Summary
우리는 질량 광합성(MP)을 사용하여 항원-항체 친화성 측정에 대한 단일 분자 접근법을 기술합니다. MP 기반 프로토콜은 빠르고 정확하며 매우 적은 양의 재료를 사용하며 단백질 변형이 필요하지 않습니다.
Abstract
항원-항체 상호 작용의 특이성 및 친화성의 측정은 의학 및 연구 응용 분야에서 매우 중요합니다. 이 프로토콜에서, 우리는 이 목적을 위해 새로운 단 하나 분자 기술, 질량 광측정법 (MP)의 구현을 설명합니다. MP는 단일 분자 수준에서 항체 및 항원 항체 복합체의 분자 질량 및 인구를 감지하고 정량화하는 라벨 및 고정되지 않은 기술입니다. MP는 몇 분 안에 항원 항체 샘플을 분석하여 결합 친화성의 정확한 측정을 허용하고 동시에 단백질의 스토이치오메트리 및 올리고메릭 상태에 대한 정보를 제공한다. 이것은 단백질의 피코몰 양과 고가의 소모품만을 필요로 하는 간단하고 간단한 기술입니다. 동일한 절차는 50 kDa보다 큰 분자 질량을 가진 단백질을 위한 단백질 단백질 결합을 연구하기 위하여 이용될 수 있습니다. 다발성 단백질 상호 작용을 위해, 다중 결합 부위의 친화력은 단일 측정에서 얻을 수 있다. 그러나 단일 분자 측정 모드와 라벨링부족은 몇 가지 실험적 한계를 가중시합니다. 이 방법은 서브 마이크로몰라 상호 작용 친화성, 20 kDa 이상의 분자 질량을 가진 항원 및 상대적으로 순수한 단백질 샘플의 측정에 적용될 때 최상의 결과를 제공합니다. 또한 기본 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 필요한 피팅 및 계산 단계를 수행하는 절차에 대해서도 설명합니다.
Introduction
항체는 분자 생물학의 유비쿼터스 공구가 되고 의학 및 연구 응용 둘 다에서 광범위하게 이용됩니다. 의학에서는 진단에서 매우 중요하지만 치료 응용 분야도 확장되고 있으며 새로운 항체 기반 치료법은지속적으로 1,2,3,4로개발되고 있습니다. 항체의 과학적 적용은 면역형성5,면역 절전6, 유동 세포측정법7,ELISA 및 서부 블로팅과 같은 많은 필수 불가결한 실험실 기술을 포함한다. 이러한 각 응용 분야에 대해 결합 친화성 및 특이성을 포함한 항체의 결합 특성의 정확한 측정을 얻는 것이 매우 중요합니다.
1990년 최초의 상업용 표면 플라스몬 공명(SPR) 기기가 도입된 이래, 광학 바이오센서는 항체 특성화의 "금본위제"가 되었지만, ELISA를 포함한 다른 기술도 항체 친화성8,9를측정하는 데 일상적으로 사용되고 있다. 이 방법은 일반적으로 잠재적으로 관심의 상호 작용에 영향을 미칠 수 있는 분석된 분자의 고정화 또는 표시를 요구합니다. 또한 데이터 분석을 위해 결과를 수집하기 전에 여러 분석 단계를 포함하는 비교적 느립니다. 최근에 개발된 단일 분자 방법, 질량 광측정법(MP)은 현미경 커버슬립10,11의표면에 착륙할 때 용액에서 직접 분자를 검출한다. MP가 사용하는 광 산란 기반 광학 검출은 단백질 라벨링 또는 변형이 필요하지 않습니다. 개별 단백질 분자는영상(도 1D)에나타나는 어두운 반점으로 간섭메트릭 산란 현미경에 의해 기록되며, 수천 개의 분자는 1분 데이터 수집12동안 검출될 수 있다. 각 개별 입자에 의해 생성된 신호는 정량화되고, 그 대비값(상대어둠)이 계산됩니다. 간섭 대비 값은 단백질의 분자 질량에 비례하여 항원-항체 혼합물에서 결합 및 자유 종의 식별을 가능하게 합니다. 동시에 분자 착륙 이벤트를 계산하여 MP는 종 인구를 직접 측정합니다. 이렇게 하면 MP 기반 메서드는 여러 바인딩 사이트의 친화성을 독립적으로 정량화할 수 있는 고유한 기능을 제공합니다.
항원(Ag)분자의 결합은 그대로항체(Ab)의2개의 결합 부위에 다음과 같이 설명될 수 있다.
평형 협회 상수 Ka1 및 Ka2로 정의 :
여기서 ci와 f는 각각 성분 i의농도 와 분수를 나타낸다. 토트에 대한 총 항원농도(cAg)토트는 다음과 같이 발현될 수 있다.
항체(cAb)토트 및 항원(cAg)의총농도가 알려져 있기 때문에, 이 방정식은 MP 측정에서 얻은 실험 성분 분획에 직접 맞고 평형 협회 상수 K a1 및 K a2를 계산하는 데 사용될 수 있다(보충 정보참조).
MP 데이터는 또한 두 항체 결합부위(11)사이의 쿠퍼성성을 추정하는 데 사용될 수 있다. 동일한 현미경 결합 상수를 가진 2개의 항체 파라토원의 경우, Ab·의집단의 과정을 설명하는 통계적 인자 아그와 Ab· Ag2 복합체는 명백한 거시적 평형 상수 Ka1 및 Ka2가 수치적으로 동일하지 않으며 Ka1 = 4Ka2를 지시합니다. 따라서, Ka1< 4K a2의 실험값은 두 항체 결합 부위 간의 양성 응고성을 나타낸다. 마찬가지로 Ka1 > 4Ka2는 부정적인 쿠퍼티를 나타냅니다.
항원-항체 결합 친화성의 MP 측정은 빠르며 소량의 물질이 필요합니다. 상량 계산에 사용되는 MP 질량 분포는 샘플 특성에 대한 추가 정보를 제공하고 단일 실험에서 샘플 순도, 올리고머화 및 집계의 평가를 가능하게 합니다. 동일한 방법은 높은 친화성 단백질 단백질 결합을 측정하는 데 사용할 수 있으며 MP는 다중 발렌트 단백질 상호 작용연구에 특히 유용합니다. 다중 단백질 복합체는 일반적으로 큰 분자 질량을 가지고 있으며, MP 검출에 최적이며, 단일 분자 데이터는 금식측정을 측정하고 동시에 다중 결합 부위의 친화성을 계산하는 데 사용될 수 있다. 이 정보는 일반적으로 대량 기반 방법을 사용하여 얻기가 어렵습니다.
수정없이, 현재 프로토콜은 20 kDa 이상의 분자 질량의 항원과의 상대적으로 높은 친화성, 하위 미세 몰라 상호 작용의 측정에 적합합니다. 최적의 결과를 위해 단백질 재고는 순도가 높어야 하지만 특정 완충 요건은 없습니다. MP를 사용하여, 항원-항체 결합은 5분 이내에 평가될 수 있다. 정확한 KD 계산에 필요한 데이터 수집 및 분석을 30분 이내에 수행할 수 있습니다.
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Protocol
1. 유동 챔버 준비
- 유리 커버립 청소
- 증류수, 에탄올, 이소프로판올이 있는 워시 병을 사용하여 물, 에탄올, 물, 이소프로판올, 물 등 24mm x 50mm 커버립을 다음 순서로 헹구세요. 깨끗한 질소의 스트림으로 커버립을 건조. 커버스립을 위에서 아래로 헹구고 하단 모서리를 부드러운 팁으로 잡고 헹구는 것이 중요합니다. 집게(도2A)로부터오염을 이송하지 않도록 커버슬립을 같은 방향으로 건조시다.
- 마찬가지로 증류수, 에탄올 및 증류수로 24mm x 24mm 커버립을 헹구는 것과 유사하게 헹구습니다. 깨끗한 질소의 스트림으로 커버립을 건조.
- 커버슬립의 작동 면을 식별하고, 깨끗한 커버슬립 표면에 증류수 한 방울을 놓고 프로토콜의 3.1-3.2 단계를 따릅니다. 일반적으로 24mm x 50mm 커버슬립의 한쪽면만이 MP 측정에 적합한 광학 품질을 가지고 있습니다.
참고: 집중 후, 중요한 표면 결함을 감지할 수 없으며 데이터 수집 소프트웨어에 표시된 "신호" 값은 0.05% 미만이어야합니다(그림 1A-C). 상자의 모든 커버립의 작동 면은 동일한 방향으로 지향됩니다. 동일한 절차를 사용하여 커버슬립 클리닝의 효율성을 테스트해야 합니다.
- 유동 챔버 조립
- 알루미늄 호일 조각에 24mm x 24mm 커버슬립을 배치합니다. 그림 2B에 표시된 대로 24mm x 24mm 커버슬립 위에 양면 테이프 스트립을 놓고 유리 가장자리를 따라 테이프를 잘라냅니다. 커버슬립을 알루미늄 호일로부터 분리하여 24mm x 50mm 커버슬립(도2C)의작동 측에 부착합니다.
참고: 채널 크기는 다를 수 있지만 폭은 3mm-5mm입니다. 더 넓은 채널은 더 큰 샘플 볼륨을 필요로하고 매우 좁은 채널로드가 어려울 수 있습니다. 일반적으로 24mm x 24mm 커버슬립에서 두 개의 병렬 채널을 쉽게 만들 수 있습니다. 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.
- 알루미늄 호일 조각에 24mm x 24mm 커버슬립을 배치합니다. 그림 2B에 표시된 대로 24mm x 24mm 커버슬립 위에 양면 테이프 스트립을 놓고 유리 가장자리를 따라 테이프를 잘라냅니다. 커버슬립을 알루미늄 호일로부터 분리하여 24mm x 50mm 커버슬립(도2C)의작동 측에 부착합니다.
2. 친화도 측정을 위한 항체 항원 시료 준비
- 0.22 μm 주사기 필터를 사용하여 PBS 버퍼의 최소 2mL를 필터링하여 먼지 입자 또는 골재를 제거합니다. 원심분리기는 탁상 원심분리기(약 16,000 x g)의최대 속도로 단백질 육수를 10분 동안 분리합니다.
참고: PBS는 이 프로토콜에 권장되는 버퍼이지만 MP에는 특정 버퍼 요구 사항이 없으며 다른 생물학적 버퍼도 허용됩니다. 그러나, 높은 글리세롤 농도 (>10%) 매우 낮은 이온 강도(소금 농도&10 mMM)는 이미지 및 데이터 품질에 영향을 줄 수 있으며 권장되지 않습니다. - 280nm UV 흡광도를 측정하여 항체 및 항원 주식의 실제 농도를 결정한다.
- 항원-항체 혼합물의 측정 농도를 계산한다. 항체 결합 친화성의 추정 값이 알려지지 않은 경우, 30nM 항원 및 20 nM 항체 농도로 샘플을 준비할 계획이다. 근사치 친화성이 알려지면, 항체 대 항원 비 및 이들의 농도는 예상되는 Kd 값에 따라 최적화되어야 한다. 아래 방정식에서 예상되는 Kd 및 총 항체 농도의 합과 동일한 혼합물내의 총 항원 농도를 사용한다. K d1 = 항체의두 파라토페에 대한 Kd2를 가정하면, 이것은 시료내의 자유 항체 및 항체-항원 복합체의 비교 농도를 초래할 것이다.
항체 농도를 조정하여 10nM 및 50 nM 범위 내의 샘플에서 총 단백질 농도를 유지합니다. 최상의 결과는 5nM과 25nM 사이의 항체 농도를 가진 혼합물을 사용하여 얻어진다.
참고: MP는 40kDa보다 큰 분자 질량으로 단백질을 검출합니다. 따라서, 40kDa보다 작은 분자 질량을 가진 항원들의 시료 농도는 전형적인 50nM 한계를 초과할 수 있다. 그러나, 약 100nM보다 높은 농도에서 저분자 질량 항원조차도 Kd 결정의 화질과 정확도에 영향을 줄 수 있다. - 2.3단계에서 계산된 최종 측정 농도에서 항체-항원 혼합물의 50 μL을 준비한다.
참고: Kd 결정에항원-항체 혼합물의 샘플은 하나만 요구된다. 그러나, 항체 비에 다른 항원 비율을 가진 몇몇 견본을 준비하는 것은 견본 집중을 최적화하는 것을 도울 수 있습니다. 여러 샘플의 데이터가 수집되는 경우 전역 맞춤을 통해 분석할 수 있습니다. - 항원-항체 혼합물(들)을 실온에서 약 10분 동안 배양하여 결합 반응이 화학적 평형에 도달할 수 있도록 한다. 불필요하게 긴 잠복기를 피하십시오.
참고: 잠복기 시간은 결합 운동학에 따라 달라질 수 있습니다. 화학적 평형에 도달되었는지 확인하기 위해 샘플 측정은 다른 잠복기에서 반복될 수 있습니다. 시간 불변K d 값은 충분한 긴 배양을 나타냅니다. 장기간 배양하면 플라스틱 실험실기 표면에 상당한 단백질 흡착이 발생할 수 있으며, 결과적으로 단백질 농도 결정에 상당한 오류가 발생할 수 있습니다. 이러한 이유로, 낮은 접착 랩웨어는 MP 샘플준비(13)에적극 권장된다.
3. 질량 광측정 데이터 수집
- MP 계측기 목표에 현미경 침지 오일 한 방울을 바르고 조립된 유량 챔버를 현미경 단계에 배치합니다. 오일이 커버슬립과 목표 사이의 간격을 포괄하는지 확인합니다.
- 유동 챔버를 로드하고 질량 광미터에 초점을 맞춥니다.
- 1단계에서 준비된 유량 챔버 채널의 한쪽 끝에 깨끗하고 여과된 완충액의 10 μL을 증착한다. 액체는 모세관 작용에 의해 채널에 입력합니다.
- 스테이지의 Z 위치를 조정하여 24 x 50mm 커버슬립의 작동 표면에 현미경을 집중시합니다.
- 데이터 수집 소프트웨어의 포커스 제어 탭에서 거친 스테이지 이동 위 및 아래쪽 버튼을 사용하여 초기 조정을 합니다.
- 선명도 버튼을 클릭하여 선명도 신호 판독값을 표시하고 미세한 위아래로 조정 버튼을 사용하여 선명도 값을 최대화합니다.
- 초점 설정 및 초점 잠금 단추를 클릭하여 포커스 추적 기능을 활성화합니다. 제대로 초점을 맞춘이미지(그림 1A,C)는0.05% 미만의 "신호" 값을 가져야 합니다.
참고: 최대 선명도 위치에서 "신호" 값이 0.05% 이상이면 유리 표면 이나 버퍼의 불순물을 나타낼 수 있습니다.
- 동일한 채널을 이용하여, 항체-항원 시료의 20 μL을 채널의 한쪽에 증착하고 다른 쪽 끝에서 액체를 블로팅 용지의 작은 조각으로 블롯팅(도2D)으로블롯팅한다.
참고: 폭 3~5mm의 부피는 약 10μL입니다. 추가 샘플 볼륨은 채널에 있는 버퍼를 완전히 교체하고 샘플 희석을 방지하는 것이 좋습니다. - 샘플을 로드한 후 즉시 레코드 버튼을 클릭하여 데이터 수집을 시작하여 100s 비디오(그림1D)를가져옵니다.
- 데이터 수집이 끝나면 파일 이름을 입력하고 확인을 클릭하여 데이터 파일을 저장합니다.
- 커버립을 버리고 이소프로판올로 젖은 면 광학 면봉으로 객관적인 렌즈에서 오일을 닦아냅니다.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.
4. MP 데이터 분석
- MP 데이터 처리 소프트웨어를 사용하여 수집된 비디오 파일을 처리하여 방문 이벤트를 식별합니다.
- 파일/열기 메뉴 옵션을 사용하여 분석을 위해 파일을 로드하고 분석을클릭합니다.
- 로드 버튼을 클릭하여 교정 기능을 로드하고 파일/결과 저장 메뉴 옵션을 사용하여 분석된 데이터를 저장합니다.
- 가우시안 기능과 분자 질량 분포를 맞추어 샘플내각 종의 상대적 농도를 얻을 수 있다. 이 분석은 일반적인 과학 그래프 소프트웨어(재료 표 참조)를 사용하여 수행할 수 있습니다.
- "events맞는.csv" 파일을 소프트웨어로 가져오고 플롯/통계/히스토그램 기능을 사용하여 분자 질량 분포(.csv 파일의 열 M)를 플롯합니다.
- 히스토그램을 두 번 클릭하여 플롯 속성 창을 엽니다. 자동 비닝을 비활성화하고 2.5 kDa의 빈 크기를 선택합니다. 적용 및 이동 단추를 클릭하여 빈 센터 및 카운트 데이터를 만듭니다.
- 빈 센터 및 카운트 열을 선택하고 분석/피크 및 베이스라인/다중 피크 핏 메뉴 함수를 사용하여 가우시안 함수와 히스토그램에 맞춥니다. 두 번 클릭하여 배포 플롯에서 대략적인 피크 위치를 표시한 다음 NLFit 열기 버튼을 클릭합니다.
- "xc" 피크 센터에 대한 고정 확인란을 확인하고 자유 항체 및 단일 및 이중 항원 항체 복합체의 예상 분자 질량에 값을 설정합니다. 너비 매개 변수에 대한 공유 옵션을 확인합니다. 맞춤 버튼을 클릭합니다. 가우시안 성분의 장착된 피크 높이 값은샘플(11)에서각 종의 상대적 농도를 나타낸다.
참고: 대량 분포 플롯의 해상도를 최적화하기 위해 빈 크기를 조정할 수 있습니다. MP 정밀도 제한은 약 1kDa이며 빈 크기가 작아 추가 정보는 공개하지 않지만 분포의 노이즈를 증폭시킬 수 있습니다. 매우 큰 빈 크기는 대량 분포의 미세한 세부 사항을 모호하게 합니다.
- 다음 방정식을 사용하여 각 종의 농도 분수를 계산합니다.
여기서 hi 및 fi 값은 각각 시료내의 자유 항체 및 단일 및 이중 결합 항체의 피크 높이 및 농도 분획을 나타낸다.
5. 평형 상수 값 계산
- 적절한 분석 소프트웨어를 사용하여 Eq. 1 및 2단계4.3단계에서 계산된 상호작용 종의 농도 분획에 맞춥시다. 여기서는 스프레드시트프로그램(14)을 사용하여 평형 상수를 계산하는 방법을 시연한다(보충 정보참조).
- "Kd 계산.xlsx 워크시트를 엽니다. 이 워크시트에서 노란색으로 강조 표시된 행 1에서 10행의 셀 값을 수정하여 평형 상수 계산을 수행할 수 있습니다.
- 나노 몰러 단위로 추정된 KD 값을 테이블의 세포 B1 및 B2로 입력합니다. 이러한 시작 값은 피팅 절차에 최적화됩니다. 예상 KD 값을 알 수 없는 경우 셀 B1 및 B2의 기본 값을 변경하지 않은 상태로 둡니다.
- (cAb)토트 및(cAg)의값을 나노몰러 단위로 세포 D2 및 E2로 입력한다. 4.3 단계에서 계산된 분획 값을 셀 F2, G2 및 H2에 입력합니다. 서로 다른 농도 비율로 여러 시료를 측정한 경우, 이러한 시료에 대해 얻어진 추가 농도 값은 2~10행으로 입력될 수 있다.
- 데이터/솔버 메뉴 기능을 선택합니다. "목표 설정" 상자에 "$B$15"를 입력하고 "변수 셀 변경:" 상자에 "$B$1:$B$2"를 입력합니다. To: 옵션에 대한 최소 라디오 버튼을 선택합니다. 구속되지 않은 변수 비음확인란을 선택하고 GRG 비선형을 해결 방법으로 선택합니다. 해결 버튼을 클릭합니다. 가장 적합한 Kd1 및 Kd2 값은 셀 B1 및 B2 및 셀 B15의 제곱 오차의 최종 합계에 표시됩니다.
참고: 솔버 기능이 활성화되어 있지 않은 경우 스프레드시트 프로그램의 파일 메뉴 에서 옵션을 선택합니다. 추가 기능 범주에서 비활성 응용 프로그램 추가 기능 에서 솔버 추가 기능을 선택하고 이동 버튼을 클릭합니다. 솔버 추가 확인란을 확인하고 확인을 클릭합니다.
그림 1: 대량 광측정 이미지. (A)깨끗한 커버슬립상에 수집된 이미징 버퍼의 대표적인 네이티브 뷰 영상과(B)표면 결점으로 커버슬립에. (C)이미징 버퍼의 차동 비율 측정 영상 및(D)AHT· HT 솔루션. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: MP 유동 챔버 준비 및 적재. (A)청소 절차에 대한 커버 슬립 보유 위치. (B)알루미늄 호일 표면의 24 x 24mm 커버슬립(가운데 층)과 양면 테이프(위층)의 정렬(하단 층, 도시되지 않음). 파란색 파선선이 잘라내기 선의 위치를 표시합니다. (C)2개의 샘플 채널이 있는 조립된 유량 챔버의 상부 및 측면 뷰, 조립된 유량 챔버의 그림. (D)이전에 버퍼로 채워진 흐름 채널에 샘플 로딩 에 대한 프로시저. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Representative Results
우리는 이전에 MP 기반분석(11)을사용하여 인간 α-혈전(HT) 및 마우스 단일클론 항인간 혈전 항체(AHT)의 상호작용을 조사하였다. HT(37 kDa)의 분자 질량은 40kDa 검출 한계 이하이기 때문에, 질량 분포의 분해능에 부정적인 영향을 미치지 않으면서 최대 시료 농도가 50nM MP 농도 제한을 초과할 수 있다. 이 실험은 고정된 25nM 농도에서 AHT 항체를 장착한 적정계로 계획되었으며, HT는 7.5nM, 15nM, 30nM, 60nM 및 120nM의 농도로 계획되었다. 도 3은 항원-항체 혼합물 및 항체 전용 샘플의 분자 질량 분포를 나타낸다. 여기서 는 프로토콜에 기재된 방법을 사용하여 데이터를 분석합니다. 과학 적인 그래프 소프트웨어는 무료 AHT를 나타내는 세 가지 가우시안 구성 요소와 대량 분포를 맞게 사용 되었다, AHT· HT 및 AHT: HT2. 3개의 성분의 공지된 분자 질량 값이 고정되었고, 3종에 대해 단일 피크 폭 파라미터가 장착되었다. 가우시안 성분의 피크 높이 파라미터는 Eq.3을 사용하여 정규화되어 종 농도 분획(표1)을얻었다. 이러한 값은 각 시료에 대한 전체 항체 및 항원 농도와 함께 "Kd 계산.xlsx"에 입력되었다. 스프레드시트의 글로벌 핏은 Kd1 = 40 nM(68.3% 신뢰 구간: 28nM, 68nM) 및 Kd2 =28nM(신뢰 구간: 68.3% 신뢰 구간: 17nM, 45nM)을 산출합니다. 실험 농도 분획 및 적합성 결과는 도 4로플롯된다. 통합 농도 분획을 피팅하여 여기에서 얻은 해리 상수값은 MP 분포를 직접 피팅하여 이전에 얻은 것과 일치하며, 이소레말 적정 열량(ITC)11에의해 얻어진 해리상값과 일치한다.
도 3: HT와 혼합된 25nM AHT의 MP 분자 질량 분포는 0, 7.5, 15, 30, 60 및 120 nM(각각 A-F)이다. 검은 점은 2.5 kDa 빈 크기로 플롯된 실험MP 데이터를 보여 준다. 시안, 녹색 및 청색 선은 각각 자유 항체, 단일 바운드 항체 및 이중 결합 항체 종의 가장 적합한 가우시안 분포를 나타낸다. 빨간색 선은 3개의 가우시안 구성 요소의 합계를 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 무료 AHT(파란색), AHT· HT(빨간색) 및 AHT· HT2(블랙) HT 농도의 함수로. 점은 MP 분포의 가우시안 피팅에서 얻은 실험 값을 나타냅니다. 단선은 Eq. 1 및 Eq. 2를 사용하여 가장 적합한 것을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: AHT 분자 질량 분포 측정의 기술적 복제. 플롯은 MP 측정의 재현성과 항체 제제의 순도를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| Ab conc (M) | Ag conc (M) | f_Ab | f_AbAg | f_AbAg2 |
| 2.50E-08 | 7.50E-09 | 0.88 | 0.10 | 0.02 |
| 2.50E-08 | 1.50E-08 | 0.81 | 0.15 | 0.04 |
| 2.50E-08 | 3.00E-08 | 0.72 | 0.21 | 0.07 |
| 2.50E-08 | 6.00E-08 | 0.27 | 0.37 | 0.35 |
| 2.50E-08 | 1.20E-07 | 0.05 | 0.23 | 0.72 |
표 1: MP 분포를 피팅하여 얻은 가우시안 성분의 정규화 된 피크 높이 (그림 3).
보충 정보: Excel 및 선호도 계산 워크시트에서 평형 상수 피팅 절차의 구현. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 설명된 질량 광측정 기반 프로토콜은 항원-항체 결합 친화성을 측정하는 빠르고 정확한 방법을 제공한다. MP 분석은 매우 적은 양의 물질을 사용하며, 스토이치오메트리, 올리고머화 및 순도를 포함한 추가 정보는 동일한데이터(그림 5)로부터평가될 수 있다. 수정없이, 이 방법은 약 5 nM에서 500 nM 범위의 해리 상수의 측정에 적용되며, 약 20 kDa 이상의 분자 질량을 가진 리간드 분자의 경우. 동일한 프로토콜은 항원-항체 결합을 분석할 뿐만 아니라, 적어도 하나의 결합 파트너의 분자 질량이 50kDa보다 클 때 단백질-단백질 상호 작용 친화성을 측정하는 데 사용될 수 있다. MP 검출은 비특이적이기 때문에, MP 측정은 고농도의 담체 단백질 또는 큰 분자 질량 불순물을 포함하는 견본에서 수행될 수 없습니다.
SPR은 일반적으로 항원-항체 결합의 특성화에 사용되며, 두 방법의 직접 비교는 분석 선택에 도움이 될 수 있다. SPR에 비해 MP 결합 분석이 빠르며 단백질 고정이 필요하지 않습니다. 일반적인 결합 실험의 경우, MP는 SPR. MP 데이터보다 적은 물질을 필요로 하며, SPR10에서쉽게 구할 수 없는 복합체의 stoichiometry를드러낸다. 결합의 운동 매개 변수는 MP데이터(13)로부터얻을 수 있지만, SPR은 결합 운동학을 직접 측정하고, 더 광범위한 연관 및 해리율을 측정할 수 있다. 두 개의 개별 바인딩 사이트의 연결 상수는 두 사이트의 연결 및 해리 비율이 충분히 다른 경우에만 SPR 데이터에서 얻을 수 있습니다. 한편, MP는 다중 결합부위(10)및11을가진 분자 복합체를 정확하게 특성화할 수 있다. SPR은 작은 분자 질량 리간드에 대한 결합 친화성을 측정할 수 있으며, MP는 약 20 kDa 이상의 분자 질량을 가진 리간드에 가장 적합합니다.
양질의 MP 데이터를 수집하는 것은 이 프로토콜에서 정확한 결과를 얻는 데 중요한 단계입니다. 버퍼 또는 커버의 표면의 불순물이 MP 데이터 수집을 방해합니다. 부적절한 초점은 분자 질량 추정 및 평형 상수 계산의 오류로 이어지는 MP 신호를 왜곡합니다. 프로토콜을 해결할 때 이러한 두 요소를 모두 검사해야 합니다. 저농도 단백질 솔루션으로 작업할 때 중요한 고려 사항은 표면 흡착이 재료의 손실과 시료 농도의 변화로 이어질 수 있다는 것입니다. 생성된 오류는 낮은 흡착 랩웨어를 사용하고 표면 패시션을 적용하여 최소화할 수 있습니다. 정확한 결과를 얻으려면 모든 단백질 희석제와 혼합물이 화학적 평형에 도달할 수 있도록 하는 것이 중요하지만 불필요하게 긴 잠복 시간을 피해야 합니다. 각 단백질 시스템에 대해, 커버슬립 유리에 결합하는 비특이적 단백질의 비율은 MP 데이터로부터 평가되는 것이 좋습니다. 다른 종에 대해 상당히 다른 비율이 관찰되는 경우, MP 데이터는 KD 계산10,11의잠재적 인 오류를 피하기 위해 쉽게 수정 할 수 있습니다.
샘플 준비를 계획할 때 몇 가지 요소를 고려해야 합니다. 정확한 결과는 단일 시료를 측정하여 얻을 수 있지만, 항원 및 항체 농도는 자유 및 결합 종의 비교 농도를 얻기 위해 조정되어야 한다. 반응 종 중 하나에 의해 지배되는 단일 질량 분포의 분석은 허용 가능한 Kd 값 추정을 제공할 수 있지만 일반적으로 상대적으로 큰 피팅오류(11)를산출한다. 대체 전략에는 적정 데이터에 대한 글로벌 분석이 포함됩니다. 이 프로토콜과 함께 제공되는 스프레드시트 소프트웨어 기반 피팅 도구를 사용하여 개별 데이터를 모두 피팅하고 전역 분석을 사용할 수 있습니다. 단일 실험 또는 데이터 집합을 분석하는 경우 오류 프로젝션 방법을 사용하여 최적의 맞춤 매개 변수의 신뢰 도수를 추정할 수 있습니다. 스프레드시트 소프트웨어의 신뢰도 간격 계산 절차에 대한 자세한 설명은14번다른 곳에서 제공됩니다. 분석기를 디자인할 때 복제 실험을 계획하는 것이 좋습니다. 복제 실험의 데이터를 분석할 때 표준 편차를 사용하여 K d 값의 오류를 보고할 수 있습니다.
여기에 설명된 프로토콜은 일반적인 분자 질량 및 선호도 범위 제한을 넘어 그 적용가능성을 확장하도록 수정될 수 있다. 측정 가능한 친화의 범위는 MP에 의해 접근되는 단백질 농도 범위에 의해 제한되며, 전형적으로 10nM에서 50 nM로 제한된다. 이 범위는 확장될 수 있고 10nM 이하 농도에서 단백질 샘플을 측정할 수 있는 것은 perfused 된 유량 세포 및 더 긴 데이터 수집 시간을 사용하여 측정될 수 있다. 더 높은 농도의 단백질 샘플은 MP 측정을 위해 통과된 커버립을 사용하여 잠재적으로 측정될 수 있습니다. 분자 질량이 적은 항원의 경우, MP 질량 분포에서 자유 항체 및 항원 항체 복합 피크가 해결되지 않을 것이다. 이것은 프로토콜에 설명된 가우시안 피크 피팅 분석의 사용을 배제합니다. 이 경우, 결합 친화성은 여전히 항원과 항체를 적티로 정성화하고 MP 분포를 평균화하여 각 샘플에 대한 모든 종의 평균 분자 질량을 획득함으로써 측정될 수 있다. 상기 결합 방정식은 항원-항체 결합친화성(11)을얻기 위해 이 데이터에 적합할 수 있다.
정확한 친화력 정보가 필요하지 않은 경우 프로토콜을 단순화하고 빠른 항체 상호 작용 스크리닝에 사용할 수 있습니다. 이 경우 시판 채널 대신 시판 기스킷 웰을 사용하여 실험 절차를 더욱 단순화할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 원고의 그의 비판적 독서에 대한 키어 노이만 감사합니다. 이 작품은 NHLBI, NIH의 교내 프로그램에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AcquireMP | Refeyn | MP data collection software | |
| Anti-human thrombin | Haematologic Technologies | AHT-5020 | RRID: AB_2864302 |
| Cotton-tipped applicators | Thorlabs | CTA10 | cotton optical swabs for lens cleaning |
| Coverslips 24x24 mm | Globe Scientific | 1405-10 | |
| Coverslips 24x50 mm | Fisher Scientific | 12-544-EP | |
| DiscoverMP | Refeyn | MP data processing software | |
| Forceps | Electron Microscopy Sciences | 78080-CF | soft-tipped forceps for coverslips handling |
| Human α-thrombin | Haematologic Technologies | HCT-0020 | |
| Immersion oil | Thorlabs | MOIL-30 | |
| Isopropanol | Alfa Aesar | 36644 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | spreadsheet | |
| OneMP | Refeyn | Mass Photometry instrument | |
| Origin | OriginLab | scientific graphing software | |
| PBS | Corning | 46-013-CM | 10x stock |
| Syringe filter | Millipore | SLGSR33SS | buffer and sample filtering |
References
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