Summary
Vi beskriver en enda molekyl strategi för antigen-antikropp affinitet mätningar med hjälp av massa photometry (MP). Mp-baserade protokollet är snabb, korrekt, använder en mycket liten mängd material, och kräver inte protein modifiering.
Abstract
Mätningar av antigen-antikroppsinteraktioners specificitet och affinitet är av avgörande betydelse för medicinska tillämpningar och forskningstillämpningar. I detta protokoll beskriver vi genomförandet av en ny single-molecule teknik, massfotometri (MP), för detta ändamål. MP är en etikett- och immobiliseringsfri teknik som detekterar och kvantifierar molekylära massor och populationer av antikroppar och antigen-antikroppskomplex på en enmolekylsnivå. MP analyserar antigen-antikroppsprovet inom några minuter, vilket möjliggör exakt bestämning av bindningsaffiniteten och samtidigt ger information om stökiometri och proteiners oligomeriska tillstånd. Detta är en enkel och okomplicerad teknik som kräver endast picomole mängder av protein och inga dyra förbrukningsvaror. Samma procedur kan användas för att studera protein-proteinbindning för proteiner med en molekylmassa som är större än 50 kDa. För multivalenta proteininteraktioner kan affiniteterna för flera bindningsställen erhållas i en enda mätning. Men den enda molekylen mätsätt och bristen på märkning medför vissa experimentella begränsningar. Denna metod ger bäst resultat när den tillämpas på mätningar av sub-mikromolar interaktionsaffiniteter, antigener med en molekylmassa på 20 kDa eller större, och relativt rena proteinprover. Vi beskriver också proceduren för att utföra de obligatoriska monterings- och beräkningsstegen med hjälp av grundläggande dataanalysprogramvara.
Introduction
Antikroppar har blivit allestädes närvarande verktyg för molekylärbiologi och används i stor utsträckning i både medicinska och forskningsapplikationer. Inom medicinen är de kritiskt viktiga inom diagnostiken, men deras terapeutiska tillämpningar expanderar också och nya antikroppsbaserade terapier utvecklasständigt 1,2,3,4. De vetenskapliga tillämpningarna av antikroppar omfattar många oumbärliga laboratorietekniker som immunofluorescens5, immunoprecipitation6, flödescytometri7, ELISA och western blotting. För var och en av dessa tillämpningar är det av avgörande betydelse att få exakta mätningar av antikroppens bindningsegenskaper, inklusive bindningstillhörighet och specificitet.
Sedan det första kommersiella instrumentet för ytplasmonresonans (SPR) infördes 1990 har optiska biosensorer blivit "guldmyntfoten" av antikroppskarakterisering, men andra tekniker, inklusive ELISA, används också rutinmässigt för att mäta antikroppsaffiniteter8,9. Dessa metoder kräver vanligtvis immobilisering eller märkning av de analyserade molekylerna, som potentiellt kan påverka interaktionen av intresse. De är också relativt långsamma, vilket innebär flera analyssteg innan resultaten kan samlas in för dataanalys. En nyligen utvecklad enmolekylmetod, massfotometri (MP), detekterar molekyler direkt i lösning när de landar på ytan av mikroskopet coverslip10,11. Den ljusspridningsbaserade optiska detektion som MP använder kräver inte proteinmärkning eller modifiering. Enskilda proteinmolekyler registreras av det interferometriskt spridningsmikroskopet som mörka fläckar som förekommer i bilden (Figur 1D), och flera tusen molekyler kan detekteras under enminutsdatainhämtningen12. Signalen som genereras av varje enskild partikel kvantifieras, och dess kontrastvärde (relativt mörker) beräknas. De interferometriska kontrastvärdena är proportionella mot de molekylära massorna av proteinerna, vilket möjliggör identifiering av bundna och fria arter i antigen-antikroppsblandningen. Samtidigt, genom att räkna molekylära landningshändelser, mäter MP direkt artpopulationerna. Detta ger MP baserade metoder en unik förmåga att självständigt kvantifiera tillhörighet av flera bindningsplatser.
Bindning av antigenen (Ag) molekyler till de två bindningsställena för den intakta antikroppen (Ab) kan beskrivas som:
med jämviktsassociationen konstanter Ka1 och Ka2 definierat som:
där ci respektive fi representerar koncentration och fraktion av komponenten i, respektive. Den totala antigenkoncentrationen (cAg)tot kan uttryckas som:
Eftersom de totala koncentrationerna av antikroppen (cAb)tot och antigen (cAg) tot ärkända, kan denna ekvation användas för att direkt passa de experimentella komponentfraktioner som erhållits från MP-mätningarna och beräkna jämviktssamorganisationens konstanter Ka1 och Ka2 (se Kompletterande information).
MP-uppgifterna kan också användas för att uppskatta samarbets- och samarbetsiteten mellan de två antikroppsbindningsställena11. För två antikroppsparatoper med identiska mikroskopiska bindningskonstanter, de statistiska faktorer som beskriver processen för populationen av Ab· Ag och Ab· Ag2 komplex diktera att den skenbara makroskopiska jämvikten konstanter Ka1 och Ka2 inte kommer att vara numeriskt lika, och Ka1 = 4Ka2. Därför indikerar de experimentella värdena för Ka1 < 4Ka2 positiv samarbetsitet mellan de två antikroppsbindningsställena. Lika lite indikerar Ka1 > 4Ka2 negativ samarbetsitet.
MP-mätningar av antigenbindningsbindningsaffiniteten är snabba och kräver en liten mängd material. De MP-massfördelningar som används för equilibrium-konstantberäkningar ger ytterligare information om exempelegenskaperna och möjliggör bedömning av provrenhet, oligomerisering och aggregering i ett enda experiment. Samma metod kan användas för att mäta protein-proteinbindning med hög affinitet, och MP är särskilt användbart för studier av multi-valent protein interaktioner. Multi-protein komplex har vanligtvis stora molekylmassor, optimal för MP upptäckt, och enmolekyldata kan användas för att mäta stökiometri och beräkna tillhörighet av flera bindningsställen samtidigt. Denna information är vanligtvis svår att få med hjälp av bulkbaserade metoder.
Utan modifieringar är det aktuella protokollet lämpligt för mätningar av relativt hög-affinitet, sub-mikromolar interaktioner med antigener av en molekylmassa på 20 kDa eller större. För optimala resultat bör proteinlager ha hög renhet, men det finns inga specifika buffertkrav. Genom att använda MP kan antigen-antikroppsbindningen bedömas på mindre än fem minuter. Den datainsamling och analys som krävs för noggranna Kd-beräkningar kan utföras inom 30 minuter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förbered flödeskamrarna
- Rengör glasskyddsslipsen
- Använda tvättflaskor med destillerat vatten, etanol, och isopropanol, skölj 24 mm x 50 mm täckslip i följande ordning: vatten, etanol, vatten, isopropanol, vatten. Torka täckskydden med en ström av rent kväve. Det är viktigt att skölja täcken uppifrån och ner, hålla det nedre hörnet med mjuk-tippade tyckor. Torka täckslipet i samma riktning för att undvika att överföra kontamination från tentsarna (Figur 2A).
- På samma sätt, skölj 24 mm x 24 mm täcken med destillerat vatten, etanol, och destillerat vatten. Torka täckskydden med en ström av rent kväve.
- Identifiera omslagssidan, placera en droppe destillerat vatten på ytan av det rena täcket och följ steg 3.1–3.2 i protokollet. Vanligtvis har endast en sida av 24 mm x 50 mm-täckslip den optiska kvalitet som lämpar sig för MP-mätningar.
OBS: Efter fokusering bör inga betydande brister på ytan kunna upptäckas, och "signal"-värdet som visas i datainsamlingsprogrammet bör vara mindre än 0,05 % (bild 1A-C). Arbetssidorna på alla täcken i lådan orienteras i samma riktning. Samma förfarande bör användas för att testa effektiviteten i täckslip rengöring.
- Montera flödeskammaren
- Placera 24 mm x 24 mm täckslip på en bit aluminiumfolie. Placera remsor av dubbelsidig tejp ovanpå 24 mm x 24 mm täckslip enligt bild 2B och klipp tejpen längs glasets kant. Separera täckslipet från aluminiumfolien och fäst den på arbetssidan av 24 mm x 50 mm täckslip (Figur 2C).
OBS: Kanalstorleken kan variera, men en bredd på 3 mm–5 mm rekommenderas. Bredare kanaler kräver större provvolymer och mycket smala kanaler kan vara svåra att läsa in. Vanligtvis kan två parallella kanaler enkelt skapas på 24 mm x 24 mm-täckslip. Protokoll kan pausas här.
- Placera 24 mm x 24 mm täckslip på en bit aluminiumfolie. Placera remsor av dubbelsidig tejp ovanpå 24 mm x 24 mm täckslip enligt bild 2B och klipp tejpen längs glasets kant. Separera täckslipet från aluminiumfolien och fäst den på arbetssidan av 24 mm x 50 mm täckslip (Figur 2C).
2. Bered antikropp-antigenproverna för affinitetsmätningarna
- Filtrera minst 2 mL av PBS-bufferten med 0,22 μmsprutedrefilter för att avlägsna dammpartiklar eller aggregat. Centrifugera proteinstocken i 10 minuter vid högsta hastigheten på bordsskivan centrifug (cirka 16 000 x g).
OBS: PBS är den rekommenderade bufferten för detta protokoll, men MP har inga särskilda buffertkrav, och andra biologiska buffertar är också acceptabla. Höga glycerolkoncentrationer (>10%) och mycket låga joniska styrkor (saltkoncentration <10 mM) kan påverka bildens och datakvaliteten och rekommenderas inte. - Bestäm antikroppens och antigenlagrens faktiska koncentrationer genom att mäta deras 280 nm UV-absorbans.
- Beräkna antigen-antikroppsblandningens mätkoncentrationer. Om det uppskattade värdet av antikroppsbindningsaffiniteten inte är känt, planera att förbereda ett prov med 30 nM-antigen och 20 nM antikroppskoncentration. När den ungefärliga tillhörigheten är känd bör antikroppen till antigenförhållandet och deras koncentrationer optimeras enligt de förväntade Kd-värdena. Använd den totala antigenkoncentrationen i blandningen lika med summan av den förväntade Kd och den totala antikroppskoncentrationen i ekvationen nedan. Om man antar Kd1 = Kd2 för antikroppens två paratopes, kommer detta att resultera i jämförbara koncentrationer av den fria antikroppen och antikropps-antigenkomplexen i provet.
Justera antikroppskoncentrationen så att den totala proteinkoncentrationen i provet håller sig inom intervallet 10 nM och 50 nM. Bästa resultat erhålls med hjälp av blandningar med antikroppskoncentrationer mellan 5 nM och 25 nM.
OBS: MP detekterar proteiner med en molekylmassa som är större än 40 kDa. Följaktligen kan provkoncentrationer av antigener med en molekylmassa som är mindre än 40 kDa överskrida den typiska gränsen på 50 nM. Vid koncentrationer som är högre än cirka 100 nM kan dock även lågmolekylära massantigener påverka bildkvaliteten och noggrannheten hos Kd-bestämningen. - Bered 50 μL av antikropp-antigenblandningen vid dess slutliga mätkoncentration beräknad i steg 2.3.
OBS: Endast ett prov av antigen-antikroppsblandningen krävs för Kd-bestämningen. Att förbereda flera prover med olika antigen- till antikroppsförhållanden kan dock bidra till att optimera provkoncentrationen. Om data från flera prover samlas in kan de analyseras via en global passform. - Inkubera antigen-antikroppsblandningen(ar) i ungefär 10 min vid rumstemperatur för att tillåta bindningsreaktionen att nå kemisk jämvikt. Undvik onödigt långa inkubationstider.
OBS: Inkubationstiden kan variera beroende på bindningskinetiken. För att bekräfta att den kemiska jämvikten har uppnåtts kan provmätningar upprepas vid olika inkubationstider. Tidsvarianta Kd-värden indikerar tillräckligt lång inkubation. Långvarig inkubation kan leda till betydande protein adsorption till ytan av plast labware och, följaktligen, till betydande fel i proteinkoncentrationen bestämning. Av denna anledning rekommenderas låg-adhesion labware starkt för MP provberedning13.
3. Samla in massfotometridata
- Applicera en droppe mikroskop nedsänkning olja på MP instrument objektiv och placera den monterade flödeskammaren på mikroskopet scenen. Se till att oljan spänner över klyftan mellan täckskydd och målet.
- Ladda flödeskammaren och fokusera massfotometern.
- Deponera 10 μL av en ren, filtrerad buffertlösning i ena änden av flödeskammarens kanal som är förberedd i steg 1. Vätska kommer in i kanalen genom kapillär åtgärd.
- Justera scenens Z-position för att fokusera mikroskopet på arbetsytan på 24 x 50 mm-täckplattan.
- I fliken Fokuskontroll i datainsamlingsprogramvaran använder du knapparna för grovstegsförflyttning Upp och Ned för att göra de inledande justeringarna.
- Klicka på knappen Skärpa för att visa avläsningen av skärpasignalen och använd justeringsknapparna för fina upp och ner för att maximera värdet För skärpa.
- Klicka på knapparna Ange fokus och Lås fokus för att aktivera fokusspårningsfunktionen. En korrekt fokuserad bild (Bild 1A,C) bör ha "signal"-värdet under 0,05 %.
OBS: Om "signal"-värdet vid maximalt skärpasläge är över 0,05 % kan detta tyda på föroreningar på glasytan eller i bufferten.
- Använd samma kanal, ladda 20 μL av antikropp-antigenprovet genom att deponera det på ena sidan av kanalen och blotting vätskan från den andra änden med en liten bit blottingpapper (Figur 2D).
OBS: Volymen på en 3–5 mm bred kanal är ungefär 10 μL. Den extra provvolymen rekommenderas för att helt ersätta den buffert som finns i kanalen och för att undvika provutspädning. - Efter inläsning av provet, klicka omedelbart på knappen Spela in för att starta datainsamling, skaffa en 100 s video ( Bild1D).
- I slutet av datainsamlingen ange filnamnet och klicka på OK för att spara datafilen.
- Kassera täcken och torka oljan från objektivet lins med bomull optiska pinnprover våt med isopropanol.
OBS: Protokollet kan pausas här.
4. Analysera MP-uppgifterna
- Bearbeta den insamlade videofilen med hjälp av MP-databehandlingsprogrammet för att identifiera landningshändelserna.
- Använd menyalternativet Arkiv/Öppna för att läsa in filen för analysen och klicka på Analysera.
- Klicka på knappen Läs in om du vill läsa in kalibreringsfunktionen och spara de analyserade data med menyalternativet Arkiv/Spara resultat som.
- Montera den molekylära massfördelningen med Gaussiska funktioner för att erhålla relativa koncentrationer av varje art i provet. Denna analys kan utföras med hjälp av en gemensam vetenskaplig grafprogramvara (se Table of Materials).
- Importera filen "eventsFitted.csv" i programvaran och plotta den molekylära massfördelningen (kolumn M i .csv-filen) med funktionen Plot/Statistics/Histogram.
- Dubbelklicka på histogrammet för att öppna fönstret Tomtegenskaper. Inaktivera automatisk binning och välj en bin storlek på 2,5 kDa. Klicka på knapparna Verkställ och Gå för att skapa datan Lagerplatscenter och antal.
- Välj kolumnerna Lagerplatscenter och antal och använd menyfunktionen Analys/toppar och Baslinje/multipla topppassning för att passa histogrammet med Gaussiska funktioner. Dubbelklicka för att ange de ungefärliga topppositionerna på fördelningsytfältet och klicka sedan på knappen Öppna NLFit.
- Kontrollera de fasta kryssrutorna för "xc" toppcentra och ställ in deras värden på de förväntade molekylmassorna hos den fria antikroppen och de enkla och dubbla antigen-antikroppskomplexen. Kontrollera alternativet Dela för breddparametrarna. Klicka på knappen Passa. De monterade topphöjdsvärdena för de gaussiska komponenterna representerar den relativa koncentrationen av varje art i provet11.
OBS: Bin storlek kan justeras för att optimera upplösningen av massa distribution tomten. MP precisionsgränsen är ungefär 1 kDa, och mindre bin storlekar kan förstärka bullret i distributionen, men inte avslöja någon ytterligare information. Mycket stora bin storlekar kommer att skymma de fina detaljerna i massfördelningar.
- Beräkna koncentrationsfraktionen för varje art med hjälp av följande ekvation:
där hi- och fi-värdena representerar topphöjder och koncentrationsfraktioner av den fria antikroppen respektive den enkel- och dubbelbundna antikroppen i provet.
5. Beräkna konstantvärden för jämvikt
- Montera koncentrationsfraktionerna av interaktionsarten som beräknats i steg 4.3 med Eq. 1 och 2 med hjälp av en lämplig analysprogramvara. Här demonstrerar vi en metod för att beräkna jämviktskonstanter med hjälp av ett kalkylprogram14 (se Kompletterande information).
- Öppna kalkylbladet "Kd calculation.xlsx". I det här kalkylbladet kan cellvärdena i raderna 1 till 10 som markerats i gult modifieras för att utföra beräkningarna av equilibrium-konstanterna.
- Ange de uppskattade Kd-värdena i nanomolarenheter i cellerna B1 och B2 i tabellen. De startvärdena kommer att optimeras i passningsproceduren. Om de uppskattade Kd-värdena inte är kända, lämna standardvärdena i cellerna B1 och B2 oförändrade.
- Ange värdena för (cAb)tot och (cAg)tot i nanomolarenheter i cellerna D2 och E2. Ange de bråkvärden som beräknats i steg 4.3 i cellerna F2, G2 och H2. Om flera prover vid olika koncentrationsförhållanden mättes, kan ytterligare koncentrationsvärden som erhållits för dessa prover föras in i rad 2 till 10.
- Välj menyfunktionen Data/Problemlösare. Ange "$B$15" i rutan "Ange målsättning" och "$B$1:$B$2" i rutan "Genom att ändra variabelceller:". Välj alternativknappen Min för alternativet Till: Kontrollera kryssrutan Gör icke-negativa variabler och välj GRG Nonlinear som lösningsmetod. Klicka på knappen Lös. Den bästa passformen Kd1 och Kd2 värden kommer att visas i cell B1 och B2 och den slutliga summan av kvadratfel i cell B15.
OBS: Om Funktionen Problemlösaren inte är aktiv väljer du Alternativ under Arkiv-menyn i kalkylprogrammet. I kategorin Tilläggs-program väljer du tilläggsprogrammet För problemlösaren under tilläggs- och klicka på knappen Gå. Kontrollera kryssrutan För Tillägg till Problemlösaren och klicka på OK.
Bild 1: Massfotometribilder. (A) Representativa infödda visa bild av bildframställning bufferten samlas på en ren coverslip och (B) på en coverslip med ytfekt. (C) Differential ratiometric bild av avbildningsbufferten och (D) den AHT· HT-lösning. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 2: MP flödeskammare förberedelse och lastning. (A) Coverslip hållposition för rengöringsproceduren. (B) Inriktningen av 24 x 24 mm täckkolla (mellanskikt) och den dubbelsidiga tejpen (översta lagret) på ytan av aluminiumfolie (bottenskikt, visas inte). Blå streckade linjer visar platsen för klipplinjer. (C) Topp- och sidovy av den hopmonterade flödeskammaren med två provkanaler, och en bild av den hopmonterade flödeskammaren. (D) Förfarande för provladdning i en flödeskanal som tidigare fyllts med buffert. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har tidigare undersökt samspelet mellan human α-trombin (HT) och mus monoklonal anti-human trombin antikropp (AHT) med hjälp av MP baserade assay11. Eftersom molekylmassan för HT (37 kDa) ligger under detekteringsgränsen på 40 kDa kan den maximala provkoncentrationen överskrida begränsningen av 50 nM MP-koncentration utan att det påverkar upplösningen av massfördelningar negativt. Försöket planerades som en titreringsserie med AHT-antikroppen vid en fast 25 nM-koncentration, och HT vid koncentrationerna av 7,5 nM, 15 nM, 30 nM, 60 nM och 120 nM. Figur 3 visar de molekylära massfördelningarna för antigen-antikroppsblandningarna och provet med enbart antikropp. Här analyserar vi data med den metod som beskrivs i protokollet. En vetenskaplig grafprogramvara användes för att passa massfördelningarna med tre gaussiska komponenter som representerar den fria AHT, AHT· HT och AHT· HT2. De kända värdena för molekylmassa för de tre komponenterna var fasta, och en enda toppbreddsparameter monterades för de tre arterna. Bäst-fit peak höjd parametrar av de Gaussiska komponenterna normaliserades med hjälp av Eq. 3 för att få art koncentration fraktioner (Tabell 1). Dessa värden, tillsammans med den totala antikropps- och antigenkoncentrationen för varje prov ingicks i "Kd-beräkningen.xlsx". Den globala passformen i kalkylarket ger Kd1 = 40 nM (68,3% konfidensintervall: 28 nM, 68 nM) och Kd2 = 28 nM (68,3% konfidensintervall: 17 nM, 45 nM). De experimentella koncentrationsfraktionerna och passformsresultaten plottas i figur 4. Dissociationskonstanten värderar erhållande här, genom att tillpassa de integrerade koncentrationsfraktionerna, är överens med de erhållna föregående, genom direkt passande MP-fördelningar, och med dissociationkonstant värderar erhållande av Isothermal Titration Calorimetry (ITC)11.
Figur 3: MP-molekylmassfördelningar av 25 nM AHT blandat med HT vid 0, 7,5, 15, 30, 60 och 120 nM (A-F, respektive). Svarta punkter visar de experimentella MP-data som ritats med 2,5 kDa-binstorlek. Cyan, gröna och blå linjer representerar de bäst-fit Gaussian distributioner av den fria antikroppen, enkel bunden antikropp, och dubbel bundna antikroppar arter, respektive. Röda linjer visar summan av de tre gaussiska komponenterna. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 4: Fraktioner av den fria AHT (blå), AHT· HT (röd), och AHT· HT2(svart) som en funktion av HT-koncentration. Pekar föreställer experimentellt värderar erhållande från gaussisk passande av MP-fördelningarna. Heldragna linjer representerar bäst-fit med hjälp av Eq. 1 och Eq. 2. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 5: Tekniska replikat av AHT-mätningarna för molekylmassfördelning. Observationsplaner visar reproducerbarheten av MP-mätningarna och antikroppspreparatets renhet. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
| Ab conc (M) | Ag conc (M) | f_Ab | f_AbAg | f_AbAg2 |
| 2.50E-08 | 7.50E-09 | 0.88 | 0.10 | 0.02 |
| 2.50E-08 | 1,50E-08 | 0.81 | 0.15 | 0.04 |
| 2.50E-08 | 3.00E-08 | 0.72 | 0.21 | 0.07 |
| 2.50E-08 | 6.00E-08 | 0.27 | 0.37 | 0.35 |
| 2.50E-08 | 1.20E-07 | 0.05 | 0.23 | 0.72 |
Tabell 1: Normaliserade topphöjder på Gaussiska komponenter som erhålls genom att mp-distributionerna (figur 3) monteras .
Kompletterande Information: Implementering av equilibriumkonstanterna passningsproceduren i Excel och Affinity beräkningsförslag. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mass Photometry baserade protokollet beskrivs här ger en snabb och korrekt metod för att mäta antigen-antikropp bindande affiniteter. MP-analys använder en mycket liten mängd material, och ytterligare information—inklusive stökiometri, oligomerisering och renhet—kan bedömas utifrån samma data (Bild 5). Utan ändringar är denna metod tillämplig på mätningarna av dissociationskonstanter i det cirka 5 nM till 500 nM-området, och för ligandmolekyler med molekylmassa på ca 20 kDa eller större. Samma protokoll kan användas inte bara för att analysera antigen-antikroppsbindningen, utan också för att mäta protein-protein interaktionsaffiniteter när den molekylära massan hos minst en av bindningspartnerna är större än 50 kDa. Eftersom MP-detektionen är ospecifik kan MP-mätningar inte utföras på prover som innehåller en hög koncentration av bärarproteiner eller stora molekylmassor.
SPR används vanligen för karakterisering av antigen-antikropp bindande, och direkt jämförelse av båda metoderna kan hjälpa till med analysen urval. I jämförelse med SPR är MP-bindningsanalysen snabbare och kräver inte proteininmobilisering. För en typisk bindande experiment, MP kräver mindre material än SPR. MP data avslöjar stökiometri av de komplex som inte är lätt tillgängliga från SPR10,11. Kinetiska parametrar för bindning kan erhållas från MP-data13, men SPR mäter den bindande kinetiken direkt, och kan mäta ett bredare spektrum av association och dissociation priser. Associeringskonstanterna av två separata bindningsplatser kan endast erhållas från SPR-data när associations- och dissociationsgraderna för båda platserna är tillräckligt olika. Mp kan å andra sidan exakt karakterisera molekylära komplex med flera bindningsställen10,11. SPR kan mäta bindningsaffinitet för små molekylmedander, och MP fungerar bäst för ligander med molekylmassa på cirka 20 kDa eller större.
Samla in god kvalitet MP data är ett kritiskt steg för att få korrekta resultat från detta protokoll. Föroreningar i bufferten eller på ytan av täcken kommer att störa MP datainsamling. Felaktig fokusering förvränger MP-signalen som leder till fel i uppskattningar av molekylmassor och beräkningar av jämviktskonstanter. Båda dessa faktorer bör undersökas vid felsökning av protokollet. Ett viktigt övervägande vid arbete med låg koncentration proteinlösningar är att ytan adsorption kan leda till förlust av material och förändringar i provkoncentrationen. De resulterande felen kan minimeras genom att använda låg adsorptions labware och genom att tillämpa yt passivering. För att få korrekta resultat är det viktigt att låta alla proteinutspädningar och blandningar nå kemisk jämvikt, men onödigt långa inkubationstider bör undvikas. För varje proteinsystem rekommenderas att satserna för det icke-specifika proteinbindningen till täckglaset bedöms utifrån MP-uppgifterna. Om betydligt olika frekvenser observeras för olika arter kan MP-data enkelt korrigeras för att undvika potentiella fel i Kd beräkningarna 10,11.
Flera faktorer bör beaktas vid planering av provberedning. Exakta resultat kan erhållas genom att mäta ett enstaka prov, men antigen- och antikroppskoncentrationerna måste justeras för att få en jämförbar koncentration av de fria och bundna arterna. Analys av en enda massfördelning som domineras av en av reaktionsarterna kan ge godtagbara Kd-värden skattningar men ger vanligtvis relativt stora passningsfel11. En alternativ strategi innebär en global analys av titreringsdata. Det kalkylprogram som är baserat passande bearbetar förutsatt att med detta protokoll kan användas för att passa både individdata och för global analys. Om ett enskilt experiment eller en datamängd analyseras kan konfidensintervallen för bästa passformsparametrar uppskattas med felprojektionsmetoden. En detaljerad beskrivning av konfidensintervallberäkningsproceduren i kalkylprogramvaran tillhandahålls på andra ställen14. När du utformar analysen, Det rekommenderas att planera för replikera experiment. När data från replikatexperiment analyseras kan standardavvikelse användas för att rapportera fel av Kd-värdena.
Det protokoll som beskrivs här kan modifieras för att utöka dess tillämplighet utöver de typiska begränsningarna för molekylmassa och affinitetsintervall. Utbudet av mätbara affiniteter begränsas av proteinkoncentrationsintervallet som mp kan ha tillgång till, vanligtvis från 10 nM till 50 nM. Detta intervall kan utökas och proteinprover vid koncentrationer under 10 nM kan mätas genom att använda perfunderade flödesceller och längre datainsamlingstider. Proteinprover vid högre koncentrationer kan potentiellt mätas genom att använda passiveated coverslips för MP mätningar. För antigener med en liten molekylmassa kommer den fria antikroppen och antigen-antikroppskomplextopparna i MP-massfördelningarna att vara olösta. Detta kommer att utesluta användningen av gaussiska topp passande analys som beskrivs i protokollet. I så fall kan bindningsaffiniteten fortfarande mätas genom att antikroppen titrerades med antigenet och i genomsnitt mp-distributionerna för att erhålla den genomsnittliga molekylmassan av alla arter för varje prov. Bindningsekvationen kan sedan passa till dessa data för att erhålla antigen-antikroppsbindningsaffiniteten11.
När korrekt affinitetsinformation inte krävs kan protokollet förenklas och användas för snabb antikroppsinteraktionsscreening. I så fall kan de kommersiellt tillgängliga packningsvalderna användas istället för provkanaler för att ytterligare förenkla försöksförfarandet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Keir Neuman för hans kritiska läsning av manuskriptet. Detta arbete stöddes av det intramural programmet av NHLBI, NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AcquireMP | Refeyn | MP data collection software | |
| Anti-human thrombin | Haematologic Technologies | AHT-5020 | RRID: AB_2864302 |
| Cotton-tipped applicators | Thorlabs | CTA10 | cotton optical swabs for lens cleaning |
| Coverslips 24x24 mm | Globe Scientific | 1405-10 | |
| Coverslips 24x50 mm | Fisher Scientific | 12-544-EP | |
| DiscoverMP | Refeyn | MP data processing software | |
| Forceps | Electron Microscopy Sciences | 78080-CF | soft-tipped forceps for coverslips handling |
| Human α-thrombin | Haematologic Technologies | HCT-0020 | |
| Immersion oil | Thorlabs | MOIL-30 | |
| Isopropanol | Alfa Aesar | 36644 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | spreadsheet | |
| OneMP | Refeyn | Mass Photometry instrument | |
| Origin | OriginLab | scientific graphing software | |
| PBS | Corning | 46-013-CM | 10x stock |
| Syringe filter | Millipore | SLGSR33SS | buffer and sample filtering |
References
- Francis, R. J., et al. A phase I trial of antibody directed enzyme prodrug therapy (ADEPT) in patients with advanced colorectal carcinoma or other CEA producing tumours. British Journal of Cancer. 87 (6), 600-607 (2002).
- van Dyck, C. H. Anti-Amyloid-beta Monoclonal Antibodies for Alzheimer's Disease: Pitfalls and Promise. Biological Psychiatry. 83 (4), 311-319 (2018).
- Vennepureddy, A., Singh, P., Rastogi, R., Atallah, J. P., Terjanian, T. Evolution of ramucirumab in the treatment of cancer - A review of literature. Journal of Oncology Pharmacy Practice. 23 (7), 525-539 (2017).
- Waldmann, T. A. Immunotherapy: past, present and future. Nature Medicine. 9 (3), 269-277 (2003).
- Huang, B., Bates, M., Zhuang, X.
- Rosenberg, M. I. Protein Analysis and Purification. , Birkhauser. Basel. (2005).
- Picot, J., Guerin, C. L., Le Van Kim, C., Boulanger, C. M. Flow cytometry: Retrospective, fundamentals and recent instrumentation. Cytotechnology. 64 (2), 109-130 (2012).
- Khan, S. H., Farkas, K., Kumar, R., Ling, J. A versatile method to measure the binding to basic proteins by surface plasmon resonance. Analytical Biochemistry. 421 (2), 385-390 (2012).
- Lofgren, J. A., et al. Comparing ELISA and surface plasmon resonance for assessing clinical immunogenicity of panitumumab. The Journal of Immunology. 178 (11), 7467-7472 (2007).
- Young, G., et al. Quantitative mass imaging of single biological macromolecules. Science. 360 (6387), 423-427 (2018).
- Wu, D., Piszczek, G. Measuring the affinity of protein-protein interactions on a single-molecule level by mass photometry. Analytical Biochemistry. 592, 113575 (2020).
- Cole, D., Young, G., Weigel, A., Sebesta, A., Kukura, P. Label-free single-molecule imaging with numerical-aperture-shaped interferometric scattering microscopy. ACS Photonics. 4 (2), 211-216 (2017).
- Soltermann, F., et al. Quantifying protein-protein interactions by molecular counting with mass photometry. Angewandte Chemie International Edition in English. 59 (27), 10774-10779 (2020).
- Kemmer, G., Keller, S. Nonlinear least-squares data fitting in Excel spreadsheets. Nature Protocols. 5 (2), 267-281 (2010).
