Summary
介绍了制备用于表面分析的纳米颗粒的多种不同程序（滴铸，旋涂，粉末沉积和冷冻固定）。我们讨论了每种方法的挑战，机遇和可能的应用，特别是关于不同制备方法引起的表面性能变化。
Abstract
近年来，纳米颗粒由于其在医学，化妆品，化学等不同领域的潜力和应用以及它们使先进材料成为可能而受到越来越多的关注。为了有效地理解和调节纳米颗粒的物理化学性质和潜在的不利影响，需要开发经过验证的纳米颗粒各种性质的测量程序。虽然测量纳米颗粒尺寸和尺寸分布的程序已经建立，但分析其表面化学性质的标准化方法尚未到位，尽管表面化学对纳米颗粒性质的影响是无可争议的。特别是，用于表面分析的纳米颗粒的储存和制备强烈影响各种方法的分析结果，为了获得一致的结果，样品制备必须既优化又标准化。在本文中，我们详细介绍了一些制备用于表面分析的纳米颗粒的标准程序。原则上，纳米颗粒可以从悬浮液或粉末沉积在合适的基板上。硅（Si）晶圆通常用作基板，但是，它们的清洁对工艺至关重要。对于悬浮液的样品制备，我们将讨论滴铸和旋涂，其中不仅基质的清洁度和悬浮液的纯度，而且其浓度对制备方法的成功起着重要作用。对于具有敏感配体壳或涂层的纳米颗粒，沉积为粉末更合适，尽管这种方法在固定样品时需要特别注意。
Introduction
纳米材料被定义为具有1 nm至100 nm之间的任何外部尺寸或在此尺度上具有内部或表面结构的材料1。由于其小规模和相应大表面积（以及其他因素）所产生的独特性能，它们在农业，化学，汽车制造，化妆品，环境，医药，印刷，能源和纺织等广泛领域中得到越来越多的应用。这种使用的增加意味着人类和环境都将以前所未有的规模暴露于这些材料，这些材料的毒理学性质尚不完全清楚，其尺寸使其能够轻松集成到生物或环境系统中2。
在表面积和粒径/粒径分布的基本性质之后，表面化学和涂层被确定为纳米材料最关键的特性3;较小的颗粒具有更高的单位质量表面积，因此表面与体积原子的比例更高。实际上，对于1nm大小的纳米颗粒，可以在角落或边缘找到超过70%的原子;这强烈影响了表面性质，例如化学吸附，其高度依赖于原子尺度的表面形态4。涉及纳米材料的法规要求有关物理化学性质的准确数据以及对这些材料的毒理学性质的可靠估计。为了从纳米材料的物理和化学性质中有效地估计毒理学性质，纳米材料界需要可靠，标准化和经过验证的分析程序。ACEnano5等项目旨在收集和关联来自纳米颗粒的准确和可验证的物理数据，以便更好地调节和表征纳米材料。ACS Nano的编辑们也支持这种对标准化分析程序的推动，希望"巩固并商定表征方法和材料的最低分析水平6"。此外，XPS和ToF-SIMS为阐明核壳纳米粒子的粒子结构提供了新的可能性7，8。
与表1中比较的X射线光电子能谱（XPS）和飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS）是研究表面原子的成熟方法。在XPS中，样品被能量在1到2 keV之间的X射线照射，由于光电效应导致电子发射。这些发射的电子具有相同范围内的动能，与固体中电子的结合能相关;因此，在这些定义的结合能和可测量的强度下，光电子的外观允许对成分进行定量分析。由于这些光电子的平均游离途径低于10 nm，因此XPS是一种用于定量分析的高表面敏感技术。此外，对高分辨光谱中结合能的详细分析使得能够定量测定这些电子的价态。
在ToF-SIMS中，表面用聚焦离子束（初级离子）溅射，从材料中喷射的离子（二次离子）在飞行时间质谱仪中收集和分析。获得的质量/电荷图允许测定元素，同位素或分子组成。由于二次离子的平均自由通路，该技术也具有高度的表面敏感性，并且具有1-2nm的信息深度，但由于基质效应，二次离子的电离概率（因此产量）受到其周围基质的强烈影响，因此充其量是半定量的。ToF-SIMS可以在静态或动态模式下运行;两者之间的区别在于影响表面的主要离子通量。静态SIMS将初级离子通量保持在影响（即碎片）最多1%-10%表面的水平;表面保持相对不受干扰，这允许分析材料的顶层原子层。由于即使是静态SIMS也会对表面造成一些破坏，因此这两种方法被认为"非破坏性"较小。
这些表面敏感技术允许分析材料的前几纳米，包括有意或无意的涂层，对于纳米材料，这些涂层可以显着影响材料性能。有意涂层的例子包括：在量子点上封顶层以提高光致发光量子产率并降低环境反应性9，氧化铝或二氧化硅涂层用于防止防晒剂中二氧化钛纳米颗粒的光催化活性10，表面功能化以实现生物结合和随后的生物活性11，用于诊断和药物递送应用的涂层12和碳氟化合物涂层在磁性颗粒上，用于铁磁流体和核壳金属体系，以提高催化剂性能13。生物系统中的无意涂层，如氧化，表面污染或蛋白质电晕对纳米颗粒性质具有同样强烈的影响，并且至关重要的是，实验制备程序确保涂层以及更普遍的纳米材料的表面化学不被破坏或转化。评估纳米颗粒的性质也至关重要，因为它们是原位的，因为它们的性质可以通过变化而发生巨大变化2，14，15。此外，纳米颗粒悬浮液中稳定剂的浓度可以显着影响纳米颗粒的分析和结构完整性;稳定剂的存在可能导致分析中出现大的不需要的信号（例如，C，H，O和Na），而其去除可能导致纳米颗粒的损坏或团聚。
由于它们的尺寸和表面积，纳米颗粒的储存条件也会影响它们的行为，无论是作为储存的粉末/悬浮液还是作为制备的样品。各种研究表明，次优储存条件的影响，特别是室温储存和暴露在光下，会导致纳米颗粒降解，这已被证明会改变颗粒的物理，化学和/或毒理学性质14，15，16，17，18.较小的纳米颗粒已被证明比较大的纳米颗粒氧化更快，其氧化/降解速率取决于储存条件15以及表面化学14。储存过程中纳米颗粒降解的影响已被证明会显着影响物理化学性质，包括毒性14，而氧化生长可以以牺牲核心为代价向内进行15。
因此，仔细储存和制备纳米材料对于准确的表面分析至关重要，并且应仔细考虑可能影响样品表面和/或测量质量的任何因素。应该注意的是，由于XPS（在μm范围内）和ToF-SIMS（几百nm）的空间分辨率相对较低，因此只能研究纳米颗粒的一小部分;这些方法在一个区域内平均，并且不具备像电子显微镜等技术那样对单个粒子进行成像的能力。因此，任何分析都需要将纳米颗粒沉积在连续层中，以确保没有来自基板的干扰。因此，电子显微镜和XPS / ToF-SIMS通常一起用作纳米材料分析的补充方法。
除了表面化学的变化之外，制备用于XPS和ToF-SIMS分析的纳米颗粒样品的主要挑战是制备一层：均匀的，以提高可重复性;无间隙，以尽量减少基板对光谱的贡献;足够薄以避免充电效应（对于非导电样品）;并牢固地固定在基板上，以避免自由纳米颗粒进入并损坏超高真空仪器
纳米颗粒可以从悬浮液或粉末沉积到基板上。首先，我们将讨论从悬浮液中沉积纳米颗粒的不同方法。硅晶片是悬浮沉积常用的衬底，因为它们相对便宜，很容易作为由纯硅或掺杂硅组成的高纯度产品（掺杂避免充电效应），并且对于大多数纳米颗粒，光谱峰不与纳米颗粒的典型峰重叠。这最后一点是重要的。在分析之前，应确保衬底峰与纳米颗粒的预期峰值很好地分离，否则光谱的解释是复杂或不可能的，并且无法验证纳米颗粒对衬底的连续覆盖。在使用硅晶圆之前，需要广泛的清洁程序（如本出版物所述）以去除（有机）污染物并提高表面润湿性。其他合适的基材，如金膜，高序热解石墨（HOPG）或铟箔已被成功使用，但关于其制备的讨论超出了本工作的范围19，20，21，22。
其次，我们提出了在基板上沉积纳米颗粒粉末的方法，用于XPS和ToF-SIMS分析，并介绍了每种方法的优缺点，使该技术的研究人员能够找到适合其目的的最佳制备方法。第三，我们讨论了冷冻固定，这是一种合适的制备方法，可以保存诸如团聚行为，有机电晕，固体/水界面23，24 或NPs生物介质25 中的分布等特征。该过程不会导致冰晶形成，但会形成无定形冰，使膜以及细胞和组织结构保持其天然生物状态，避免水结晶过程造成的损害，并使所有细胞代谢物和细胞膜化合物的精确化学分布得以维持26，27，28.该制备方法对于呈现实际NP附聚物或杂凝聚物的精确化学图谱，在悬浮液中直接在纳米颗粒附近可视化精确化学空间，或关联NP附聚物或杂聚物内的细胞组织特异性特征或细胞内区室可能特别感兴趣。
通过本工作中呈现的结果所示，在特定情况下最合适的程序取决于各种参数，例如纳米颗粒的亲水性，稳定性，导电性，状态（例如，粉末或悬浮液）和手头的分析问题（例如，尺寸，体积性质或表面涂层）。这里介绍了可用于制备用于表面分析的NP的各种方法，以及其优缺点的比较。
Protocol
注意：纳米颗粒的毒理学性质仍在研究中;由于它们的大小，即使它们由本质上无害的材料组成，它们也会在人类和环境中产生独特的危害。在对纳米颗粒进行任何工作之前，应完成适当的风险评估，并根据要研究的材料的危险水平，适当的工程控制，实验室程序和PPE（个人防护设备）到位29，30，31，32。
1. 硅晶圆的制备
注意：这些步骤对于去除不需要的（有机）污染物并增加表面润湿性是必要的。所有使用的溶剂应至少为ACS级。标准超声处理浴（35 kH 和 120 瓦）是合适的。
- 硅晶圆的湿化学清洗
- 将Si晶片放入装有异丙醇的烧杯中，并超声处理5分钟。
- 将Si晶圆转移到带有碱玻璃清洁溶液的烧杯中，并超声处理10分钟。
- 将威化片放入装有超纯水的烧杯中。通过倒出水并重新填充烧杯来更换水10次;由于毛细管效应，Si晶圆将保持在底部。
- 用干净的N2 气体干燥晶圆。
注意：用N2 干燥可防止水干燥形成"咖啡环"和其他伪影。 - 将晶圆放入第二个烧杯中，用异丙醇和超声波灭菌10分钟。
- 用干净的N2 气体干燥晶圆。
- 将晶圆放入装有乙醇的烧杯中，并超声处理10分钟。
- 用干净的N2 气体干燥晶圆。该协议可以在此处暂停。
- 硅晶圆的等离子或紫外线/臭氧清洗
- 将硅晶圆引入等离子体或紫外线/臭氧清洁剂中，然后打开30分钟。
注：晶圆在使用前应立即进行等离子或紫外线/臭氧清洗。
- 将硅晶圆引入等离子体或紫外线/臭氧清洁剂中，然后打开30分钟。
2. 悬浮液沉积纳米颗粒
注意：纳米颗粒最常见的暴露途径是吸入。使用悬架可以最大限度地减少暴露危险。
- 粉末纳米颗粒悬浮液的制备
注：此处描述的所有数量均为示例。该方法应针对每种情况下使用的特定纳米颗粒进行优化。- 将15mg纳米颗粒粉末（±10%）准确地称量到10mL管中。
- 在约 8 mL 超纯水中准确称量。
- 关闭管，用纸巾包装在50 mL离心管中，以3，000rpm的速度放入涡旋器中15分钟。
- 从水悬浮液中滴铸导电纳米颗粒
- 将晶圆放入紫外线/臭氧清洁剂中30分钟。
- 将晶圆置于晶圆支架的一半中，并在环的中心放置3μL纳米颗粒悬浮液。
- 将直径为6.07 mm的Viton O形圈安装在液滴周围的晶圆上。注意戒指不要接触液滴。
- 将晶圆置于真空干燥器中，在4 mbar的真空下干燥15分钟以干燥晶圆。
- 从干燥器中取出晶片，并使用光学显微镜和XPS进行检查，以确定颗粒层是均匀和封闭的。重复步骤 2.2.1 和 2.2.2，直到分析显示一个封闭且均匀的层。该协议可以在此处暂停。
- 水悬浮液中电非导电纳米颗粒的旋涂
- 将晶圆放入紫外线/臭氧清洁剂中30分钟。
注意：通过使用相同的方案对不同浓度的悬浮液进行旋涂，可以实现不同水平的表面覆盖。 - 对旋转涂布机进行编程。一个合适的示例程序是：步骤1：500 rpm / s斜坡到1，000 rpm（5 s）;第 2 步：1，000 转/秒斜坡至 2，000 转/分（3 分钟）;第 3 步：以 2，000 rpm/s 至 0 rpm 的速度减速。
- 将晶圆插入旋涂机，打开真空进行固定。
- 将80μL悬浮液沉积在晶圆上并开始程序。
- 从旋涂机中取出晶圆。
- 将样品储存在新的、干净的晶圆托盘中。该协议可以在此处暂停。
- 使用SEM分析样品，以确认基板的无间隙覆盖。
- 将晶圆放入紫外线/臭氧清洁剂中30分钟。
3. 从粉末中沉积纳米颗粒
- 纳米颗粒沉积在双面胶带上（"粘住就走"）
- 将双面胶粘剂固定在样品架上，然后取下衬垫。
- 取纳米颗粒粉末的刮刀尖端，并将其浸入粘合剂上。
- 将样品铺在粘合剂上，并用刮刀压入粘合剂中，直到尽可能多的粉末粘附。
- 通过倒置和敲击样品架，并通过吹过样品架的气体流（例如氮气）来检查粉末是否固定在水龙头上。该协议可以在此处暂停。
注意：或者，可以将少量粉末放在清洁的表面上（铝箔或载玻片），然后用粘合剂和双面样品架从上方压制。 - 将粉末的刮刀尖端放在清洁的表面上。将带有粘合剂的样品架从上方压到粉末上。
- 通过倒置和敲击样品架，并通过吹过样品架的气体流（例如氮气）来检查粉末是否固定在水龙头上。该协议可以在此处暂停。
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压制粉末颗粒的制备
- 彻底清洁颗粒模具的所有部分，注意不要划伤抛光表面。
- 倒置沉淀模具并放在一个小垫片上。
- 插入柱塞和一个不锈钢颗粒，抛光面朝上，并将柱塞拉过，直到有足够的空间填充粉末样品。
- 用少量样品（1个大铲头）填充模具，然后插入第二个不锈钢沉淀，抛光面朝向样品。
- 将底座放在身体上，小心地倒置。如果需要真空并且可用，请将真空泵连接到颗粒模具的底部。
- 将模具放入压力机中，确保其居中。
- 施加轻负荷（2 kN）约20秒并释放。
- 施加较重的负载（6 kN）2分钟并释放。
- 释放负载后，释放真空泵。
注意：由于各种纳米颗粒的材料性质不同，制备一系列具有不同载荷和载荷时间的颗粒以确定最佳颗粒压制条件可能是有利的。 - 倒置模具，将提取环放置到位，并在柱塞和提取环之间放置轻负载（最大1 kN）。
- 从压机上取出模具部件，并用镊子小心地提取样品沉淀。
- 使用双面粘合剂将样品轻轻地安装在清洁的Si晶圆上。该协议可以在此处暂停。
4. 纳米颗粒悬浮液的冷冻固定
- 用液氮填充快速冷冻装置的主腔。
- 用冷冻剂（丙烷）填充冷却的快冻室。
- 让快速冷冻设备冷却至其工作温度。
注：在样品制备之前，快速冷冻装置需要一些时间才能达到工作温度，因此冷冻固定样品需要合理的时间范围（几个小时）。 - 用移液器将10-20μLNP悬浮液滴铸到清洁的Si晶圆上。
- 用固定镊子握住硅晶圆，将其放入陷入式冷冻装置内。
- 将固定镊子移动到切入位置。
- 按下按钮将样品放入制冷剂内。
- 等待几秒钟，直到样品完全冻结。
- 将冷冻样品尽可能快地转移到冷却环境中。
- 将冷冻固定的样品（硅晶圆）放入样品架中，并将其转移到仪器内。
注意：对于运输，建议使用干冰，并且可以短期储存样品。样品可以在冷冻状态下使用冷却仪器或在稳定后通过冷冻干燥样品来测量样品。
Representative Results
本文提出了用于纳米颗粒表面分析的多种样品制备方法。由于特定NP的物理化学性质将定义样品制备的最佳方法（例如，滴铸与旋涂）和该方法的最佳程序（例如，需要不同的基底或溶剂），因此应通过替代分析方法验证所用方法的适用性，并在必要时进行优化。本出版物中看到的结果与先前发表的文献一致，表明需要一致的样品制备方案和程序，以及需要进行质量检查，以确保样品制备和纯化方法是适当的，成功的，并且不会损坏纳米颗粒22，33，34，35，36。
这里没有涉及NP的抽样和储存方法，因为其他各种参考资料14、15、16、17、18、34、37、38、39对此作了详细描述。当然，应该非常小心，分析的样品代表了整体纳米颗粒分布以及开发和验证的适当采样方法。储存条件也被证明在几个月的时间内强烈影响纳米颗粒的性质，因此应仔细考虑。例如，我们建议纳米颗粒应少量储存在远离光线的密封容器中，理想情况下低于4°C。 同样重要的是，根据经过验证的程序始终如一地进行存储，采样和样品制备，并详细记录。此文档应包括来自 NP 本身的元数据，例如出处信息和存储条件40。电子实验室笔记本（ELNs）等工具可用于一致地记录程序和NP元数据，以及根据FAIR原则（可查找，可访问，可互操作和可重用）生成数据。
NPs的准确和正确的表面分析首先需要合适的基材选择。我们使用清洁的硅晶片作为基板，因为它们易于获得，耐用，易于清洁，导电且足够平坦，但是根据分析的目标，氧化物表面层可能是一个缺点，因为基板上的外来碳氢化合物无法与纳米颗粒上的碳氢化合物区分开来。必要时，可以使用其他材料，例如硅晶圆，Si3N4晶圆或HOPG（高度取向的热解石墨）上的金或聚合物涂层19，20，21，22。本文中描述的样品制备的第一步是清洁Si晶圆，如图1所示的示意图。清洗过程的功效可以通过包括XPS在内的多种方法进行验证，如图2所示。主要污染物（外来碳）是储存在空气中的样品的典型污染物，并且在清洁过程后显着减少。此外，通过UV或臭氧处理使晶圆表面羟基化，通过增强润湿性并导致纳米颗粒的更均匀分布，从而避免了水悬浮液沉积的咖啡环效应，如图3所示。可根据需要使用硅晶圆的替代湿化学清洗方法;这里只需要一个可重复清洁的表面，而不是完全去除所有有机污染物或氧化层。如果在清洁和悬浮沉积步骤之间暂停方案，则应在等离子体或UV /臭氧下再次处理晶圆，并且在处理后的15分钟内理想地沉积悬浮液。
第2.2节所示的60 nm Au-Ag核壳纳米颗粒的悬浮液含有大量的柠檬酸钠作为稳定剂，这在纳米颗粒悬浮液中很常见。为了准确分析这些颗粒及其表面特性，特别是通过XPS，应尽可能多地去除稳定剂，因为它会衰减来自纳米颗粒的信号并引起充电效应。为了建立这些纳米颗粒的最佳纯化方法， 如图4所示的SEM显微照片，它们要么在超纯水中透析，要么使用离心和一式三份的再分散进行纯化。虽然透析似乎是一种更温和的方法，离心和再分散更容易引起颗粒的团聚和聚集，但SEM图像显示透析后Au-Ag纳米颗粒的显着变形和损伤（图4B），而离心/再分散的颗粒仍然完好无损（图4C).这在金属纳米颗粒中尤其显着;我们的假设是，有一个最佳量的柠檬酸钠，可以使溶液稳定，同时不干扰纳米颗粒的信号，并且去除过多的稳定剂会对纳米颗粒造成损害。以前的一份报告显示，有最佳的离心循环次数来去除大部分柠檬酸钠;超过此数字会导致一些 NP 聚合33。在这项研究中，需要九个透析循环（总共36小时）才能获得相似的柠檬酸盐浓度;然而，这种方法导致比离心更多的聚集量，并导致表面功能化的降低。这些结果表明了验证每种不同类型纳米颗粒的制备过程中每个步骤的重要性，特别是对于未知样品。
本例中使用的60 nm Au-Ag核壳纳米颗粒由于其导电性而适合滴铸，因为充电效应不是问题，并且使用相对较少的设备重复沉积可以产生厚斑。这种较厚的层具有提供更多可重复测量的优点，并且通过减少沉积步骤的数量来从更浓缩的悬浮液中浇注可以节省时间。沉积受基底润湿性的影响;润湿性差会产生较厚的纳米颗粒斑点，这对导电样品有利，而良好的润湿性可以产生更均匀的纳米颗粒层，这对于导电和绝缘样品都很有用。如协议所述，纳米颗粒悬浮液的滴铸通常需要重复应用以获得具有完全覆盖的厚层;这应该使用XPS进行验证，但也可以使用光学显微镜快速轻松地进行验证。 图5 显示了从水溶液中滴铸的Au-Ag核壳纳米颗粒中液滴覆盖的演变;在这种情况下，需要13个下降铸造步骤才能实现全覆盖。滴铸特别适用于导电颗粒，或可以充分补偿充电效应的颗粒。与本出版物中描述的其他方法一样，应针对每个样品优化滴铸，因为不同的NP材料在信息深度和浓度以及薄膜厚度限制方面具有不同的特性。重要的是要避免太厚的薄膜，这可能导致有机物堆叠，从而抑制NP信号。
均匀和高质量的涂层有助于确保一致和可重复的结果。除了悬浮液浓度、溶剂和旋涂参数外，旋涂悬浮液的质量也会受到灰尘或其他大型宏观或微观颗粒存在的负面影响。 图6 显示了用0.45μm注射器过滤器过滤后纳米颗粒悬浮液的纺丝涂层质量的改善。应选择过滤器以确保它不会从悬浮液中除去纳米颗粒。在相同条件下对方案中描述的三种不同的悬浮液浓度（90，9.0和0.9mg / mL的135 nm PS-PTFE核壳纳米颗粒）进行旋转铸造，并使用SEM和XPS进行分析。 图7 中的顶部图像和光谱显示了90 mg / mL悬浮液的胶片投射，其显示SEM图像中厚而无间隙的多层覆盖以及CPS光谱中明显没有Si峰，表明基底对光谱没有贡献。此示例非常适合 XPS 或 ToF-SIMS 分析。此外，在没有来自基板的大信号的情况下，可以清楚地看到来自颗粒壳的较小的F1s峰。从9.0 mg / mL悬浮液中浇铸的第二个样品显示颗粒在小的单层附聚物中，其不完全覆盖表面。此样品对于 XPS 或 ToF-SIMS 分析来说太薄且不均匀。此外，即使在仔细清洁后，由于外来碳对基材的贡献，定量分析也可能受到损害。至少，必须在测量的不确定性预算中考虑这种影响。然而，该样品非常适合使用图像分析软件对颗粒尺寸分布进行SEM或TEM分析，因为颗粒存在于单个层中并且数量足够多（在图像中）以提供具有统计显着性的评估。从最低浓度（0.9 mg/mL）开始的样品铸件既不能提供连续的覆盖，也不能提供足够的颗粒密度，使其适用于表面化学或粒径分布的分析。由于底物的主导影响，根本不可能进行可靠的定量分析。
采用"粘即走"法，采用悬浮液和粉末滴铸法制备了PDMS或甘油外层的Al2O3-TiO2核壳NP，以比较不同制备方法对敏感外层的影响。使用ToF-SIMS分析样品，其中光谱使用主成分分析（PCA）进行分析。PCA是一种统计技术，用于通过创建新的不相关变量（主成分）来降低大型数据集的维数，从而最大化数据中的方差41，42，43，44，45。在主成分图上分离不同的样本集可以更容易地分析和分组结果。在图8B中的PCA评分图上，该图显示了每个数据集与所有其他数据集（即不同样本集之间）相比的辨别能力，由粉末制备的两个样品显示出非常不同的分数，而从分散制备的样品显示出非常相似的分数。图8C所示的载荷图显示了变量之间的关系，即哪些峰值对各自的主成分贡献最大。所有主成分都根据其对数据集之间观察到的差异的贡献进行排序，即PCA1对不同数据集的观察到的分离贡献最大。PC1主要由PDMS峰的存在（PDMS包被的NP）或不存在（所有其他样品）PDMS峰为主，而PC2是数据集中第二大变异的因子，能够区分Al2O3和NP上的有机封顶。这表明从悬浮液中制备的NPs的测量光谱非常相似，并表明PDMS和甘油层可能已被悬浮液本身或干燥过程的制备去除或损坏，其主要信号来自Al2O3或TiO2。
虽然压制颗粒可以为制备粉末样品提供优势，例如易于处理和超高真空仪器的稳定性（包括溅射而不在高真空室中移出NP的能力），但所涉及的高力也可能损坏敏感的纳米颗粒，正如已经看到的那样。应准备并验证合适的方案。
在NP分散体的情况下，滴铸样品悬浮液的冷冻固定避免了咖啡环效应（因为NP悬浮液的瞬时固定，因此消除了干燥效应）以及保留悬浮液中存在的较大结构。此外，还避免了胶带的应用。这反过来又反映在减少的信号中，这可能归因于盐，污染物或相应质谱中样品制备过程的其他伪影，如图9所示。冷冻固定的主要优点是能够"按原样"保存纳米颗粒和/或颗粒附聚物或杂聚物的化学实体周围的化学空间，以及它们与组织或单个细胞内的生物学特征的相关性，甚至对细胞内区室的共定位，而不会受到样品处理步骤（如干燥）的干扰， 落铸等46'47。我们已经证明了冷冻固定技术在当前论文中的适用性，并强调了冷冻固定对TiO2纳米颗粒的优势。我们强调，冷冻固定特别适用于分析自然状态下的生物样品，而不会因样品制备伪影而导致化学物质错位。有关生物样品固定技术的更深入信息，请参阅文献19，25，27，48，49。
| 断续器 | 托夫-模拟人生 | |
| 探头光束 | 光子 | 离子 |
| 分析光束 | 电子 | 离子 |
| 空间分辨率* | > 1 μm | 0.1 微米 |
| 采样深度 | 0.5 – 7.5 纳米 | <2 海里 |
| 检测限 | 0.01 -0.1原子 % | ppb |
| 量化 | 优秀（半定量） | 具有挑战性（矩阵效应） |
| 信息内容 | 元素 化学键合 |
元素 分子的 |
| 有机分析 | 非常好 | 在静态模式下表现出色 |
| * 由制造商指定 | ||
表1：各种表面分析方法的比较。
| 方法 | 适用于 | 给 | 优势 | 弊 | 谨慎 | 控制 | 检查 |
| 透析 | 纯化 | 去除稳定剂/杂质 | 简单、省力、无复杂设备 | 缺乏对过程的控制 | 可能对纳米颗粒造成损害 | 时间 | 纳米颗粒损伤（扫描电镜） |
| 离心/再分散 | 纯化 | 去除稳定剂/杂质 | 更好地控制过程，同时浓缩 | 劳动密集型，需要离心机 | 可能导致聚集或聚集 | 离心机转速、溶剂量 | 纳米颗粒的团聚/聚集/损伤（SEM） |
| 滴铸（悬挂） | 无敏感外层的导电NP | 相对较厚的涂层斑点 | 简单，没有复杂的设备 | 可赋予不均匀的厚度，时间密集 | 悬浮液制备可能会损坏敏感的NP外壳 | 悬浮液浓度、溶剂（基质润湿性） | 覆盖范围（光学显微镜/XPS） |
| 旋涂（悬浮液） | 无敏感外层的导电或非导电NP | 薄的均匀层，或单个颗粒 | 一致的设置 | 需要通过实验确定最佳参数 | 过滤掉灰尘/杂质，覆盖范围可能不一致 | 浓度、旋涂参数、溶剂 | 预过滤、覆盖、层厚（扫描电镜/XPS） |
| "坚持和去"（粉末） | 具有敏感外层的无机导电和非导电NPS | 胶粘剂上的粉末斑点 | 简单、省力、无复杂设备 | 不适用于有机或含C的NPs，薄膜厚度不一致 | NP释放到仪器中的危险 | 将 NPs 固定到粘合剂上 | 高真空条件下的稳定性 |
| 沉积在短截面（粉末）的孔中 | XPS分析;导电/非导电有机或无机颗粒 | 轻压纳米颗粒样品 | 不与其他材料接触 | 没有安全固定的NP;不适用于 ToF-SIMS | NP释放到仪器中的匕首 | 没有 | 轻轻向侧面倾斜，确保粉末被压实 |
| 压制颗粒（粉末） | 导电和非导电NPS，聚合物NP | 固体颗粒 | 能够以粉末形式分析聚合物NP | 可能损坏或污染NP表面 | 应彻底清洁材料，以避免表面污染;可能损坏表面 | 尺寸、压力、时间 | 高真空条件下的稳定性 |
| 冷冻固定（悬浮液） | 具有敏感配体层的NP悬浮液;生物样品 | 固体样品 | 保存形态，天然生物状态和日冕，减少咖啡环效应 | 复杂而昂贵的制备和样品处理，需要熟练的用户 | 样品处理和样品储存所需的高度技能 | 浓度、液滴大小、温度 | 玻璃化保存 |
表2：不同样品制备方法的比较。
图1：硅晶圆的清洗工艺。请点击此处查看此图的放大版本。
图2：硅晶圆清洗前后的XP光谱。 清洁前（灰色）和（红色）后的调查显示碳量从13%下降到2%。光谱是用具有单色Al Kα辐射的Kratos Supra DLD（英国曼彻斯特）获得的。将样品用双层胶带固定在样品架上，通过能量为80 eV，步宽为1 eV，停留时间为500 ms。使用了"混合镜头模式"。X射线光斑尺寸为300 x 700 μm²。一把泛光枪被用于充电补偿。对于定量分析，使用软件包UNIFit 202050 ，使用用Tougaard背景校正的相应光电子峰的峰面积，并使用斯科菲尔德因子，非弹性均值游离通路和透射函数归一化。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：紫外线/臭氧清洗对 水悬浮液中PTFE-PMMA核壳纳米颗粒滴铸中颗粒分散均匀性的影响。用紫外线/臭氧清洁的晶圆显示出咖啡环的显着减少，以及颗粒对表面的更好附着力。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4：从纳米颗粒悬浮液中去除杂质（例如稳定剂）的处理方案 SEM图像显示了透析（右上）以及一式三份（右下）在60 nm Au-Ag核壳纳米颗粒上的离心和再分散效果。透析明显损坏了纳米颗粒，而离心则没有明显的影响。所有比例尺均为 100 nm。 请点击此处查看此图的放大版本。
图5：从 水悬浮液到硅晶片上的60nm直径Au-Ag核壳纳米颗粒的滴铸的光学显微镜图像，显示13滴后有足够的覆盖。 请点击此处查看此图的放大版本。
图6：旋转涂层纳米颗粒悬浮液，在（左）和后（右） 用0.45μm注射器过滤器过滤。过滤后质量的提高可以清楚地看到。 请点击此处查看此图的放大版本。
图7：各种浓度下PMMA-PTFE核壳纳米粒子的扫描电镜图像和XPS光谱，显示了底物峰（由于覆盖不足）对XPS光谱的影响。请点击此处查看此图的放大版本。
图8：主成分分析（PCA）评分图，源自甘油和PDMS包被的Al2O3-TiO2核壳NP的ToF-SIMS光谱。 （一）NP结构示意图;（B）分数和（C）ToF-SIMS分析后滴铸（分散）和"粘合"（粉末）制备方法的加载图。PC1表示与PDMS片段相关的峰值;PC2用有机涂层（由粉末制备的样品）从Al2O3峰中分离样品，似乎没有表面涂层。在 IONTOF ToF-SIMS IV 仪器（ION-TOF GmbH，明斯特，德国）上，在光谱模式 （HCBU） 下，使用 25 kV Bi3+ 离子束测量光谱，最大剂量密度为 1012 离子/cm2。在锯齿模式下扫描150 x 150 μm的视场，像素为125 x 125像素。请点击此处查看此图的放大版本。
图9：TiO2 NPs的ToF-SIMS质谱部分。 （A）用"棒即走"法制备的粉末和（B）冷冻后再分散NP。一个ToF-SIMS仪器（离子TOF V;Ion-TOF GmbH，德国明斯特）用于使用脉冲30 keV Bi3 +液态金属离子枪（LMIG，直流（直流），16 nA）进行质谱分析。通过扫描500×500μm样品区域的离子束来获取每个光谱。使用106个Bi3 +脉冲在0-1，200 Da的质量范围内获得正二次离子。请点击此处查看此图的放大版本。
Discussion
已经提出了许多使用XPS和ToF-SIMS制备用于表面分析的纳米颗粒的方法。我们在 表2中总结了这些方法的优缺点，以及误差的可能来源和不同材料的适用性。如代表性结果所示，纳米颗粒的制备可以强烈影响所得表面分析的成功。此外，由于信号干扰基板或安装材料，非导电厚膜中的充电效应，纳米颗粒作为粉末或悬浮液的状态，敏感外层的潜在损坏，生物结构的破坏以及聚集和界面上的信息，或敏感的超高真空仪器对自由纳米颗粒的脆弱性等因素，并非所有方法都适用于所有颗粒类型。
由于XPS和ToF-SIMS测量在一个区域内是平均的，而不是测量单个颗粒，因此只能从均匀的层中获得可重复的结果;因此，应避免颗粒在基板上聚集或团聚。此外，太厚的非导电材料层在分析过程中会引起充电效应，这可能导致光谱中出现不需要的伪影，特别是无法用泛光枪补偿的部分电荷。另一方面，不完整的薄膜显示来自基板或安装材料（例如粘合剂）的强信号，这可能会干扰来自颗粒表面的敏感峰。薄膜的理想厚度取决于材料，应通过对不同厚度薄膜的分析通过实验确定。特别是，使用旋涂制备的样品应使用SEM进行分析，以确保涂层的完整性。
与使用NP粉末相比，使用NP悬浮液的暴露危险和安全要求更少。液滴铸是一种相对简单的方法，设备要求较低，特别适用于不考虑薄膜厚度的悬浮液中的导电纳米颗粒。虽然样品可以在大气条件下轻松干燥，但真空干燥器用于减少液滴的干燥时间，并保护晶圆免受污染。氟橡胶环用于改变液滴的蒸发模式，从而最大限度地减少咖啡环的形成。蒸发模式也可能受到使用清洁方案改变基材亲水性或通过应用替代涂层51，52，在溶剂气氛中蒸发53，甚至通过加热基质54的影响。对于悬浮液中非导电纳米颗粒的悬浮液，建议使用旋涂，因为它能够产生足够薄的均匀颗粒层以避免充电效应，但仍然足够厚以防止Si衬底对XPS和ToF-SIMS光谱做出贡献。对于每个单独的NP系统和浓度，离心机和旋涂参数都必须进行优化，但即使在不同的仪器上也可以非常可靠地再现。由于旋涂液滴始终位于晶圆的中间，因此旋转半径无关紧要，可以使用"每分钟转数"（rpm）单位。启动程序后，悬浮液也可以沉积在晶圆上;然而，这将需要不同的旋涂参数和更多的悬浮液来获得更厚的涂层。
由于其极小的尺寸，纳米颗粒可能从基板上脱落，并在受到离子或X射线束撞击时在超高真空室内自由移动。对于用粉末制备的样品来说，这是一个特殊的问题。在某些情况下，纳米颗粒可以渗透到仪器的敏感组件中，需要昂贵且耗时的维护。由于施加了加速电压，使用ToF-SIMS损坏敏感部件的危险比使用XPS更大。粉末状样品，特别是使用"粘即走"方法制备的粉末样品，应仔细检查，以确保粉末足够牢固地固定，特别是对于ToF-SIMS分析。例如，可以通过将样品倒置并吹过其上的气体流（例如N2）来证实这一点。在分析之前，样品也可以在仪器的气闸或其他初始样品进入室中过夜，其中稳定的真空可以表明样品中没有松散的颗粒。然而，作为颗粒制备的纳米颗粒甚至可以溅射（在低加速度电压下）而不会损坏仪器;这种方法可以消除从压机引入的污染物，特别是碳氢化合物，还可以对颗粒进行批量分析。
在样品架存根中制备NP粉末可以制备具有定义几何形状和宏观平坦表面的样品。关键点是压制样品的工具的清洁度，以及使用低压以避免由于该过程而导致纳米颗粒表面的变化。它的缺点是需要相对大量的材料，以及高真空仪器中材料损失的潜在问题。我们不建议将此方法用于ToF-SIMS分析，因为颗粒不会以任何方式压缩或固定。
关于NP材料，样品制备的首要考虑因素是消除或尽量减少NP与类似材料的基板之间的干扰;例如，硅晶圆不适合使用XPS和ToF-SIMS分析SiO2 NPs，即使有足够的样品覆盖率。由于纳米颗粒和双面粘合剂之间缺乏信号干扰，金属或无机纳米颗粒可以很容易地分析为粘合剂上的粉末（假设它们不包含有机层或涂层），这种制备方法不适合聚合物NP。 并且可能是用相对较少的设备进行直接铸造的;然而，它们可能含有来自其合成的大量杂质和稳定剂，必须小心地去除而不损坏颗粒。聚合物纳米颗粒可能更容易被模压损坏，但也可能更容易在颗粒中保持在一起，这取决于所使用的压力。NP表面上的颗粒或柔软的有机涂层也可能对损伤敏感。溶液中的直接沉积有可能通过悬浮液或干燥过程损坏敏感涂层，但对于分析悬浮液中已经存在的NP是有利的。冷冻固定是分析悬浮液中化学结构、表面或界面的合适方法，这些结构、表面或界面会被各种其他样品制备技术损坏或破坏，但需要XPS和ToF-SIMS46'47的专用冷冻设备。
虽然本文描述了几种可用于样品制备的示例性方法，但在每种情况下，都应使用替代分析方法对该方法进行优化和验证。最近发表了不同因素影响的详细概述22。除了开发和验证合适的制备方法外，这些步骤的记录也至关重要40。本出版物介绍了一些易于处理的方法，并指导您根据特定任务的要求修改或开发新方法。
Disclosures
作者没有竞争利益可披露。
Acknowledgments
该项目已根据第720952号赠款协议（ACEnano）获得了欧盟地平线2020计划（H2020）的资助。作者要感谢Sigrid Benemann的SEM测量，Markus Schneider的ToF-SIMS测量和PCA，以及Philipp Reichardt的拍摄协助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-figure Laboratory balance | Kern & Sohn GmbH | ADB200-4A | |
| 5 mm Pellet die | Specac | GS03060 | |
| Alkali glass cleaning solution | Sigma-Aldrich | Hellmanex™ III Z805939 | Special cleaning solution for cuvettes |
| Carbon adhesive tabs | Plano | "Leit-Tabs" G3347 | |
| Clean laboratory beakers | any | e.g. 300 mL | |
| Cryo-freezer | Electron Microscopy Sciences | EMS-002 Cryo Workstation | |
| Dialysis tube with fasteners | Medicell Membranees Ltd | DTV12000.06.30 | Molecular weight cut-off (MWCO) 12-14 kDa |
| Die press | any | Capable of 2 kN force | |
| Disposable syringe, 1 mL, Luer-slip | TH Geyer | Labsolute 7657545 | Any appropriate volume can be used |
| Double-sided adhesive | 3M | Removable Repositionable Tape 665 | |
| Dry ice | Linde AG | ICEBITZZZ® | For short term storage/cooling |
| Eppendorf transfer pipette and tips | Eppendorf | various | Check correct size for planned pipetting volume |
| Ethanol, ACS grade | Merck KGaA | 1009832500 | |
| FFP2 or FFP3 mask | various | For working with nanoparticles from non-hazardous materials, when not in a fume hood or glove box | |
| Isopropanol, ACS grade | Merck KGaA | 1096342500 | |
| Lab coat, gloves and goggles | any | ||
| Laboratory centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5430 | |
| Laboratory fume hood | any | necessary for working with nanoparticles | |
| Laboratory stirrer & stirrer bar | NeoLab | D-6010 | |
| Lint-free wipes | Kimberley Clark Professional | Kimtech Science Precision wipes | Recommended for working with Si wafers |
| Liquid Nitrogen | Linde AG | Stickstoff flüssig 5.0 | Only for cooling of the cryogen. |
| Microtube/centrifuge tube 1,5 mL | T.H. Geyer GmbH & Co. KG | Labsolute 7696751 | |
| Nitrogen 5.0 | any | 99.999% purity | |
| Pasteur pipette, PE, plastic 3 mL | TH Geyer | Labsolute 7 691 203 | |
| Pasteur pipette, PE, plastic 3 mL | TH Geyer | Labsolute 7 691 203 | |
| Powder sample holder | BAM workshop | "Home-made" sample holder | |
| Propane | Sigma-Aldrich | 769037 | The cryogen should be of highest possible purity. |
| Sample vial or centrifuge tube 1 mL | Greiner Bio-One GmbH | Cellstar 188 261 | Should be capable of being fixed in the Vortexer |
| Silicon wafers | any | ideally 1cm2 pre-cut | |
| Spin-coater | SPS Europe | SPIN150i-NPP | |
| Syringe filter 0,45 µm | Th Geyer | Labsolute 7699803 | For smaller samples; larger versions exist for larger sample volumes |
| ToF-SIMS | IONTOF GmbH | ToF-SIMS IV or V, equipped with Bi LMIG and flood gun | |
| Tweezers for handling Si wafers | any | ||
| ultrapure water | TKA | MicroPure 08.1202 | |
| Ultrasonicator | Bandelin | Sonorex Super | |
| UV/Ozone cleaner | NanoBioAnalytics | UVC-1014 | |
| Vacuum dessicator | any | ||
| Vacuum pump (membrane/diaphragm) | Vacuubrand GmbH | Type MD-4T | |
| Viton O-ring 6.07 x 1.78 mm | Betech GmbH | 2-010, FKM 80 | |
| Vortexer | Heathrow Scientific | Vortexer HS120212 | |
| Wafer Holder 25mm coin style | Semiconductor Production Systems Europe | eWB0091-ASSY-1 | |
| XPS | Kratos | Kratos Axis Ultra DLD |
References
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