagen og en vibrerende mikrotom (vibratom)13. Andre eiendeler av hjernen skive teknikken er omgåelse av blod-hjerne-barrieren (BBB) og utvasking av endogene utgitt molekyler før starten av eksperimentet5, noe som gjør det mulig å studere effekten av legemidler med relativt presis doseringskontroll14. Videre bevarer hjerneskiver cytoarkitekturen og synaptiske kretsene i hippocampus15,16, hvor nevroanatomien og det lokale miljøet med nevronal tilkobling og komplekse nevron-glia interaksjoner bevares4,11,17. I tillegg er hippocampal fiberforbindelser overveiende enveis og hippocampal nevroner har en høy synaptisk plastisitet, noe som enormt forenkler samlingen og tolkningen av elektrofysiologiske opptak av høy kvalitet for å forstå nevrologiskeprosesser 18,19. Viktigere, hjerneskiver presentere en verdifull ressurs som gjelder i et bredt spekter av ulike vitenskapelige teknikker, som spenner fra molekylære biologiske teknikker over imaging opptak opp til elektrofysiologiske målinger12,20,21,22,23,24,25,26.

Som beskrevet ovenfor, hippocampal hjerneskiver presentere et kraftig eksperimentelt verktøy for å studere strukturelle og funksjonelle funksjoner i synaptisk tilkobling. Dette gir mulighet til å vurdere effekten av kjemikalier eller mutasjoner på nevronal spenning og plastisitet16.

Akutte hjerneskiver preparater presenterer en relativt følsom teknikk og optimal skivekvalitet er svært avhengig av ideelle eksperimentelle forhold, inkludert dyrets alder, metoden for eutanasi, hastigheten på disseksjon og kutting, kutteløsninger og parametere (f.eks. kuttehastighet) samt betingelsene forskivegjenoppretting 4. Derfor er en godt utformet protokoll av største betydning og sikrer reproduserbarheten på tvers av ulike forskningsenheter13.

Her gir vi en detaljert protokoll for akutte horisontale hippocampal skive preparater, med sikte på å bevare integriteten til hippocampal lateral og mediale perforant banen og mossy fiber banen, slik at undersøkelse av bulke gyrus relaterteprosesser 9. Vi vil beskrive i detalj de viktigste trinnene for å dissekere, trekke ut og horisontalt skjære murine hjernen, etterfulgt av representative resultater av kalsium-mikrofluorimetriske opptak og felt excitatory postsynaptic potensielle opptak (fEPSPs) under baseline forhold og under LTP induksjonsprotokoller i hjernen skiver av vill type C57BL/6J mus.

Protocol

Alle dyreforsøk for denne studien ble godkjent av den etiske gjennomgangskomiteen i KU Leuven (Belgia) (P021/2012).

1. Fremstilling av høysukrose skive løsning og kunstig cerebrospinalvæske (ACSF)

  1. Før eksperimentell dag
    1. Forbered 1 l 10x skive pre-løsning med laboratoriegrad Type 1 vann som inneholder (i mM): 25 KCl, 20 CaCl2,10 MgSO4,12,5 KH2PO4 (Tabell 1). For å forhindre kalsiumfosfatnedbør, bland sakte kjemikaliene i et beger som er ferdigfylt med 800 ml H2O mens du stadig rører med en magnetisk rører. Oppbevar oppløsningen ved 4 °C eller romtemperatur (RT).
  2. På den eksperimentelle dagen
    1. Forbered 1 L 1 l 1x ACSF med laboratoriegrad Type 1 vann som inneholder (i mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl2,1 MgSO4,1,25 NaH2PO4,26 NaHCO3,25 Glukose (tabell 2). Bruk et damptrykk osmometer for å validere osmolariteten mellom 305–315 mOsm (pH ~ 7,55–7,6).
      MERK: For å forhindre kalsiumfosfatnedbør, bland langsomt alle faste kjemikalier i et beger som er ferdigfylt med 800 ml H2O mens du stadig rører med en magnetisk rører. Tilsett MgSO4 og CaCl2 helt på slutten, sakte dryppende i den nødvendige mengden fra 1 M lagerløsninger.
    2. Kontinuerlig boble 1x ACSF løsning ved RT med karbaogen for å sette pH mellom 7.3-7.4.
      MERK: Hvis pH-en er litt for høy eller for lav, vil små justeringer i karbaogeniseringsstyrken være tilstrekkelig. Hvis pH er høyere enn 7,45 med karbagenering, juster den ved å legge til noen dråper 1 M NaH2PO4-løsning.
    3. Forbered 250 ml (per hjerne) av 1x høysukrose skive løsning i et beger som inneholder 25 ml 10x skive pre-løsning og (i mM): 252 Sukrose, 26 NaHCO3, og 10 Glukose (tabell 3). Kontroller at osmolariteten er mellom 320–325 mOsm (pH ~ 7,55–7,6).
    4. Boble den høye sukrose skive oppløsningen i 10-15 min med karbagen for å kontrollere pH mellom 7,3-7,4.
      MERK: Hvis pH-en er høyere enn 7,45 med karbagenering, justerer du den ved å legge til noen dråper 1 M KH2PO4-løsning.
    5. Oppbevar oppløsningen med høy sukroseskive i 20–30 min i ultrafryseren (-80 °C) til den er delvis frosset.

2. Utarbeidelse av arbeidsområdet for hjernens disseksjon

  1. Under nedkjøling av den høye sukrose skiveløsningen, klargjør følgende.
    1. Varm opp vannbadet til 32 °C.
    2. Fyll oppkrevingskammeret (figur 2A) med den karbagenerte ACSF-løsningen og plasser kammeret i vannbadet. Bruk kontinuerlig karbagen på hoved ACSF-flasken og ACSF i gjenopprettingskammeret.
    3. Før dyret til det eksperimentelle rommet.
      MERK: Dyrets alder, kjønn og belastning må bestemmes av den enkelte eksperimenterer og er avhengig av det spesifikke studiespørsmålet. Imidlertid bør dyrets parametere holde seg konstante i en studie for å garantere sammenlignbarhet mellom de forskjellige eksperimentelle dagene. Denne protokollen ble designet for bruk av C57BL/6J hannmus i en alder av 2–6 uker. Hvis eldre dyr skal brukes, kan det hende at skive- og restitusjonsløsninger må tilpassestilsvarende 4,27 (f.eks. NMDG+-baserteløsninger 23,28) for å bevare hjernens helse til de akutte skivene.
    4. Forbered anestesikammeret.
    5. Legg ut silkepapir, plast Pasteur pipette med bred åpning (kuttet åpen), 90 mm kulturrett fylt med is, en firkant av filterpapir på toppen av den kjølte kulturfatet, sterk saks for halshugging, disseksjonsaks, buede tang, slikkepott, 35 mm kulturrett, fin børste, blad, prøveplate (leveres med vibratom), superlim, pipettespiss, fire stropper filterpapir (~ 2 cm x 0,5 cm) (figur 2A).
    6. Sett opp vibratomen: Programmer først vibratomen for de riktige innstillingene (bladhastighet: 0,08 mm/s, skjære amplitude: 1,4 mm, klippefrekvens: 85 Hz) og fest karbagenlinjen i skivekammeret. Deretter plasserer du skivekammeret i holderen, fyller holderen rundt skivekammeret med is og fester alt til vibratomen. Til slutt plasserer du barberbladet i vibratombladholderen (figur 2B).
  2. Etter frysing av høysukroseløsningen utfører du følgende trinn.
    1. Etter 20–30 min tar du høysukneskiven ut av -80 °C ultrafryseren og holder begeret på is.
    2. Plasser den høysukneløsningen ved siden av vibratomen på benken, knus og bland den delvis frosne løsningen med en slikkepott for å få en fin slaps og begynn å boble med karbagen.
    3. Ta opp noen høy-sukrose skive løsning med plast Pasteur pipette å suge kvadrert filterpapir på toppen av den avkjølte 90 mm kulturfat.
    4. Fyll 35 mm kulturfat (eller tilsvarende liten beholder som er egnet til å lagre hele hjernen) opptil 75% med høysukroseskiveløsningen (tilstrekkelig til å dekke hele hjernen) og kjøle kulturfatet på isen som holdes ved siden av begeret med resten av løsningen. Karbagenat løsningen i 35 mm kulturfat.

3. Disseksjon og posisjonering av murine hjernen

  1. Bedøve dyret med 5% isofluran. Bestem riktig dybde av anestesi ved å klemme poten. Ingen poteuttaksrefleks bør forekomme.
  2. Overfør dyret på silkepapir og halshugge det med sterk saks eller en liten dyrelomjotin.
  3. Bruk disseksjon saks for å kutte åpne hodebunnen.
  4. Klipp opp calvaria langs sagittalsuturen og fjern den ved hjelp av buede tang til hele hjernen, inkludert olfaktoriske pærer, er synlig.
    MERK: Vær forsiktig så du ikke skader hjernen med de skarpe kantene på calvaria eller tang.
  5. Bruk en slikkepott til å forsiktig øse ut hjernen (olfaktoriske pærer bør holde seg festet).
  6. Overfør hjernen i den avkjølte 35 mm kulturfatet og fjern alt hår eller blodpartikler fra vevet ved å vaske hjernen forsiktig med en ACSF-fylt Pasteurpipette (blod har cytotoksiske effekter på hjernevev29).
  7. Overfør hjernen ved hjelp av slikkepotten på det gjennomvåte filterpapiret på toppen av den avkjølte 90 mm kulturfatet (figur 2A).
  8. Bruk et blad til å kutte hjernen i to, skille de to halvkulene, og plasser begge halvkuler på den nykuttede mediale siden.
  9. Bruk et blad til å fjerne dorsaldelen (5 %–10 %) hjernen fra hver halvkule med et parallelt kutt til den dorsale toppen (Figur 2C)30 og plasser begge halvkulene på den nykuttede siden med ventraldelen av hjernen vendt oppover.
  10. Plasser en dråpe superlim på prøveplaten og spred ut riktig med en pipettespiss for å imøtekomme begge halvkulene.
  11. Bruk en filterpapirstropp til å plukke opp en halvkule med kapillære krefter ved å berøre ventral side med filterpapirstroppen, og dermed ikke skade vevet.
  12. Bruk en annen filterpapirstropp til å forsiktig halvtørke den dorsale siden av hjernen før du plasserer halvkule med dorsalsiden ned på toppen av limet på prøveplaten. Gjenta samme prosedyre med den andre halvkule.
    MERK: Halvkulene skal plasseres i horisontal justering på en speilet måte på vibratomplaten, med rostralsidene pekende mot utsiden og de kaudale sidene vendt (men ikke berøre) hverandre i midten. De mediale sidene av begge halvkuler skal peke mot vibratombladet og sidesidene mot eksperimentereren (figur 2D).
  13. Plasser prøveplaten i skjærekammeret og dekk den forsiktig med iskald høysukneskiveoppløsning slush. Så snart løsningen berører limet, vil det stivne og lime halvkulene til prøveplaten.
  14. Forsikre deg om at halvkulene er riktig dekket med høy-sukrose skive løsning og bekrefter at løsningen er bobler med karbaogen.
    MERK: Hele disseksjonsprosedyren skal utføres så fort som mulig. Vennligst sørg for at hjernen ikke forblir uten tilførsel av oksygen i svært lang tid. Det bør ta bare rundt 1-1,5 min fra halshugging til hjernenedsenking i høysukne skiveløsningen slaps. Dette er det mest kritiske kravet til akutte hjerneskiver for å garantere høy kvalitet på skiven.

4. Horisontal kutting av hjernen

  1. Plasser vibratombladet foran den mediale siden av halvkulene og senk det til samme høyde som ventrale sider av halvkulene som nå vender oppover. Senk bladet ved hjelp av vibratomkontrollen til 600 μm lenger i ryggretningen og begynn å kutte. Bladet skal treffe vevet (hvis ikke, reversere bladet og senke det litt mer). Skjær til de to første skivene er helt atskilt fra de to halvkulene.
  2. Snu bladet og senk ytterligere 300 μm og skjær igjen.
  3. Når hippocampus blir synlig (bruk musen31 hjerneatlas for hjelp, om nødvendig) (Figur 2E) samle skiver med utvidet plast Pasteur pipette. Samle skiver til caudate putamen blir synlig ved siden av hippocampus. Vanligvis kan mellom 8–12 skiver på 300 μm (4–6 per halvkule) samles inn for musehjernen.
  4. Bruk den plast pasteur pipette for å samle skiver og overføre dem til utvinning kammeret i vannbadet (Figur 2F) (samle skiver etter hver runde med kutting for å hindre dem fra å flyte rundt i skivekammeret).
    MERK: Arbeid så fort som mulig og sørg for at den høysukne skiveoppløsningen er iskald og karbagenert under hele prosedyren. Fyll om nødvendig isen rundt skivekammeret.

5. Gjenoppretting av hjerneskiver for elektrofysiologiske opptak

  1. La skivene stå i det ACSF-fylte oppgjenvinningskammeret i det 32 °C vannbadet i 1 time.
    MERK: Restitusjonskamre er også kommersielt tilgjengelige.
  2. Ta oppkrevingskammeret ut av vannbadet.
  3. Plasser skivene ved RT i minst 30 minutter til for gjenoppretting før du starter videre påføring.

6. fEPSP-opptak i den mediale perforante banen (MPP) på hippocampus

  1. Trekk opptakspipetter fra borosilikatglasskapillærer med en horisontal pipettetrekker for å motta pipetter på størrelse med ~ 2 MΩ når de er fylt med ACSF-løsning og nedsenket i det ACSF-fylte opptakskammeret.
  2. Fyll ACSF bad løsning og ACSF løsning som inneholder de riktige kjemikaliene (f.eks, Bicuculline) i en tyngdekraften-kontrollert multi-fat perfusjon system som er koblet til opptakskammeret. Kontinuerlig karbagenate alle løsningene.
  3. Slå på en peristaltisk eller vakuumpumpe som er koblet til et sugerør som ender på motsatt side av perfusjonslinjen i opptakskammeret. Åpne den ACSF-fylte fatet og begynn å etablere en kontinuerlig strømning (1–2 dråper per sekund). Kontroller at referanseelektroden er nedsenket i ACSF-oppløsningen.
  4. Slå på oppsettsdatamaskinen, forsterkeren, mikromanipulatoren, stimulatoren, mikroskoplampen(e), kameraet og skjermen (hvis aktuelt).
  5. Åpne riktig programvare for elektrofysiologiske opptak (flere forskjellige maskinvare- og programvareleverandører for elektrofysiologisk utstyr finnes).
  6. Overfør en hjerneskive halvkule fra gjenopprettingskammeret til opptakskammeret i skiveoppsettet og plasser den i riktig retning med dentate gyrusgranulatcellelaget og det molekylære laget i synsfeltet. Kontroller at stimuleringselektroden kan nå MPP i skiven fra retning av entorhinal cortex og at opptakselektroden har tilgang til MPP fra motsatt side fra retningen av CA3.
  7. Stabiliser skiven i opptakskammeret med en binders (figur 3A) eller et kommersielt tilgjengelig hjerneskiver.
    MERK: Det kan være nyttig å slå av perfusjonen under skiveoverføring og posisjonering. Dette bør imidlertid ikke ta for lang tid for å garantere kvaliteten på hjerneskiven.
  8. Senk og plasser opptaks- og stimuleringselektrodene i MPP i den nedre tredjedelen av det molekylære laget nær granulatcellelaget (figur 3B), vendt mot hverandre i en avstand på ca. 100–150 μm. Stimuleringselektroden skal minimalt kontakte overflaten, mens opptakselektroden skal infiltrere det øvre skivelaget litt.
  9. Påfør en stimulans med lav intensitet (30–50 μA for 0,1 ms) på hjerneskiven for å få fEPSP-signalet. Tilpass plasseringen av elektrodene om nødvendig (f.eks. lavt eller atypisk formet fEPSP-signal).
  10. Begynn å registrere Input-Output kurver: bruk økende stimulans intensiteter til hjernen skive i intervaller på 30 s.
  11. Sett stimulansintensiteten til 50 % av den maksimale fEPSP-responsen og start baseline fEPSP-opptak som bruker 50 % stimulansintensitet i 20–40 minutter i 30 s intervaller på hjerneskiven.
  12. Hvis grunnlinjen ser ut til å være stabil, fortsetter du med flere opptak (f.eks. LTP/LTD-protokoller og/eller legemiddelapplikasjoner). (For LTP induksjon i MPP, her en protokoll bestående av fire ganger 1 s 100 Hz pulser brukt i et intervall på 5 min ble brukt. Bicuculline ble påført 10 min før og under kondisjoneringsfasen.)
    MERK: Alle opptak skal utføres i gjeldende klemmemodus med passende lavpassfiltrering (<5 kHz) og samplingsfrekvenser (> 10 kHz).
  13. Pakk ut dataene i et passende filformat og analyser fEPSP-parametere, for eksempel fibervolley, fEPSP amplitude og fEPSP-helling.

7. Kalsiumavbildningsopptak av hjerneskiver

  1. Overfør en hjerneskive halvkule i et 12-brønnskammer og last den i 30 min til 1 time med et passende kalsiumfargestoff. Kontinuerlig karbagenate lasteløsningen ved å sette inn et karbageneringsrør gjennom et selvstyrt hull (med en varm 18G-nål) i lokket på 12-brønnplaten.
    MERK: Dette trinnet er ikke nødvendig i tilfelle hjerneskiver fra genmodifiserte dyr som endogene uttrykker en fluorescerende reporter som GCaMP.
  2. Klargjør opptaksoppsettet som beskrevet i trinn 6.2–6.5.
    MERK: Ingen forsterker eller mikromanipulator er nødvendig for mikrofluorimetriske bildeforsøk. Bruken av en stimulator er eksperimentavhengig. Spesifikk programvare for fluorescens imaging eksperimenter er viktig.
  3. Juster programvaren til de riktige bildeinnstillingene: Dette inkluderer kameraforsterker og binning-innstilling, innstilling av bølgelengde, eksponeringstid og tidsberegningsprotokoll. Innstillingene kan variere avhengig av de nøyaktige eksperimentene. (For eksempelspor, 1 x 1 binning, 2,4x forforsterkerforsterkning, 300 EM kameraforsterkning, eksponering på 50 ms ved 488 nm gjentatt hver 500 ms i løpet av eksperimentet ble brukt.)
  4. Etter lasting med kalsiumfargestoffet, overfør hjerneskiven fra 12-brønnen til opptakskammeret og plasser den på mikroskopstadiet.
  5. Stabiliser skiven i opptakskammeret med en binders (figur 3A) eller et kommersielt tilgjengelig hjerneskiver som ligner på det som er beskrevet i trinn 6.7.
  6. Forsikre deg om at interesseområdet er i riktig mikroskopisk felt og i fokus.
  7. Bruk fluorescensbildeprogramvaren til å velge flere områder av interesse (ROIer) på stykket.
    MERK: Det kan være nyttig å velge hele synsfeltet for å følge de generelle svingningene i lysstyrke, på grunn av fotobleaching.
  8. Start opptaket og bruk eksperimentelle testmedisiner på valgte tidspunkter.
    MERK: Det anbefales å bruke en høy K+ løsning på slutten av hvert eksperiment for å verifisere cellenes nevronale karakter og skivekvaliteten.
  9. Pakk ut dataene i et passende filformat og analyser fluorescenssignalendringene som oppstår i ROIene over hele målingen. ROIer kan også tilpasses under off-line analyse.
    MERK: Andre protokoller som beskriver fEPSP-opptak og kalsiummikrofluorimetri i hjerneskiver er tilgjengeligei litteratur 24,32,33,34,35.

Representative Results

Generell oversikt over verktøy og kritiske trinn som trengs for protokollen
Figur 2 presenterer alle nødvendige verktøy og kritiske skritt for fremstilling av horisontale akutte hippocampal hjerneskiver som beskrevet i denne protokollen. Vanligvis er det nødvendig med et begrenset antall viktige instrumenter, inkludert noen få disseksjonsverktøy og et stykke utvinningskammer (figur 2A), et laboratorievannbad og et vibratom (figur 2B). Figur 2C–E visualiserer viktige trinn og orienteringer i hjernen og halvkulene under skiveforberedelsesprotokollen. Figur 2F er en illustrasjon av et forventet resultat av horisontale hjerneskiver.

fEPSP-opptak i den mediale perforantbanen
Etter gjenopprettingsperioden kan hjerneskivene brukes til elektrofysiologiske opptak av fEPSPs. Her brukte vi et oppreist mikroskop utstyrt med et flerkanals gravitasjonskontrollert perfusjonssystem (figur 3A og figur 3B). En glassmikropipette (~ 2 MΩ) ble fylt med ACSF-løsning og festet på toppen av en kloridbelagt sølvelektrode som er montert på en operativ forsterker i krets med en klorert badelektrode. fEPSPs ble registrert og visualisert med en forsterker og passende opptaksprogramvare ved å sette glassmikropipetten inn i MPP av hippocampus i det øvre laget av hjerneskiven. fEPSPs ble indusert ved stimulering med en 2-kontakt klynge mikroelektrorod, bruke ulike gjeldende intensiteter til MPP oppstrøms av opptakelektroden. Vær oppmerksom på at denne protokollen ikke er ment å forklare hvordan du får TAK i MPP-opptak, men bruker bare opptak i MPP som et eksempel for å demonstrere suksessen til skiveforberedelsesprotokollen som er beskrevet her. Hvis noen prøver å utføre MPP-opptak, kan visse kontroller (f.eks. sammenkobling av pulsopptak) være nødvendig for å sikre riktig opptaksområde og skille MPP fra LPP8,36,37.

Figur 3C illustrerer et negativt (venstre panel, lav kvalitet skive) og positiv (høyre panel, høy kvalitet skive) eksempel på en fEPSP opptak. Den negative eksempelsporingen viser en stor fibervolley (FV) amplitude som er enda høyere enn den faktiske fEPSP amplituden (≈0,5 mV). I motsetning viser det høykvalitets skiveeksemplet (høyre panel) et lite FV-til-fEPSP-forhold og en høy fEPSP-amplitude (> 0,5 mV). Fibervolleyen er signalet som oppstår ved depolarisering av de stimulerte nevronale fibrene og går derfor foran den postsynaptiske potenseringen (fEPSP). Forholdet mellom FV til fEPSP-egenskaper gir viktig informasjon om bevaring av aksonære og synaptiske egenskaper. Høy kvalitet skiver med intakte nervefibre bør vise en høy fEPSP amplitude til FV ratio. Tvert imot vil lavkvalitets skiver med nedsatt ledningsegenskaper ha et redusert fEPSP til FV-forhold. På samme måte kan levedyktigheten til en hjerneskive analyseres ved å plotte fEPSP-bakker versus fibervolley amplitudene (figur 3D).

Videre brukes Input-Output kurver (fEPSP-helling og FV amplitude over stimulansintensitet) som standard for å bestemme skivekvaliteten. Slike kurver oppnås ved å bruke økende nåværende stimuli til hjerneskiven og ved å overvåke de påfølgende fEPSP-svarene. Hjerneskiver av lav kvalitet viser en redusert Input-Output-kurve på grunn av suboptimale ledningsegenskaper av dårlig bevart hjernevev (figur 3E, F). Videre er Input-Output kurver nødvendig for å definere det ideelle stimuleringsintensitetsområdet for undersøkelse av synaptiske prosesser. Ideelt sett bør stimulansintensiteten settes rundt 50% av intensiteten for maksimale responser. Ved denne valgte stimulansintensiteten er fEPSP-svarene svært følsomme for eventuelle endringer i synaptisk plastisitet, noe som gir mulighet til å undersøke både langsiktig potensering (LTP) og langsiktig depresjon (LTD).

For å studere synaptisk plastisitet overvåkes den synaptiske overføringen av hjerneskiven (fEPSP-hellingen) ved den valgte 50% stimulansintensiteten i lengre tid (vanligvis mellom 20–40 min) før kondisjoneringsfasen. Levedyktige hjerneskiver vil ha stabile grunnlinjer, mens hjerneskiver med en ustabil baseline ikke kan brukes til ytterligere kondisjoneringsprotokoller for å studere synaptisk plastisitet i hjernekretsene (figur 3G, øvre panel). fEPSP baseline opptak kan også være nyttig for å overvåke narkotikaeffekter på synaptisk overføring selv (Figur 3G, lavere panel). Gjennomsnittet for de registrerte fEPSP baseline signaler brukes vanligvis til å normalisere en fEPSP tidskurs og er standard satt til 100%.

Synaptisk plastisitet kan studeres ved å bruke spesifikke kondisjoneringsprotokoller på hjerneskiver. Disse protokollene avhenger av den undersøkte hjernekretsen og interessemekanismen (f.eks. LTP eller LTD). For å indusere LTP i MPP av dentate gyrus, er en sterk kondisjoneringsprotokoll nødvendig på grunn av den sterke GABAergiske hemmingen som er tilstede ved MPP-synapsene38. Det er rapportert at GABAergic hemming er enda mer uttalt i hjerneskiver tilberedt med høy-sukrose kutte løsninger39. Her bruker vi en protokoll bestående av fire stimuleringer av 1 s lange 100 Hz pulser brukt i et 5 min intervall mens den behandles med GABAA reseptorantagonisten Bicuculline (figur 3H). Samtidig tilsetning av NMDA og Bicuculline i kondisjoneringsperioden resulterer i økt LTP (figur 3H). Lav kvalitet på skiven og ustabil synaptisk overføring (fEPSP baseline) kan resultere i endret eller mislykket LTP og LTD induksjon. Derfor er det av høy betydning å arbeide med høykvalitets skivepreparater og bruke strenge ekskluderingskriterier (lavt fEPSP amplitude-fibervolleyforhold (<3), liten fEPSP-helling (<0,5 mV/ms) eller amplitude (<0,5 mV) og ustabil fEPSP-grunnlinje (endring på mer enn 5 %) for uvekelige skiver når du undersøker synaptiske prosesser.

Kalsium mikrofluorimetriske målinger i granulatcellelaget av dentate gyrus
Etter utvinning ble en hjerneskive inkubert ved romtemperatur med 2 μM av et kalsiumfølsomt fargestoff i 1 time i karbagenert ASCF, skjermet mot lys. Skiven ble overført til et opptakskammer (figur 3A) på et oppreist fluorescensmikroskop utstyrt med et flerkanals gravitasjonskontrollert perfusjonssystem. Fluorescens utslipp bilder ble anskaffet hver 500 millisekunder etter belysning på 488 nm (Figur 4A, B). Excitation ble gjort med en Xenon lampe og en skanner montert diffraksjon riste monokromator og bildeoppkjøp ble utført med et datastyrt CCD-kamera. Under målingene ble skiven behandlet med NMDA-reseptorantagonisten APV, noe som resulterte i en reduksjon i den intracellulære kalsiumkonsentrasjonen. Stimulering av skiven med en ekstracellulær løsning som inneholder en høy kaliumkonsentrasjon (50 mM) resulterte i en massiv tilstrømning av ekstracellulært kalsium på grunn av depolarisering av nevronene og åpningen av spennings-gated ion kanaler (Figur 4C).

Sammensatte Konsentrasjon (mM) Molekylvekt (g/mol) Beløp (g)
KCl (andre 25 74.55 1.86
CaCl2 * 2T2O 20 147.01 2.94
MgSO4 * 7H2O 10 246.48 2.46
KH2PO4 12.5 136.08 1.7

Tabell 1: 10 x skive pre-oppløsning (1 L).

Sammensatte Konsentrasjon (mM) Molekylvekt (g/mol) Beløp (g)
Nacl 125 58.44 7.3
KCl (andre 2.5 74.55 0.19
CaCl2 * 2T2O 2 fra 1 M CaCl2-løsning 2 ml
MgSO4 * 7H2O 1 fra 1 M MgSO4 oppløsning 1 ml
NaH2PO4 * 2T2O 1.25 156.02 0.2
NaHCO3 26 84.01 2.18
Glukose * H2O 25 198.17 4.95

Tabell 2: 1x ACSF (1 L) (osmolaritet mellom 305–315 mOsm).

Sammensatte Konsentrasjon (mM) Molekylvekt (g/mol) Beløp (g)
10x skive presolution N/a N/a 25 ml
Sukrose 252 342.3 21.57
NaHCO3 26 84.01 0.55
Glukose * H2O 10 198.17 0.49

Tabell 3: 1x høysukroseskiveoppløsning (250 ml) (osmolaritet mellom 320–325 mOsm).

Figure 2
Figur 2: Detaljert informasjon om fremstilling av horisontale hippocampal hjerneskiver. (A) Bilde av verktøy som kreves for disseksjon og kutting av gnagerhjernen: (a) ±2 cm lang og ±0,5 cm brede stropper av filterpapir (f.eks. grad 413); (b) blad; (c) super lim; (d) pipettespiss; (e) prøveplate (leveres med vibratom); (f) 35 mm kulturrett; (g) fin børste; (h) slikkepott; (i) buede tang; (j) disseksjon saks; (k) sterk saks (bladlengde over 10 cm); (l) pasteurpipette i plast med bred åpning (mellom 0,6 og 0,8 cm i diameter); (m) gjenvinningskammer (selvprodert med 250 ml beger, plastring, nylonnett, stykke en 10 ml serologisk pipette); (n) 90 mm kulturrett fylt med is og (o) firkantet filterpapir på toppen av den avkjølte kulturfatet. (B) Bilde av en vibratom med (a) holder av skivekammer fylt med is; (b) skive kammer; (c) karbaogenlinje og (d) skjære barberblad. (C) Tegneserie som illustrerer orienteringen av kuttet av den dorsale siden av en halvkule for å forberede hjernen for horisontal kutting (se trinn 3.9). (D)Isometrisk projeksjon av hjernens orientering på prøveplaten på vibratomen. (E) Tegneserie som illustrerer en toppvisning av posisjonen til de to halvkulene på prøveplaten. (F) Tegneserie som viser posisjonen til hippocampus i en horisontal hjerneskive. Dentate gyrus (DG) og Cornu Ammonis (CA)–Subiculum (SB) regioner av hippocampus er indikert. (G)Bilde av et gjenopprettingskammer med karbagenert ACSF som inneholder ti nysnittede horisontale hjerneskiver. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Elektrofysiologiske opptak av hippocampal hjerneskiver. (A) Bilde av et opptakskammer med perfusjon og suging, brukt under et oppreist mikroskop. En hjerneskive vil bli plassert i kammeret og immobilisert med et stykke bind av en binders før starten av opptakene. (B)Bright felt bilde av en hippocampal hjerne skive under en oppreist mikroskop (10x mål). Dentate gyrus (DG) og CA3-regionen er indikert, samt stimuleringen (nederst til venstre) og opptakselektroder (nederst til høyre), rettet mot den mediale perforantbanen under fEPSP-opptak. (C)Venstre: representasjon av et lavkvalitetsskiveeksempel på et fEPSP-opptak med en robust fibervolley og en liten amplitude. Høyre: høy kvalitet skive eksempel på en fEPSP opptak. Den grå linjen angir det opprinnelige nivået. De stiplede linjene peker på cut-off amplitude på 0,5 mV. (D) Plot av fEPSP skråningen versus FV amplitude for høy kvalitet (svart; n = 10) og lav kvalitet hjerneskiver (grå; n = 4). Data representert som gjennomsnittlig ± SEM. (E) Inndataplott (fEPSP-helling) for ulike stimuleringsintensiteter (μA) for høykvalitets skiver (svart; n = 10) og lavkvalitets skiver (grå; n = 4)). (F)Samme som i (E) men for FV amplitudes versus stimulans intensiteter. (G)Tidsforløpet for tre forskjellige baseline fEPSP-opptak (helling av fEPSP i %; normalisert til gjennomsnittlig fEPSP-helling på de første 5 min). Øvre panel representerer et positivt (svart) og negativt (rødt) eksempel, hvor sistnevnte har en ustabil baseline på grunn av utelatelse av karbagen under opptaket. Nedre panel viser to stabile baseline opptak i behandlet (etter 20 min stabil baseline, AMPA reseptorer ble blokkert ved påføring av AMPA reseptor antagonist DNQX (10 μM)) (blå) og ubehandlet tilstand (svart). (H) Tidsforløp for LTP-opptak for ulike behandlingsforhold (angitt i nedre panel). Svart farge for påføring av bikuculline (20 μM) under kondisjonering og blå for samtidig påføring av bicuculline (20 μM) og NMDA (10 μM) under kondisjonering. Piler i øvre panel indikerer tidspunktene der høyfrekvent stimulering ble påført (4 x 1s av 100Hz). Søylegraf i nedre panel representerer gjennomsnittlig fEPSP-bakker (%) i 50–60 min etter LTP-induksjon av eksperimentene som vises i det øvre panelet (enkeltrepresentantopptak for hver betingelse). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Kalsium-mikrofluorimetri av hippocampal hjerneskiver. (A og B) Fluorescens bilde (spent på 488 nm) (A) og tilsvarende varmekart (B) av en horisontal hippocampal hjerne skive av musen hjernen. Dentate gyrus (DG), CA3-regionen og et eksempel på en interesseregion (ROI) er angitt i panel A. (C) Tidsforløp av kalsiumresponser (F488 nm) fra en avkastning i dentate gyrus av en akutt hippocampal hjerneskive under behandling med NMDA-reseptorantagonisten APV (50 μM) og oppløsning som inneholder høyt ekstra kalium (K+) (50 mM). Sporet normaliseres til høyeste kalsiumrespons under høy K+ perfusjon og er baseline korrigert for fotografering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Selv om det ofte brukes blant nevrovitenskapssamfunnet, står hjerneskiver også overfor flere ulemper. For eksempel er inngangs- og utgangsforbindelser til hjerneområdene av interesse ikke lenger koblet i en hjerneskive. Videre, når isolert, begynner vevet å forringe sakte over tid, og denne prosessen kan endre de fysiologiske forholdene i hjerneskiven. Dette emnet er spesielt svært bekymringsfullt fordi de fleste hjernesnittopptak tar flere minutter til timer, noe som resulterer i lange eksperimentelle dager med opptak utført på vev som ble isolert opptil 6-8 timer før starten av eksperimentet. Videre blir cerebrospinalvæsken og blodsirkulasjonen avbrutt under skivepreparater, noe som kan føre til mangel på viktige endogene forbindelser i en hjerneskive. Og mest åpenbart, kutte prosedyren i seg selv kan forårsake mekanisk vev skade som kan kompromittere de oppnådde resultatene. Imidlertid er de faktiske fordelene med hjerneskivepreparater fortsatt oppveier deres ulemper, og derfor presenterer de en høyt verdsatt og ansatt teknikk i nevrovitenskapsforskning.

Akutte hippocampal hjerneskiver presenterer en kraftig og derfor mye brukt teknikk for å undersøke nevronale prosesser fra molekylært nivå opp til komplekse hjernekretsstudier. Dette er basert på den ideelle nevroanatomien til hippocampus som lett kan bevares i et stykke preparat18. Følgelig brukes hippocampal hjerneskiver i et bredt spekter av vitenskapelige forskningsprosjekter, inkludert narkotikascreening17,studier av nevronale og synaptiske egenskaper involvert i kognitivefunksjoner 40,41,og undersøkelser av patologiske hjerneforhold14,42,43. Imidlertid forårsaker et bredt spekter av forskjellige applikasjoner også et bredt spekter av tilgjengelige skiveforberedelsesprotokoller som kan variere i ulike parametere, for eksempel disseksjonsforhold og kutteplanorientering, blant andre. Derfor må det eksakte forskningsspørsmålet for et vitenskapelig prosjekt bestemmes for å velge en passende skiveforberedelsesprotokoll.

Vevshelikopteret presenterer en av de eldste brukte teknikkene for å forberede hippocampal hjerneskiver44,45. De viktigste fordelene med denne tilberedningsmetoden inkluderer den lave kostnaden for helikopteret og rask og enkel bruk46. Vevsheliko hakker forårsaker imidlertid mekanisk stress som resulterer i morfologiske endringer og celledød47. Til sammenligning er vibratomen en ganske dyr maskin, og tiden for skiveforberedelse økes betydelig, noe som kan ha innvirkning på kvaliteten på skiven. Vibratomen tilbyr imidlertid vanligvis en mer skånsom måte å skille skivene fra vevet og gjør det mulig å holde hjernen pent avkjølt og oksygenert over hele isolasjonsprosedyren, og dermed forbedreskiveegenskapene 46. Derfor bruker flere grupper vanligvis denne teknikken og har fremmet protokoller for fremstilling av akutte hippocampal hjerneskiver ved hjelp av vibratome16,30,48. Mens noen protokoller gir bare noen få detaljer for kutting seg selv, men heller fokusere på en bestemt anvendelse av slike stykkeforberedelse 48, andre gir detaljerte stykke protokoller som varierer i kutteplan eller andre protokolldetaljer (f.eks agarose innebygging eller skive / utvinning løsninger) gitt i denne artikkelen27,30.

Protokollen beskrevet her presenterer en enkel metode for å forberede høy kvalitet akutte horisontale hippocampal mus hjerneskiver fra unge dyr. Protokollen er spesielt nyttig for å bevare den perforante banen (medial og lateral) som presenterer hippocampal input pathway, som prosjekter fra entorhinal cortex til hippocampus8,49,50. Sagittal, koronar, samt isolerte hippocampus tverrgående skivepreparater ikke riktig bevare perforant banen, som stammer fra hovedsakelig Lag II og V av entorhinal cortex og prosjekter til flere områder innenfor hippocampus18. På grunn av anatomisk posisjonering av entorhinal cortex i forhold til hippocampus, er horisontale hjerneskiver en nødvendighet for å opprettholde helt intakte perforante banefibre i skivepreparatet31. I tillegg bevarer horisontal kutting ideelt de mosete fibrene som projiserer fra dentate gyrus til CA3-nevronene i hippocampus9,30,50. Derfor er denne forberedelsesmetoden av høy verdi for studier som undersøker hippocampal input pathways og DG-relaterte prosesser. I tillegg tillater denne protokollen etterforskning av Schaffer collateral pathway50. Imidlertid er sagittal og koronar hjerne skive preparater mer vanlig når du undersøker CA3 til CA1 fiber projeksjoner, antagelig på grunn av deres litt raskere forberedelsestid som kan øke sjansen for å oppnå høy kvalitet skiver. Likevel presenterer horisontale hippocampal skivepreparater et kraftig forskningsverktøy siden det tillater bevaring og undersøkelse av alle hippocampal fiberveier innenfor en skive halvkule. Dette kan være spesielt nyttig når kretsresponser studeres, for eksempel i multielektrodeanalyseopptak.

En stor bekymring når du forbereder hjerneskiver er riktig bevaring av hjernevevet. Dette oppnås ved flere kritiske trinn i vår protokoll, inkludert en rask disseksjon, kontinuerlig og tilstrekkelig oksygenering og kjøling av vevet, og beskyttelse av hjernevevet ved bruk av den beskyttende kuttemetoden med en lavnatrium, høysukrosekutteløsning39,51. Til tross for at protokollen beskrevet her gir en suksessrate rundt 90%, potensielt flere beskyttende skritt kan være nødvendig når du arbeider med vev avledet fra eldre eller genetisk forskjellige dyr eller når du prøver å bevare en bestemt cellepopulasjon. Flere metoder ble allerede rapportert for å beskytte følsomme hjernevevpreparater. Disse metodene inkluderer bruk av NMDG-baserte kutteløsninger for å redusere natriumpermeasjon52,bruk av høye magnesiumnivåer i kutteløsningen for å blokkere NMDA-reseptoraktivitet53, og langvarig bruk av beskyttende løsninger også i gjenopprettingsperioden23. Alle disse tiltakene vil resultere i redusert eksitoksisitet. I tillegg er en trans-cardial perfusjon med iskalde beskyttende ACSF-løsninger ofte ansatt og nødvendig når du arbeider med eldre dyr27.

Akutte hippocampal hjerneskiver er ideelt egnet og mye brukt til elektrofysiologiske studier av grunner som de høye amplitudesignalene som kan oppnås fra et relativt tykt (300-500 μm) akutt hjerneskive, noe som garanterer et høyt signal til støyforhold11. Standard brukte elektrofysiologiske applikasjoner inkluderer ekstracellulære feltopptak og intracellulære helcelleopptak i spennings- eller strømklemmemodus. For å skaffe seg elektrofysiologiske data av høy kvalitet, er skivehelsen av primær bekymring og kan garanteres ved å følge den presenterte protokollen nøye. Men siden skivepreparater presenterer en svært sensitiv teknikk, bør en kvalitetskontroll rutinemessig inkluderes før starten av hvert eksperiment. Flere parametere kan brukes som kvalitetskontroll av stykket og vurderes vanligvis via Inndata-utgangskurver og baseline fEPSP- eller EPSC-opptak19. Likevel bør det bemerkes at suboptimale elektrofysiologiske egenskaper kan oppstå fra eksperimentelle feil som elektrodeposisjonering, orientering eller til og med skade og representerer ikke utelukkende helsen til den tilberedte skiven. Derfor er det tilrådelig å utføre ekstra kvalitetskontroll som enkel visualisering og vurdering av cellene under et 40x mål eller en DAPI kjernefarging. Slike kvalitetskontroller kan brukes til å bekrefte konstant skive helse over flere skive forberedelse økter.

Kalsium mikrofluorimetri presenterer en mindre vanlig teknikk for å studere hippocampal hjerneskiver. Denne teknikken er imidlertid av ekstra verdi til standard ekstracellulære og intracellulære elektrodeopptak, da den gjør det mulig å visualisere og kvantifisere intracellulære kalsiumkanaler, som er av høy betydning i nevronal og synaptisk signalisering. Endringer i intracellulære kalsiumkonsentrasjoner er involvert i nevrotransmitter vesikkel frigjøring, postsynaptisk potensiell generasjon, regulering av synaptisk plastisitet og aksonalnerveledning 54,55,56. Som en illustrasjon av denne teknikken (Figur 4) benyttet vi oss av et kommersielt tilgjengelig kalsiumfargestoff. Uten tvil kan behandling av vevskiver med kalsiumfargestoffer gi vanskeligheter som en økt eksperimentell tidsramme samt ineffektiv lasting av lavere lokaliserte nevronale celler. Variasjoner på denne teknikken kan imidlertid brukes til å omgå disse tekniske utfordringene. For eksempel er det mulig å kombinere kalsiummålinger og patch klemmeopptak i hippocampal skiver. På denne måten kan et kalsiumfluoreserende fargestoff lastes inn i en bestemt celle gjennom patchpipetten, slik at målinger av kalsiumdynamikk i en bestemt celle av interesse57. Alternativt kan genmodifiserte dyr som uttrykker kalsiumindikatoren, GCaMP58, enten i hele hjernen, eller drevet av en cellespesifikk promotor, brukes. Interessant, hjernevev fra GCaMP dyr med en direkte linker til et protein av interesse kan gi muligheter til å bestemme neuronal uttrykk mønster eller undersøke involvering i kalsium gnister og bølger.

Til sammen gir vi retningslinjene for vellykket fremstilling av sunne og levedyktige horisontale hippocampal hjerneskiver fra mus for elektrofysiologiske og bildeopptak. Denne metodikken er svært nyttig for å få tilgang til nevrologiske endringer som forekommer i hjernepatologier som er beskrevet i dentate gyrus.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker elektrofysiologienheten til VIB-KU Leuven Center for Brain and Disease Research under tilsyn av Dr. Keimpe Wierda og prof. Dr. Joris De Wit for bruk av deres forskningsfasiliteter. Videre takker vi alle medlemmene av Laboratoriet for Ion Channel Research og Laboratory of Endometrium, Endometriosis and Reproductive Medicine ved KU Leuven for deres nyttige diskusjoner og kommentarer.

Dette prosjektet har mottatt støtte fra Research Foundation-Flanders (G.084515N og G.0B1819N til J.V.) og Forskningsrådet i KU Leuven (C1-finansiering C14/18/106 til J.V.). K.P. er en FWO [PEGASUS]2 Marie Skłodowska-Curie Fellow og fikk støtte fra EUs Horizon 2020 forsknings- og innovasjonsprogram under Marie Skłodowska-Curie tilskuddsavtale (665501) med Research Foundation Flanders (FWO) (12T0317N). K.H. er postdoktor ved Forskningsstiftelsen Flandern i Belgia (12U7918N).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthesia chamber home made - Generic N/A plexiglas
Anesthesia vaporizer Dräger & MSS International Ltd Isoflurane Vapor 19.3 & MSS Isoflurane to vaporize isoflurane for rodent anesthetization
Barrels for the perfusion system TERUMO Hypodermic syringes without needle https://www.terumotmp.com/products/hypodermics/terumo-hypodermic-syringes-without-needle.html
Bicuculline methiodide hellobio HB0893 https://www.hellobio.com/bicuculline-methiodide.html
Borosilcate glass capillaries Science Products GB150F-8P https://science-products.com/en/shop/micropipette-fabrication-1/capillary-glass-for-micropipette-pullers/borosilicate-glass-capillaries/borosilicate-filament-polished
Calcium chlorid dihydrate Merck 102382 https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Calcium-chloride-dihydrate,MDA_CHEM-102382?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Calcium Imaging software Till Photonics LiveAcquisition v2.3.0.18
Carbogen tank Air Liquide Alphagaz mix B50 Gasmixture CO2/O2: 5/95, purity 5
Cluster microelectrode FHC CE2C55 https://www.fh-co.com/product/cluster-microelectrodes/
Culture dish (35 mm) Corning Life Sciences 353001 https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2c/US/en/Cell-Culture/Cell-Culture-Vessels/Dishes%2C-Culture/Falcon®-Cell-Culture-Dishes/p/353001
Culture dish (90 mm) Thermo Fisher Scientific 101VR20 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/101R20#/101R20
Curved forceps Fine Science tools 11270-20 https://www.finescience.de/de-DE/Products/Forceps-Hemostats/Dumont-Forceps/Dumont-7b-Forceps/11270-20
D-AP5 hellobio HB0225 https://www.hellobio.com/dap5.html
D-(+)-Glucose monohydrate Sigma Aldrich 16301 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/16301?lang=en&region=BE
Digital CMOS camera HAMAMATSU ORCA-spark C11440-36U https://www.hamamatsu.com/eu/en/product/type/C11440-36U/index.html
Dissection scissors Fine Science tools 14058-09 https://www.finescience.de/de-DE/Products/Scissors/Standard-Scissors/Fine-Scissors-ToughCut®/14058-09
DNQX hellobio HB0262 https://www.hellobio.com/dnqx-disodium-salt.html
EMCCD camera Andor iXon TM + DU-897E-CSO-#BV https://andor.oxinst.com/products/ixon-emccd-cameras?gclid=CjwKCAjw97P5BRBQEiwAGflV6ULsKjXfhN2YZxtvsWAmF4QghyXZKuqYHVMa6KU9JyS80ATQkSKeBBoCIM0QAvD_BwE
EPC10 USB Double Patch Clamp Amplifier HEKA Elektronik 895278 https://www.heka.com/sales/brochures_down/bro_epc10usb.pdf
Filter paper VWR 516-0818 grade 413
Fine brush Raphael Kaerell 8204 Size #1
18G needle Henke Sass Wolf Fine-Ject 18G X 1 1/2" 4710012040 https://www.henkesasswolf.de/cms/de/veterinaer_produkte/produkte_vet/einmalkanuelen/hsw_henke_ject_einmalkanuelen/
Isoflurane Dechra Veterinary Products Iso-Vet 1000mg/g 250 ml bottle
Loctite 406 Henkel Adhesive technologies Loctite 406 Super glue
Magnesium sulfate heptahydrate Merck 105886 https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Magnesium-sulfate-heptahydrate,MDA_CHEM-105886?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Micromanipulator Luigs & Neumann SM-10 with SM-7 remote control system https://www.luigs-neumann.org
Microscope (for calcium imaging) Olympus BX51WI https://www.olympus-lifescience.com/de/microscopes/upright/bx61wi/
Microscope (for ephys recordings) Zeiss Axio Examiner.A1 https://www.micro-shop.zeiss.com/de/de/system/axio+examiner-axio+examiner.a1-aufrechte+mikroskope/10185/
Microscope light source CAIRN Research dual OptoLed power supply https://www.cairn-research.co.uk/product/optoled/
Monochromator Till Photonics Polychrome V
N-Methyl-D-aspartic acid (NMDA) Sigma Aldrich M3262 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m3262?lang=en&region=BE
Oregon Green® 488 BAPTA-1 Invitrogen Molecular Probes #06807 10x50ug
Osmometer Wescor 5500 vapor pressure osmometer to verify osmolarity of salt solutions
Peristaltic pump Thermo Fisher Scientific Masterflex C/L 77120-62 https://www.fishersci.be/shop/products/masterflex-peristaltic-c-l-dual-channel-pump-2/p-8004229
pH meter WTW inoLab series pH 720 https://www.geminibv.nl/wp-content/uploads/manuals/wtw-720-ph-meter/wtw-inolab-ph-720-manual-eng.pdf
Pipette puller Sutter Instrument P-1000 https://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-1000.html
Potassium chlorid Chem-lab CL00.1133 https://www.chem-lab.be/#/en-gb/prod/1393528
Potassium dihydrogen phosphate Merck 104873 https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Potassium-dihydrogen-phosphate,MDA_CHEM-104873?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Razor blade to prepare hemispheres SPI supplies Safety Cartridge Dispenser - Pkg/10 GEM Scientific Single Edge Razor Blades
Razor blade for vibratome Ted Pella Inc 121-6 double edge breakable style razor blades (PTFE-coated stainless steel)
Recovery chamber home made - Generic N/A to collect and store brain slices in (see details in manuscript)
Scissors Any company N/A Blade should be well sharpened and at least 15 cm long for easy decapitation
Silver electrode wire Any company for recording and reference electrodes
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate Merck 106342 https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Sodium-dihydrogen-phosphate-dihydrate,MDA_CHEM-106342?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Sodium hydrogen carbonate Alfa Aesar 14707 https://www.alfa.com/en/catalog/014707/
Sodium chlorid Fisher Scientific S/3160/60 https://www.fishersci.co.uk/shop/products/sodium-chloride-certified-ar-analysis-meets-analytical-specification-ph-eur/10428420
Software for field recordings HEKA Elektronik PatchMaster https://www.heka.com/downloads/software/manual/m_patchmaster.pdf
Spatula Sigma Aldrich S9147-12EA https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s9147?lang=en&region=BE
Stimulator A.M.P.I ISO-FLEX http://www.ampi.co.il/isoflex.html
Sucrose VWR International Ltd. 102745C https://es.vwr-cmd.com/ex/downloads/magazine/lupc_userguide_uk.pdf
Tubing for carbogen, perfusion and suction lines 1 Warner Instruments 64-0167 Tygon tubing (TY-50) for standard valve systems
Tubing for carbogen, perfusion and suction lines 2 Fisher Scientific 800/100/200 & 800/100/280 Smiths Medical Portex Fine Bore LDPE Tubing
Vacuum pump home made - Generic N/A
8 valve multi-barrel perfusion system home made N/A consists of barrels, tubing and a self-made automated valve control (specifications of all purchased parts can be found in this Table)
Magnetic valves (to control the perfusion lines) NResearch Inc. p/n 161P011 https://nresearch.com/
Vibratome Leica 14912000001 Semi-automatic vibrating blade microomei VT1200
Water bath Memmert WNB 7 https://www.memmert.be/wp-content/uploads/2019/09/Memmert-Waterbath-WNB-7.en_.pdf
Water purification system Merck Synergy millipore to obtain highly purified water
12-well plates Greiner Bio-One CELLSTAR, 665180 http://www.greinerbioone.com/UserFiles/File/Catalogue%202010_11/UK/3680_005-Kapitel1_UK.pdf

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Scoville, W. B., Milner, B. Loss of recent memory after bilateral hippocampal lesions. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 20 (1), 11-21 (1957).
  2. Cavarsan, C. F., Malheiros, J., Hamani, C., Najm, I., Covolan, L. Is mossy fiber sprouting a potential therapeutic target for epilepsy. Frontiers in Neurology. 9, 1023 (2018).
  3. Nadler, J. V. The recurrent mossy fiber pathway of the epileptic brain. Neurochemical Research. 28 (11), 1649-1658 (2003).
  4. Raimondo, J. V., et al. Methodological standards for in vitro models of epilepsy and epileptic seizures. A TASK1-WG4 report of the AES/ILAE translational task force of the ILAE. Epilepsia. 58, Suppl 4 40-52 (2017).
  5. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. , 86-98 (2015).
  6. Tohno, Y., et al. Relationships among the hippocampus, dentate gyrus, mammillary body, fornix, and anterior commissure from a viewpoint of elements. Biological Trace Element Research. 140 (1), 35-52 (2011).
  7. Maclean, P. D. The limbic system and its hippocampal formation; studies in animals and their possible application to man. Journal of Neurosurgery. 11 (1), 29-44 (1954).
  8. Petersen, R. P., et al. Electrophysiological identification of medial and lateral perforant path inputs to the dentate gyrus. Neuroscience. 252, 154-168 (2013).
  9. Amaral, D. G., Scharfman, H. E., Lavenex, P. The dentate gyrus: fundamental neuroanatomical organization (dentate gyrus for dummies). Progress in Brain Research. 163, 3-22 (2007).
  10. Szirmai, I., Buzsaki, G., Kamondi, A. 120 years of hippocampal schaffer collaterals. Hippocampus. 22 (7), 1508-1516 (2012).
  11. Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Current Neuropharmacology. 5 (1), 19-33 (2007).
  12. Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. Journal of Visualized Experiments. (49), e2330 (2011).
  13. Papouin, T., Haydon, P. G. Obtaining Acute Brain Slices. Bio-protocol. 8 (2), 2699 (2018).
  14. Li, Q., Han, X., Wang, J. Organotypic hippocampal slices as models for stroke and traumatic brain injury. Molecular Neurobiology. 53 (6), 4226-4237 (2016).
  15. Lo, D. C., McAllister, A. K., Katz, L. C. Neuronal transfection in brain slices using particle-mediated gene transfer. Neuron. 13 (6), 1263-1268 (1994).
  16. Lein, P. J., Barnhart, C. D., Pessah, I. N. Acute hippocampal slice preparation and hippocampal slice cultures. Methods in Molecular Biology. 758, Clifton, N.J. 115-134 (2011).
  17. Magalhaes, D. M., et al. Ex vivo model of epilepsy in organotypic slices-a new tool for drug screening. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 203 (2018).
  18. Bliss, T. The hippocampus book. Andersen, P., Morris, R., Amaral, D., O'Keefe, J. , Oxford University Press. Ch. 3 37-114 (2007).
  19. Bortolotto, Z. A., Amici, M., Anderson, W. W., Isaac, J. T. R., Collingridge, G. L. Synaptic plasticity in the hippocampal slice preparation. Current Protocols in Neuroscience. 54 (1), 11-26 (2011).
  20. Al-Osta, I., et al. Imaging calcium in hippocampal presynaptic terminals with a ratiometric calcium sensor in a novel transgenic mouse. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 209 (2018).
  21. McLeod, F., Marzo, A., Podpolny, M., Galli, S., Salinas, P. Evaluation of synapse density in hippocampal rodent brain slices. Journal of Visualized Experiments. (128), e56153 (2017).
  22. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024 (2016).
  23. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. 1183, Clifton, N.J. 221-242 (2014).
  24. Weng, W., Li, D., Peng, C., Behnisch, T. Recording synaptic plasticity in acute hippocampal slices maintained in a small-volume recycling-, perfusion-, and submersion-type chamber system. Journal of Visualized Experiments. (131), e55936 (2018).
  25. Zhou, Q., Abe, H., Nowak, T. S. Immunocytochemical and in situ hybridization approaches to the optimization of brain slice preparations. Journal of Neuroscience Methods. 59 (1), 85-92 (1995).
  26. Koike-Tani, M., Tominaga, T., Oldenbourg, R., Tani, T. Birefringence changes of dendrites in mouse hippocampal slices revealed with polarizing microscopy. Biophysical Journal. 110 (10), 2366-2384 (2020).
  27. Ting, J. T., et al. Preparation of acute brain slices using an optimized N-Methyl-D-glucamine protective recovery method. Journal of Visualized Experiments. (132), e53825 (2018).
  28. Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8 (9), 745-752 (2011).
  29. Hua, Y., Keep, R. F., Hoff, J. T., Xi, G. Brain injury after intracerebral hemorrhage: the role of thrombin and iron. Stroke. 38, 2 Suppl 759-762 (2007).
  30. Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1 (4), 2075-2081 (2006).
  31. Paxinos, G., Franklin, K. The Mouse Brain In Stereotaxic Coordinates. 3 edn. , Academic Press. 256 (2008).
  32. Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Preparation of acute subventricular zone slices for calcium imaging. Journal of Visualized Experiments. (67), e4071 (2012).
  33. Schauer, C., Leinders-Zufall, T. Imaging calcium responses in GFP-tagged neurons of hypothalamic mouse brain slices. Journal of Visualized Experiments. (66), e4213 (2012).
  34. Tetteh, H., Lee, J., Lee, J., Kim, J. G., Yang, S. Investigating Long-term Synaptic Plasticity in Interlamellar Hippocampus CA1 by Electrophysiological Field Recording. Journal of Visualized Experiments. (150), e59879 (2019).
  35. Smith, C. J., et al. Investigations on alterations of hippocampal circuit function following mild traumatic brain injury. Journal of Visualized Experiments. (69), e4411 (2012).
  36. McNaughton, B. L. Evidence for two physiologically distinct perforant pathways to the fascia dentata. Brain Research. 199 (1), 1-19 (1980).
  37. Colino, A., Malenka, R. C. Mechanisms underlying induction of long-term potentiation in rat medial and lateral perforant paths in vitro. Journal of Neurophysiology. 69 (4), 1150-1159 (1993).
  38. Coulter, D. A., Carlson, G. C. Functional regulation of the dentate gyrus by GABA-mediated inhibition. Progress in Brain Research. 163, 235-243 (2007).
  39. Kuenzi, F. M., Fitzjohn, S. M., Morton, R. A., Collingridge, G. L., Seabrook, G. R. Reduced long-term potentiation in hippocampal slices prepared using sucrose-based artificial cerebrospinal fluid. Journal of Neuroscience Methods. 100 (1-2), 117-122 (2000).
  40. Connor, S. A., et al. Loss of synapse repressor MDGA1 enhances perisomatic inhibition, confers resistance to network excitation, and impairs cognitive function. Cell Reports. 21 (13), 3637-3645 (2017).
  41. Lisman, J., et al. Viewpoints: how the hippocampus contributes to memory, navigation and cognition. Nature Neuroscience. 20 (11), 1434-1447 (2017).
  42. Moodley, K. K., Chan, D. The hippocampus in neurodegenerative disease. Frontiers of Neurology and Neuroscience. 34, 95-108 (2014).
  43. Kong, H., et al. Inhibition of miR-181a-5p reduces astrocyte and microglia activation and oxidative stress by activating SIRT1 in immature rats with epilepsy. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. , (2020).
  44. Skrede, K. K., Westgaard, R. H. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Research. 35 (2), 589-593 (1971).
  45. Schwartzkroin, P. A. Characteristics of CA1 neurons recorded intracellularly in the hippocampal in vitro slice preparation. Brain Research. 85 (3), 423-436 (1975).
  46. Wang, T., Kass, I. S. Preparation of brain slices. Methods in Molecular Biology. 72, Clifton, N.J. 1-14 (1997).
  47. Garthwaite, J., Woodhams, P. L., Collins, M. J., Balazs, R. On the preparation of brain slices: morphology and cyclic nucleotides. Brain Research. 173 (2), 373-377 (1979).
  48. Booker, S. A., Song, J., Vida, I. Whole-cell patch-clamp recordings from morphologically- and neurochemically-identified hippocampal interneurons. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51706 (2014).
  49. Aydin-Abidin, S., Abidin, İ 7,8-Dihydroxyflavone potentiates ongoing epileptiform activity in mice brain slices. Neuroscience Letters. 703, 25-31 (2019).
  50. Xiong, G., Metheny, H., Johnson, B. N., Cohen, A. S. A comparison of different slicing planes in preservation of major hippocampal pathway fibers in the mouse. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 107 (2017).
  51. Aghajanian, G. K., Rasmussen, K. Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices. Synapse. 3 (4), 331-338 (1989).
  52. Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 118-125 (2008).
  53. Reid, K. H., Edmonds, H. L., Schurr, A., Tseng, M. T., West, C. A. Pitfalls in the use of brain slices. Progress in Neurobiology. 31 (1), 1-18 (1988).
  54. Brini, M., Calì, T., Ottolini, D., Carafoli, E. Neuronal calcium signaling: function and dysfunction. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 71 (15), 2787-2814 (2014).
  55. Gleichmann, M., Mattson, M. P. Neuronal calcium homeostasis and dysregulation. Antioxidants & Redox Signaling. 14 (7), 1261-1273 (2011).
  56. Padamsey, Z., Foster, W. J., Emptage, N. J. Intracellular Ca(2+) release and synaptic plasticity: a tale of many stores. The Neuroscientist: A Review Journal Bringing Neurobiology, Neurology and Psychiatry. 25 (3), 208-226 (2019).
  57. Chen-Engerer, H. J., et al. Two types of functionally distinct Ca2+ stores in hippocampal neurons. Nature Communications. 10 (1), 3223 (2019).
  58. Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).

Tags

Nevrovitenskap Utgave 163 nevrovitenskap hippocampus akutte hjerneskiver elektrofysiologi gnagere ex vivo
Horisontale Hippocampal skiver av musen hjernen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Van Hoeymissen, E., Philippaert, K., … More

Van Hoeymissen, E., Philippaert, K., Vennekens, R., Vriens, J., Held, K. Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain. J. Vis. Exp. (163), e61753, doi:10.3791/61753 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter